專利名稱：用于糖類的傳感系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總的來說涉及熒光傳感分子，具體來說涉及一類新的模塊熒光傳感分子。
現有技術的描述已經開發(fā)了大量的分析方法用來檢測包含在生物化學樣品中的分析物并對它們進行定量測定。目前使用的分析方法中大部分依賴于分析物與分析試劑之間的特異性結合反應。分析物可以是大的復雜分子，例如蛋白、病毒、病毒抗原、細菌細胞、細胞表面受體、酶、激素、多糖、糖蛋白、脂蛋白，或小的半抗原分子，例如肽、某些激素、治療藥物和濫用的藥物等。
結合性分析方法根據它們的形式分成兩個主要的類別同質的和異質的分析方法。同質分析是基于分析物和分析試劑之間的單相反應。異質分析一般來說包括將包含在液體樣品中的分析物與連接在固相支持物上的分析試劑結合。已經有各種不同的材料被用做支持表面，包括玻璃棒、玻璃珠、二氧化硅浸漬的條帶、玻璃纖維和微粒。
總的來說，染料、特別是熒光染料，在同質的和異質的分析方法中都經常被使用，以提供可檢測的信號。但是，分析物與標記物結合而產生的熒光信號的精確檢測，常常被由于生物樣品本身的熒光而產生的高的、變化的背景所阻礙。
液體流式細胞計量術可以幫助克服這個問題。在流式細胞計量術中，將與分析物結合的標記的微粒通過激光束。微粒所發(fā)射出的熒光信號被測量并與分析物的存在和量關聯。這種方法的主要優(yōu)點是它在樣品中存在其它未被結合的成分的情況下，精確檢測和測量與結合的分析物相關的熒光信號的能力。
糖類代表了一類重要的生物化學分析物。現有的測定它們在樣品中的濃度的方法一般依賴于酶法分析。盡管酶法分析已經被證明是可靠的，但是它們必須依賴相當不穩(wěn)定的酶，這些酶在存在其底物的情況下將被耗盡。此外，傳統(tǒng)的酶學分析方法不能被應用在方便的流式細胞計量方式中?；谖⒘５姆治龇椒?，例如在流式細胞計量術中使用的分析方法需要信號的變化局限于微粒。但是常用的酶學分析方法使用可自由擴散的中間體，與這種需要相違背。
糖類的測定在臨床背景中特別重要。糖尿病和低血糖癥的治療需要經常地測量組織的葡萄糖濃度。這通常是通過每天幾次抽取少量血液樣品(例如通過針刺手指)而完成的。通常使用刺血針從病人抽取一滴血，將這滴血滴在試紙條上，在一個小儀器上讀數。這個過程是有痛感的、侵入性的和耗時的。
最近，在1999年9月10日提交的美國專利申請Ser.No.09/393,738中公開了一種侵入性最低的測量體內葡萄糖的方法，該申請已經被正常指定給本發(fā)明的受讓人，并在此引為參考。該方法基于被植入的傳感微粒的使用，這些傳感微粒能夠對身體中的分析物濃度作出反應而產生可檢測的分析物信號。該提議的方法比常規(guī)的針刺手指測量血液中D-葡萄糖的技術侵入性小。它只需要定期替換皮膚中的傳感微粒。
傳感微粒一般含有熒光傳感分子，它們或結合在微粒的表面或摻入微粒體內部。傳感分子對靶分析物具有特異性。傳感分子與分析物的結合產生了能夠反映分析物濃度的可檢測的信號。當分析物是葡萄糖時，使用與熒光劑結合的二硼酸。
類似的特異性針對葡萄糖的熒光傳感分子，在James等，Journal ofthe American Chemical Society，1995，vol.117，8982-8987頁、James等，美國專利No.5,503,770以及Takeuchi等，Tetrahedron，vol.52，No.4，1195-1204頁中也有描述。簡單來說，James和Takeuchi的熒光傳感分子具有下面的通式 在通式中，F代表熒光基團，R是小的脂肪或芳香基團，n+m是2或3。傳感分子的熒光強度對氨基基團和熒光基團之間的光誘導的電子傳遞(PET)作出反應而發(fā)生變化，而光誘導的電子傳遞受葡萄糖的羥基與一對硼酸的結合的調節(jié)。在未結合葡萄糖的情況下，熒光基團產生的熒光被氮原子的未共享電子對所猝滅。當結合了葡萄糖時，未共享電子對被用于鍵的形成而不參與熒光的猝滅。結果，傳感分子固有的熒光被表現出來。
