專利名稱：人LXRα變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型肝X受體(LXR)及編碼這種受體的核酸序列。
背景技術(shù)：
在真核細胞中基因表達受轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)類固醇激素(例如糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雌激素、黃體酮、雄激素和維生素D)結(jié)合為轉(zhuǎn)錄因子的其核受體，并以此方式調(diào)節(jié)特定蛋白編碼基因的表達，控制關(guān)鍵的細胞活性，例如分化、增殖和凋亡(Meier，Recept.Signal Transduct.Res.1997，17，319-335)。肝X受體(LXR)是一個首先被鑒別為核受體超家族孤兒成員的轉(zhuǎn)錄因子家族。鑒別出一類特別的膽固醇氧化衍生物為LXR配體，這對幫助理解這些受體在體內(nèi)的功能至關(guān)重要，并首先表明了其在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中的作用。核受體超家族成員LXR包括LXRα(也稱為RLD-1)和泛素受體(UR，也叫做LXRβ)。LXR依賴性途徑包括但不限于經(jīng)膽汁酸途徑增加膽固醇消耗的膽固醇-7α-羥化酶、潛在刺激反向膽固醇運輸和增加血漿HDL-C水平(Venkateswaran et al.，J.Biol.Chem.275，2000，14700-14707；Costet et al.，J.Biol.Chem.2000 275(36)28240-28245；Ordovas，Nutr.Rev.58，2000，76-79，Schmitz and Kaminsky，F(xiàn)ront.Biosci.6，2001，D505-D514)和/或抑制腸膽固醇吸收(Mangelsdorf，XIIth InternationalSymposium on Atherosclerosis，Stockholm，June 2000)的ABC蛋白的表達。另外，已推測肝LXR介導(dǎo)的脂肪酸和膽固醇代謝之間有可能存在干擾(Tobin et al.，Mol.Endocrinol.14，2000，741-752)。
總之，正在進行的研究提示，LXR依賴性途徑很復(fù)雜，LXR變體可在不同程度上影響這些途徑。
為了理解LXR依賴性途徑和LXR作用機制，重要地是分離和表征LXR的新亞型、變體和/或同種型。鑒別出導(dǎo)致特定病癥或病理狀況的基本LXR亞型、變體或同種型可允許更精確地預(yù)測LXR相關(guān)性疾病后果。而且，這樣的多核苷酸和/或所述多核苷酸編碼的多肽是否表達或表達量可用于診斷相關(guān)的病理狀況、判斷對相關(guān)病理狀況的敏感性、開發(fā)受LXR影響的疾病或病癥的基因特異性和同種型特異性療法、監(jiān)視LXR相關(guān)性疾病或病癥的治療進程、和/或開發(fā)新的藥物靶點。
由于認識到這些變體可能與單獨編碼的蛋白一樣對代謝和生理功能至關(guān)重要，所以需要鑒別和表征LXRα蛋白的其它變體。本發(fā)明滿足了這種需要，也具有相關(guān)優(yōu)勢。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及新型LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-)的編碼核酸序列的鑒別和這些變體的某些活性和特征。因此，本發(fā)明涉及編碼人肝X受體α(LXRα)變體多肽的分離核酸分子，例如編碼SEQ ID NO4、6、8、17或19的分離核酸分子；編碼與SEQ ID NO4、6、8、17或19具有至少90％(例如90％、95％或99％)一致性的氨基酸序列的分離核酸分子；在6X SSC(1MNaCl)、50％甲酰胺、1％SDS、42℃的雜交條件和42℃、1X SSC的洗滌條件與68℃、0.2X SSC和0.1％SDS的洗滌條件下與上述分離核酸分子雜交的分離核酸分子；以及和本文描述的任一種LXRα變體序列互補的分離核酸分子。LXRα變體核酸分子還可為全長LXRα變體mRNA或cDNA的片段。一般來說，至少一部分片段是在野生型LXRα mRNA或cDNA中不存在的序列。在某些實施方案中，分離核酸分子由SEQ ID NO3、5、7、16或18組成。
在某些實施方案中，分離核酸分子為DNA分子。分離核酸分子可為RNA分子，或者可含合成核苷酸和天然核苷酸。在某些情況下，分離核酸分子包括SEQ ID NO3、5、7、16或18的核酸序列或其片段，或者可由SEQ ID NO3、5、7、16或18的核酸序列組成。在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可編碼具有LXR反應(yīng)途徑活性的多肽，例如可與野生型LXRα形成二聚體、可與類視黃醇X受體(RXR)(例如RXRα、RXRβ或RXRγ)形成雜二聚體、或者可影響LXR反應(yīng)途徑分子的表達和活性，例如ABCA1或SREBP-1C的表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及由本文描述的分離的LXRα變體核酸分子編碼的多肽(LXRα變體多肽，例如LXRα-64多肽、LXRα-42e+多肽、LXRα-42e-多肽，或其片段)。在某些情況下，多肽可與野生型LXRα形成二聚體。在某些情況下，多肽可與RXR(例如RXRα、RXRβ或RXRγ)形成雜二聚體。在某些實施方案中，形成雜二聚體可抑制RXR和核受體(其與RXR天然雜二聚化)之間形成雜二聚體。在此情況下，形成雜二聚體可調(diào)節(jié)與RXR和核受體(其與RXR天然雜二聚化)二聚化相關(guān)的活性(例如降低或增加)。在另一個實施方案中，LXRα變體多肽可形成抑制RXR同二聚體形成的雜二聚體。在某些情況下，抑制對RXR同二聚體誘導(dǎo)的活性產(chǎn)生調(diào)節(jié)(例如增加或降低)。在某些實施方案中，LXRα變體多肽或其片段可對LXR(例如野生型LXRα)顯示顯性負調(diào)控活性。在某些實施方案中，本文描述的多肽為LXRα變體片段，可具有LXRα變體的至少一種功能，例如結(jié)合特異性結(jié)合LXRα變體的抗體。
本發(fā)明還包括含LXRα變體或其片段的分離核酸分子的構(gòu)建物(例如質(zhì)粒，包括但不限于pCMV/myc、pcDNA 3.1或其衍生物)。分離核酸分子可有效連接調(diào)節(jié)序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含本文所述的分離核酸分子(例如LXRα變體或其衍生物)的宿主細胞或細胞后代。本發(fā)明還包括含上述構(gòu)建物的宿主細胞。宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌細胞)或真核細胞，例如哺乳動物細胞，如小鼠細胞、大鼠細胞、猴細胞或人細胞(例如人胚細胞或其它類型的干細胞)。宿主細胞的實例包括但不限于人肝癌細胞(HepG2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、猴COS-1細胞和人胚腎細胞(HEK293)。宿主細胞的其它實例包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)細胞和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
本發(fā)明的一個方面是含LXRα-64、LXRα-42e+或/和LXRα-42e-氨基酸序列的分離LXRα變體多肽，例如含SEQ ID NO4、6、8、17、19的氨基酸序列、其天然等位基因變體或其片段的分離多肽。分離的多肽可由SEQ ID NO4、6、8、17、19的氨基酸序列或其片段組成。一般來說，片段與SEQ ID NO2的同源性不超過25個連續(xù)氨基酸(例如20、15、10或5個連續(xù)氨基酸)。在某些實施方案中，分離的LXRα變體多肽包括異源的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在LXRα變體多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的方法。該方法包括使樣品和選擇性結(jié)合LXRα變體多肽(或其片段)的化合物(例如抗體如單克隆抗體)接觸，并測定化合物是否結(jié)合樣品中的多肽。本發(fā)明還包括一種試劑盒，其包括選擇性結(jié)合LXRα變體多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的化合物及使用說明。
本發(fā)明的實施方案包括特異性結(jié)合本文所述的分離LXRα變體多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)或其片段的抗體。在某些情況下，抗體不明顯結(jié)合野生型LXRα。在某些實施方案中，抗體為多克隆抗體。在其它實施方案中，抗體為單克隆抗體?？贵w可包含可檢測標記。本發(fā)明還包括抗體片段，例如特異性結(jié)合LXRα變體的抗體Fab片段。本發(fā)明還涉及含本文所述抗體或其片段和藥物可接受載體的組合物。
本發(fā)明的一個方面包括鑒別新LXRα變體核酸分子(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)的方法。該方法包括使含一種或多種核酸分子的樣品與LXRα變體核酸分子或其片段在嚴格雜交條件下雜交，鑒別樣品中與LXRα變體核酸分子雜交的核酸分子，由此鑒別推定的LXRα變體核酸分子，并測定推定LXRα變體核酸分子的序列，其中序列與LXRα變體序列不相同的推定LXRα變體核酸分子為新LXRα變體核酸。在某些情況下，新LXRα變體核酸分子編碼已知的LXRα變體多肽。在某些情況下，新LXRα變體核酸分子編碼的LXRα多肽與已知的LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)不相同。與已知的LXRα變體多肽相比，新LXRα變體多肽可含一種或多種保守置換。
在一個方面，本發(fā)明涉及檢測生物樣品中的LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)表達的方法。該方法包括使生物樣品與LXRα變體核酸分子或其片段(如本文所述)雜交，并測定核酸分子是否與樣品中的核酸分子雜交，其中雜交代表LXRα變體被表達。在某些實施方案中，測定雜交量(例如絕對量或相比于對照或參比量的相對量)。
本發(fā)明的另一方面涉及降低細胞中的RXR二聚體形成的方法。該方法包括使細胞與LXRα變體多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)或其片段接觸，由此抑制RXR二聚體形成(例如抑制RXR雜二聚化或抑制RXR同二聚化)。
再另一方面，本發(fā)明涉及鑒別LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的配體的方法。該方法包括提供含LXRα變體多肽的樣品，使樣品與測試化合物接觸，測定測試化合物是否可結(jié)合LXRα變體，這樣可結(jié)合LXRα變體的化合物是LXRα變體配體。在某些實施方案中，配體的Kd小于1×106、小于1×109、在1×106和1×1012之間、在1×109和1×1012之間。在某些情況下，樣品中存在RXR。該方法可包括測定LXRα變體配體是否可結(jié)合野生型LXRα，例如測定LXRα變體配體不結(jié)合野生型LXRα。在某些情況下，鑒別的LXRα變體配體對LXRα變體的親和性比對野生型LXRα的親和性高。
本發(fā)明的一個方面涉及調(diào)節(jié)(例如增加或降低)LXRα調(diào)節(jié)基因的表達。該方法包括調(diào)節(jié)LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的表達或活性。LXRα調(diào)節(jié)基因的實例包括但不限于SREBP-1C(甾醇調(diào)節(jié)結(jié)合元件1c)、FAS、CYP7A1(膽固醇7-α羥化酶)、ApoE、CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4和PLTP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)。
在再另一個方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)受試者中的LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)表達或活性的方法。該方法包括將LXRα變體核酸分子或其片段以足以表達LXRα變體和調(diào)節(jié)LXRα表達或活性的量和時間引入到受試者中。在某些實施方案中，LXRα變體抑制野生型LXRα的表達或活性(例如誘導(dǎo)LXRα依賴性途徑基因的表達)。在某些情況下，所述活性為LXRα雜二聚化，例如配體刺激的雜二聚化。
在另一方面，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)受試者中RXR表達或活性的方法。該方法包括將LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)核酸分子或其片段以足以表達LXRα變體和調(diào)節(jié)RXR表達或活性的量和時間引入到受試者中。在某些實施方案中，調(diào)節(jié)(例如抑制)RXR雜二聚化(例如RXR與PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR的雜二聚化)或調(diào)節(jié)(例如抑制)RXR同二聚化。RXR可為例如RXRα、RXRβ或RXRγ。
在再另一方面，本發(fā)明包括治療患RXR相關(guān)疾病或病癥的個體的方法，該方法包括給予該個體藥學(xué)有效量的LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)或其片段。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含可表達LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)或其片段的細胞，并任選包含藥物可接受載體；本文所述的分離LXRα變體核酸分子或其片段和藥物可接受載體；或本文所述的LXRα變體(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)多肽和藥物可接受載體。
除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語所具有的含義都和本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的相同。盡管可使用和本文所述相似或等同的方法和材料實施或檢驗本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻，都通過引用整體結(jié)合到本文中。另外，材料、方法和實施例僅為說明目的，無限制意圖。
由詳述、附圖和權(quán)利要求書顯而易見本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。
附圖簡述和序列描述由以下的詳述、附圖和序列可更全面地理解本發(fā)明，詳述、附圖和序列構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。


圖1A圖示了野生型LXRα(天然)cDNA與部分變體LXRα-64cDNA(參見實施例2)的序列對比。上方的行描述了部分野生型LXRα序列，下方的行描述了部分LXRα-64序列。數(shù)字代表自每個cDNA序列起始密碼子的核苷酸位置。
圖1B圖示了人LXRα(天然)的預(yù)測氨基酸序列和對應(yīng)于圖1A中序列的LXRα-64的序列對比。上方的行描述了部分天然LXRα氨基酸序列，下方的行描述了部分LXRα-64氨基酸序列。數(shù)字代表預(yù)測序列中的氨基酸位置。LXRα-64變體特有的另外序列加下劃線。
圖2A描述了部分野生型LXRαcDNA和部分新型變體LXRα-42e+cDNA(參見實施例2)的序列對比。上方的行描述了部分天然LXRα序列，下方的行描述了部分LXRα-42e+序列。數(shù)字代表自cDNA起始密碼子的核苷酸位置。
圖2B描述了人LXRα(野生型)的預(yù)測氨基酸序列和LXRα-42e+的序列對比。上方的行為部分天然LXRα序列，下方的行為部分新型變體。數(shù)字代表氨基酸位置。LXRα-42e+變體特有的序列加下劃線。
圖3A描述了部分野生型LXRαcDNA和部分新型變體LXRα-42e-cDNA(參見實施例2)的序列對比。上方的行描述了部分野生型LXRα序列，下方的行為部分LXRα-42e-序列。數(shù)字代表自cDNA起始密碼子的核苷酸位置。
圖3B描述了野生型人LXRα的預(yù)測氨基酸序列和LXRα-42e-的序列對比。上方的行為部分野生型LXRα序列，下方的行為部分新型變體。數(shù)字代表氨基酸位置。LXRα-42e-變體特有的序列加下劃線。
圖4是LXRα-64mRNA的圖示。
圖5是LXRα-42e+mRNA的圖示。
圖6是LXRα-42e-mRNA的圖示。
圖7A是條形圖，描述了測定各種組織中LXRα-64的相對RNA表達的實驗結(jié)果。
圖7B是條形圖，描述了測定各種組織中LXRα-42(LXRα-42e+和LXRα-42e-混合)的相對RNA表達的實驗結(jié)果。
圖8A是條形圖，描述了測定THP-1細胞中LXRα-64RNA表達的基因調(diào)節(jié)的實驗結(jié)果。
圖8B是條形圖，描述了測定THP-1細胞中LXRα-42RNA表達的基因調(diào)節(jié)的實驗結(jié)果。
圖9是條形圖，描述了測定LXRα-64和LXRα-42抑制報告基因的LXR配體依賴性活化的實驗結(jié)果。
圖10是條形圖，描述了測定LXRα-64和LXRα-42抑制報告基因的LXR配體依賴性活化的實驗結(jié)果。該實驗和結(jié)果示于圖9的實驗的差異在于用野生型LXRα和每種新變體同時共轉(zhuǎn)染293細胞。
圖11是條形圖，描述了測定HEK293細胞中的SREBP-1C表達的實驗結(jié)果，其中所述HEK293細胞在有或沒有LXRα激動劑(TO901317)、RXRα激動劑(9RA)或兩種激動劑的情況下用編碼RXRα(RXRa)、野生型LXRα(LXRa)和RXRα、或LXRα-64(L64)和RXRα的表達載體轉(zhuǎn)染。樣品為RXRα+pCMV(對照載體)、RXRa+L64、RXRa+LXRa。表達表示為相比于對照的倍數(shù)變化。
圖12是條形圖，描述了測定HEK293細胞中的ABCA1表達的實驗結(jié)果，其中所述HEK293細胞在有或沒有LXRα激動劑(TO901317)、RXRα激動劑(9RA)或兩種激動劑的情況下用編碼RXRα(RXRa)、野生型LXRα(LXRa)和RXRα、或LXRα-64(L64)和RXRα的表達載體轉(zhuǎn)染。樣品為RXRα+pCMV(對照載體)、RXRa+L64、RXRa+LXRa。表達表示為相比于對照的倍數(shù)變化。
以下提供了簡單的序列表描述，序列在實施例之后和附圖中提供。
SEQ ID NO1是編碼野生型LXRα的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是推斷的野生型LXRα的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是編碼變體LXRα-64的核苷酸序列。
SEQ ID NO4是推斷的變體LXRα-64的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是編碼變體LXRα-42e+的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是推斷的變體LXRα-42e+的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是編碼變體LXRα-42e-的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是推斷的變體LXRα-42e-的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是正向引物L(fēng)XRα-For的核苷酸序列。
SEQ ID NO10是反向引物L(fēng)XRα-rev的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是正向引物L(fēng)64-for的核苷酸序列。
SEQ ID NO12是反向引物L(fēng)64-rev的核苷酸序列。
SEQ ID NO13是L64 TaqMan探針的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是用于熒光素酶實驗(參見實施例6)的部分LXRα啟動子序列。
SEQ ID NO15是LXR效應(yīng)元件(LXRE)的核苷酸序列。
SEQ ID NO16是LXRα-64變體獨有的核苷酸序列，相比于野生型其含有另外的序列，該序列連接野生型LXRα的外顯子6和7，在LXRα-64中產(chǎn)生了更長的外顯子6。新外顯子6包含所述野生型LXRα外顯子6的全部，另外還包含來源于野生型LXRα內(nèi)含子6序列(位于外顯子6和外顯子7之間)的額外序列。
SEQ ID NO17是由SEQ ID NO16編碼的推斷氨基酸序列。
SEQ ID NO18是LXRα-42e獨有的核苷酸序列，其與野生型LXRα的外顯子8組合，在LXRα-42變體中產(chǎn)生了更長的外顯子8。該序列長234個核苷酸，在126位含終止密碼子(TAG)，因此隨后的108個核苷酸是不翻譯的。其在LXRα-42e-和LXRα-42e+中都存在。
SEQ ID NO19是由SEQ ID NO18編碼的推斷氨基酸序列。
SEQ ID NO20是用于本發(fā)明的LXRα效應(yīng)元件(LXRE)的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是引物L(fēng)42-For的核苷酸序列。
SEQ ID NO22是引物L(fēng)42-Rev的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是L42探針的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是野生型(天然)LXRαcDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO25是LXRα-64cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO26是LXRα-64cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO27是野生型LXRαcDNA的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO28是LXRα-64cDNA的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO29是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO30是LXRα-42e+cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO31是LXRα-42e+cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO32是野生型LXRα的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO33是LXRα-42e+cDNA的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO34是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。
IDS EQ ID NO35是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。
IDS EQ ID NO36是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO37是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO38是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO39是野生型LXRα的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO40是LXRα-43e-的部分氨基酸序列。
發(fā)明詳述申請人成功鑒別和表征了LXRα基因的新剪接變體，其編碼在本文分別稱為LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-的新LXRα變體。新鑒別的序列產(chǎn)生的變體在結(jié)構(gòu)和功能上不同于已知的LXRα蛋白。LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-變體分別由SEQ ID NO3、SEQID NO5和SEQ ID NO7的多核苷酸序列編碼，并代表了全長LXRαcDNA的可變變體。
基因組結(jié)構(gòu)分析表明，新分離的變體LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-與野生型LXRα共有某些蛋白結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)組成(圖4、5和6)。RT-PCR分析揭示，本發(fā)明的變體mRNA轉(zhuǎn)錄物在肝臟中最豐富(圖7A和7B)。更具體地說，LXRα-64在肝臟、小腸和胰臟中的表達最高。LXRα-42e+和LXRα-42e-在肝臟中的表達最高。在其它組織中的表達明顯較低。三種LXRα亞型的N-端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域與野生型LXRα的對應(yīng)區(qū)域相同，而C-端結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)具有某些變異性。與野生型LXRα相比，LXRα-64變體在其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有額外的64個氨基酸，LXRα-42e+具有替代的42個氨基酸，其由野生型LXRα序列的殘基367開始，野生型LXRα的殘基368至末端的C端(80個氨基酸)在該變體中不存在，因此沒有存在于野生型LXRα中的部分配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。LXRα-42e-含349個氨基酸，沒有由野生型LXRα的外顯子6編碼的60個氨基酸。由LXRα-42-的氨基酸237開始，有71個氨基酸與野生型LXRα100％相同。后面的42個氨基酸與野生型完全不同。和LXRα-42+一樣，野生型LXRα的C-端在LXRα-42e-中不存在。