發(fā)明簡述盡管上面描述的熒光傳感分子在生物化學分析和臨床化驗中的應用與以前的基于酶的體外方法相比提供了某些優(yōu)點，但它仍然具有嚴重的缺點。因為熒光基團被用做隔離物將糖結合基團分離開來并提供所需的分析物選擇性，這就必需要求對熒光基團的類型、它的大小和構象有嚴格的限制。出于同樣的原因，對于能夠與被公開的熒光化合物特異性結合并產生可檢測信號的分析物的類型、大小和構象也有極大的限制。此外，盡管引用的技術建議在異質的分析方式中使用PET類型的熒光化合物，但沒有提供將化合物結合在固相支持物上的方法。此外，考慮到對于熒光分子的構象和結構的嚴格限制，這樣的結合將是特別困難的。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供熒光傳感分子、特別是PET類型的傳感分子，它具有模塊式的結構，允許獨立地選擇熒光基團和結合基團。本發(fā)明的另一個目的是提供能夠被容易地改造以與廣范圍的分析物特異性結合的熒光傳感分子。本發(fā)明的下一個目的是提供可以用于同質的和異質的結合分析形式中并可以容易地結合到固相表面的熒光傳感分子。最后，本發(fā)明還有一個目的是提供方便的制造和使用熒光傳感分子的方法。
這些以及其它的目的和優(yōu)點在本發(fā)明的模塊式熒光傳感分子中實現了，它具有下面的通式
在上面的通式中，F1是熒光團，N是氮原子，Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團。n＝1或2，m＝1或2，y＝1或3，x是一個整數。結合基團能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1的復合物。結合基團的例子包括但不限于硼酸、冠醚和氮雜冠醚，例如1，4，7，10，13-五氧-16-氮雜-環(huán)十八烷(aza 18-crown-6)和1，4，7，13-四氧-10-氮雜-環(huán)十六烷(aza 15-crown-5)。在優(yōu)選實施方案中，Bd1是R1-B(OH)2，Bd2是R2-B(OH)2。R1和R2是彼此獨立選擇的脂肪族或芳香族官能團，B是硼原子。
優(yōu)選情況下Sp含有6個碳原子。
另一方面，本發(fā)明提供了合成模塊式熒光傳感分子的方法。該方法包括下列步驟(a)形成具有下列通式的不對稱化合物 以及(b)用Bd1和Bd2基團取代氫原子。
在上面的通式中，F1是熒光團，N是氮原子，H是氫原子，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團。Bd1和Bd2是能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1復合物的獨立選擇的結合基團，n＝1或2，x是一個整數。
本發(fā)明還提供了標記固相基質的方法。該方法包括下列步驟(a)提供固相基質；(b)提供本發(fā)明通式(2)的模塊式熒光傳感分子，其中An能夠被結合到固相基質上；(c)將傳感分子與固相基質在足夠將傳感分子連接到基質上的條件下進行反應。
固相基質可以是例如珠子、顆?；蛭⒘?。當將傳感分子結合到珠子上時，它可以結合在珠子的外表面上，也可以結合到珠子的內部。
本發(fā)明還提供了用于檢測糖類的分析系統(tǒng)，包括a)已知含有或懷疑含有糖的樣品；一種或一種以上的固相基質，固相基質上連接有一個或多個糖傳感分子，它們具有下面的通式 在上面的通式中，Z從氫、烷基或芳香基中選擇；N是氮原子；Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團，其中結合基團能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1復合物；Sp是脂肪族間隔物；An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團；S是固相基質；n＝1或2，m＝1或2，y＝1或2，x是一個整數。以及b)檢測與傳感分子結合或不結合的至少一個糖的裝置。
在一個實施方案中，系統(tǒng)選擇性地檢測葡萄糖。
本發(fā)明的模塊式熒光傳感分子已經被發(fā)現提供了許多優(yōu)點。傳感分子的模塊式結構允許對它的功能性部分進行方便的替換以適應廣范圍的結構、結合親和性和溶解性。即時傳感分子的錨定位點和不對稱結構允許將傳感分子方便地與各種固相基質結合，這在異質的分析方式中是需要的。此外，本發(fā)明的熒光傳感分子將信號的產生與分析物的結合相偶聯，從而使分析物的測量區(qū)域化。因此，傳感分子非常適合應用于基于顆粒的分析方法和流式細胞計量術中。最后，在本發(fā)明中，使用了特別的間隔基團以在分析物結合基團間提供了所需的分子內距離，這控制了分析物選擇性。另一方面，常規(guī)的PET類型傳感分子使用熒光團作為間隔物，這對可以使用的熒光團的類型提出了嚴格的限制。相反，在本發(fā)明中。熒光團可以不受其大小或構象的限制而進行選擇。
本發(fā)明還包括了非熒光的糖類傳感分子。在一個實施方案中，這種非熒光的糖類傳感分子被結合在珠子上。這個實施方案可用于在競爭性分析中檢測糖類的方法。在一個實施方案中，方法選擇性地檢測葡萄糖。
考慮到它的多方面適合性，本發(fā)明的新型熒光傳感分子可用于廣范圍的分析和臨床實踐中。該傳感分子在糖類的檢測和定量分析中特別有益。
附圖描述在參考下面的描述連同隨附的圖后，上面提到的和其它的本發(fā)明的特點以及獲得它們的方式將變得更明顯，并得到最好的了解。這些圖僅描述了本發(fā)明典型的實施方案，并沒有對它的范圍進行限制。


圖1顯示了在基于珠子的固相基質上合成本發(fā)明的熒光傳感分子。
圖2顯示了用于基于珠子的本發(fā)明的多分析物檢測系統(tǒng)的示例性的珠子，其中珠子1表示珠子-受體-分析物-受體復合物，珠子2表示珠子-受體-分析物復合物。
圖3是本發(fā)明的示例性流式細胞計量系統(tǒng)的示意圖。
圖4是使用圖2中示例的并用于本發(fā)明的珠子檢測系統(tǒng)所進行的方法的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了具有下列通式的模式熒光傳感分子 在上面的通式中，F1是熒光團，N是氮原子，Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團。在通式(2)中，n、m、x和y都是整數，其中n＝1或2，m＝1或2，y＝1或2，x是一個整數。在一個實施方案中，x＝0-10。結合基團能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1的復合物。
在本發(fā)明中，熒光團F1不作為結合基團之間的間隔物。因此，它可以從廣范圍的具有不同大小和構象的官能團中選擇?？梢越邮艿臒晒鈭F的例子包括但不限于含有π-電子系統(tǒng)的官能團，例如萘基、蒽基、芘基、菲基和苝基。熒光團可以是未取代的，也可以是取代的。例如，眾所周知，某些分子可以通過在分子中導入強的堿性或酸性基團、例如羧酸或磺酸，而被賦予水溶性。因此，熒光團可以用磺酸基團取代以適應于同質的分析方式。