本文還證明了新型LXRα變體的功能在于它們可起野生型LXRα活性的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物的作用。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-變體在人單核細胞/巨噬細胞THP-1細胞中被LXR或RXR激動劑上調(diào)(圖8)。而且，當新型LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-變體和報告基因共轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)LXR配體依賴性活化急劇下降(圖9和10)。在存在LXRα-64、LXRα激動劑的情況下(圖11和12)，在某些情況下甚至在不存在LXRα激動劑時(圖11)，LXR依賴性途徑基因的配體依賴性誘導(dǎo)也下降。
三種新型LXRα變體還通過起顯性負調(diào)控基因的作用，表現(xiàn)出拮抗天然(野生型)LXRα蛋白的生物/生化活性。LXRα蛋白的一部分，例如DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)，也可以活化野生型LXRα蛋白的生物/生化活性，有效性稍微低于野生型LXRα。
增加LXRα變體(例如LXRα-64)表達或活性用于治療與SREBP-C1表達相關(guān)的疾病。例如，通過過表達LXRα-64或增加在細胞中表達的LXRα-64的活性(例如通過給予與野生型LXRα相比差異性結(jié)合LXRα-64的化合物)，破壞LXRα的活性，這可提供一種抑制胰島素誘導(dǎo)SREBP-C1的方法，因此提供了一種抑制不需要的胰島素誘導(dǎo)脂肪酸合成的方法。在另一個實例中，過表達LXRα變體(例如LXRα-64)或選擇性活化LXRα變體(例如用差異性結(jié)合LXRα-變體的化合物)可導(dǎo)致抑制SREBP-C1，由此提供了一種治療高甘油三酯血癥的方法，該病癥是心臟病的強烈預(yù)示。在另一個實例中，降低SREBP-C1表達(通過增加LXRα變體如LXRα-64的表達或活性)可導(dǎo)致VLDL-TG(極低密度脂蛋白甘油三酯)的表達降低，這是某些疾病如糖尿病和某些類型的高脂蛋白血癥中需要的作用。野生型LXR具有上調(diào)ABCA1的作用，該作用與反向膽固醇運輸有關(guān)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LXRα變體可抑制參與甘油三酯合成的SREBP-1C的基礎(chǔ)表達。
核受體與RXR雜二聚化，這些雜二聚體的活化導(dǎo)致特定基因的表達增加。在不需要一種或多種這些基因表達的情況下(例如LXR介導(dǎo)的SREBP1c上調(diào))，如果表達的LXRα變體結(jié)合RXR，由此降低二聚化的RXR的利用度，并因此降低對不需要的基因表達的誘導(dǎo)，則LXRα-64的過表達有益于受試者。
如下文更詳盡的描述，本發(fā)明提供編碼各種LXRα新型變體的分離核酸、其同源物和片段。本發(fā)明進一步提供增殖和表達本發(fā)明核酸的載體、含本發(fā)明核酸和載體的宿主細胞、本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和蛋白融合物，以及全部變體中的任一種的特異性抗體。本發(fā)明提供藥學(xué)或生理學(xué)可接受的組合物，其含有本發(fā)明的多肽、多核苷酸和/或抗體，以及通常的生理學(xué)可接受的載體。本發(fā)明另外提供基于本發(fā)明的LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-核酸片段、多肽和抗體的診斷、研究和治療方法。
定義提供以下的定義和縮寫是為了全面理解本說明書使用的術(shù)語和縮寫。
如本文和所附權(quán)利要求書中所使用的一樣，單數(shù)形式的“一個”和“一種”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外明確指出。因此，例如，所提及的“宿主細胞”包括多種這樣的宿主細胞，所提及的“抗體”是指一種或多種抗體或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
說明書中的縮寫對應(yīng)于以下測量單位、技術(shù)、特性或化合物“min”表示分鐘；“h”表示小時；“μL”表示微升；“mL”表示毫升；“mM”表示毫摩爾；“M”表示摩爾；“mmole”表示毫摩爾；“kb”表示千堿基；“bp”表示堿基對，而“IU”表示國際單位。
“Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基”縮寫為DMEM。
“高效液相層析”縮寫為HPLC。
“高通量篩選”縮寫為HTS。
“可讀框”縮寫為ORF。
“聚丙烯酰胺凝膠電泳”縮寫為PAGE。
“十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳”縮寫為SDS-PAGE。
“聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為PCR。
“逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為RT-PCR。
“肝X受體α”縮寫為LXRα。
“類視黃醇X受體”縮寫為RXR。RXR是指所有的RXR，包括RXRα、RXRβ、RXRγ及其組合。
“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”縮寫為DBD。
“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”縮寫為LBD。
“非翻譯區(qū)”縮寫為UTR。
“十二烷基硫酸鈉”縮寫為SDS。
在本說明書的正文中，將使用許多術(shù)語。本文使用的術(shù)語“核酸分子”是指磷酸酯形式的核糖核苷酸(RNA分子)或脫氧核糖核苷酸(DNA分子)或任何磷酸酯類似物，其為單鏈形式或雙鏈螺旋?？赡艽嬖陔p鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語核酸分子，具體地說為DNA或RNA分子，僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，沒有將其限定為任何特定的三級形式。因此，該術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其是以線性(例如限制性片段)或環(huán)狀DNA分子、質(zhì)粒和染色體存在的雙鏈DNA。在討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，可按照一般慣例描述序列，即僅沿著DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即序列對應(yīng)于mRNA的鏈)以5′至3′方向給出序列。
“重組核酸分子”是指經(jīng)歷了分子生物學(xué)操作的核酸分子，或其來源于經(jīng)歷了生物學(xué)操作的分子(即非天然核酸分子)。而且，術(shù)語“重組DNA分子”是指非天然存在的核酸分子，或可通過人工組合兩個在其它情況下分離的序列節(jié)段制備，即通過將一般不連續(xù)的DNA部分連接在一起制備。所述“重組產(chǎn)生的”是指生產(chǎn)非天然組合，經(jīng)常通過化學(xué)合成方法或通過人工操作分離的核酸節(jié)段來實現(xiàn)，例如通過使用限制酶、連接酶的基因工程技術(shù)和例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.；(1989)，或Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.(1989)，和DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II(ed.D.N.Glover)IREL Press，Oxford，(1985)所述的類似重組技術(shù)實現(xiàn)。
在某些情況下，構(gòu)建重組核酸分子，以用編碼相同或保守氨基酸的冗余密碼子代替密碼子，同時通常導(dǎo)入或去除序列識別位點?；蛘?，設(shè)計重組核酸分子用于將所需功能的核酸節(jié)段連接在一起，以產(chǎn)生含所需功能組合的、通常在所操作序列的天然形式中不存在的單個遺傳實體。限制酶識別位點可為這種人工操作的靶，但其它的位點特異性靶如啟動子、DNA復(fù)制位點、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征可通過設(shè)計摻入。重組核酸分子的實例包括重組載體，例如含DNA序列的克隆或表達載體，其為5′至3′方向(有義)或3′至5′方向(反義)。適于制作含LXRα變體序列及其片段的重組載體(例如表達載體)的載體在本領(lǐng)域是已知的。
術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”、“基因”、“基因編碼的mRNA”是指一系列在DNA和RNA中的核苷酸堿基(也稱為核苷酸)，包括兩個或更多個核苷酸的任何鏈、RNA或DNA(單鏈或雙鏈、編碼鏈、互補鏈或反義鏈)，或單鏈或雙鏈形式的一個以上核苷酸的RNA/DNA雜合序列(盡管以上類別中的每個都可具體指定)。
多核苷酸可為嵌合混合物或衍生物，或其修飾形式，可為單鏈或雙鏈。多核苷酸可在堿基部分、糖部分或磷酸骨架部分進行修飾，以例如提升分子的穩(wěn)定性或改變其雜交參數(shù)。反義多核苷酸可包含選自以下的修飾堿基部分包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖苷Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核苷酸序列通常攜帶遺傳信息，包括細胞機器(cellularmachinery)制備蛋白和酶所使用的信息。這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈基因組和cDNA、RNA、任何合成多核苷酸、遺傳操作的多核苷酸以及有義和反義多核苷酸。其包括單鏈和雙鏈分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜合子，以及堿基結(jié)合氨基酸骨架所形成的“蛋白核酸”(PNA)。其還包括含修飾堿基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鳥嘌呤和氟尿嘧啶，或包括含碳水化合物或脂質(zhì)的核酸。
“基因組DNA”是其核苷酸序列與基因同源的DNA鏈。作為實例，染色體DNA片段為基因組DNA。
在本發(fā)明的正文中，對常見的核酸堿基使用以下的縮寫?！癆”代表腺嘌呤，“C”代表胞嘧啶，“G”代表鳥嘌呤，“T”代表胸腺嘧啶，而“U”代表尿嘧啶。
可使用本領(lǐng)域已知的方法合成本發(fā)明的多核苷酸，例如使用自動化DNA合成儀(例如可由Biosearch，Applied Biosystems商購的自動化DNA合成儀)。作為實例，可利用Stein et al.，Nucl.Acids Res.，16，3209，(1988)的方法合成硫代磷酸寡核苷酸，可使用可控多孔玻璃聚合物支持體制備甲基磷酸寡核苷酸(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7448-7451，(1988)。
為將反義DNA或RNA傳遞入細胞中，已開發(fā)了許多方法，例如可將反義分子直接注射入組織部位。設(shè)計用于靶向特定細胞的修飾反義分子(例如與可特異性結(jié)合在靶細胞表面上表達的受體或抗原的肽或抗體連接的反義核酸)可全身給予。反義RNA分子可通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子的DNA序列產(chǎn)生?？蓪⑦@種DNA序列摻入到各種整合了合適RNA聚合酶啟動子(例如T7或SP6聚合酶啟動子)的載體中?；蛘?，可將反義構(gòu)建物穩(wěn)定導(dǎo)入細胞系中，其中所述反義構(gòu)建物根據(jù)所使用的啟動子組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA。為將反義構(gòu)建物的胞內(nèi)濃度提升至足以抑制靶向內(nèi)源mRNA翻譯的水平，人們可使用其中反義寡核苷酸處于強啟動子控制之下的重組DNA構(gòu)建物。這種構(gòu)建物轉(zhuǎn)染靶細胞的用途導(dǎo)致足量的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄，其與內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄物形成互補堿基對，由此防止靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄。例如，可將載體體內(nèi)導(dǎo)入，以使其被細胞吸收，并控制反義RNA在細胞中的轉(zhuǎn)錄。這種載體可保持為游離型，或者可成為染色體整合型，只要其可被轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)需要的反義RNA。這種載體可通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建。載體可為質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的適于在哺乳動物細胞中復(fù)制和表達的其它載體。可使用本領(lǐng)域已知的在哺乳動物如人細胞中起作用的任何啟動子促進反義RNA編碼序列的表達。這種啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。這種啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist and Chambon，Nature，290，304-310，(1981))、包含在Rous肉瘤病毒的3′長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto et al.，Cell，22，787-797，(1980))、皰疹胸腺嘧啶激酶啟動子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，1441-1445，(1981))以及金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster et al.，Nature296，39-42，(1982))。任一種類型的質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體或病毒載體都可用于制備可直接導(dǎo)入組織位點中的重組DNA構(gòu)建物。或者，可使用選擇性感染目的組織的病毒載體，在該情況下可通過另一途徑實現(xiàn)給予(例如全身給予)。
核酶是有能力以類似于DNA限制性內(nèi)切核酸酶的方式特異性切割單鏈RNA的RNA分子。通過修飾編碼核酶的核苷酸序列，可將分子加工成識別RNA分子中的特異性核苷酸序列并對其切割(Cech，JAMA，260，3030，(1988))。該方法的主要優(yōu)勢在于因為它們是序列特異性的，所以只有具有特異性序列的mRNA才失活。
本文描述的多核苷酸可位于天然調(diào)節(jié)(表達控制)序列側(cè)翼，或者可與異源序列結(jié)合，包括啟動子、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和其它核糖體結(jié)合位點序列、增強子、效應(yīng)元件、抑制基因、信號序列、聚腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5′-和3′-非編碼區(qū)等。還可以通過本領(lǐng)域已知的其它方法修飾核酸。這種修飾的非限制性實例包括甲基化、“加帽”、用類似物置換一個或多個天然核苷酸以及核苷酸間修飾，例如具有不帶電鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯或氨基甲酸酯)和帶電鍵(例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)的核苷酸間修飾。多核苷酸可包含一個或多個另外的共價連接部分，例如蛋白(如核酸酶、毒素、抗體、單個肽或聚-L-賴氨酸)、嵌入劑(如吖啶或補骨脂素)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵或氧化金屬)以及烷化劑。多核苷酸可通過形成磷酸三酯(其中一個為甲酯或乙酯)或氨基磷酸烷基酯鍵而衍化。而且，還可用能夠直接或間接提供可檢測信號的標記修飾本文的多核苷酸。示例性的標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。
術(shù)語“上游”是指由特定參照點到多核苷酸的5′末端的位置。
術(shù)語“堿基配對的”和“Watson和Crick堿基配對的”在本文可互換使用，是指可利用其序列一致性相互氫鍵鍵合的核苷酸，鍵合方式類似于存在于雙螺旋DNA中的方式胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過兩個氫鍵連接至腺嘌呤殘基，胞嘧啶和鳥嘌呤殘基通過三個氫鍵連接(參見Stryer，(1995)Biochemistry，第4版，其公開內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中)。
術(shù)語“外顯子”是指存在于基因組DNA中的核酸序列，經(jīng)預(yù)測(例如使用生物信息學(xué))和/或憑經(jīng)驗確定其為成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物提供連續(xù)序列。
術(shù)語“分支位點”和“3′接受位點”是指真核mRNA中3-剪接點的共有序列。幾乎所有的內(nèi)含子都以GU開始，以AG結(jié)尾。根據(jù)許多外顯子-內(nèi)含子的邊界分析，已經(jīng)確定了在5和3末端優(yōu)選核苷酸的延長共有序列。除了AG以外，恰好位于3′剪接點上游的其它核苷酸對精確剪接也很重要(即分支位點共有序列YNYURAY和3′接受位點(Y)nNAG G)。
術(shù)語“編碼多肽的核酸片段”包括僅含編碼序列的多核苷酸以及含編碼序列和其它編碼或非編碼序列的多核苷酸。
當單鏈形式的核酸分子可與另一核酸分子在合適的溫度和溶液離子強度條件下退火時，核酸分子與另一核酸分子(例如cDNA、基因組DNA或RNA)“可雜交”(Sambrook，J.et al.eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY.Vols.1-3(ISBN 0-87969-309-6)。溫度和離子強度條件決定了雜交的“嚴格性”。為初步篩選同源核酸，可使用相當于Tm55℃的低嚴格雜交條件，例如5×SSC、0.1％SDS、0.25％奶，無甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS。中等嚴格雜交條件對應(yīng)于較高的Tm，例如40％甲酰胺和5×或6×SSC。高嚴格雜交條件對應(yīng)于較高的Tm，例如50％甲酰胺、5×或6×SSC。一般來說，高嚴格雜交條件是在6×SSC(1M NaCl)、50％甲酰胺、1％SDS、42℃下雜交，接著在1×SSC、0.1％SDS、42℃下漂洗20分鐘，然后在0.2×SSC、0.1％SDS、68℃下漂洗3次，每次20分鐘。雜交需要兩種核酸含互補序列，盡管雜交取決于雜交的嚴格性，但有可能存在堿基錯配。適于核酸雜交的嚴格性取決于本領(lǐng)域眾所周知的變量核酸長度和互補程度。兩種核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，具有這些序列的核酸雜合子的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高的Tm)按以下順序下降RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對于長度超過100個核苷酸的雜合子，已經(jīng)導(dǎo)出了計算Tm的方程式(Sambrook et al.eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，9.50-9.51)。對于與較短的核酸(即寡核苷酸)雜交，錯配的位置變得更重要，寡核苷酸的長度決定了其特異性(Sambrook et al.eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，11.7-11.8)。這種序列的Tm也可以計算，并確定合適的雜交條件。
本文描述的核酸分子包括在嚴格條件下與本文描述的LXRα變體編碼序列及其互補序列雜交的核酸序列。對于本發(fā)明目的，術(shù)語“嚴格條件”指僅在核酸序列之間的一致性至少為90％(例如至少為95％)時發(fā)生雜交。因此，本發(fā)明還包括與所附序列表中報告的完整序列互補的分離核酸片段和與這些序列至少95％相同的序列，以及其序列與前述多核苷酸互補的多核苷酸。一般來說，與本文描述的LXRα變體編碼序列的互補物雜交的本發(fā)明多核苷酸，其編碼的多肽基本保留了和SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的cDNA編碼的成熟LXRα多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
氨基酸或核苷酸序列的“顯著部分”是足量的多肽氨基酸序列或基因核苷酸序列，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員直接評價序列，或使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215403-410；另參見ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)之類的算法通過計算機自動化序列比較和鑒別來推測鑒別該多肽或基因。一般來說，必須至少10個(例如至少15個、至少20個、至少25個或至少30個或更多個)連續(xù)核苷酸的序列來推測鑒別與已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列。而且，對于核苷酸序列，可在序列依賴性基因鑒別(例如DNA雜交)和分離(例如細菌菌落或噬菌斑原位雜交)方法中使用含15-30(例如20-30)個連續(xù)核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針。另外，12-25個堿基(例如12-20個堿基、15-20個堿基)的短寡核苷酸可用作PCR中的擴增引物，以便獲得含所述引物的特定核酸片段。因此，“顯著部分”的核苷酸序列含所述序列的足量部分，以特異性鑒別和/或分離含所述序列的核酸片段。本發(fā)明教導(dǎo)了編碼一種或多種特定LXR變體的部分或全部氨基酸序列和核苷酸序列。具有了本文報告的序列的益處，技術(shù)人員可使用公開序列的全部或顯著部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用途。因此，本發(fā)明包含在所附序列表中報告的完整序列，以及如上定義的這些序列的顯著部分。
術(shù)語“互補”用于描述互相能夠雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，對于DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。
本領(lǐng)域已知的“一致性”和“相似性”是指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關(guān)系，其通過序列對比確定。在本領(lǐng)域，一致性還表示多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，根據(jù)具體情況，通過這種序列鏈之間的匹配確定。一致性和相似性都可通過已知方法容易地計算，例如描述于以下的方法Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，e d.，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991。常用于確定序列之間一致性和相似性的方法包括但不限于在Carillo，H.andLipman，D.，SIAM J.Applied Math.481073(1988)中公開的方法。確定一致性和相似性的方法被編程為公眾可獲得的計算機程序。確定兩個或更多個序列之間的一致性和相似性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Res.12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA(Paschal，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215403(1990))。
術(shù)語“同源的”是指兩種聚合物(即多肽分子或核酸分子)之間的序列相似程度。同源性百分率圖在本文中用于反映兩種聚合物之間的最大可能同源性，即兩種聚合物比對以具有最大數(shù)目的匹配(同源)位置時的同源百分率。
術(shù)語“同源百分率”是指多肽之間的氨基酸序列一致性程度。任何兩種多肽之間的同源性是在任一個序列中給定位置的匹配氨基酸總數(shù)的正函數(shù)，例如如果任一個序列中氨基酸總數(shù)的一半相同，則稱兩個序列具有50％同源性。
術(shù)語“直向同源物”是指經(jīng)物種形成為同系物的基因或蛋白，例如基于結(jié)構(gòu)和功能考慮緊密相關(guān)并假定具有共同譜系的基因或蛋白。直向同源蛋白一般在不同物種中具有相同功能和相同活性。術(shù)語“種內(nèi)同源”是指經(jīng)基因復(fù)制為同系物的基因或蛋白，例如基因組中基因的復(fù)制變體。另外參見Fritch，W M(1970)Syst.Zool.1999-113。術(shù)語“直向同源物”可指另一個物種中的多肽，其對應(yīng)于SEQ IDNO4、6、8、17或19中提出的LXRα變體樣多肽氨基酸序列。例如，小鼠和人LXRα樣多肽被認為是相互的直向同源物。