盡管傳感分子的實施方案在其分子結構中含有熒光團，但在不存在分析物的情況下它不發(fā)射熒光。如同在簡介中所解釋的那樣，在PET分子中，熒光團的熒光被氮原子的未共享電子對所淬滅。當傳感分子與樣品中包含的分析物結合時，氮原子的未共享電子對參與了傳感分子與分析物的分子內復合物的形成。結果，傳感分子本身固有的熒光被表達出來。
在本發(fā)明中，結合基團可以是任何官能團，只要它們能夠為分析物與傳感分子提供所需的特異性結合，并形成1∶1的復合物。優(yōu)選情況下，結合基團是缺少電子的基團。電子的缺乏在結合基團與分析物特異性結合時使未共享的電子對從氮原子向結合基團移動?？山邮艿慕Y合基團的例子包括但不限于硼酸、冠醚和氮雜冠醚，例如1，4，7，10，13-五氧-16-氮雜-環(huán)十八烷(氮雜18-冠-6)和1，4，7，13-四氧-10-氮雜-環(huán)十六烷(氮雜15-冠-5)?？梢允褂帽景l(fā)明的傳感分子進行鑒定的分析物的例子包括但不限于糖類、氨基糖類和羰基糖類。
在優(yōu)選實施方案中，Bd1是R1-B(OH)2，Bd2是R2-B(OH)2。R1和R2是彼此獨立選擇的脂肪族或芳香族官能團，B是硼原子?？山邮艿腞1和R2基團的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、甲氧基、乙氧基、丁氧基和苯氧基基團。
結合基團被脂肪族間隔物Sp所分開。間隔物的碳骨架長度被選擇得與分析物的大小匹配。在一個實施方案中，分析物是葡萄糖，碳骨架的長度可以使得結合基團之間的距離與葡萄糖的大小相當。
盡管間隔物可以有直鏈的、支鏈的或環(huán)形的結構，在優(yōu)選實施方案中間隔物是直鏈的烷基。一般來說，間隔物含有從1個到9個碳原子，但是較大長度的間隔物也可以被使用以匹配分析物的大小。例如，當分析物是葡萄糖時，間隔物可以含有6個碳原子。
傳感分子的錨定基團An提供了將傳感分子固定在固相基質/支持物上、例如用于異質結合分析方法中的基質上的方法。在本文中，術語固相基質、固相支持物、基質和支持物可以互換使用。An基團或者直接或者通過碳橋-(CH2)x-連接到傳感分子的一個氮原子上。An基團的類型和碳橋中碳的數量(x)經過選擇以便能夠為傳感分子與固相基質提供牢固的連接。例如在一個實施方案中，傳感分子被連接到微米級的珠子上。連接了本發(fā)明的傳感分子的微米級的珠子可以用于各種應用中，包括流式細胞計量術。一般來說，An包含了有機官能團。在一個實施方案中，An包含了苯基。
錨定基團An是可選擇的。例如在同質分析中，不需要連接傳感分子。因此，傳感分子可以被合成為不帶有錨定基團或帶有官能團，例如甲基和芐基。
本發(fā)明為在其功能性元件之間具有最小的相互作用的模塊式傳感分子提供了框架。本發(fā)明的傳感分子的每個獨立的功能性元件都可以被容易地替換，以適應廣范圍的分析物。例如，在一個實施方案中，對傳感分子的所有功能性基團和碳橋的長度進行了選擇，提供了傳感分子對葡萄糖的選擇性結合。
在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的模塊式熒光傳感分子具有下面的通式 在上面的通式(4)中，F1是熒光團，N是氮原子，B是硼原子。R1和R2是允許分析物與硼酸基團中的羥基共價結合形成1∶1的穩(wěn)定復合物的脂肪族或芳香族官能團。R1和R2彼此獨立地選擇。An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團；x是任何整數。在一個實施方案中，x＝0-10。
屬于本發(fā)明的通式(2)和(4)的典型化合物具有下面的通式
意外地是，化合物(5)對葡萄糖具有特異的敏感性，并且當與包含在樣品中的葡萄糖結合時發(fā)射出強烈的熒光。這種對葡萄糖的特異性可以用化合物(5)的結構來解釋。兩個硼酸基團彼此之間被包含6碳鏈的間隔物所分開，使得它們結合了葡萄糖的順-1，2-和4，6-羥基基團，與葡萄糖形成很強的1∶1復合物。
另一方面，本發(fā)明提供了合成模塊式熒光傳感分子的方法。該方法包括下列步驟(a)形成具有下列通式的不對稱化合物 以及(b)用Bd1和Bd2基團取代氫原子。
在上面的通式中，F1是熒光團，N是氮原子，H是氫原子，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團。Bd1和Bd2是能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1復合物的獨立選擇的結合基團，n＝1或2，x是任何整數。在一個實施方案中，x＝0-10。在一個實施方案中，取代氫原子的步驟包括加入鄰溴甲基苯基硼酸。例如，可以使用例如在圖1中顯示的和在實施例1中詳細討論的反應方案。
本發(fā)明還提供了標記固相基質的方法。該方法包括下列步驟(a)提供固相基質；(b)提供通式(2)中的本發(fā)明的模塊式熒光傳感分子，其中An能夠被結合到固相基質上；(c)將傳感分子與固相基質在足夠將傳感分子連接到基質上的條件下進行反應。
對本發(fā)明而言，不妨礙傳感分子與基質結合的條件就是足夠的條件。本領域的專業(yè)技術人員將了解根據固相基質的類型和錨定基團的本質來說什么樣的條件是足夠的。例如，當錨定基團是氨基、優(yōu)選為伯胺時，固相基質應該含有羧酸基團，足夠的條件可以通過加入偶聯試劑來滿足。可接受的偶聯試劑包括但不限于1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺或水溶性的碳二亞胺，以及羰二咪唑(CDI)。此外，N-羥基琥珀酰亞胺可以被加入到反應混合物中以獲得更好的反應效率。按照本發(fā)明的一個實施方案，當錨定基團是伯胺時，傳感分子通過將1，3-二異丙基碳二亞胺(DIPC)、1-羥基-1H-苯并三唑(HOBt)、4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)與N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑混合后，將混合物在室溫攪拌2-24小時而結合到基質上。
本發(fā)明還提供了連接或固定在固相基質例如珠子上的糖類傳感分子。在這個實施方案中，糖類傳感分子并不是必需在其分子結構中含有熒光團。與固相基質結合的糖類傳感分子可以具有下面的通式
在上面的通式中，Z從氫、烷基基團、芳基基團和熒光團中選擇，N是氮原子，Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子連接到固相基質(S)上的錨定基團。在通式(6)中，n、m、x和y是整數，其中n＝1或2，m＝1或2，y＝1或2，x是一個整數。在一個實施方案中，x＝0-10。在一個實施方案中，結合基團能夠與分析物分子結合形成穩(wěn)定的1∶1的復合物。
在一個實施方案中，糖類傳感珠具有能夠選擇性結合和檢測葡萄糖的糖類傳感分子，該分子具有下面的結構 在上面的通式中，Z從氫、烷基基團和芳基基團中選擇，N是氮原子，Sp是脂肪族間隔物，An是將傳感分子連接到固相基質(S)上的錨定基團。Z可以是熒光團。
在另一個實施方案中，糖類傳感珠含有一個或多個選擇性結合葡萄糖的傳感分子以檢測葡萄糖。結合在珠子上的傳感分子/配體可以具有下面的結構