術(shù)語“片段”、“類似物”和“衍生物”當涉及本發(fā)明的多肽(例如SEQ ID NO4、6、8、17和19)時，可指基本保留所涉及多肽的至少一種生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括可通過切割前體蛋白部分產(chǎn)生活性成熟多肽而活化的前體蛋白。本文描述的多肽(例如SEQ ID NO4、6、8、17和19)的片段、類似物或衍生物可具有保守或非保守氨基酸置換。置換的氨基酸殘基可由或可不由遺傳密碼編碼，或者置換可為一個或多個置換的氨基酸殘基含取代基的置換、其中多肽與化合物(例如聚乙二醇)融合以增加多肽半衰期的置換，或其中另外的氨基酸與多肽(如信號肽或序列如用于純化多肽或前體蛋白的聚組氨酸標記)融合的置換。這種片段、類似物或衍生物實際上屬于本發(fā)明的范圍。
多核苷酸序列的“保守”殘基是在要對比的兩個或更多個相關(guān)序列的相同位置未發(fā)生改變的殘基。相對保守的殘基是在更多相關(guān)的序列中與出現(xiàn)在序列中其它位置的殘基相比保守的殘基。
相關(guān)的多核苷酸是共有顯著部分的相同殘基的多核苷酸。
不同的多核苷酸相互“對應(yīng)”，假設(shè)一個最終得自另一個的話。例如，mRNA對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄其的基因。cDNA對應(yīng)于產(chǎn)生其的RNA，例如通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或通過基于RNA序列信息的DNA化學(xué)合成產(chǎn)生。cDNA還對應(yīng)于編碼RNA的基因。如果多核苷酸具有相似的功能，例如在要比較的不同物種、菌株或變體中編碼相關(guān)多肽，則多核苷酸也相互“對應(yīng)”。
DNA、RNA或多核苷酸的“類似物”是指在形式和/或功能(例如參與和互補多核苷酸序列上的堿基對序列特異性氫鍵鍵合的能力)上類似于天然多核苷酸、但與DNA或RNA在例如具有不常見或非天然堿基或改變的骨架方面不同的分子。參見例如Uhlmann et al.，Chemical Reviews 90，543-584，(1990)。
術(shù)語“天然的”在應(yīng)用于目標對象時，是指目標對象可天然存在的事實。例如，存在于生物(包括細菌)中、可分離自天然來源并未經(jīng)實驗室人員故意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。本文使用的術(shù)語“天然的”用于指已知的LXRα，也稱為“野生型”LXRα。此術(shù)語的這種用法不應(yīng)被解釋為指本文描述的LXRα變體是非天然的。
“編碼序列”或“編碼”表達產(chǎn)物(例如RNA、多肽、蛋白或酶)的序列為表達時導(dǎo)致產(chǎn)生該RNA、多肽、蛋白或酶的核苷酸序列，即可編碼多肽或蛋白(例如酶)的氨基酸序列的核苷酸序列。
術(shù)語“密碼簡并”是指遺傳密碼的分散，其允許改變多核苷酸序列，但不影響編碼多肽的氨基酸序列。因此，本發(fā)明涉及編碼全部或顯著部分的氨基酸序列的任何核酸片段或其互補物，該氨基酸序列編碼SEQ ID NO4、6和8提出的LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-蛋白。技術(shù)人員非常了解特定宿主細胞表現(xiàn)的使用核苷酸密碼子指定給定氨基酸的“密碼子偏倚”。因此，當在宿主細胞中合成表達改進的基因時，期望設(shè)計該基因，使得其密碼子選擇的頻率接近宿主細胞優(yōu)選密碼子選擇的頻率。
術(shù)語“編碼”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列在生物過程中用作其它聚合物和大分子的合成模板的固有特性，該聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列，以及由此形成的生物特性。因此，如果對應(yīng)于該基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白，則該基因編碼該蛋白。其核苷酸序列與mRNA序列相同的編碼鏈(通常在序列表中提供)和用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈，都可稱作編碼蛋白或該基因或cDNA的其它產(chǎn)物。
本發(fā)明的多核苷酸可為RNA形式或DNA形式，所述DNA包括cDNA和合成DNA。DNA可為單鏈或雙鏈。如果其為單鏈，則其可為編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼序列可與SEQ ID NO3、5、7、16、18或其片段中任一個的編碼序列相同，或可為由于遺傳密碼的簡并性或冗余性而與參比編碼序列(例如SEQ ID NO3、5、7、16、18或其片段之一)編碼相同多肽的不同編碼序列。
本發(fā)明包括本文描述的上文所述多核苷酸的變體，其編碼由SEQID NO4、6、8、17或19的推斷氨基酸序列所表征的多核苷酸的片段、類似物和衍生物。多核苷酸變體可為多核苷酸的天然等位基因變體，或為多核苷酸的非天然變體。
本發(fā)明的多核苷酸的編碼序列可為由SEQ ID NO4、6、8、17或19的DNA序列所表征的編碼序列的天然等位基因變體。
編碼成熟多肽即LXRα的多核苷酸可僅含成熟多肽的編碼序列，或者可含成熟多肽的編碼序列和其它序列，例如基因控制序列、調(diào)節(jié)序列或分泌序列。
因此，本發(fā)明包括多核苷酸，使得成熟多肽的編碼序列按照相同讀框有效連接至有助于表達和從宿主細胞分泌多肽的多核苷酸序列(例如信號肽)。多核苷酸還可編碼前體蛋白。
本發(fā)明多核苷酸還可具有編碼序列，其按照讀誆融合至標記序列，例如在基因的3′或5′端以例如允許純化多肽的六組氨酸標記(Qiagen Inc.)。
“合成基因”可由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法化學(xué)合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元裝配。連接并退火這些結(jié)構(gòu)單元，形成基因節(jié)段，然后酶促組裝這些節(jié)段，以構(gòu)建完整基因?！盎瘜W(xué)合成的”在涉及DNA序列時指體外組裝組成核苷酸?？墒褂帽娝苤姆椒ㄍ瓿蒁NA的人工化學(xué)合成，或者可使用眾多市售機器中的一種進行自動化化學(xué)合成。因此，可根據(jù)反映宿主細胞密碼子偏倚的優(yōu)化核苷酸序列設(shè)計出最優(yōu)基因表達的基因。如果密碼子選擇偏向于宿主喜歡的密碼子，則技術(shù)人員了解基因表達成功的可能性。優(yōu)選密碼子的確定可基于考察獲得序列信息的宿主細胞來源的基因。
術(shù)語“基因”指表達特定蛋白的核酸片段，包括在編碼序列之前(5′非編碼序列)和之后(3′非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉敝概c其調(diào)節(jié)序列一起天然存在的基因?！扒逗匣颉被颉扒逗蠘?gòu)建物”指非天然基因的任何基因或構(gòu)建物，其含有天然不一起存在的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因或嵌合構(gòu)建物可包含得自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者得自相同來源但以不同于天然存在方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！皟?nèi)源基因”指在生物體基因組中其天然位置的天然基因?！巴庠础被蛑敢话悴淮嬖谟谒拗魃镏?、但通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物中的基因。外源基因可包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組中的基因。
“靶基因”、“靶基因序列”、“靶DNA序列”或“靶序列”指基因、其RNA轉(zhuǎn)錄物或其蛋白產(chǎn)物受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因。靶序列可包括完整基因、外顯子、內(nèi)含子、調(diào)節(jié)序列或基因之間的任何區(qū)域。靶基因可包含受試者基因組DNA中的一部分特定基因或基因座。本文使用的“靶基因”指參與LXR反應(yīng)途徑的差異性表達基因?！安町愋员磉_”指基因的時間和/或組織表達模式中的定量和定性差異。LXR靶基因的實例是SREBP-1c(甾醇調(diào)節(jié)結(jié)合元件1c)、FAS、CYP7A1(膽固醇7-α羥化酶)、ApoE、CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4和PLTP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)(Edwards et al.Vasc.Pharmaco1.38，(2002)249-256)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、當中或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，其影響例如所連編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工、RNA穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)節(jié)序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識別序列。
術(shù)語“基因控制序列”指啟動基因轉(zhuǎn)錄所需的DNA序列加上調(diào)節(jié)啟動發(fā)生速率所需的DNA序列。因此，基因控制序列可由啟動子(通常轉(zhuǎn)錄因子和聚合酶組裝的位置)加上結(jié)合基因調(diào)節(jié)蛋白來控制啟動子上這些組裝過程速率的全部調(diào)節(jié)序列組成。例如，適于原核生物的控制序列可包括啟動子、任選的操縱基因序列以及核糖體結(jié)合位點。真核細胞已知利用啟動子、增強子和/或聚腺苷酸化信號。
術(shù)語“啟動子”指能夠控制編碼序列或功能RNA表達的核苷酸序列。一般來說，編碼序列位于啟動子序列的3′。啟動子序列由鄰近的和更遠的上游元件組成，后一元件經(jīng)常被稱為增強子。因此，“增強子”是可刺激啟動子活性的核苷酸序列，其可為啟動子的先天性元件，或者可為插入以增強啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可全部來源于天然基因，或可由來源于天然存在的不同啟動子的不同元件組成，甚至可包含合成核苷酸節(jié)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，不同啟動子可控制基因在不同組織或細胞類型中表達，或在不同發(fā)育階段或響應(yīng)不同環(huán)境條件而表達。
術(shù)語“3′非編碼序列”指位于編碼序列下游的核苷酸序列，包括聚腺苷酸化識別序列和其它能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號的編碼序列。聚腺苷酸化信號通常其特征為將聚腺苷酸段加入到mRNA前體的3′末端的作用。
術(shù)語“翻譯前導(dǎo)序列”指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA中翻譯起始序列的上游。翻譯前導(dǎo)序列可對初級轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率起作用。
術(shù)語“有效連接”指兩個或更多個核酸片段結(jié)合在單個核酸片段上，使得一個的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即編碼序列處于啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下)時，啟動子和編碼序列有效連接。編碼序列可以有義或反義方向與調(diào)節(jié)序列有效連接。
術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”指具有特定生物特性的氨基酸片段。該術(shù)語包含所有已知的結(jié)構(gòu)和線性生物基序。這種基序的實例包括但不限于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、亮氨酸拉鏈、糖基化位點、泛素化位點、α螺旋和β折疊、引導(dǎo)蛋白分泌的信號肽、翻譯后修飾位點、酶活性位點、底物結(jié)合位點和酶切割位點。
“DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指DNA結(jié)合蛋白與脫氧核糖核苷酸鏈特異性相互作用的任何部分。序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合特異性序列或相互之間顯示高度序列一致性的特異性序列家族。
術(shù)語“LBD”或“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指核受體的結(jié)合配體(例如類固醇激素)的蛋白結(jié)構(gòu)域，該核受體例如類固醇超家族受體或本文討論的其它合適核受體。
術(shù)語“報告基因”指其編碼產(chǎn)物的表達可通過物理、免疫學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)或生物學(xué)實驗檢測和/或計量的任何基因。報告基因產(chǎn)物例如可具有一種以下特征(不是限制性)特異性核酸芯片雜交模式、熒光(例如綠色熒光蛋白)、酶活性、毒性或特異性結(jié)合第二種標記或未標記分子的能力。
術(shù)語“RNA轉(zhuǎn)錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄形成的產(chǎn)物。當RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的互補拷貝時，其被稱為初級轉(zhuǎn)錄物，或者其可為來源于初級轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，被稱為成熟RNA?！靶攀筊NA(mRNA)”指無內(nèi)含子的RNA，可被細胞翻譯成多肽?！癱DNA”指與mRNA模板互補并來源于mRNA模板的DNA。cDNA可為單鏈形式，或可使用例如DNA聚合酶1的Klenow片段轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。
與部分RNA“互補”的序列指互補性足以能夠和RNA雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的序列；因此，在雙鏈反義核酸的情況下，可測試雙鏈DNA的單鏈，或者可測定三鏈體形成。雜交能力取決于互補性程度和反義核酸長度。反義RNA的互補性可在特異性核苷酸序列的任何部分中，即在5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列中。一般來說，雜交核酸越長，其可包含越多的RNA錯配堿基并仍形成穩(wěn)定雙鏈體(或三鏈體，視情況而定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用標準方法測定雜交復(fù)合物的解鏈溫度，來確定容許的錯配程度。
“功能RNA”指有義RNA、反義RNA、核酶RNA或其它不被翻譯但仍對細胞進程有影響的RNA。
具體多核苷酸的“反義”拷貝指能夠與多核苷酸氫鍵鍵合并因此能夠調(diào)節(jié)多核苷酸表達的互補序列。這些“反義”拷貝為DNA、RNA或其類似物，包括如上所述的具有改變骨架的類似物。結(jié)合反義拷貝的多核苷酸可為單鏈形式或雙鏈形式。以“反義方向”連接至啟動子的DNA序列可連接至啟動子，使得產(chǎn)生與靶基因的編碼mRNA互補的RNA分子。
反義多核苷酸可包含至少一種選自以下的修飾糖部分包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在一個實施方案中，反義寡核苷酸可包含至少一種選自以下的修飾磷酸酯骨架硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸烷基酯三酯(alkyl phosphotriester)及甲縮醛(formacetal)或其類似物。
術(shù)語“有義”指和編碼mRNA核酸序列方向相同的核酸序列。連接以“有義方向”連接啟動子的DNA序列，使得含與mRNA相同序列的RNA分子被轉(zhuǎn)錄。但是，產(chǎn)生的RNA分子不需要被轉(zhuǎn)錄為功能蛋白。
“有義”鏈和“反義”鏈當在相同上下文中使用時，指相互互補的單鏈多核苷酸。它們可為雙鏈多核苷酸的對立鏈，或者可按照公認的堿基配對規(guī)則由一條鏈預(yù)測另一條鏈。除非另有說明或暗示，否則分配一條鏈或另一條鏈為“有義”或“反義”是任意的。
術(shù)語“多核苷酸編碼多肽”包括可僅含編碼序列的多核苷酸，以及可含另外的編碼或非編碼序列的多核苷酸。
術(shù)語“siRNA”或“RNAi”指小干擾RNA和其起作用的過程。siRNA能夠引起RNA干擾，并可引起細胞(如哺乳動物細胞(包括人細胞))和機體(如哺乳動物機體(包括人))中特定基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。RNA干擾現(xiàn)象描述和討論于Bass，Nature，411，428-29，(2001)；Elbahiret al.，Nature，411，494-98，(2001)；和Fire et al.，Nature，391，806-11，(1998)，其中還討論了制備干擾RNA的方法?；诒疚墓_序列的siRNA可利用本領(lǐng)域已知的方法制備，包括使用互補DNA鏈或合成方法。示例性的siRNA可具有最多達29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bp或在此附近或在此之間的任何整數(shù)。
本文使用的術(shù)語“表達”指來源于本發(fā)明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達還可以指mRNA翻譯成多肽?！胺戳x抑制”指生產(chǎn)能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄物。
術(shù)語“過表達”指在轉(zhuǎn)基因生物中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物超出了在正常或非轉(zhuǎn)化生物中的生產(chǎn)水平?！肮惨种啤敝干a(chǎn)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物能夠抑制相同或基本相似的外源或內(nèi)源基因的表達(美國專利No.5,231,020，通過引用結(jié)合到本文中)。
術(shù)語“改變的水平”指以不同于正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物的量或比例在轉(zhuǎn)化生物中生產(chǎn)基因產(chǎn)物。本發(fā)明多肽的過表達可通過以下步驟實現(xiàn)首先構(gòu)建其中編碼區(qū)有效連接至啟動子的嵌合基因或嵌合構(gòu)建物，所述啟動子能夠控制基因或構(gòu)建物在目的組織中于需要的發(fā)育階段表達。為方便起見，嵌合基因或嵌合構(gòu)建物可含有來源于相同基因的啟動子序列和翻譯前導(dǎo)序列。還可提供編碼轉(zhuǎn)錄終止信號的3′非編碼序列。所述嵌合基因或嵌合構(gòu)建物還可含有一個或多個內(nèi)含子，以便于基因表達。然后可構(gòu)建含所述嵌合基因或嵌合構(gòu)建物的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體的選擇取決于用于轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法。技術(shù)人員非常了解必須存在于質(zhì)粒載體上以便成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含嵌合基因或嵌合構(gòu)建物的宿主細胞的遺傳元件。技術(shù)人員還認識到不同的獨立轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生不同的表達水平和模式(Jones et al.，1985，EMBO J.42411-2418；De Almeida et al.，1989，Mol.Gen.Genetics 21878-86)，因此，為了獲得表現(xiàn)出所需表達水平和模式的譜系，必須篩選多個事件。這種篩選可利用DNA的Southern分析、mRNA表達的Northern分析、蛋白質(zhì)表達的Western分析或表型分析實現(xiàn)。
術(shù)語“盒”或“表達盒”指可在限定的限制位點插入到載體中的DNA編碼序列或編碼表達產(chǎn)物的DNA節(jié)段。盒限制位點設(shè)計用于確保盒以正確的讀框插入。一般來說，外源DNA插入在載體DNA的一個或多個限制位點上，然后連同可傳遞載體DNA一起由載體攜帶進入宿主細胞。具有插入或添加的DNA的DNA節(jié)段或序列，如表達載體，也可以稱為“DNA構(gòu)建物”。
術(shù)語“表達系統(tǒng)”指處于合適條件下的宿主細胞和相容載體，例如適于由載體攜帶并導(dǎo)入宿主細胞的外源DNA編碼的蛋白表達的條件。常見的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌宿主細胞和質(zhì)粒載體、昆蟲宿主細胞和桿狀病毒載體，以及哺乳動物宿主細胞和載體。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指外源多核苷酸插入到宿主細胞中，與使用的插入方法或插入的多核苷酸的分子形式無關(guān)。其包括插入的多核苷酸本身和插入的組成外源多核苷酸的載體或質(zhì)粒。外源多核苷酸可由細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯，并保持為非整合載體，如質(zhì)粒，或可穩(wěn)定整合入宿主基因組。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”指任何將核酸片段插入到宿主原核細胞中的已知方法。術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”指任何將核酸片段插入到宿主真核細胞中的已知方法。這種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞包括使插入的DNA能夠在宿主細胞中復(fù)制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞。其還包括在有限的時間段內(nèi)表達插入DNA或RNA的瞬時表達細胞。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法取決于要轉(zhuǎn)化的宿主細胞。其可包括將核酸片段封裝入病毒中，以及直接攝入核酸片段，例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染或微注射。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染可使插入的DNA摻入到宿主細胞基因組中，或?qū)⒉迦氲腄NA以質(zhì)粒形式保持在宿主細胞中。轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括但不限于脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、病毒感染和磷酸鈣介導(dǎo)的直接攝取。轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域是已知的，包括磷酸鈣DNA共沉淀(Methods in Molecular Biology，Vol.7，Gene Transfer and Expression Protocols，Ed.E.J.Murray，Humana Press(1991))、DEAE-葡聚糖、電穿孔、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和鎢顆粒推動的微粒轟擊(Johnston，Nature 346776-777(1990))。磷酸鍶DNA共沉淀(Brash et al.，Molec.Cell.Biol.72031-2034(1987))是替代性轉(zhuǎn)染方法。
術(shù)語“細胞”、“宿主細胞”或“重組宿主細胞”在本文可互換使用。要理解地是，這種術(shù)語不僅指特定的目標細胞，而且指這種細胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境的影響，某些修飾可在后代出現(xiàn)，所以這種后代可能與親代細胞不完全相同，但其仍包括在本文使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。術(shù)語“重組細胞”指含異源核酸的細胞，術(shù)語“天然細胞”指不含人工導(dǎo)入的異源核酸的細胞。
細胞可為原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括各種大腸桿菌菌株。典型的真核宿主細胞是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞(HEK 293細胞)。導(dǎo)入的DNA通常為含DNA插入部分的載體形式。導(dǎo)入的DNA序列可來自和宿主細胞相同的物種或和宿主細胞不同的物種，或者其可為含某些外源DNA和某些同源DNA的雜合DNA序列。進一步要理解地是，這些術(shù)語不僅指特定的目標細胞，而且指這種細胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境的影響，某些修飾可在后代出現(xiàn)，所以這種后代可能實際上與親代細胞不完全相同，但其仍包含在本文使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。
術(shù)語“克隆”指來源于單個細胞或有絲分裂共同祖先的細胞群?！凹毎怠敝改軌蛟隗w外穩(wěn)定生長數(shù)代的初級細胞的克隆。