通式(8)中顯示的葡萄糖傳感分子在結合葡萄糖后不產生在光學上可檢測的熒光信號。這種化合物的制備在實施例3和圖1中進行了詳細的描述和圖示。
固相基質可以是珠子、顆?；蛭⒘５龋诒疚闹行g語珠子、顆粒和微粒可以互換使用。糖類傳感珠的直徑一般在大約0.1到大約50微米的范圍內。在本發(fā)明的一個實施方案中，珠子的大小在大約0.1到大約20微米的范圍內。珠子一般懸浮在液體中以便它們的密度在每毫升大約0.5到大約2克之間的范圍內。這些大小和密度范圍的組合使得糖類傳感珠可以被大多數液體轉移裝置例如滴管、泵和某些閥當作簡單的液體來處理。
優(yōu)選情況下珠子是圓形的和均勻的，例如通?？梢酝ㄟ^乳液聚合形成的聚苯乙烯乳膠珠。它們也可以用其它材料通過本領域現有的其它方法制成。對珠子還可以采用某些手段，例如帶有相同的電荷，以便有效地防止與其它顆粒狀的傳感器相互作用。材料和方法的例子包括但不限于將溶解的聚合物滴鑄而產生的增塑聚氯乙烯(PVC)珠或從溶膠產生的玻璃樣的珠子。此外，傳感珠可以用生物可再吸附的聚合物制成。生物可再吸附的聚合物的例子包括但不限于聚羥基乙酸(PGA)、聚DL-丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、淀粉、明膠等。
本發(fā)明的傳感珠可以是親水性的珠子，例如但不限于控制孔徑的玻璃珠(CPG)或聚合物凝膠。它也可以是具有適當的增塑劑或足夠低的玻璃轉變溫度、以允許小的分析物自由通過的疏水性珠子。此外，它可以是半透膜，例如但不限于脂質體。為了避免傳感分子的降解，傳感分子可以結合在親水性珠子的內部，例如CPG珠或聚合物凝膠的孔中。受體也可以被捕獲在具有適當的增塑劑以允許小的分析物自由通過的疏水性珠子的內部。受體還可以被包裹在半透膜的內部。對本發(fā)明而言，增塑劑如果允許小的分析物自由通過進入到疏水珠中，就是適當的增塑劑。這樣的增塑劑的例子包括但不限于己二酸二辛酯、己二酸二異癸酯等。根據其它的實施方案，本發(fā)明的傳感分子也可以結合在疏水的或其它不溶的珠子的表面。
分析系統(tǒng)本發(fā)明還提供了同時檢測一個以上分析物的分析系統(tǒng)。這個系統(tǒng)在Michael L.Bell等2001年11月14日提交的名稱為“分析檢測系統(tǒng)”的共同未決申請No.09/990,678中有詳細的描述，在本申請中以其全文引為參考。該系統(tǒng)利用了熒光標記的珠子以分辨大量珠子的亞群并對大量所需的分析物進行定量。在這種分析系統(tǒng)中使用的熒光標記物可以用常用的源激發(fā)，并在與系統(tǒng)中的自身和其它熒光源可分辨的波長處發(fā)射，激發(fā)波長位于光譜的遠紅和近紅外區(qū)。
按照本發(fā)明的這個實施方案，大量的分析物可以通過將微射流學和熒光珠傳感技術相結合而同時檢測和測量。大量分析反應被分隔在一組微米級的珠子上，用裝置例如流式細胞儀分別進行讀數。裝置確定了每組珠子的身份以及每個珠子與其分析物反應的程度。每組珠子1)帶有獨特的熒光標記物的組合以編碼珠子；2)對一種分析物或一類所需分析物具有特異性；并且3)含有用于鑒定每個所需分析物的熒光染料(即分析染料或熒光分析物檢測染料)。
按照本發(fā)明的方法，允許分析樣品與一組對不同所需分析物特異的珠子進行反應。然后將珠子通過通過檢測裝置例如流式細胞儀。已經與它們特異的所需分析物反應的珠子產生熒光發(fā)射光譜，該光譜對應于與特定珠子和所需分析物相關的熒光染料。裝置至少部分通過整合在珠子中的熒光標記物的獨特組合來鑒定珠子。將來自熒光標記物的信息與來自分析物特異性熒光染料的信息相關聯，相應的結果允許在一個反應中定量鑒定大量的分析物。
本文描述的檢測系統(tǒng)和方法的一個方面是制備和使用適當標記的珠子。在本發(fā)明中使用的珠子一般由聚合的材料例如聚苯乙烯制成。對于本領域的專業(yè)技術人員來說，適當的制備可用于本發(fā)明的珠子/微粒的技術是眾所周知的。適當的制備技術的例子在美國專利No.4,609,689中有描述，在此引為參考。此外，珠子/微粒也可以從供應商例如Bio-Rad實驗室公司或Bangs實驗室公司獲得。
在本發(fā)明中使用的熒光標記物在優(yōu)選情況下、但不是必需包埋在珠子中。將熒光標記物內部包埋在珠子中通過將標記物與引起熒光降解的環(huán)境因素相屏蔽而增加了信號的穩(wěn)定性。將熒光標記物內部包埋在珠子中也保留了珠子的外部用于結合分析物和/或分析染料。
熒光標記物通過使用本領域專業(yè)人員所熟知的方法加入到珠子中。一種已知的方法是澆鑄方法，例如在美國專利Nos.4,302,166和4,162,282中所描述的澆鑄方法，在此引為參考。在該方法中，熒光標記物和聚合物被溶解在溶劑中。溶液通過細的噴嘴被趕成細流進入水套中。壓電轉換器將細流打碎成不連續(xù)的液滴，當溶劑擴散到水中后固化成珠子。另一種方法是膨脹-收縮方法。這個方法由L.B.Bangs進行了描述(均一的膠乳顆粒；Seragen Diagnostics Inc.1984，40頁)，在此引為參考。膨脹-收縮方法是將脂溶性或疏水的染料加到攪動的珠子中，在溫育一段時間后，將任何沒有被珠子吸附的染料洗掉。
一組珠子可以根據用于編碼珠子的熒光標記物的組合與另一組珠子分辨開來。多組珠子可以被用來在單個反應中特異性檢測多種分析物。在一個反應中檢測多種分析物可以簡化多個分析步驟，并導致由分別的分析所帶來的結果之間可變性的減少。
在本發(fā)明中，不同量的熒光標記物被用在不同組珠子的各種組合中以便將每一組珠子與另一組珠子分辨開來。在優(yōu)選情況下，但并不是必需的，珠子用至少兩種熒光標記物標記，更大數量的標記物的組合可以被用來產生更大數量的珠子種群。例如，含有一份標記物A和兩份標記物B的珠子可以與含有兩份標記物A和一份標記物B的第二個珠子分辨開來。這些珠子可以與含有兩份標記物A和四份標記物B或四份標記物A和兩份標記物B的第三個珠子分辨開來。成對的熒光標記物可以以這種方式使用以增加可分辨的珠子種群的數量。因此，如果一個分析檢測系統(tǒng)能夠分辨10種不同量的標記物A，那么單獨的標記物A只能用來分辨10種不同的珠子種群。但是，如果一個分析檢測系統(tǒng)另外還能分辨10種不同量的標記物B，那么標記物A和標記物B就可以組合使用，對10乘以10、或100種不同的珠子種群的身份進行熒光標記。如果使用第三種標記物，可以鑒定的珠子的數量將擴展到1000種可分辨的珠子種群。
對于最適數量的不同的珠子種類來說，熒光珠標記物的發(fā)射光譜精確地對應于在特定珠子組中使用的不同熒光標記物的濃度，將是有利的。為了通過熒光對珠子上的多種分析物進行精確的鑒定和量化，在外部的熒光源、分析中使用的熒光標記物和與分析物相關的熒光染料之間有最小的干擾，也是有利的?，F有的檢測系統(tǒng)和方法不能提供可以同時提供這些優(yōu)點的基于熒光的檢測系統(tǒng)。
珠子的大小是編碼珠子的另一個參數?？梢再徺I到預制大小的珠子或制備不同的大小均一的珠子。在優(yōu)選情況下，但并不是必需的，珠子的大小是5.5、7.0和10.2微米。珠子的大小可以與熒光分離開分別檢測和測定，并且與熒光標記物一起與分析物檢測染料相關聯，對所需的分析物進行檢測和定量。如果只需要較少量的編碼的珠子，用熒光標記物的組合來標記珠子是優(yōu)選的。