術(shù)語“細胞生長”指細胞群大小的增加。
術(shù)語“細胞分裂”指有絲分裂，即細胞再生的過程。
術(shù)語“增殖”指細胞的生長和分裂?！盎钚栽鲋场敝富钴S生長和分裂的細胞。
術(shù)語“分化”指具有與原型組織或細胞不同的特征或功能。因此，“分化”是分化的過程或作用。
術(shù)語“基因誘導(dǎo)型系統(tǒng)”指使用配體調(diào)節(jié)基因表達。已經(jīng)開發(fā)了幾種利用小分子誘導(dǎo)基因表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)(綜述于Clackson，Curr.Opin.Chem.Biol.，1，210-218，(1997)；Lewandoski，Nat Rev Genet.2，743-755，(2001))?；蛘T導(dǎo)型系統(tǒng)是一種分子工具，當系統(tǒng)未激活時允許靶基因低至不可檢測的基礎(chǔ)表達，當系統(tǒng)激活時增加靶基因的表達水平。
術(shù)語“抑制細胞增殖”指減慢和/或防止細胞的生長和分裂。可根據(jù)在特定細胞周期階段的停滯進一步將細胞分為G1(間期1)、S期(DNA合成)、G2(間期2)或M期(有絲分裂)。
術(shù)語“優(yōu)選抑制細胞增殖”指和正常細胞相比減慢和/或防止細胞的生長和分裂。
術(shù)語“凋亡”指當年齡或細胞健康狀況和環(huán)境發(fā)出指示時，由正常功能性人和動物細胞中的細胞核發(fā)出信號的程序性細胞死亡。“凋亡”是垂死細胞的主動過程，需要代謝活性，常以將DNA切割成片段而在凝膠上產(chǎn)生所謂的梯狀模式為特征。凋亡死亡的細胞通常不激發(fā)與壞死相關(guān)的炎癥反應(yīng)，但原因不清楚。但是，癌細胞不能經(jīng)歷或縮減了正常細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)或凋亡驅(qū)動的天然細胞死亡進程。在形態(tài)學(xué)上，凋亡的特征在于不與鄰近細胞接觸、胞質(zhì)濃縮、內(nèi)切核酸酶活性相關(guān)的染色質(zhì)凝聚和核固縮，以及核分節(jié)等。
術(shù)語“多肽”指氨基酸聚合物，和聚合物長度無關(guān)；因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白”包括在多肽定義中，在本文可互換使用。該術(shù)語指天然或合成的氨基酸單體(殘基)聚合物，與長度無關(guān)，其中此處的氨基酸單體包括能夠參與肽鍵的天然氨基酸、天然氨基酸結(jié)構(gòu)變體或合成非天然類似物。該術(shù)語也沒有指定或排除本發(fā)明多肽的化學(xué)或表達后修飾，但根據(jù)具體實施方案可包括或排除這些多肽的化學(xué)或表達后修飾。因此，例如，包括共價連接糖基基團、?；鶊F、磷酸基團、脂質(zhì)基團等的多肽修飾清楚地包含在術(shù)語多肽中。而且，具有這些修飾的多肽可作為單個類別包含或排除于本發(fā)明。天然或其它化學(xué)修飾，例如列于上文的實例，可出現(xiàn)在多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基端。要認識到，相同類型的修飾可以相同或不同程度存在于給定多肽中的數(shù)個位點。另外，給定多肽可包含多種類型的修飾。多肽可為例如由于泛素化所致的分支形式，可為有或沒有分支的環(huán)狀。修飾包括乙?；?、?；DP-核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、γ-羧化、糖基化、形成GPI錨定、羥化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)氨基酸加入到蛋白中(例如精氨?；?以及泛素化(參見例如proteins-structure and molecular properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；posttranslationalcovalent modification of proteins，b.c.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1-12頁，1983；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182626-646，1990；Rattan et al.，Ann.NY Acad.Sci.66348-62，1992)。該定義還包括含一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸、僅天然存在于不相關(guān)生物體系中的氨基酸或哺乳動物系統(tǒng)的修飾氨基酸)、具有取代鍵以及本領(lǐng)域已知其它修飾的天然和非天然多肽。術(shù)語“多肽”還可和術(shù)語“蛋白”或“肽”互換使用。
術(shù)語“肽”指兩個或更多個氨基酸的任何聚合物，其中每個氨基酸經(jīng)肽鍵(-CONH-)連接至一個或兩個其它氨基酸，肽鍵在相鄰氨基酸的NH2和COOH基團之間形成。氨基酸優(yōu)選為天然氨基酸，具體地說為L-對映體形式的α-氨基酸。但是，其它氨基酸、對映體形式和氨基酸衍生物可包括在肽中。肽包括“多肽”，其在水解作用下產(chǎn)生兩個以上的氨基酸。多肽可包括蛋白，其通常含50個或更多氨基酸。本文的術(shù)語“寡肽”表示具有25個或更少單體亞單位的蛋白、多肽或肽。
“變體”指不同于參比多核苷酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸變體的核苷酸序列不同于參比多核苷酸。變體核苷酸序列的變化可改變或不改變參比多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下文所述，核苷酸變化可在參比序列編碼的多肽中產(chǎn)生氨基酸置換、添加、缺失、融合和截短。
術(shù)語“變體”指分別不同于參比多肽的一個或多個多肽。一般來說，氨基酸序列和參比多肽不同的多肽和參比多肽之間的差異是有限的，以使參比和變體的氨基酸序列整體上緊密相似，在某些區(qū)域可能相同。變體和參比多肽的氨基酸序列可相差一個或多個可以任何組合存在的置換、缺失、添加、融合或截短。置換或插入的氨基酸殘基可由或可不由遺傳密碼編碼。典型的保守置換包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe和Tyr。另外，變體可為本發(fā)明多肽的片段，其與參比多肽序列的差異在于比參比序列短(例如末端或中間缺失)。本發(fā)明多肽的變體還包括基本保留與所述多肽相同的生物學(xué)功能和活性的多肽，例如可通過切割前體部分產(chǎn)生活性成熟多肽而活化的前體蛋白。而且，變體可為(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)置換的變體，這種置換的氨基酸殘基可由或可不由遺傳密碼編碼，或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基含取代基的變體，或(iii)其中成熟多肽與另一種化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的變體，或(iv)其中另外的氨基酸融合至成熟多肽(例如前導(dǎo)序列或分泌序列，或用于純化成熟多肽的序列，或前體蛋白序列)的變體。多肽變體還可為天然變體，例如天然等位基因變體，或者其可為已知非天然存在的變體。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可通過誘變技術(shù)或直接合成制備。變體還包括具有一種或多種翻譯后修飾(例如糖基化、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化等)的多肽。實施方案包括甲基化N-端氨基酸、磷酸化絲氨酸和蘇氨酸以及修飾C-端甘氨酸。在這點上，多肽變體包括由于氨基酸置換、缺失或添加而與前述多肽不同的變體。置換、缺失或添加可涉及一個或多個氨基酸。氨基酸序列的改變可為保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。根據(jù)本文教導(dǎo)和本領(lǐng)域知識，以上定義的所有這些變體都被認為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
本文描述的被稱為LXRα-64(SEQ ID NO4)的LXRα變體由于含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與先前已知的LXRα同源；但是，由于其含有64個新氨基酸，其與已知的LXRα在序列的中間部分不同。由于其氨基酸序列的部分一致性和部分趨異性，變體和已知同源物可具有某些共同的功能，但在其它功能上可能不同。例如，已知野生型LXRα為細胞氧甾醇的感應(yīng)器，當其被激動劑活化時，控制甾醇和脂肪酸代謝/穩(wěn)態(tài)的基因的表達增加，而LXRα-L64、LXRα-42e+和LXRα-42e-起野生型LXRα的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物的作用。
術(shù)語“顯性負調(diào)控多肽”指蛋白的失活變體，其通過與細胞機器相互作用而取代了與細胞機器相互作用的活性蛋白或與活性蛋白競爭，由此減弱了活性蛋白的作用。例如，結(jié)合配體但不響應(yīng)配體結(jié)合而傳送信號的顯性負調(diào)控受體可降低配體表達的生物學(xué)作用。同樣，顯性負調(diào)控的催化失活激酶一般與靶蛋白相互作用，但不磷酸化靶蛋白，其可降低響應(yīng)細胞信號的靶蛋白磷酸化。類似地，顯性負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因控制區(qū)中的啟動子位點，但不增加基因轉(zhuǎn)錄，其可通過占據(jù)啟動子結(jié)合位點但不增加轉(zhuǎn)錄而降低一般正常轉(zhuǎn)錄因子的作用。
術(shù)語“剪接變體”指由RNA分子產(chǎn)生的cDNA分子，RNA分子最初由相同的基因組DNA序列轉(zhuǎn)錄，但其經(jīng)歷了可變RNA剪接。當初級RNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)歷剪接時發(fā)生可變RNA剪接，一般用于去除內(nèi)含子，導(dǎo)致產(chǎn)生一個以上的mRNA分子，它們每個都可編碼不同的氨基酸序列。術(shù)語剪接變體還可指以上cDNA分子編碼的蛋白。剪接變體在序列上可部分地與已知同源基因產(chǎn)物相同。“多個剪接變體”指具有不相同的一級氨基酸序列但共有由至少一個相同外顯子編碼的氨基酸序列的多個蛋白。
本文使用的短語“可變剪接”及其語言學(xué)等意詞包括所有類型的RNA加工，其導(dǎo)致單個基因表達多個蛋白同種型；因此，短語“可變剪接”及其語言學(xué)等意詞包括由給定基因轉(zhuǎn)錄但加工過的mRNA，其共同地編碼多個蛋白同種型。例如，僅作為說明，剪接變體可包括外顯子插入、外顯子延伸、外顯子截短、外顯子缺失、在5′非翻譯區(qū)(“5′UT”)中的變化和在3′非翻譯區(qū)(“3′UT”)中的變化。這種3′變化包括例如RNA轉(zhuǎn)錄物切割位點中的差異和聚腺苷酸添加位點中的差異(例如Gautheret et al.，Genome Res.8524-530(1998))。
術(shù)語“分離的”指將材料由其原始或天然環(huán)境(例如其天然存在的自然環(huán)境)中取出。因此，存在于活體動物中的天然多核苷酸或多肽不是分離的，但通過人為干預(yù)由天然系統(tǒng)中某些或全部共存材料中分離的相同多核苷酸或多肽是分離的。例如，“分離的核酸片段”是RNA或DNA聚合物，其為單鏈或雙鏈，任選含合成的、非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離核酸片段可由一個或多個cDNA、基因組DNA或合成DNA節(jié)段組成。這種多核苷酸可為載體的一部分，在異源位點整合入宿主細胞染色體，和/或這種多核苷酸或多肽可為組合物的一部分，由于這種載體或組合物不是其天然存在環(huán)境的一部分，所以仍然是分離的。
術(shù)語“純化的”不要求絕對純度；相反，其意為相對的定義。本發(fā)明明確預(yù)期原料或天然材料純化至少一個數(shù)量級，優(yōu)選2或3個數(shù)量級，更優(yōu)選4或5個數(shù)量級。同樣地，術(shù)語“基本純化的”指已通過人為干預(yù)由其天然存在的直接化學(xué)環(huán)境中分離或除去的物質(zhì)?；炯兓牡亩嚯幕蚝怂峥赏ㄟ^本領(lǐng)域周知的多種技術(shù)和方法中的任一種獲得或產(chǎn)生。
術(shù)語“純化的”在本文中進一步用于描述已由其它化合物(包括但不限于多肽、多核苷酸、碳水化合物或脂質(zhì))中分離出來的本發(fā)明多肽或多核苷酸。術(shù)語“純化的”可用于表示由寡聚形式如同二聚體、雜二聚體或三聚體中分離本發(fā)明的單體多肽。術(shù)語“純化的”還可用于表示由線性多核苷酸中分離共價閉合(即環(huán)狀)的多核苷酸?；炯兓亩嚯幕蚨嗪塑账嵬ǔ７謩e包含多肽或多核苷酸樣品的約50％(重量/重量)，優(yōu)選60-90％(重量/重量)，更通常約95％純，優(yōu)選超過約99％純，但可指定為50和100之間的任何整數(shù)的百分率。多肽和多核苷酸純度或均一性由本領(lǐng)域眾所周知的多種方法顯示，例如樣品的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著在染色凝膠后目測單一條帶。對于某些目的，可通過使用HPLC或本領(lǐng)域已知的其它方法提供較高分辨率。作為替代的實施方案，本發(fā)明多肽和多核苷酸的純化可表示為相對于異源多肽和多核苷酸(DNA、RNA或二者)的“至少”某個百分率純度。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽和多核苷酸相對于異源多肽和多核苷酸分別為至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％純。在另一個實施方案中，相對于異源多肽和多核苷酸，多肽和多核苷酸的純度分別為90％和100％之間達到千分之一位的任何數(shù)值(例如多肽和多核苷酸至少99.995％純)，或者為相對于所有化合物和分子(載體中存在的化合物和分子除外)的重量/重量比率。每個代表純度百分率的達到千分之一位的數(shù)值都可作為單個純度類別要求保護。
當?shù)鞍滓蕴烊徊淮嬖诘募兌?其中純度可相對于存在的其它序列蛋白、相對于存在的非蛋白化合物如核酸、脂質(zhì)或其它生物細胞組分進行判斷)存在時，或者以天然不存在的組合物(例如在天然不表達該蛋白的宿主細胞中)存在時，可認為蛋白是“分離的”。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離形式提供，并優(yōu)選純化至均一。
術(shù)語“成熟”蛋白指翻譯后加工過的多肽；即已經(jīng)由其中去除了初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽或原肽的多肽?！扒绑w”蛋白指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物；即仍存在前肽和原肽。前肽和原肽包括但不限于胞內(nèi)定位信號。
術(shù)語“抗體”指多肽，其至少一部分由至少一個免疫球蛋白基因或其片段編碼，其可特異性結(jié)合目的靶分子。該術(shù)語包括天然形式以及片段和衍生物。
片段可包括各種蛋白酶消化產(chǎn)生的片段、化學(xué)切割和/或化學(xué)解離產(chǎn)生的片段以及重組產(chǎn)生的片段，只要片段仍能夠特異性結(jié)合靶分子。這些片段包括Fab、Fab′、Fv、F(ab)′2和單鏈Fv(scFv)片段。屬于該術(shù)語范圍的衍生物包括序列已經(jīng)修飾但仍能夠特異性結(jié)合靶分子的抗體(或其片段)，包括種間嵌合和人源化抗體、抗體融合物、異數(shù)(heteromeric)抗體復(fù)合物和抗體融合物，例如雙功能抗體(雙特異性抗體)、單鏈雙功能抗體和胞內(nèi)抗體(參見例如Marasco(ed.)，Intracellular AntibodiesResearch and Disease Applications，Springer-Verlag New York，Inc.(1998)(ISBN3540641513)，其公開內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中)。
術(shù)語“免疫反應(yīng)性”指與抗體“免疫反應(yīng)”的多肽，即由于抗體識別多肽中包含的特異性表位而與抗體結(jié)合的多肽。免疫反應(yīng)性可通過抗體結(jié)合測定，更具體地說通過抗體結(jié)合的動力學(xué)和/或使用已知多肽競爭劑競爭結(jié)合而測定，其中所述已知多肽含所述抗體針對的表位。測定多肽是否與抗體免疫反應(yīng)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。“免疫反應(yīng)性”多肽也可以是“免疫原性”的。
抗體可通過任何已知技術(shù)產(chǎn)生，包括由天然B淋巴細胞的細胞培養(yǎng)物收集、由雜交瘤、重組表達系統(tǒng)和噬菌體的培養(yǎng)物展示收集。
能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體)特異性相互作用的分子是“抗原性”的?？乖远嚯暮辽偌s5個、優(yōu)選至少約10個氨基酸。分子的抗原部分可為對抗體或T細胞受體識別免疫顯性的部分，或者其可為用于產(chǎn)生該分子抗體的部分，抗體通過將抗原部分綴合至載體分子進行免疫產(chǎn)生?？乖苑肿幼陨聿恍枰哂忻庖咴?，即能夠在沒有載體的情況下激發(fā)免疫應(yīng)答。和抗體接觸的抗原部分被命名為“表位”。
術(shù)語“分子結(jié)合配偶體”以及等同的“特異性結(jié)合配偶體”指一對分子，通常為一對生物分子，其具有特異結(jié)合性。非限制性實例是受體和配體、抗體和抗原，以及生物素對抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、NeutrAvidinTM和CaptAvidinTM中的任一種。
術(shù)語“結(jié)合配偶體”或“相互作用蛋白”指能夠特異性識別特定分子或分子復(fù)合物或被特定分子或分子復(fù)合物特異性識別的分子或分子復(fù)合物，例如抗原和抗原特異性抗體，或酶及其抑制劑。結(jié)合配偶體可包括例如生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和A蛋白、受體-配體對、蛋白-蛋白相互作用，以及互補多核苷酸鏈。術(shù)語“結(jié)合配偶體”還可以指在細胞中結(jié)合多肽的多肽、脂質(zhì)、小分子或核酸。蛋白和結(jié)合配偶體之間的相互作用的變化自身可表現(xiàn)為相互作用形成可能性增加或降低，或蛋白-結(jié)合配偶體復(fù)合物的濃度增加或降低。例如，LXRα-64或LXRα-42蛋白可與另一種蛋白或多肽結(jié)合，并形成可調(diào)節(jié)LXR或RXR活性的復(fù)合物。
“特異性結(jié)合”指共存于異質(zhì)(不均一)樣品中的兩個分子類別相比于樣品中的其它分子類別優(yōu)先相互結(jié)合的能力。通常，特異性結(jié)合相互作用與反應(yīng)中的偶然結(jié)合相互作用差別至少為2倍，更通常至少10倍，經(jīng)常至少100倍；當用于檢測分析物時，特異性結(jié)合足以區(qū)分異質(zhì)(不均一)樣品中分析物的存在。
術(shù)語“二聚化”指兩個蛋白多肽通過共價或非共價相互作用結(jié)合的特定多聚分子?！岸刍肿印笨蔀橛蓛蓚€相同(同二聚)或不同(雜二聚)蛋白分子亞單位組成的受體。
術(shù)語“同二聚體”指其中兩個亞單位組分基本相同的二聚化分子，例如RXR和RXR?！巴蹚?fù)合物”指兩個相同受體(例如RXR/RXR)之間的蛋白復(fù)合物?！巴蹚?fù)合物”可包括具有較小微觀不均一性的二聚化蛋白，其有時在生產(chǎn)或加工重組蛋白時產(chǎn)生。術(shù)語“同二聚化”指兩個相同亞單位(例如RXR和RXR)二聚化的過程。
術(shù)語“雜二聚體”指其中兩個亞單位組分不同的二聚化分子，例如RXR和LXR。術(shù)語“雜二聚復(fù)合物”指任一種核受體之間的蛋白復(fù)合物(例如RXR和任一種本發(fā)明變體，或RXR和LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR)。術(shù)語“雜二聚化”指兩個不同亞單位(例如RXR和LXRα-64)二聚化的過程。
術(shù)語“天然雜二聚化”指分子(例如多肽)通常天然與不同分子雜二聚化的過程。例如，與RXR天然雜二聚化的多肽是核受體，其通常與天然RXR如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR雜二聚化。
術(shù)語“LXR效應(yīng)途徑”指本領(lǐng)域已知的參與核受體(例如LXR或RXR)活化或失活的任一種途徑，該途徑至少部分由LXR介導(dǎo)。
術(shù)語“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指將胞外信號傳導(dǎo)通過細胞膜成為胞內(nèi)信號的分子。然后該信號刺激細胞反應(yīng)。參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的多肽分子可為受體和非受體蛋白。
術(shù)語“受體”指胞內(nèi)或細胞表面上的分子結(jié)構(gòu)，其一般特征為選擇性結(jié)合特定物質(zhì)。示例性的受體包括肽激素、神經(jīng)遞質(zhì)、抗原、補體片段和免疫球蛋白的細胞表面受體以及甾體激素的胞質(zhì)受體。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”指增強或抑制生物活性或過程(例如受體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性)的功能特性的能力。這種增強或抑制可隨特異性事件而定，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，和/或可僅在特定細胞類型中表現(xiàn)出來。蛋白“調(diào)節(jié)物”指各種可直接或間接地對蛋白(例如目的受體)活化和/或阻遏施加影響的分子(例如抗體、核酸片段、小分子、肽、寡肽、多肽或蛋白)和/或條件，包括物理結(jié)合蛋白、改變蛋白表達的數(shù)量和質(zhì)量、改變蛋白的任何可測量或可檢測活性、特性或行為，或以任何方式和蛋白或化合物相互作用。
術(shù)語“抑制”指減少、制止、減輕、防止、降低或消除功能或活性(無論是部分還是全部)的作用。例如，抑制基因轉(zhuǎn)錄或表達指這些功能的任何水平下調(diào)，包括完全消除這些功能。術(shù)語“抑制”可用于體外系統(tǒng)和體內(nèi)系統(tǒng)。本文使用的術(shù)語“抑制劑”或“阻遏物”指任何抑制物。
術(shù)語“小分子”指合成或天然的化合物，例如可任選衍化的肽或寡肽、天然產(chǎn)物或任何其它天然或合成來源的低分子量(通常小于約5KD)有機、生物無機或無機化合物。這種小分子可為治療可傳遞物質(zhì)，或者可進一步衍化，以利于傳遞。
術(shù)語“誘導(dǎo)物”指任何誘導(dǎo)、增強、促進或增加特定活性(例如脂質(zhì)代謝或LXR分子表達)的物質(zhì)。
術(shù)語“物質(zhì)”或“測試物”或“測試樣品”指要測試的任何分子或一種以上分子的組合。
本發(fā)明物質(zhì)的實例包括但不限于肽、蛋白、小分子和抗體。如果有需要，上述的核苷酸片段和部分以及反義實施方案也可用做物質(zhì)。物質(zhì)可隨機選擇，或合理地選擇或設(shè)計。不考慮物質(zhì)和靶化合物或位點之間的特異性相互作用而隨機選擇物質(zhì)時，認為物質(zhì)是本文使用的“隨機選擇”的。考慮與物質(zhì)作用相關(guān)的靶化合物或位點和/或構(gòu)象和物質(zhì)之間的相互作用而在非隨機基礎(chǔ)上選擇物質(zhì)時，認為物質(zhì)是本文使用的“合理地選擇和設(shè)計”的。
術(shù)語“生物樣品”廣義地被限定為包括任何細胞、組織、生物液體、器官、多細胞生物等。生物樣品可來源于例如體外的細胞或組織培養(yǎng)物?；蛘撸飿悠房蓙碓从诨铙w生物或單細胞生物群。生物樣品可為活組織，例如肝臟。術(shù)語“生物樣品”還意欲包括分離自受試者的樣品(例如細胞、組織或生物液體)以及存在于受試者中的樣品。即，本發(fā)明的檢測方法可用于在體外以及體內(nèi)檢測生物樣品中的LXR變體mRNA、蛋白、基因組DNA或活性。例如，檢測LXR變體mRNA的體外技術(shù)包括TaqMan分析、RNA雜交和原位雜交。檢測LXRα蛋白的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光。檢測LXR變體基因組DNA的體外技術(shù)包括DNA雜交。
術(shù)語“測試樣品”指來自目的受試者的生物樣品。例如，測試樣品可為細胞樣品或組織樣品。“測試樣品”和“生物樣品”在本文可互換使用。
術(shù)語“體液”指任何體液，包括但不限于血清、血漿、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳、全血、汗液、尿液、腦脊髓液、唾液、痰液、淚液、汗、粘液、組織培養(yǎng)基、組織提取物和細胞提取物。其還可應(yīng)用于體液的級分和稀釋物。體液的來源可為人體、動物體、實驗動物、植物或其它生物。
術(shù)語“治療”和“療法”指任何處理、作用、應(yīng)用、治療等，其中為受試者(包括人類)提供醫(yī)療救助的目的在于直接或間接改善受試者病情，或減慢受試者疾病或病癥的發(fā)展。
而且，術(shù)語“治療”被定義為應(yīng)用或給予受試者或由受試者分離的組織或細胞系(其可能具有疾病、疾病癥狀或疾病誘因)一種物質(zhì)(例如治療劑或治療組合物)，目的是為了治療、治愈、減輕、緩解、改變、補救、改良、改善或影響疾病、疾病癥狀或疾病誘因。本文使用的“治療劑”指有助于治療疾病的任何物質(zhì)或物質(zhì)組合。因此，治療劑包括但不限于小分子、肽、抗體、核酶和反義寡核苷酸。
治療劑或治療組合物還可包括防止和/或減輕特定疾病癥狀的藥學(xué)可接受形式的化合物。例如，治療組合物可為防止和/或減輕脂質(zhì)代謝疾病癥狀的藥物組合物。本發(fā)明設(shè)想以任何合適的形式提供本發(fā)明的治療組合物。治療組合物的形式取決于許多因素，包括給予方式。治療組合物可包含稀釋劑、佐劑和賦形劑以及其它成分。
術(shù)語“治療有效量”指當將化合物或化合物的組合物給予受試者治療疾病時，其量足以對這種疾病的治療有效?！爸委熡行Я俊备鶕?jù)本領(lǐng)域人員已知的參數(shù)變化，例如取決于化合物、疾病、疾病嚴重程度以及要治療的哺乳動物的年齡、體重或性別。
術(shù)語“受試者”指任何哺乳動物，包括人或非人受試者。非人受試者可包括實驗動物、測試動物、農(nóng)業(yè)動物、表演動物或?qū)櫸铩?br> 本發(fā)明通過引用結(jié)合了分子和細胞生物學(xué)領(lǐng)域已知的方法和技術(shù)。這些技術(shù)包括但不限于以下出版物中描述的技術(shù)Old，R.W.&S.B.Primrose，Principles of Gene ManipulationAn Introduction ToGenetic Engineering(3d Ed.1985)Blackwell Scientific Publications，Boston.Studies in Microbiology；V.2409頁(ISBN 0-632-01318-4)，Sambrook，J.et al.eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.1-3卷，(ISBN 0-87969-309-6)；Miller，J.H.&M.P.Calos eds.，Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells(1987)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(ISBN 0-87969-198-0)。本發(fā)明蛋白的編碼DNA可為任何DNA，只要其含有上述本發(fā)明蛋白的編碼核苷酸序列。
核酸分子本發(fā)明涉及編碼三種新型LXRα變體蛋白(即LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-)的分離核酸分子。本發(fā)明還包括與LXRα變體蛋白或其片段具有至少90％序列一致性的核酸分子、LXRα變體的簡并變體、具有保守或中等保守置換的編碼LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-蛋白的變體、交叉雜交核酸(例如在高嚴格雜交條件下雜交)，以及其片段。
本發(fā)明的序列分別示于SEQ ID NO3(LXRα-64的全長核苷酸序列，cDNA)、SEQ ID NO4(LXRα-64的全長氨基酸序列)、SEQ ID NO5(編碼完整LXRα-42e+的核苷酸序列)、SEQ ID NO6(LXRα-42e+的全長氨基酸序列)、SEQ ID NO7(編碼完整LXRα-42e-的核苷酸序列)、SEQ ID NO8(LXRα-42e-的全長氨基酸序列)、SEQ ID NO16(LXRα-64變體獨有的核苷酸序列，其連接野生型LXRα的外顯子6和7，在LXRα-64變體中產(chǎn)生了比野生型LXRα外顯子6大的外顯子6)、SEQID NO17(由SEQ ID NO16編碼的推斷氨基酸序列)、SEQ ID NO18(LXRα-42e獨有的核苷酸序列，其組合野生型LXRα的外顯子8，在LXRα-42e變體中產(chǎn)生了比野生型LXRα外顯子8長的外顯子8)，以及SEQ ID NO19(由SEQ ID NO18編碼的推斷氨基酸序列)。
本發(fā)明的核酸可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)生產(chǎn)。這種反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(美國專利No.4,754,065、4,800,159、4,683,195和4,683,202提供了PCR技術(shù)和方法，這些美國專利通過引用整體結(jié)合到本文中)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-核酸分子是和天然LXRα變體相比可增加生物利用度、穩(wěn)定性、效力或降低毒性的合成核酸或核酸模擬物。這種合成核酸可改變組成核苷酸聚合物的基本A、T、C、G或U堿基或糖，以改變核酸的作用。
本文描述的LXRα變體以及由LXRα變體衍生的核酸片段可用作分離方法、診斷實驗和法醫(yī)方法中的試劑。例如，本文描述的來自LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-并可與其雜交(例如在嚴格雜交條件下)的多核苷酸序列可被檢測性標記并用作分離其它序列的探針。另外，來自LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-的多核苷酸序列可用于設(shè)計在分離、診斷或法醫(yī)方法中使用的PCR引物。
本文描述的LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-核酸分子也可用于克隆對應(yīng)基因組DNA上位于LXRα變體序列上游的序列。這種上游序列能夠調(diào)節(jié)基因表達，并可包含例如啟動子序列、增強子序列或影響轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的其它上游序列。一被鑒別和克隆，這些上游調(diào)節(jié)序列就可用在表達載體中，設(shè)計用于以需要的空間、時間、發(fā)育或定量方式控制插入基因的表達。
使用染色體步查技術(shù)，衍生自本文所述多核苷酸的序列可用于分離對應(yīng)基因的啟動子。染色體步查技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如由BDBiosciences Clontech(Palo Alto，CA)獲取的GenomeWalker試劑盒，該試劑盒可按照生產(chǎn)商的說明使用。
一旦克隆和測序上游基因組序列，就可通過比較本發(fā)明多核苷酸的上游序列和含已知轉(zhuǎn)錄起始位點、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或啟動子序列的數(shù)據(jù)庫，鑒別上游序列中的預(yù)期啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點。
另外，可如下使用啟動子報告基因載體鑒別上游序列中的啟動子當報告基因處于LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-啟動子區(qū)(位于LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-基因的第一個外顯子上游)的調(diào)節(jié)活性多核苷酸片段或變體控制之下時，檢測報告基因的表達?？煽寺∪隠XRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-啟動子序列的合適啟動子報告基因載體包括得自Clontech的pSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer或pEGFP-1啟動子報告基因載體，或得自Promega的pGL2-basic或pGL3-basic無啟動子熒光素酶報告基因載體。簡單地說，這些啟動子報告基因載體每個都包含多個位于報告基因上游的克隆位點，報告基因編碼可容易測定的蛋白，例如分泌性堿性磷酸酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白。將LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-編碼區(qū)上游序列以兩個方向插入報告基因上游的克隆位點，并導(dǎo)入合適的宿主細胞中。測定報告蛋白的水平，并與在克隆位點沒有插入序列的載體所獲得的水平相比較。相比于對照載體，含插入序列的載體的表達水平提高，這表明在插入序列中存在啟動子。在某些情況下，將上游序列克隆入含增加弱啟動子序列轉(zhuǎn)錄水平的增強子的載體中。含插入序列的載體的表達水平顯著高于沒有插入序列的載體所觀測到的水平，這表明在插入的上游序列中存在啟動子序列。上游基因組DNA中的啟動子序列可進一步通過位點定向誘變、接頭分區(qū)分析或本領(lǐng)域人員熟知的其它技術(shù)來確定。
每個LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-基因的啟動子的強度和特異性都可通過在不同類型細胞和組織中有效連接至LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-啟動子的可檢測多核苷酸的表達水平來評價?？蓹z測多核苷酸可為與預(yù)定寡核苷酸探針特異性雜交的多核苷酸，或編碼可檢測蛋白的多核苷酸，包括LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-多肽或其片段或變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知該類型的檢測。其中某些方法在本申請的其它部分進行了更詳細的論述。
位于本發(fā)明多核苷酸上游的啟動子和其它調(diào)節(jié)序列可用于設(shè)計表達載體，其能夠以所需時間、空間、發(fā)育或定量方式控制插入基因表達?？墒褂帽疚乃霰磉_分析的結(jié)果，選擇能夠引導(dǎo)所需時間、空間、發(fā)育和定量模式的啟動子。例如，如果需要在肌肉中提供高表達水平的啟動子，則可在表達載體中使用來源于肌肉中高水平表達mRNA的本發(fā)明多核苷酸上游啟動子序列。
而且，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法，包括在本節(jié)描述的基于雜交或擴增的技術(shù)，使用本發(fā)明的核酸片段分離和/或純化與其類似的核酸。這些方法可用于獲得基因組DNA，其編碼衍生LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-cDNA的mRNA、對應(yīng)于LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-cDNA的mRNA或與LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-cDNA或其片段同源的核酸(例如變體、種同源物或直向同源物)。
或者，本發(fā)明的核酸片段和基因可用作參比，來鑒別表現(xiàn)出這些受體相關(guān)功能減弱的受試者(例如哺乳動物、人、患者)。
載體和宿主細胞本發(fā)明涉及含本發(fā)明多核苷酸的載體、用本發(fā)明載體(例如克隆載體或表達載體)基因工程改造的宿主細胞以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽。例如，可將LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-核酸分子連接至載體。載體可為自主復(fù)制載體或復(fù)制缺陷載體。載體可為用于基因療法的藥學(xué)可接受載體。
本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法在合適的宿主中表達本發(fā)明多肽的編碼多核苷酸，并使用已知重組技術(shù)回收表達產(chǎn)物。還可使用肽合成儀合成本發(fā)明多肽?？捎帽景l(fā)明載體工程改造宿主細胞。宿主生物(重組宿主細胞)可為任何真核細胞或原核細胞或多細胞生物。替代實施方案可使用哺乳動物或人細胞，尤其是胚胎哺乳動物和人細胞。合適的宿主細胞包括但不限于哺乳動物細胞(如人胚腎細胞(HEK 293)、人肝細胞瘤細胞(HepG2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、猴COS-1細胞系、哺乳動物細胞CV-1)、兩棲動物細胞(例如非洲爪蟾卵細胞)、酵母細胞(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris))和昆蟲細胞。而且，可使用各種大腸桿菌菌株(例如DH5α、HB101、MC1061)作為宿主細胞，特別是用于分子生物學(xué)操作。
載體可為克隆載體或表達載體，例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w或任何其它可在宿主細胞中復(fù)制和生存的載體形式。工程宿主細胞可在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基改良得適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增本發(fā)明多核苷酸。培養(yǎng)條件如pH、溫度等，適用于為表達多核苷酸而選擇的宿主細胞，是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。
本文通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標準命名慣例，以小寫字母“p”前加和/或后接大寫字母和/或數(shù)字命名質(zhì)粒。本文的質(zhì)?；蛘呖缮藤?、在不受限的基礎(chǔ)上公開獲得，或者可通過常規(guī)應(yīng)用眾所周知的公開方法由可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建。另外，可按照本發(fā)明使用的許多質(zhì)粒和其它克隆和表達載體是眾所周知的，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可容易地獲得。而且，技術(shù)人員可容易地構(gòu)建任何數(shù)量的適用于本發(fā)明的其它質(zhì)粒。根據(jù)本說明書，技術(shù)人員很容易明白本發(fā)明中的這種質(zhì)粒以及其它載體的特性、構(gòu)建和用途。
可通過本領(lǐng)域已知的各種方法將合適的DNA序列插入載體中。
表達載體中的DNA序列可有效連接至合適的表達控制序列(啟動子)，以引導(dǎo)mRNA合成。這種啟動子包括但不限于SV40、人巨細胞病毒(CMV)啟動子(例如pCMV/myc載體、pcDNA 3.1載體或任何形式的pcDNA系列)、SP6、T7和T3RNA聚合酶啟動子。表達載體還可以包括用于轉(zhuǎn)錄起始的核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子和適于放大表達的序列。表達載體還可以包括一個或多個選擇標記基因，以提供特異性表型來選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞，例如用于真核細胞的新霉素抗性或用于大腸桿菌的氨芐青霉素抗性。
表達載體可包含至少一個選擇標記。這種標記包括但不限于用于真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。合適宿主的示例性實例包括但不限于細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞，如酵母細胞；昆蟲細胞，如果蠅(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9細胞；動物細胞，如CHO、Cos和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。適用于上述宿主細胞的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。
用于細菌的載體的說明性實例包括但不限于得自Qiagen(Valencia，CA)的pA2、pQE70、pQE60和pQE-9；得自Stratagene(CedarCreek，TX)的pBS載體、Phagescript載體、BluescriptTM載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及得自Promega(Madison，WI)的pGEMEX-1、pGEMEX-2、PinPointTMX系列、pET-5系列。真核載體包括但不限于得自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合適的載體對技術(shù)人員來說是顯而易見的。
基因可置于啟動子、核糖體結(jié)合位點(用于細菌表達)、合適的基因控制序列或調(diào)節(jié)序列控制之下，以使編碼蛋白的DNA序列在用含表達構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞中轉(zhuǎn)錄為RNA。這種啟動子包括但不限于SV40、人巨細胞病毒(CMV)啟動子(例如pCMV/myc載體、pcDNA 3.1載體或pcDNA系列的任何形式)、SP6、T7和T3RNA聚合酶啟動子。在某些情況下，可能需要加入使宿主細胞分泌多肽的序列，隨后切除分泌信號。
對于某些用途，需要減少或消除本發(fā)明多肽編碼基因的表達。為實現(xiàn)此目的，可通過將編碼該多肽的基因或基因片段連接至啟動子序列，構(gòu)建設(shè)計用于共抑制該多肽的嵌合基因或嵌合構(gòu)建物?；蛘撸赏ㄟ^將基因或基因片段反向連接至啟動子序列，構(gòu)建設(shè)計用于表達全部或部分所述核酸片段的反義RNA的嵌合基因或嵌合構(gòu)建物?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化將共抑制或反義嵌合基因?qū)肽康乃拗骷毎校谒鏊拗骷毎袑?yīng)的內(nèi)源基因的表達被降低或消除。
多肽LXRα變體多肽可用于各種用途，包括但不限于生產(chǎn)抗體(例如特異性結(jié)合LXRα變體的抗體)、調(diào)節(jié)LXR野生型活性以及改變脂肪酸和膽固醇代謝(例如通過在表達LXRα變體的細胞中調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝調(diào)節(jié)酶的基因表達)。LXRα變體多肽還可用于鑒別差異性結(jié)合LXRα野生型多肽和LXRα變體多肽的化合物。這種化合物是差異調(diào)節(jié)與LXRα相關(guān)的代謝活性的候選化合物。
可在表達目的多肽的條件下，通過培養(yǎng)由上述表達載體轉(zhuǎn)化的合適宿主細胞，生產(chǎn)本發(fā)明多肽。然后可分離和純化多肽。由細胞培養(yǎng)物純化蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于硫酸銨沉淀、陰離子或陽離子交換層析和親和層析。
還可以使用來源于本發(fā)明多核苷酸的RNA，使用無細胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)本發(fā)明多肽。
可在表達目的多肽的條件下，通過培養(yǎng)由表達載體(例如本文所述表達載體)轉(zhuǎn)化的合適宿主細胞，生產(chǎn)本發(fā)明多肽。然后可分離和純化多肽。由細胞培養(yǎng)物純化蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于硫酸銨沉淀、陰離子或陽離子交換層析和親和層析。
還可以使用來源于本發(fā)明多核苷酸的RNA，使用無細胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)本發(fā)明多肽。
大規(guī)模生產(chǎn)克隆的LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-使得能夠篩選大量的LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-類似物，并可促進開發(fā)用于治療脂質(zhì)代謝疾病的新型或改良型激動劑和拮抗劑。更具體地說，篩選大量類似物的LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-活性可導(dǎo)致開發(fā)出影響脂質(zhì)代謝的改良藥物。脂質(zhì)代謝疾病和病癥包括但不限于動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖、Alzheimer病、炎性疾病和高膽固醇血癥。
對于某些用途，有用的是將本文所述多肽引導(dǎo)入不同細胞區(qū)室，或促進細胞分泌多肽。因此，本發(fā)明設(shè)想可通過加入合適的胞內(nèi)靶向序列(如轉(zhuǎn)運序列)和/或去除已存在的靶向序列，改變編碼本發(fā)明多肽的編碼序列，借此進一步補充上述嵌合基因。
而且，本發(fā)明多肽或其表達細胞可用作免疫原，以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備抗體。例如，由SEQ ID NO3、5或7編碼的多肽或其片段和/或由SEQ ID NO16或18編碼的多肽，或表達前述任一種多肽的細胞，都可用作免疫原。其中特別有用的是抗野生型LXRα中不存在的LXRα-64的64個新氨基酸的抗體?？贵w可為多克隆抗體或單克隆抗體，可包括嵌合抗體、單鏈抗體和Fab片段或Fab表達文庫產(chǎn)物?？贵w可用于原位檢測細胞中的本發(fā)明多肽，或在體外檢測細胞提取物中的本發(fā)明多肽。
另外，本發(fā)明多肽可用作靶點，以利于可用作藥物(例如候選化合物)的化合物的設(shè)計和/或鑒別。具體地說，這些化合物可用于治療由途徑(例如膽汁酸合成、血漿脂蛋白組成控制、由外周組織轉(zhuǎn)運膽固醇至肝臟、調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡)改變而產(chǎn)生的疾病。另外，本發(fā)明多肽可用于鑒別可影響LXRα的其它靶點(例如共活化或共抑制蛋白)。本發(fā)明LXRα變體的各種用途包括但不限于病理生理性類異戊二烯合成途徑、膽固醇代謝、膽固醇分解代謝、膽汁酸合成和細胞分化的治療性調(diào)節(jié)(例如基因傳遞方法、基因沉默方法、蛋白治療、抗體治療)、診斷用途、藥物靶、鑒別受體型激動劑或拮抗劑以及研究LXRα作用的分子機制。
而且，在由于表型表達本發(fā)明的內(nèi)源性顯性負調(diào)控LXRα變體而LXRα活性低的細胞中，可使用基因沉默方法如反義、siRNA(小干擾RNA)作為誘導(dǎo)或刺激LXRα活性的策略。另外，本發(fā)明的新變體可用于制備融合LXRα變體，其可用于開發(fā)受體型激動劑和拮抗劑。
此外，本發(fā)明的新序列，如SEQ ID NO16和SEQ ID NO18，可用于生產(chǎn)野生型LXRα的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物?？蓪EQ ID NO16或18的核酸分子或其片段摻入任一種存在的變體如LXRα和/或其它核受體中。獲得的含SEQ ID NO16和18或其片段編碼的氨基酸序列(例如在SEQ ID NO17和19中提出的序列)的新多肽可產(chǎn)生野生型LXRα的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物。
LXR，具體地說是LXRα，對膽固醇代謝和脂肪酸生物合成的脆弱平衡的重要性，導(dǎo)致開發(fā)出用作治療膽汁酸和膽固醇代謝相關(guān)疾病的治療劑或診斷劑的LXR調(diào)節(jié)物。本發(fā)明的新顯性負調(diào)控LXRα變體可用于開發(fā)這種治療劑或診斷劑。因此，本發(fā)明的一個實施方案是在受試者中治療其特征為LXR(例如LXRα)表達水平異?；蛴泻Φ募膊〉姆椒?。該方法包括為受試者提供治療有效量的LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-蛋白、同源蛋白或具有所需活性(例如抑制LXRα變體活性的能力)的LXRα變體蛋白片段，或可調(diào)節(jié)LXRα活性的其任何組合。在細胞表達LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-蛋白、同源蛋白或其片段(其導(dǎo)致調(diào)節(jié)野生型LXRα受體和/或其它與RXR雜二聚化的核受體)的條件下，通過將編碼LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-蛋白、同源蛋白或片段或其任何組合的核酸序列導(dǎo)入受試者攜帶LXRα的細胞中，可提供所述蛋白。這些受體的實例包括但不限于LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR。
將LXRα變體核酸導(dǎo)入受試者細胞中可包括a)處理受試者的細胞或適于移植入受試者中的活體外培養(yǎng)細胞或組織(例如培養(yǎng)的干細胞系、骨髓細胞、臍帶血細胞)，以將核酸序列插入細胞中；和b)將步驟a)的細胞導(dǎo)入受試者中(例如美國專利No.6,068,836和5,506,674)。
受試者可為動物，例如哺乳動物(如小鼠、大鼠、非人靈長類動物、犬、山羊或綿羊)。哺乳動物受試者可為人。
LXR的作用是與類視黃醇X受體(RXR)形成雜二聚體。而且，RXR在多種激素反應(yīng)途徑中同時起同二聚受體和雜二聚配偶體(例如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR(Miyataet al.，J.Biol.Chem.，2719189-9192，1996))作用的能力是獨一無二的。本發(fā)明的LXR變體LXR64、LXRα-42e+和LXRα-42e-可與RXR雜二聚化。因此，例如，在翻譯LXR64、LXRα-42e+和/或LXRα-42e-變體的位置，RXR將與這些變體雜二聚化，而不與LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和/或PXR雜二聚化或與自身(RXR)同二聚化。這減少了可用于和特定核受體雜二聚化和/或同二聚化的RXR量。
因此，作為顯性負調(diào)控變體，本發(fā)明的新LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-可用于靶向特異性受體，如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR。因此，本發(fā)明的顯性負調(diào)控LXRα變體提供了以下用途治療性調(diào)節(jié)病理生理性疾病、診斷、發(fā)病風(fēng)險或治療其中RXR、LXR或其它核受體(例如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、PXR、XR)介導(dǎo)的過程與病理生理性病癥或疾病相關(guān)的各種疾病。這種疾病的實例是動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖、癌癥和藥物代謝疾病。
而且，本發(fā)明的LXRα變體可通過與野生型LXRα結(jié)合配偶體如RXR相互作用而調(diào)節(jié)靶基因表達或靶基因產(chǎn)物活性。本文使用的LXR或RXR活性分別指調(diào)節(jié)LXR(如LXRα)或RXR靶基因的表達或活性。
在一個實施方案中，可通過使細胞與至少一種本發(fā)明的新型LXRα變體接觸，改變含RXR的細胞的靶基因特異性。在一個具體實施方案中，可通過使細胞與至少一種本發(fā)明的新型LXRα變體接觸，活化含RXR的細胞，靶基因與序列為5′-AGGTTAnnnnTGGTCA-3′(SEQ ID NO15)的效應(yīng)元件有效連接，其中每個“n”獨立地選自A、G、T或C。
可使用本領(lǐng)域已知的各種方法測定本發(fā)明的LXRα變體對同二聚化或雜二聚化過程的作用。這些方法的實例描述于Terrillon et al.Molecular Endocrinology 2003，17677-691，Germain-Desprez et al.，J.Biol.Chem.，2003，278(25)22367-22373，以及Mercier et al.，J.Biol.chem.2002，277(47)44925-44931。例如，可使用以上參考文獻中的任一種技術(shù)定量評價RXR同二聚化或雜二聚化，測定RXR活性。例如，可通過使一種核受體(例如RXR)cDNA與能量供體Rluc(海腎熒光素酶)在羧基端融合，并使第二種核受體(例如LXRα)cDNA與能量接納體GFP(綠色熒光蛋白)融合，定量核受體的同二聚化和雜二聚化。使用可區(qū)分海腎熒光素酶和綠色熒光蛋白發(fā)射光譜的BRET技術(shù)(Biosignal Packard)，可定量核受體的同二聚化和雜二聚化。
而且，本發(fā)明涉及降低哺乳動物SREBP-1基因表達的方法。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)顯性負調(diào)控的LXRα變體抑制野生型LXRα，并相應(yīng)地可抑制哺乳動物細胞中的SREBP-1表達。在有和沒有本發(fā)明變體的情況下，通過評價SREBP-1基因表達，可容易地證實后一結(jié)論。SREBP-1基因的不正常表達與脂肪營養(yǎng)不良、高甘氨酸血癥、高甘油三酯血癥和糖尿病之類的疾病相關(guān)。本發(fā)明變體不僅對治療性和預(yù)防性治療由SREBP-1過表達介導(dǎo)的疾病有用，而且對研究脂肪酸穩(wěn)態(tài)機制以及脂肪營養(yǎng)不良的成因和機制有用。
抗體本發(fā)明還提供分離和純化的抗體，例如單克隆抗體或多克隆抗體，包括對新LXRα變體特異性的獨特型或抗獨特型抗體。本發(fā)明的多肽或其表達細胞可用作免疫原，以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備抗體。例如，由SEQ ID NO3、5、7、16或18或SEQ ID NO3、5、7、16或18的任何部分和/或SEQ ID NO3、5、7、16或18編碼的這些多肽或表達前述任一種多肽的細胞，都可用作免疫原。這些抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，可包括嵌合抗體、單鏈抗體和Fab片段或Fab表達文庫產(chǎn)物?？贵w可用于原位檢測細胞中的本發(fā)明多肽，或體外檢測細胞提取物中的本發(fā)明多肽。
例如，抗體可特異性識別新型變體的64個新氨基酸。用含SEQ IDNO4或其免疫原性部分的肽或含SEQ ID NO4的融合肽免疫兔，并分離新型變體特異性的多克隆抗血清?；蛘撸瑢⒚庖邉游锏钠⒓毎c骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤。然后篩選雜交瘤，以鑒別分泌單克隆抗體的雜交瘤，該抗體特異性針對含新型LXRα-64變體64個氨基酸序列的多肽或肽。這些抗體可用于檢測生物樣品(例如臨床樣品)中的新型LXRα-64變體，檢測新型變體對其它變體的相對量。
篩選實驗一般來說，本文描述的新方法包括鑒別可調(diào)節(jié)LXRα變體表達或活性的化合物的方法。在某些情況下，鑒別調(diào)節(jié)LXRα變體表達或活性且不影響或在較小程度上影響野生型LXRα表達或活性的化合物。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)LXRα(例如大規(guī)模生產(chǎn)克隆的LXRα)的方法，其使得能夠篩選相對大量的LXRα類似物，并能促進開發(fā)用于LXRα相關(guān)疾病(如脂質(zhì)代謝疾病)臨床治療的新型或改良型激動劑和拮抗劑。更具體地說，篩選大量的類似物用于大規(guī)模生產(chǎn)克隆的LXRα使得能夠篩選大量的LXRα活性，這可導(dǎo)致開發(fā)出改良的工具和藥物，用于診斷和臨床治療例如脂肪營養(yǎng)不良、高甘油三酯血癥、高甘氨酸血癥、糖尿病或高膽固醇血癥。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽用作靶，例如通過結(jié)合多肽，促進調(diào)節(jié)多肽的表達和活性的化合物的設(shè)計和/或鑒別。這種化合物是治療與LXRα介導(dǎo)途徑相關(guān)的疾病的候選化合物，例如，可用作調(diào)節(jié)LXRα途徑的一個或多個方面的藥物。具體地說，這種化合物可用于治療由激素反應(yīng)途徑改變而產(chǎn)生的疾病(如糖尿病和藥物代謝疾病)。另外，本發(fā)明多肽可用于鑒別可影響激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它靶點(例如共活化或共抑制蛋白)。本發(fā)明LXRα變體的各種用途包括但不限于治療性調(diào)節(jié)與異常脂質(zhì)代謝相關(guān)的病理生理性疾病(例如基因傳遞方法、基因沉默方法、蛋白治療、抗體治療)、診斷用途、藥物靶、鑒別受體型激動劑或拮抗劑以及研究LXRα作用的分子機制。
LXRα變體的系統(tǒng)性研究使得有可能推斷所研究蛋白的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。這些變體的信息對所研究的疾病來說是基礎(chǔ)性的，因為其使得有可能理解病理學(xué)分子成因。而且，在鑒別組織選擇性核受體調(diào)節(jié)物如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR時，新型LXRα變體可以不同的方法用于靶向特異性受體相互作用。
因此，本發(fā)明提供了鑒別調(diào)節(jié)物的方法(本文也稱為“篩選實驗”)，所述調(diào)節(jié)物即為結(jié)合LXRα變體蛋白的候選化合物或物質(zhì)(例如蛋白、肽、肽模擬物、擬肽、小分子或其它藥物)，其對例如LXRα變體的表達或活性具有刺激或抑制作用，或?qū)鏛XRα變體底物的表達或活性具有刺激或抑制作用。由此鑒別的化合物可在治療方案中用于調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物(例如LXRα變體基因)的活性、詳盡闡述靶基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能或鑒別破壞正常靶基因相互作用的化合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供實驗來篩選為LXRα變體蛋白或多肽或其生物活性部分的底物的候選化合物或測試化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供實驗來篩選結(jié)合LXRα變體蛋白或多肽或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性的候選化合物或測試化合物。
例如可使用任何本領(lǐng)域已知的眾多組合文庫方法，獲得本發(fā)明的測試化合物，所述文庫方法包括生物文庫、擬肽文庫(具有肽功能性但具有抗酶降解的新型非肽骨架且仍保持生物活性的分子文庫；參見例如Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678-85)、空間可定位平行固相或液相文庫、需要去卷積的合成文庫法、‘一珠一化合物’文庫法和使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫和擬肽文庫法限于肽文庫，而其它四種方法可應(yīng)用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145)。
本領(lǐng)域存在合成分子文庫的方法實例，例如載于DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science 2611303；CarTell et al.(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文庫可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13412-421)，或存在于珠(Lam(1991)Nature 35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、細菌(Ladner，美國專利No.5,223,409)、孢子(Ladner，出處同上)、質(zhì)粒(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(Scott and Smith(1990)Science 249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310；Ladner出處同上)上。
在一個實施方案中，實驗是基于細胞的實驗，其中使表達LXRα變體蛋白或其生物活性部分的細胞與測試化合物接觸，并測定測試化合物調(diào)節(jié)LXRα變體活性的能力?？赏ㄟ^監(jiān)測例如表達野生型LXRα的細胞中LXRα變體的顯性負調(diào)控活性，例如通過監(jiān)測LXRα誘導(dǎo)型基因或基因產(chǎn)物的表達，實現(xiàn)測定測試化合物調(diào)節(jié)LXRα變體活性的能力。細胞例如可為哺乳動物來源，例如人。
還可以評價測試化合物調(diào)節(jié)LXRα變體結(jié)合化合物(例如天然的LXRα變體配體)或結(jié)合LXRα變體的能力。這可通過例如以下方法實現(xiàn)將化合物與放射性同位素或酶標記偶聯(lián)，使得化合物與LXRα變體的結(jié)合可通過檢測復(fù)合物中的標記化合物測定?；蛘?，LXRα變體可與放射性同位素、酶標記偶聯(lián)，或工程改造為含肽標記，以監(jiān)測復(fù)合物中測試化合物調(diào)節(jié)LXRα變體結(jié)合例如LXRα變體、野生型LXRα或與另一類固醇受體超家族成員雜二聚化的能力。例如，化合物可用125I、35S、14C或3H直接或間接標記，并通過直接計數(shù)放射性發(fā)射或閃爍計數(shù)檢測放射性同位素。或者，可用例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶酶標記化合物，并通過測定合適底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化檢測酶標記。
在有或沒有標記任何相互作用物的情況下，可評價化合物與LXRα變體相互作用的能力。例如，可在沒有標記化合物或LXRα變體的情況下，使用微生理功能測定儀檢測化合物與LXRα變體的相互作用(例如McConnell et al.(1992)Science 2571906-1912)。本文使用的“微生理功能測定儀”(例如細胞傳感器)是一種分析性儀器，其使用光尋址電位傳感器(LAPS)檢測細胞酸化其環(huán)境的速率。該酸化速率的變化可用于指示化合物和LXRα變體之間的相互作用。
在再另一個方法中，提供無細胞實驗，其中使LXRα變體蛋白或其生物活性部分與測試化合物接觸，并評價測試化合物結(jié)合LXRα變體蛋白或其生物活性部分的能力。用于實驗的LXRα變體蛋白的優(yōu)選生物活性部分包括參與和LXRα變體分子、非LXRα變體分子相互作用的片段(例如具有高表面概率記分的片段)，以及預(yù)測的LXRα變體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
可溶性和/或膜結(jié)合形式的分離蛋白(例如LXRα變體蛋白或其生物活性部分)可用于本發(fā)明的無細胞實驗。
無細胞實驗包括在足以允許兩種組分相互作用并結(jié)合的條件和時間下，制備靶基因蛋白和測試化合物的反應(yīng)混合物，由此形成可使用本領(lǐng)域已知方法取出和/或檢測的復(fù)合物。
還可以使用例如熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)檢測兩種分子之間的相互作用(參見例如Lakowicz et al.，美國專利No.5,631,169；Stavrianopoulos，et al.，美國專利No.4,868,103)。選擇在第一個‘供體’分子上的熒光團標記，使得其能夠發(fā)射出熒光能量，熒光能量被第二個‘接納體’分子上的熒光標記吸收，該熒光標記由于吸收能量又能夠發(fā)熒光?；蛘撸w’蛋白分子可僅使用色氨酸殘基的天然熒光能量。選擇發(fā)射不同波長光的標記，使得‘接納體’分子標記可與‘供體’不同。因為標記之間能量轉(zhuǎn)移的效率與分子間距相關(guān)，所以可估測分子之間的空間關(guān)系。在分子間發(fā)生結(jié)合的情況下，實驗中‘接納體’分子標記的熒光發(fā)射應(yīng)最大。FET結(jié)合事件可通過本領(lǐng)域眾所周知的標準熒光檢測法(例如使用熒光計)進行常規(guī)檢測。
在另一個實施方案中，可使用實時生物分子相互作用分析(BIA)(例如Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.632338-2345和Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)，實現(xiàn)對LXRα變體蛋白結(jié)合靶分子能力的測定。“表面等離子共振”或“BIA”實時檢測生物特異性相互作用，而不需要標記任何相互作用物(例如BIAcore)。結(jié)合表面質(zhì)量的變化(指示結(jié)合事件)導(dǎo)致表面附近的光的折射率改變(表面等離子共振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)，產(chǎn)生的可檢測信號可用作生物分子間實時反應(yīng)的指示。
在一個實施方案中，將靶基因產(chǎn)物(例如LXRα變體蛋白或其片段)或測試物錨定在固相上。錨定在固相上的靶基因產(chǎn)物/測試化合物復(fù)合物可在反應(yīng)結(jié)束時檢測。一般而言，靶基因產(chǎn)物可錨定在固體表面，而測試化合物(其未被錨定)可用本文論述的可檢測標記直接或間接標記。
可能需要將LXRα變體、抗LXRα變體抗體或其靶分子固定化，以促進一種或兩種蛋白的復(fù)合與非復(fù)合形式的分離，以及適于實驗自動化。在有和沒有候選化合物的情況下測試化合物與LXRα變體蛋白的結(jié)合或LXRα變體蛋白與靶分子的相互作用，可在任何適于包含反應(yīng)物的容器中完成。這種容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一個實施方案中，可提供加入結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該結(jié)構(gòu)域允許一種或兩種蛋白結(jié)合基質(zhì)。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/LXRα變體融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白可吸附到谷胱甘肽SepharoseTM珠(Sigma Chemical，St.Louis，Mo)或谷胱甘肽衍化的微量滴定板上，然后將其與測試化合物混合，或者將其與測試化合物和未吸附靶蛋白或LXRα變體蛋白混合，在有助于形成復(fù)合物的條件下(例如在生理鹽和pH條件下)溫育混合物。溫育后，漂洗珠或微量滴定板孔，以去除任何未結(jié)合的組分，對于珠，固定基質(zhì)，例如如上所述直接或間接測定復(fù)合物?；蛘?，復(fù)合物可與基質(zhì)解離，使用標準技術(shù)檢測LXRα變體結(jié)合或活性水平。
其它將LXRα變體蛋白或靶分子固定在基質(zhì)上的技術(shù)包括使用綴合的生物素和鏈霉抗生物素?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化LXRα變體蛋白或靶分子，并固定在鏈霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。
為進行實驗，將未固定組分加至含錨定組分的包被表面。反應(yīng)完成后，在使所形成的任何復(fù)合物仍固定在固體表面的條件下去除(例如通過漂洗)未反應(yīng)組分。可以多種方法完成對錨定在固體表面上的復(fù)合物的檢測。當先前未固定的組分預(yù)先標記過時，檢測固定在表面上的標記，其代表形成復(fù)合物。當先前未固定的組分未預(yù)先標記時，可使用間接標記檢測錨定在表面上的復(fù)合物；例如使用對固定組分特異性的標記抗體(抗體又可用例如標記的抗Ig抗體直接標記或間接標記)。
在一個實施方案中，使用與LXRα變體蛋白或靶分子反應(yīng)但不干擾LXRα變體蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體進行實驗。這種抗體可被衍化至板的孔，未結(jié)合的靶或LXRα變體蛋白通過抗體結(jié)合被捕獲在孔中。檢測此復(fù)合物的方法除了上述用于GST-固定化復(fù)合物的方法以外，還包括使用與LXRα變體蛋白或靶分子反應(yīng)的抗體免疫檢測復(fù)合物，以及依靠檢測與LXRα變體蛋白或靶分子相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)實驗。
或者，可在液相中進行無細胞實驗。在該實驗中，可通過任何本領(lǐng)域已知的眾多技術(shù)，包括但不限于差速離心(例如Rivas andMinton，(1993)Trends Biochem Sci 18284-7)、層析(凝膠過濾層析、離子交換層析)、電泳(例如Ausubel et al.，eds.Current Protocols inMolecular Biology 1999，J.WileyNew York.)，以及免疫沉淀(例如Ausubel et al.，eds.(1999)Current Protocols in Molecular Biology，J.WileyNew York)，分離反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)組分。這種樹脂和層析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如Heegaard，(1998)J.Mol.Recognit.11141-8；Hage and Tweed，(1997)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.699499-525)。此外，如本文所述，也可以常規(guī)性使用熒光能量轉(zhuǎn)移，以在沒有進一步純化溶液中復(fù)合物的情況下檢測結(jié)合。
在某些情況下，實驗包括使LXRα變體蛋白或其生物活性部分與已知結(jié)合LXRα變體(例如LXRα、LXRα變體或類固醇受體超家族的其它成員)的化合物接觸，形成實驗混合物，使實驗混合物與測試化合物接觸，并測定測試化合物與LXRα變體蛋白相互作用的能力，其中測定測試化合物與LXRα變體蛋白相互作用的能力包括測定測試化合物優(yōu)先結(jié)合LXRα變體或其生物活性部分的能力，或破壞LXRα變體和已知化合物之間相互作用的能力，或和已知化合物相比調(diào)節(jié)靶分子活性的能力(例如通過監(jiān)測LXRα變體的顯性負調(diào)控活性)。
本發(fā)明的靶基因產(chǎn)物可與一種或多種細胞或胞外大分子如蛋白體內(nèi)相互作用。對于該討論的目的，這種細胞和胞外大分子在本文被稱為“結(jié)合配偶體”。破壞此相互作用的化合物可用于調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物的活性。這種化合物可包括但不限于抗體、肽和小分子之類的分子。用于本實施方案的靶基因/產(chǎn)物一般為本文鑒別的LXRα變體基因。在一個替代實施方案中，本發(fā)明提供方法，測定測試化合物通過調(diào)節(jié)LXRα變體靶分子下游效應(yīng)子的活性調(diào)節(jié)LXRα變體蛋白活性的能力。例如，可測定效應(yīng)分子對合適靶的活性，或者可如前所述測定效應(yīng)子與合適靶的結(jié)合。
為鑒別干擾靶基因產(chǎn)物與其細胞或胞外結(jié)合配偶體之間相互作用的化合物，在足以使兩種產(chǎn)物形成復(fù)合物的條件和時間下，制備含靶基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體的反應(yīng)混合物。為了測試抑制劑，在有和沒有測試混合物的情況下提供反應(yīng)混合物。首先可將測試化合物加入反應(yīng)混合物中，或者可在加入靶基因及其細胞或胞外結(jié)合配偶體之后的時間加入測試化合物。在沒有測試化合物的情況下溫育對照反應(yīng)混合物，或?qū)φ辗磻?yīng)混合物與安慰劑溫育。然后檢測靶基因產(chǎn)物與細胞或胞外結(jié)合配偶體之間形成的任何復(fù)合物。在對照反應(yīng)中形成復(fù)合物，但在含測試化合物的反應(yīng)混合物中未形成復(fù)合物，這表明化合物干擾靶基因產(chǎn)物和相互作用性結(jié)合配偶體的相互作用。另外，在含測試化合物和正常靶基因產(chǎn)物的反應(yīng)混合物中形成的復(fù)合物還可與在含測試化合物和突變靶基因產(chǎn)物的反應(yīng)混合物中形成的復(fù)合物對比。這種對比對于需要鑒別破壞突變靶基因產(chǎn)物的相互作用但不破壞正常靶基因產(chǎn)物的相互作用的化合物的情況可能很重要。
這些實驗可以異質(zhì)或均質(zhì)形式進行。異質(zhì)實驗包括將靶基因產(chǎn)物或結(jié)合配偶體錨定在固相上，并在反應(yīng)結(jié)束時檢測錨定在固相上的復(fù)合物。在均質(zhì)實驗中，整個反應(yīng)在液相中進行。在每一種方法中，反應(yīng)物加入的順序都可改變，以獲得有關(guān)待測試化合物的不同信息。例如，干擾靶基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體之間相互作用(例如通過競爭)的測試化合物，可通過在測試物質(zhì)存在下進行反應(yīng)來鑒別?；蛘?，可通過在形成復(fù)合物后向反應(yīng)混合物中加入測試化合物，檢驗破壞預(yù)先形成復(fù)合物的測試化合物，例如具有較高結(jié)合常數(shù)的化合物替換了復(fù)合物中的一種組分。下文簡要描述了各種形式。
在異質(zhì)實驗系統(tǒng)中，靶基因產(chǎn)物或相互作用的細胞或胞外結(jié)合配偶體被錨定在固體表面(例如微量滴定板)上，而未錨定組分被直接或間接標記。錨定的組分可通過非共價或共價連接固定化?；蛘撸墒褂脤Υ^定的組分特異性的固定化抗體將組分錨定在固體表面上。
為了進行實驗，在有或沒有測試化合物的情況下，使固定化組分的配偶體接觸包被表面。在反應(yīng)完成后，去除(例如通過漂洗)未反應(yīng)的組分，形成的任何復(fù)合物都仍固定在固體表面上。當未固定化組分預(yù)先標記時，檢測固定在表面上的標記，其代表形成復(fù)合物。當未固定化組分未預(yù)先標記時，可使用間接標記檢測錨定在表面上的復(fù)合物；例如使用對最初未固定化的組分特異性的標記抗體(抗體又可用例如標記的抗Ig抗體直接或間接標記)。根據(jù)反應(yīng)組分加入的順序，可檢測抑制復(fù)合物形成或破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的測試化合物。
或者，可在有或沒有測試化合物的情況下在液相中進行反應(yīng)，分離反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)組分，并檢測復(fù)合物；例如使用對一種結(jié)合組分特異性的固定化抗體，以錨定在溶液中形成的任何復(fù)合物，以及使用對其它配偶體特異性的標記抗體，以檢測錨定的復(fù)合物。此外，根據(jù)反應(yīng)物加入到液相中的順序，可鑒別抑制復(fù)合物或破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的測試化合物。
在某些方法中，可使用均質(zhì)實驗。例如，制備靶基因產(chǎn)物和相互作用性細胞或胞外結(jié)合配偶體產(chǎn)物的預(yù)先形成復(fù)合物，使得靶基因產(chǎn)物或其結(jié)合配偶體被標記，但標記產(chǎn)生的信號由于形成復(fù)合物而被猝滅(參見例如使用該方法進行免疫實驗的美國專利No.4,109,496)。加入競爭并替代預(yù)先形成復(fù)合物中一種組分的測試化合物，導(dǎo)致產(chǎn)生了高于背景的信號。以此方式可鑒別破壞靶基因產(chǎn)物-結(jié)合配偶體相互作用的測試物。
在再另一方面，LXRα變體蛋白可在雙雜交實驗或三雜交實驗中用作“餌蛋白”(參見例如美國專利No.5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell 72223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14920-924；Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 81693-1696；和Brent WO94/10300)，以鑒別與LXRα變體結(jié)合或相互作用并與LXRα變體活性相關(guān)的其它蛋白(“LXRα變體-結(jié)合蛋白”或“LXRα變體-bp”)。這種LXRα變體-bp可為LXRα變體蛋白或LXRα變體靶(例如LXRα變體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游元件)的信號(例如配體)的激活劑或抑制劑。進行這些實驗的試劑盒可商購(如Stratagene，La Jolla，CA；BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)。
在另一個實施方案中，鑒別LXRα變體表達的調(diào)節(jié)物。例如，使細胞或無細胞混合物接觸候選化合物，并相對于沒有候選化合物情況下的LXRα變體mRNA或蛋白的表達水平，評價LXRα變體mRNA或蛋白的表達。當存在候選化合物時LXRα變體mRNA或蛋白的表達高于沒有候選化合物時，候選化合物被鑒別為LXRα變體mRNA或蛋白表達的刺激劑?；蛘撸敶嬖诤蜻x化物時LXRα變體mRNA或蛋白的表達低于(統(tǒng)計學(xué)顯著地低于)沒有候選化合物時，候選化合物被鑒別為LXRα變體mRNA或蛋白表達的抑制劑。LXRα變體mRNA或蛋白表達水平可通過本文描述的用于檢測LXRα變體mRNA或蛋白的方法測定。
在另一個方面，本發(fā)明涉及本文描述的兩種或更多種實驗的組合。例如，可使用基于細胞或無細胞的實驗鑒別調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)LXRα變體蛋白活性的能力可在例如動物(如高膽固醇血癥或與脂肪酸代謝相關(guān)的其它疾病的動物模型)中體內(nèi)證實。
本發(fā)明進一步涉及通過上述篩選實驗鑒別的新物質(zhì)。因此，在合適的動物模型中進一步使用如本文所述鑒別的物質(zhì)(例如LXRα變體調(diào)節(jié)劑、反義LXRα變體核酸分子、LXRα變體特異性抗體或LXRα變體-結(jié)合配偶體)，確定用該物質(zhì)治療的效力、毒性、副作用或作用機制，屬于本發(fā)明的范圍。而且，由上述篩選實驗鑒別的新物質(zhì)可用于本文所述的治療。
轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動物。這種動物用于研究LXRα變體蛋白的功能和/或活性，以及用于鑒別和/或評價LXRα變體表達或活性的調(diào)節(jié)劑。本文使用的“轉(zhuǎn)基因動物”是其中一個或多個動物細胞含轉(zhuǎn)基因的非人動物，例如哺乳動物，如大鼠或小鼠之類的嚙齒動物。轉(zhuǎn)基因動物的其它實例包括非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲動物等。轉(zhuǎn)基因是外源DNA或重排，例如缺失內(nèi)源染色體DNA，其一般整合入或出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物細胞的基因組中。轉(zhuǎn)基因可引導(dǎo)編碼基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因動物的一種或多種細胞類型或組織中表達，其它轉(zhuǎn)基因如敲除基因降低表達。因此，轉(zhuǎn)基因動物可為這種動物其中內(nèi)源LXRα變體基因已通過例如內(nèi)源基因和導(dǎo)入動物細胞(例如動物胚胎細胞)中的外源DNA分子之間的同源重組改變，然后培育動物。在某些情況下，鑒別動物中的LXRα變體的直系同源物，并使用直系同源序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。當已知基因(例如人基因)和目的LXRα變體基因之間的同源性足夠時，可使用人序列。
轉(zhuǎn)基因中還可以包含內(nèi)含子序列和多腺苷酸化信號，以增加轉(zhuǎn)基因的表達效率。組織特異性調(diào)節(jié)序列可有效連接至本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因，以控制特定細胞表達LXRα變體蛋白?？筛鶕?jù)其基因組中存在LXRα變體轉(zhuǎn)基因和/或在動物組織或細胞中表達LXRα變體mRNA，鑒別轉(zhuǎn)基因起始動物。還可以通過其它與轉(zhuǎn)基因相關(guān)的特征鑒別轉(zhuǎn)基因動物。例如，表達LXRα-64轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物的SREBP-1C表達量降低，相比于對照動物，其在LXRα激動劑存在時特別顯著。然后可使用轉(zhuǎn)基因起始動物繁殖攜帶轉(zhuǎn)基因的其它動物。而且，可將攜帶LXRα變體蛋白編碼轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物進一步繁殖成攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基因動物。
可在轉(zhuǎn)基因動物中表達LXR變體蛋白或多肽，例如可將編碼蛋白或多肽的核酸導(dǎo)入動物基因組中。一般來說，核酸置于組織特異性啟動子(例如乳或卵特異性啟動子)控制之下，并由動物生產(chǎn)的奶或蛋中回收。適用于該用途的動物包括小鼠、豬、牛、山羊和綿羊。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因動物細胞群。分離和繁殖這種細胞的方法是本領(lǐng)域已知的，包括培育和繁殖初級、次級和無限增殖化細胞。
實施例在以下的實施例中進一步闡述了本發(fā)明，除非另有說明，否則其中所有的份和百分率都是重量，度數(shù)是攝氏度。應(yīng)當理解，這些實施例盡管代表本發(fā)明實施方案的實例，但僅以說明的方式提供。由以上論述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的基本特征，在不偏離其精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明實施各種改變和修飾，以使其適于各種用途和條件。實施例不應(yīng)被以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。
實施例1克隆人LXR變體使用QIAGEN試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)由THP-1細胞(人單核細胞-巨噬細胞細胞系)分離總RNA。在20μL反應(yīng)混合物中由0.1μg總THP-1RNA合成第一條鏈cDNA，所述反應(yīng)混合物含4μL 5XRT反應(yīng)緩沖液、10單位Rnasin、200μM dNTP、20pM隨機引物和20單位逆轉(zhuǎn)錄酶。混合物于42℃溫育1小時，然后于53℃溫育30分鐘。然后用10單位RNase H于37℃消化未雜交的RNA 10分鐘。使用人LXRα特異性引物對2μL逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物進行PCR擴增。引物序列為LXRα-For5′-CGGTCGACATGTCCTTGTGGCTGGGG(SEQ IDNO9)和LXRα-Rev5′-CAGCGGCCGCTTCGTGCACATCCCAGATCTC(SEQ ID NO10)(限制性位點加下劃線)。在熱循環(huán)儀中以94℃(30秒)、58℃(30秒)和72℃(2分鐘)進行35輪擴增。在1.2％瓊脂糖凝膠上分析RT-PCR產(chǎn)物。在PCR中使用相同量的總RNA作為模板，以檢驗由cDNA擴增的條帶。將RT-PCR產(chǎn)物亞克隆入pCMV表達載體的Sal I/Nit I位點，進行測序。亞克隆測序結(jié)果是鑒別出許多新序列，包括本文稱為LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-的序列。
實施例2克隆的測序和初步分析使用實施例1的LXRα-For和LXRα-Rev引物(見上文)，由人單核細胞/巨噬細胞THP-1細胞鑒別和克隆人LXRα的三種可變剪接變體。變體是被發(fā)現(xiàn)比天然(野生型)LXRα長64個氨基酸的LXRα-64；有42個氨基酸與天然LXRα不同的LXRα-42e+；以及有42個氨基酸與天然LXRα不同且對應(yīng)于天然LXRα外顯子6的序列缺失的LXRα-42e-。新LXRα變體和野生型人LXRα的核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列的對比示于圖1B、2B和3B。
圖1A列出的新核苷酸序列存在于LXRα-64中，但不存在于野生型LXRα中(核苷酸1121-1154)。圖1B列出的新氨基酸序列存在于LXRα-64中，但不存在于野生型LXRα中(氨基酸368-409)。
圖2A列出的新核苷酸序列存在于LXRα-42e+中。LXRα-42e+中的缺失序列(在野生型LXRα中存在(核苷酸1121-1154))引起移碼。這在LXRα-42e+中產(chǎn)生了新的氨基酸序列(LXRα-42e+的氨基酸368-409)。LXRα-42e+缺失的氨基酸序列對應(yīng)于野生型LXRα-42e+的氨基酸368-447。
圖3A顯示了核苷酸651-1220的LXRα-42e-完整序列。該圖未顯示野生型LXRα對應(yīng)區(qū)域(核苷酸651-1166)的完整序列。對應(yīng)于野生型LXRα的核苷酸708-887的序列在LXRα-42e-中不存在。對應(yīng)于LXRα-42e-的核苷酸1101-1134的序列在野生型LXRα中不存在。圖3B顯示了存在于野生型LXRα中但不存在于LXRα-42e-中的序列(野生型LXRα的氨基酸237-296和368-447)，以及僅存在于LXRα-42e-中的序列(LXRα-42e-的氨基酸308-349)。
新變體的完整cDNA編碼區(qū)和預(yù)測的氨基酸序列示于SEQ IDNO3(編碼LXRα-64的核苷酸序列)、SEQ ID NO4(LXRα-64的推測氨基酸序列)、SEQ ID NO5(編碼LXRα-42e+cDNA的核苷酸序列)、SEQ ID NO6(LXRα-42e+的推測氨基酸序列)、SEQ ID NO7(編碼LXRα-42e-的核苷酸序列)、SEQ ID NO8(LXRα-42e-的推測氨基酸序列)、SEQ ID NO16(LXRα-64獨有的核苷酸序列，其連接野生型LXRα的外顯子6和7，來源于內(nèi)含子6，產(chǎn)生了更大的外顯子6)、SEQ ID NO17(LXRα-64獨有的氨基酸序列，由SEQ IDNO16編碼)、SEQ ID NO18(LXRα-42e mRNA中外顯子8的新部分，其不存在于野生型LXRα的外顯子8中)，以及SEQ ID NO19(由在LXRα-42cDNA中鑒別的其它序列編碼的推測氨基酸序列)。
實施例3基因特征測定本發(fā)明新變體LXRα-64、LXRα-42+和LXRα-42-的基因組結(jié)構(gòu)。LXRα-64、LXRα-42+和LXRα-42-的轉(zhuǎn)錄起始位點、基因組結(jié)構(gòu)、可變剪接和功能結(jié)構(gòu)域以及其與野生型LXRα的對比分別描述于圖4、5和6。
圖4圖示了LXRα-64mRNA的結(jié)構(gòu)，表明新序列摻入到對應(yīng)于野生型LXRα的外顯子6的序列中。因此，具有新序列的探針可用于例如鑒別LXRα-64的表達或鑒別LXRα-64變體。由新序列編碼的氨基酸序列可用作抗原，來產(chǎn)生特異性結(jié)合LXRα-64變體的抗體。LXRα-64變體的特征在于其mRNA含新核酸序列，并編碼新氨基酸序列。這種變體可含保守置換。
圖5圖示了LXRα-42e+mRNA的結(jié)構(gòu)，表明新序列摻入到對應(yīng)于野生型LXRα的外顯子8的序列中，該序列將終止信號引入到外顯子9之前的序列中。新LXRα-42e+序列還缺失野生型LXRα的外顯子10。具有新序列的探針可用于例如鑒別LXRα-42e+的表達或鑒別LXRα-42e+變體。LXRα-42e+變體的特征在于其mRNA含新核酸序列，并編碼新氨基酸序列。這種變體可含保守置換。某些LXRα-42e+變體缺失外顯子10。在某些情況下，LXRα-42e+變體既含新序列，又缺失外顯子10。
圖6圖示了LXRα-42e-mRNA的結(jié)構(gòu)，表明在LXRα-42e-中沒有野生型LXRα的外顯子6。(野生型LXRα的某些報告將外顯子1命名為外顯子1A，將外顯子2命名為外顯子1B。在這種命名法中，野生型LXRα的外顯子5對應(yīng)于缺失的外顯子6序列)。因此，含LXRα-42e-的連續(xù)外顯子5和外顯子7序列的探針可用于例如特異性檢測該序列的表達，或用于鑒別LXRα-42e-新變體。因此，LXRα-42e-變體的特征在于缺失野生型外顯子6。由橋接外顯子5和7的序列編碼的氨基酸序列還可用于產(chǎn)生特異性結(jié)合LXRα-42e-的抗體。
實施例4組織分布使用BD Biosciences Clontech(Palo Alto，CA)的實時PCR和多組織cDNA文庫(MTC，人cDNA)進行組織分布研究。使用AppliedBiosystems 7700序列檢測儀(Foster City，CA)對文庫進行實時定量PCR實驗。各擴增混合物(50μL)含50ng cDNA、400nM正向引物(SEQID NO11)、400nM反向引物(SEQ ID NO12)、200nM雙標記熒光探針(SEQ ID NO13)(Applied Biosystems)、5.5mM MgCl2和1.25單位Gold Taq(Applied Biosystems)。引物擴增約80個核苷酸長的一部分LXRα序列。PCR熱循環(huán)參數(shù)為95℃10分鐘，以及95℃15秒和60℃1分鐘的40個循環(huán)。與樣品和無模板對照一起平行分析連續(xù)稀釋的cDNA標準。使用用于GAPDH的Predeveloped Assays(Applied Biosystems)的探針和引物，在相同實驗中平行分析所有樣品的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達。將所有的靶基因表達對GAPDH表達歸一化。按照生產(chǎn)商(Perkin-Elmer)的方法，使用閾值法進行定量分析，由標準曲線計算相對量。
在這些研究中用于檢測LXRα變體LXRα-64的引物和探針如下L64-For(5′-TGGGAAGCAGGGATGAGG-3′；SEQ ID NO11)、L64-Rev(5′-GAGGGCTGGTCTTGGAGCA-3′；SEQ ID NO12)，以及L64TaqMan探針(FAM-TCGGCCTCCCTGGMGAGGCC-TAMRA；SEQ ID NO13)。L64引物和探針位于在LXRα-64cDNA中存在的64個核苷酸中。
LXRα-64mRNA被發(fā)現(xiàn)在肝中表達最豐富(圖7A)。還在小腸、胎盤、胰腺、卵巢和結(jié)腸中檢測到相對較高水平的轉(zhuǎn)錄物。在其它測試組織中觀測到的表達非常少。在這些研究中用于檢測LXRα變體LXRα-42的引物和探針如下L42-For(5′-GGTGGAGGCATTTGCTGTGT-3′；SEQ ID NO21)、L42-Rev(5′-CCCAAATTGCMCCAAAATATAGA-3′；SEQ ID NO22)和L42探針(FAM-TTTAGGATGAGAGAGCTTGGCTGGAGCAT-TAMRA；SEQ ID NO23)。FAM/TAMRA熒光探針可由BioSearch Technologies(Novato，CA)獲得。
與LXRα-64相比，LXRα-42的表達具有不同的模式。盡管在肝中觀測到的表達最豐富，但在其它測試組織中僅檢測到低水平的LXRα-42序列或沒有檢測到。
野生型LXRα以及LXRα變體在肝中高表達。在肝之后，野生型LXRα在胰腺中的存在量最豐富，其后是睪丸、小腸和脾臟，它們具有相似的mRNA水平。前列腺、胸腺、腎臟、卵巢、胎盤、肺和結(jié)腸表達低于睪丸，而白細胞、心臟、腦和骨骼肌含有的野生型LXRαmRNA的量可忽略不計。LXRα-64在肝臟中的表達水平也是最高，其后是小腸。胎盤、胰腺、卵巢、結(jié)腸和肺表達的LXRα-64低于小腸。在腎臟和白細胞中觀測到的表達甚至更低，而心臟、腦、骨骼肌、脾臟、胸腺、前列腺和睪丸含有的表達量可忽略不計。LXRα-42在肺中的表達(LXRα-42e-+LXRα-42e+)比在肝臟中低。其余組織(見前文討論)的表達水平明顯比肝臟低。
實施例5LXR激動劑在dTHP-1細胞中上調(diào)LXRα-64進行實驗，以確定野生型LXRα激動劑是否也可調(diào)節(jié)LXRα變體的表達。在這些實驗中，THP-1細胞由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，并在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為在分化的THP-1細胞中進行基因表達分析，在補加10％無脂蛋白血清(LPDS)(Intracel Corp，Rockville，MD)的RPMI培養(yǎng)基中溫育THP1細胞，并用150nM佛波酯處理3天，接著用LXR、RXR或過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑化合物處理，具體地說是用僅載體(對照)、10μM T0901317、10μM GW 3965、10μM Ciglitazone或1μM9RA處理。用于實時RT-PCR的引物和TaqMan探針如實施例4所述。數(shù)據(jù)表明，在與兩種合成LXR激動劑(T0901317([N-(2，2，2，-三氟-乙基)-N-[4-(2，2，2，-三氟-1-羥基-1-三氟甲基-乙基)-苯基]-苯磺酰胺])(Repa et al.，Science 2000 289(5484)1524-9，和Schultz et al.，GenesDev.200014(22)2831-8)、GW3965[3-(3-(2-氯-3-三氟甲基芐基-2，2-二苯基乙氨基)丙氧基)苯乙酸](Collins et al.，J.Med.Chem.，2002 451963-1966和Laffitte et al.，Mol.Cell.Biol.2001，217558-7568))中的任一種、PPARγ配體(10μM Citglitazone)和RXR配體(9-順式視黃酸)溫育的THP-1細胞中，LXRα-64和LXRα-42mRNA的表達都增加(圖8A和8B)。
這些數(shù)據(jù)表明，可使用已知LXRα激動劑誘導(dǎo)LXRα變體的表達。
實施例6LXRα變體的功能特征使用公開的LXRα基因組結(jié)構(gòu)和序列信息(GenBank檢索號AC090589)，通過PCR擴增人LXRα啟動子(SEQ ID NO14)。將LXRα啟動子由-2660至-2363(相對于外顯子1的轉(zhuǎn)錄起始位點)的片段亞克隆入pGL3基本質(zhì)粒，產(chǎn)生pGL-3-LXRα-Luc，其中所述片段含LXR效應(yīng)元件(5′-TGACCAgcagTAACCT-3′，SEQ ID NO20)(Laffitte et al.2001，Mol.Cell.Biol.21，7558-7568和Whitney et al.，2001，J.Biol.Chem.276，43509-43515)。用作本文公開實驗和分析的參比的LXRα“天然”序列其GenBank登錄號是人LXRα的Genbank登錄號BC008819。根據(jù)GenBank中的序列，通過RT-PCR擴增人LXRα和RXRα(GenBank登錄號BC007925)的編碼區(qū)，將其亞克隆入pCMV/myc/nuc表達載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。將新的LXRα-L64編碼區(qū)亞克隆入pCMV/myc/nuc表達載體。
在含10％FBS的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)HEK 293細胞。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在24孔板中一式三份進行轉(zhuǎn)染。每個孔用400ng報告基因質(zhì)粒、100ng報告基因表達載體以及200ng含細菌β-半乳糖苷酶基因的pCMV-βgal參比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。調(diào)節(jié)每個孔的加入量，以使每個孔含恒定量的DNA和pCMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)表達載體。在轉(zhuǎn)染后6-8小時，用磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗細胞1次，然后與含10％無脂蛋白血清(LPDS)(IntracelCorp，Rockville，MD)的新鮮培養(yǎng)基和LXR激動劑、RXR激動劑或載體對照溫育24小時。收獲細胞，進行分析，以微量滴定板發(fā)光計/光度計讀數(shù)器(Lucy-1；Anthos，Salzburg，Austria)測定提取物的熒光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。將熒光素酶活性對β-半乳糖苷酶活性歸一化。
更詳細地說，用對照pGL3-基本載體(Promega Madison，WI 53711)或pGL3-LXRα-Luc(含LXRα啟動子的LXRE序列(TGACCAgcagTAACCT；SEQ ID NO20)的部分LXRα啟動子亞克隆入pGL3-基本載體的Kpn I/Xho I位點中)報告基因和pCMV-hLXRα/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-64/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-42e+/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-42e-/pCMV-hRXRα分別共轉(zhuǎn)染HEK 293細胞。在轉(zhuǎn)染后，將細胞在補加10％無脂蛋白血清(LPDS)和10μM T0901317或載體對照的DMEM中溫育24小時，然后測定熒光素酶活性并歸一化。
如圖9所示，當新LXRα變體與報告基因共轉(zhuǎn)染時，與天然LXRα共轉(zhuǎn)染相比，LXR配體依賴性活化急劇下降。而且，如圖10所示，當變體和LXRα與報告基因同時共轉(zhuǎn)染時，與一同的LXRα共轉(zhuǎn)染相比，外源LXRα的活化受到抑制。這些數(shù)據(jù)表明，新克隆的LXRα變體可起天然LXRα表達的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物的作用。
實施例7LXRα變體調(diào)節(jié)LXR靶基因LXRα的重要特征在于其與多種生理作用相關(guān)，其中某些生理作用對生物體是有利的，而其中某些生理作用至少在某些情況下對生物體是有害的。因此，本文描述的新LXRα變體的發(fā)現(xiàn)提供了以下目標允許差異調(diào)節(jié)細胞中LXRα的不同方面。為測定變體的功能，檢測在表達的LXRα變體存在下LXR靶基因的表達。
在這些實驗中，通過RT-PCR擴增人LXRα、RXRα和LXRα變體(LXRα-64)的編碼區(qū)。將PCR產(chǎn)物亞克隆入pCMV/myc/nuc表達載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并用于下文描述的實驗。
使用在含10％FBS的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中繁殖的HEK 293細胞進行表達實驗。用含LXRα(野生型)編碼序列的表達載體或編碼LXRα-64的表達載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細胞。所有的樣品都用編碼RXRα序列的表達載體共轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)在24孔板中一式三份進行轉(zhuǎn)染。每個孔用200ng LXRα表達載體(LXRα)、LXRα-64表達載體(L64)或?qū)φ召|(zhì)粒(pCMV)連同200ng人RXRα表達載體(RXRα)轉(zhuǎn)染。調(diào)節(jié)每個孔的加入量，以使每個孔含恒定量的DNA和pCMV表達載體。在轉(zhuǎn)染后6-8小時，用磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗細胞1次，然后將細胞與含10％無脂蛋白血清(LPDS)(Intracel Corp，Rockville，MD)的新鮮培養(yǎng)基和合成LXR激動劑(TO901317)和/或RXR激動劑(9-順式視黃酸，9RA)或僅載體(對照)溫育48小時。然后收獲細胞，使用QIAGEN試劑盒由細胞中分離總RNA。使用Applied Biosystems 7700序列檢測儀，以實時定量PCR測定基因表達水平。
當用人RXRα編碼序列和編碼新變體LXRα-64的序列共轉(zhuǎn)染并在HEK 293細胞中表達時，與用野生型LXRα和RXRα或空表達載體和RXRα轉(zhuǎn)染的細胞中的SREBP-c1表達相比，基礎(chǔ)的、LXR-配體依賴性和LXR+RXR配體依賴性誘導(dǎo)的SREBP-c1(LXR靶基因)表達急劇下降(圖11)。變體L64和RXRα引入到細胞中未影響另一種LXR靶基因ABCA1的基礎(chǔ)表達。但是，與天然LXRα和RXRα或空表達載體和RXRα轉(zhuǎn)染的細胞中的表達相比，LXR以及LXR+RXR-配體依賴性誘導(dǎo)的ABCA1表達在表達LXRα-64和RXRα的細胞中較少(圖12)。
這些數(shù)據(jù)表明，LXRα變體可差異性調(diào)節(jié)HEK 293細胞中的LXR靶基因表達，起LXRα誘導(dǎo)型基因表達的顯性負調(diào)控調(diào)節(jié)物的作用。因此，調(diào)節(jié)LXRα變體的表達或活性提供了在細胞中差異性調(diào)節(jié)LXRα相關(guān)性作用的方法。
這些數(shù)據(jù)還表明，LXRα變體的過表達可抑制SREBP-C1表達。另外，LXR激動劑對SREBP-1C表達的誘導(dǎo)在表達LXRα變體(例如LXRα-64)的細胞中顯著下降。因此，增加LXRα變體(例如LXRα-64)的表達或活性對治療與SREBP-1C表達相關(guān)的疾病有用。例如，通過過表達LXRα-64或增加在細胞中表達的LXRα-64的活性(例如通過給予與野生型LXRα相比差異性結(jié)合LXRα-64的化合物)破壞LXRα的活性，可提供抑制胰島素誘導(dǎo)SREBP-1C的方法，因此提供抑制不需要的胰島素誘導(dǎo)脂肪酸合成的方法。在另一個實施例中，過表達LXRα變體(例如LXRα-64)或選擇性激活LXRα變體(例如用差異性結(jié)合LXRα變體的化合物)可對SREBP-1C產(chǎn)生抑制，由此提供治療高甘油三酯血癥的方法，高甘油三酯血癥是心臟病的強烈預(yù)示。在另一個實施例中，降低SREBP-1C表達(通過增加LXRα變體如LXRα-64的表達或活性)可降低VLDL-TG(極低密度脂蛋白甘油三酯)的表達，這在某些疾病如糖尿病和某些類型的高脂蛋白血癥中是需要的效果。
在LXR激動劑存在下野生型LXR表達對參與反向膽固醇轉(zhuǎn)運的ABCA1具有上調(diào)作用。LXRα變體(例如LXRα-64)的表達對細胞進程幾乎沒有明顯作用。因此，LXRα變體過表達的有益之處在于其降低了特定LXRα靶基因(例如SREBP-1C)的表達，但不影響可能需要其表達的另一種LXRα靶基因(例如ABCA1)。
與RXR雜二聚化并活化這些雜二聚體的核受體導(dǎo)致特定基因的表達增加。對于這些基因中的一種或多種的表達不需要的情況(例如LXR介導(dǎo)的SREBP1c上調(diào))，如果表達的LXRα變體結(jié)合RXR，由此降低了用于雜二聚化的RXR的利用度，并因此減少了對不需要的基因表達的誘導(dǎo)，則LXRα-64的過表達可對受試者有益。
序列表SEQ ID NO1野生型LXRα完整編碼區(qū)的cDNA1atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt gatgcttctg901 gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt gagagtatca ccttcctcaa951 ggatttcagt tataaccggg aagactttgc caaagcaggg ctgcaagtgg1001 aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca gggccatgaa tgagctgcaa1051 ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt gctatcagca tcttctctgc1101 agaccggccc aacgtgcagg accagctcca ggtggagagg ctgcagcaca1151 catatgtgga agccctgcat gcctacgtct ccatccacca tccccatgac1201 cgactgatgt tcccacggat gctaatgaaa ctggtgagcc tccggaccct1251 gagcagcgtc cactcagagc aagtgtttgc actgcgtctg caggacaaaa1301 agctcccacc gctgctctct gagatctggg atgtgcacga atga
SEQ ID NO2野生型LXRα的推斷氨基酸序列1MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVMLL301 ETSRRYNPGS ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ351 LNDAEFALLI AISIFSADRP NVQDQLQVER LQHTYVEALH AYVSIHHPHD401 RLMFPRMLMK LVSLRTLSSV HSEQVFALRL QDKKLPPLLS EIWDVHE*
SEQ ID NO3編碼LXRα-64的cDNA序列1atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt ggctggagaa901 gggcaaggga tgaagggaga agcagagtgg gattatctgt gggaggggcc951 tccagacatc gagctgggag agccaaatct gctgggaagc agggatgagg1001 agaatcggcc tccctggaag aggccatgct ccaagaccag ccctcctagt1051 ccccgtttga ggtttgctgc ttgtgtgcag gtgatgcttc tggagacatc1101 tcggaggtac aaccctggga gtgagagtat caccttcctc aaggatttca1151 gttataaccg ggaagacttt gccaaagcag ggctgcaagt ggaattcatc1201 aaccccatct tcgagttctc cagggccatg aatgagctgc aactcaatga1251 tgccgagttt gccttgctca ttgctatcag catcttctct gcagaccggc1301 ccaacgtgca ggaccagctc caggtggaga ggctgcagca cacatatgtg
1351 gaagccctgc atgcctacgt ctccatccac catccccatg accgactgat1401 gttcccacgg atgctaatga aactggtgag cctccggacc ctgagcagcg1451 tccactcaga gcaagtgttt gcactgcgtc tgcaggacaa aaagctccca1501 ccgctgctct ctgagatctg ggatgtgcac gaatgaSEQ ID NO4LxRα-64的推斷氨基酸序列1MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVAGE301 GQGMKGEAEW DYLWEGPPDI ELGEPNLLGS RDEENRPPWK RPCSKTSPPS351 PRLRFAACVQ VMLLETSRRY NPGSESITFL KDFSYNREDF AKAGLQVEFI401 NPIFEFSRAM NELQLNDAEF ALLIAISIFS ADRPNVQDQL QVERLQHTYV451 EALHAYVSIH HPHDRLMFPR MLMKLVSLRT LSSVHSEQVF ALRLQDKKLP501 PLLSEIWDVH E*SEQ ID NO5LXRα-42e+編碼區(qū)的cDNA序列1atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc
701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt gatgcttctg901 gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt gagagtatca ccttcctcaa951 ggatttcagt tataaccggg aagactttgc caaagcaggg ctgcaagtgg1001 aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca gggccatgaa tgagctgcaa1051 ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt gctatcagca tcttctctgc1101 aggtgtggag gaggggcaat gggaaacagc aagagactta caccaaggag1151 ggctgcaggt cccacaggaa tcggtggggg gaggggggtg gtggcttggg1201 agggtggagg catttgctgt gttattttagSEQ ID NO6LXRα-42e+的推斷氨基酸序列1MSLWLGAgVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVMLL301 ETSRRYNPGS ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ351 LNDAEFALLI AISIFSAGVE EGQWETARDL HQGGLQVPQE SVGGGGWWLG401 RVEAFAVLF*SEQ ID NO7編碼LXRα-42e-的cDNA序列1atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc701 gagtcacggt gatgcttctg gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt751 gagagtatca ccttcctcaa ggatttcagt tataaccggg aagactttgc801 caaagcaggg ctgcaagtgg aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca851 gggccatgaa tgagctgcaa ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt901 gctatcagca tcttctctgc aggtgtggag gaggggcaat gggaaacagc951 aagagactta caccaaggag ggctgcaggt cccacaggaa tcggtggggg1001 gaggggggtg gtggcttggg agggtggagg catttgctgt gttattttag
SEQ ID NO8LXRα-42e-的推斷氨基酸序列1MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP201 QILPQLsPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTVMLL ETSRRYNPGS251 ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ LNDAEFALLI301 AISIFSAGVE EGQWETARDL HQGGLQVPQE SVGGGGWWLG RVEAFAVLF*SEQ ID NO9正向引物L(fēng)XRα-For的核苷酸序列5′-CGGTCGACATGTCCTTGTGGCTGGGGSEQ ID NO10反向引物L(fēng)XRα-Rev的核苷酸序列5′-CAGCGGCCGCTTCGTGCACATCCCAGATCTCSEQ ID NO11正向引物L(fēng)64-For的核苷酸序列5′-TGGGAAGCAGGGATGAGG-3′SEQ ID NO12反向引物L(fēng)64-Rev的核苷酸序列5′-GAGGGCTGGTCTTGGAGCA-3′SEQ ID NO13L64 TaqMan探針的核苷酸序列FAM-TCGGCCTCCCTGGAAGAGGCC-TAMRASEQ ID NO14部分LXRα啟動子序列；用于實施例6中提及的熒光素酶實驗1tgggaactgg agttcatagc aaaacaggaa gagccggtga gcaggaaact51 gggaatgggg cagggggtga atgaccagca gtaacctcag cagcttgcct101 cccacatctg gactggagca tctgcagggt tctcagcctc tcccctgtag151 cccaccagcc ctggctgctt ccattacagc acttcactgg cccaagacgc201 aacaagacaa gattgtcctg gactctgaca cagcaaaggg actggagtga251 ggacatctgg gttctgatcc cagcccagcc actaactgtg tggtcttgga
SEQ ID NO15LXR效應(yīng)元件(LXRE)的核苷酸序列5′-AGGTCAnnnnAGGTCA-3′SEQ ID NO16LXRα-64變體獨有的核苷酸序列，其形成了一個新的更大的外顯子6，連接野生型LXRα的外顯子6和7。
GCTGGAGAAG GGCAAGGGAT GAAGGGAGAA GCAGAGTGGG ATTATCTGTG GGAGGGGCCTCCAGACATCG AGCTGGGAGA GCCAAATCTG CTGGGAAGCA GGGATGAGGA GAATCGGCCTCCCTGGAAGA GGCCATGCTC CAAGACCAGC CCTCCTAGTC CCCGTTTGAG GTTTGCTGCTTGTGTGCAGG TGSEQ ID NO17由SEQ ID NO16編碼的推斷氨基酸序列VAGEGQGMKGEAEWDYLWEGPPDIELGEPNLLGS RDEENRPPWKRPCSKTSPPSPRLRFAACVQSEQ ID NO18LXRα-42e獨有的核苷酸序列，其形成了新的外顯子8，該序列包括野生型LXRα的外顯子8，產(chǎn)生了外顯子8更長的LxRα-42變體GTGTGGAGGA GGGGCAATGG GAAACAGCAA GAGACTTACA CCAAGGAGGG CTGCAGGTCCCACAGGAATC GGTGGGGGGA GGGGGGTGGT GGCTTGGGAG GGTGGAGGCA TTTGCTGTGTTATTTTAGGA TGAGAGAGCT TGGCTGGAGC ATGTCTCTAT ATTTTGGTTG CAATTTGGGGTATGGAACTG GACCCTGGCC AGACCTGCTC CTCAACTCTC TTGGTGACCT ATAGSEQ ID NO19由SEQ ID NO18編碼的推斷氨基酸序列GVEEGQWETARDLHQGGLQVPQESVGGGGWWLGRVEAFAVLFSEQ ID NO20LXRα啟動子中的LXR效應(yīng)元件(LXRE)的核苷酸序列5′-TGACCAgcagTAACCT-3′SEQ ID NO21L42-For的核苷酸序列5′-GGTGGAGGCATTTGCTGTGT-3′
SEQ ID NO22LA2-Rev的核苷酸序列5′-CCCAAATTGCAACCAAAATATAGA-3′SEQ ID NO23L42探針的核苷酸序列FAM-TTTAGGATGAGAGAGCTTGGCTGGAGCAT-TAMRA其它實施方案要理解地是，盡管已結(jié)合本發(fā)明的詳述闡述了本發(fā)明，但前文的描述意在說明，而不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書的范圍所限定。其它的方面、優(yōu)勢和修改都屬于以下權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1.一種編碼人肝臟X受體α(LXRα)變體多肽的分離核酸分子，所述分離核酸分子選自(a)編碼SEQ ID NO4、6、8、17或19的分離核酸分子；(b)編碼與SEQ ID NO4、6、8、17或19具有至少90％一致性的氨基酸序列的分離核酸分子；(c)在以下雜交條件下與(a)或(b)的分離核酸分子雜交的分離核酸分子6×SSC(1M NaCl)、50％甲酰胺、1％SDS，42℃，以1×SSC于42℃漂洗，以及以0.2×SSC和0.1％SDS于68℃漂洗；和(d)與(a)、(b)或(c)互補的分離核酸分子。
2.權(quán)利要求1的分離核酸分子，所述分離核酸分子由SEQ IDNO3、5、7、16或18組成。
3.權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述分離核酸分子為DNA分子。
4.權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述分離核酸分子為RNA分子。
5.權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述分離核酸分子包含SEQID NO3、5、7、16或18。
6.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有LXR反應(yīng)途徑活性的多肽。
7.權(quán)利要求1的核酸分子，其中由所述分離核酸分子編碼的多肽可與野生型LXRα形成二聚體。
8.權(quán)利要求1的核酸分子，其中由所述分離核酸分子編碼的多肽可與類視黃醇X受體(RXR)形成雜二聚體。
9.權(quán)利要求8的核酸分子，其中所述RXR是RXRα、RXRβ或RXRγ。
10.一種多肽，所述多肽由權(quán)利要求1的分離核酸分子編碼。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中所述多肽可與野生型LXRα形成二聚體。
12.權(quán)利要求10的多肽，其中所述多肽可與RXR形成雜二聚體。
13.權(quán)利要求12的多肽，其中雜二聚體的形成可抑制RXR和核受體之間形成雜二聚體，所述核受體與RXR天然雜二聚化。
14.權(quán)利要求12的多肽，其中雜二聚體的形成可抑制RXR同二聚體的形成。
15.權(quán)利要求12的多肽，其中RXR是RXRα、RXRβ或RXRγ。
16.權(quán)利要求10的多肽，其中所述多肽可表現(xiàn)出LXRα顯性負調(diào)控活性。
17.權(quán)利要求12的多肽，其中所述LXRα變體為LXRα-64、LXRα-42+或LXRα-42-的片段。
18.權(quán)利要求17的多肽，其中所述LXRα變體片段可表現(xiàn)出LXRα變體的至少一種功能。
19.一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含權(quán)利要求1的分離核酸分子。
20.權(quán)利要求19的構(gòu)建物，其中所述分離核酸分子有效連接至調(diào)節(jié)序列。
21.權(quán)利要求19的構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物為質(zhì)粒。
22.權(quán)利要求19的構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物包含pCMV/myc或pcDNA 3.1或是其衍生物。
23.一種宿主細胞或細胞的子代，其包含權(quán)利要求1的分離核酸分子。
24.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求19的構(gòu)建物。
25.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞為原核細胞。
26.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞為大腸桿菌。
27.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞為哺乳動物細胞。
28.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞為人細胞。
29.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞為人胚胎細胞。
30.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自人肝細胞瘤細胞(HepG2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、猴COS-1細胞和人胚腎細胞(HEK 293)。
31.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)細胞和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
32.一種分離的多肽，所述多肽包含LXRα-64、LXRα-42+或LXRα-42-的氨基酸序列。
33.權(quán)利要求32的分離多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO4、6、8、17、19的氨基酸序列、其天然等位基因變體或其片段。
34.權(quán)利要求32的分離多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO4、6、8、17、19的氨基酸序列或其片段組成，該片段不與SEQ ID NO2的超過5個連續(xù)氨基酸共享同源性。
35.權(quán)利要求32的多肽，所述多肽進一步包含異源氨基酸序列。
36.一種檢測樣品中是否存在權(quán)利要求32的多肽的方法，所述方法包括a)使樣品與選擇性結(jié)合權(quán)利要求32的多肽的化合物接觸；和b)測定該化合物是否結(jié)合樣品中的多肽。
37.權(quán)利要求37的方法，其中所述結(jié)合多肽的化合物為抗體。
38.一種試劑盒，所述試劑盒包含選擇性結(jié)合權(quán)利要求32的多肽的化合物和使用說明。
39.一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合權(quán)利要求14或權(quán)利要求32的分離多肽。
40.權(quán)利要求39的抗體，其中所述抗體為多克隆抗體。
41.權(quán)利要求39的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
42.權(quán)利要求39的抗體，其中所述抗體含可檢測標記。
43.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求39的抗體和藥物可接受載體。
44.一種鑒別新LXRα變體核酸分子的方法，所述方法包括(a)在嚴格雜交條件下，使含一種或多種核酸分子的樣品與LXRα變體核酸分子或其片段雜交；(b)鑒別樣品中與LXRα變體核酸分子雜交的核酸分子，由此鑒別推定的LXRα變體核酸分子；和(c)測定推定的LXRα變體核酸分子的序列，其中其序列與LXRα變體序列不相同的推定LXRα變體核酸分子是新LXRα變體核酸。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述新LXRα變體核酸分子編碼LXRα變體多肽。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述新LXRα變體多肽與LXRα變體多肽相比包含一個或多個保守置換。
47.一種檢測生物樣品中LXRα變體表達的方法，所述方法包括(a)使生物樣品與權(quán)利要求1的核酸分子雜交；和(b)測定核酸分子是否與樣品中的核酸分子雜交，其中雜交表示表達了LXRα變體。
48.權(quán)利要求47的方法，其中對雜交量進行測定。
49.一種降低細胞中RXR二聚體形成的方法，所述方法包括使細胞與權(quán)利要求10的多肽接觸，由此抑制RXR二聚體形成。
50.權(quán)利要求49的方法，其中RXR雜二聚化受到抑制。
51.權(quán)利要求49的方法，其中RXR同二聚化受到抑制。
52.一種鑒別LXRα變體配體的方法，所述方法包括(a)提供含LXRα變體多肽的樣品；(b)使樣品與測試化合物接觸；(c)測定測試化合物是否可結(jié)合LXRα變體，其中可結(jié)合LXRα變體的化合物為LXRα變體配體。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述配體的Kd小于1×106。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述配體的Kd小于1×109。55.權(quán)利要求52的方法，其中RXR存在于樣品中。
56.權(quán)利要求52的方法，所述方法進一步包括測定LXRα變體配體是否可結(jié)合野生型LXRα。
57.權(quán)利要求52的方法，其中所述LXRα變體配體不結(jié)合野生型LXRα。
58.權(quán)利要求52的方法，其中與野生型LXRα相比，所述LXRα變體配體對LXRα變體的親和性較高。
59.一種調(diào)節(jié)LXRα調(diào)節(jié)性基因表達的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)LXRα變體的表達或活性。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述LXRα調(diào)節(jié)性基因為FAS、CYP7A1(膽固醇7-α羥化酶)、ApoE、CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4或PLTP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述LXRα調(diào)節(jié)性基因為SREBP-1C(甾醇調(diào)節(jié)結(jié)合元件1c)、FAS、CYP7A1(膽固醇7-α羥化酶)、ApoE、CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4或PLTP(磷脂轉(zhuǎn)移蛋白)。
62.權(quán)利要求59的方法，其中所述LXRα調(diào)節(jié)性基因的表達增加。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述LXRα調(diào)節(jié)性基因的表達降低。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述LXRα變體為LXRα-64、LXRα-42+或LXRα-42-。
65.一種調(diào)節(jié)受試者中LXRα變體表達或活性的方法，所述方法包括將LXRα變體核酸分子或其片段以足以表達LXRα變體的量和時間導(dǎo)入受試者中，并調(diào)節(jié)LXRα的表達或活性。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述LXRα變體抑制野生型LXRα的表達或活性。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述活性為LXRα雜二聚化。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述LXRα雜二聚化受配體刺激。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述LXRα變體為LXRα-64、LXRα-42+或LXRα-42-。
70.一種調(diào)節(jié)受試者中RXR表達或活性的方法，所述方法包括將LXRα變體核酸分子或其片段以足以表達LXRα變體的量和時間導(dǎo)入受試者中，并調(diào)節(jié)RXR的表達或活性。
71.權(quán)利要求70的方法，其中RXR的雜二聚化受調(diào)節(jié)或RXR的同二聚化受調(diào)節(jié)。
72.權(quán)利要求70的方法，其中RXR與PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR的雜二聚化受調(diào)節(jié)。
73.權(quán)利要求70的方法，其中RXR雜二聚化受抑制或RXR同二聚化受抑制。
74.權(quán)利要求70的方法，其中所述LXRα變體為LXRα-64、LXRα-42+或LXRα-42-。
75.權(quán)利要求70的方法，其中所述RXR為RXRα、RXRβ或RXRγ。
76.一種治療具有RXR相關(guān)疾病或病癥的個體的方法，所述方法包括給予該個體藥學(xué)有效量的LXRα變體。
77.一種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求23的細胞和藥物可接受載體、權(quán)利要求1的分離核酸分子和藥物可接受載體、或權(quán)利要求10的多肽和藥物可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明提供人LXPα變體多肽和編碼這種多肽的核酸。本發(fā)明還提供這種多核苷酸和多肽的治療、診斷和研究用途以及生產(chǎn)方法。
文檔編號G01N33/50GK1894409SQ200480030439
公開日2007年1月10日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者劉強遠, P·納姆比 申請人:惠氏公司