珠子中熒光標記物的濃度與發(fā)射信號的量值成比例。可分辨的珠子組合的最大數量通過用同樣量值的發(fā)射信號制備珠子而獲得。希望但不是必需的是，不同大小的不同組的珠子的發(fā)射信號的量值有大約同樣的量值。為了達到這個目的，在小珠子中熒光標記物的濃度被增加，并且/或大珠子中熒光標記物的濃度被減小。用于本發(fā)明的熒光標記物的發(fā)射波長是在電磁光譜的近紅外區(qū)。對于本發(fā)明而言，電磁光譜的近紅外區(qū)是波長大于750nm并小于1000nm的光。用具有較長發(fā)射波長的熒光標記物以一系列固定的預定的量標記珠子，以及完成這項工作的方法，在本技術領域內是一項改進。這些熒光標記物的吸收和發(fā)射光譜遠離常見的干擾物質的光譜。在本發(fā)明中使用的熒光標記物的長的發(fā)射波長允許對用做分析信號檢測大量所需分析物的傳感染料有較大的選擇余地。因此，發(fā)射波長小于750nm的熒光染料可以被包括在分析傳感染料的侯選者中，而不考慮與熒光標記物的重疊的發(fā)射光譜。
希望但不是必需的是，熒光染料在用于制備編碼的珠子的溶劑中和珠子本身中在儲存和使用期間是穩(wěn)定的。這包括了使用條件，在其中，珠子被重復加熱到接近水的沸點。此外，希望但不是必需的是，用于編碼珠子的熒光標記物在將它們注入珠子所需的的溶劑中是可溶的。在有利的情況下，熒光標記物在延長儲存于水性介質的過程中、或在各種分析例如DNA擴增的高溫過程中，不從珠子中浸出。
另外還希望但并不是必需的是，一組中的熒光標記物不通過能量轉移發(fā)生明顯的相互作用，即使是在包埋于單一的珠子中時。這樣的相互作用可能導致不準確的熒光檢測(例如在存在較長波長染料的情況下，較短波長染料的熒光的明顯損失)。這些類型的相互作用有可能使得同時使用染料作為珠子的標記物復雜化。此外，在有利的情況下，熒光標記物不與用做分析染料的熒光染料有明顯的相互作用，這樣的熒光染料例如ETH 5294，它是用于測量靶陽離子的珠狀極棒中的熒光pH指示劑。
有利的但不是必需的是，熒光標記物享有同樣的激發(fā)激光。當系統(tǒng)中使用同樣的激發(fā)激光時，檢測系統(tǒng)通常更簡潔，使用一個激光來激發(fā)熒光標記物組合一般來說更有經濟效益。但是，在其它的實施方案中也可以在檢測系統(tǒng)中使用多個激發(fā)激光來激發(fā)熒光標記物組合。
當組合起來用在珠子中時，熒光標記物的發(fā)射波長一般可以互相分辨開，但是可以有重疊的部分?？煞直娴臒晒鈽擞浳锝M合是指帶有一種熒光標記物組合的一個特定的珠子可以與帶有不同熒光標記物組合的另一個珠子通過每個珠子特有的發(fā)射光譜鑒定或分辨開來。例如，第一個珠子可以通過比較該珠子中熒光標記物光譜發(fā)射的相對量級得到鑒定。這個珠子可以同其中熒光標記物光譜發(fā)射的相對量級不同的第二個珠子分辨開來。一般來說，使用光譜發(fā)射峰值彼此之間差別至少大約為30nm Stokes shift的熒光標記物的熒光標記物組合是可以分辨開的。但是，這不是本發(fā)明的必要條件，為了實現本發(fā)明所需的熒光標記物光譜發(fā)射最大峰值的準確分離可能隨著每種特定的標記物組合和光譜的分辨率而變化。在一個實施方案中，分析檢測染料的發(fā)射光峰值波長與熒光標記物發(fā)射光的第一和第二峰值波長相差至少100nm，第一和第二激發(fā)波長的差別至少100nm，激發(fā)波長之一大于大約750nm。
由于以下幾個方面，在分析系統(tǒng)中使用上述的熒光標記物解決了現有的基于熒光的檢測系統(tǒng)受到的限制1)珠子的發(fā)射信號彼此之間沒有明顯的相互作用；2)分析物的發(fā)射信號與珠子的發(fā)射信號沒有明顯的相互作用；3)珠子和分析物的發(fā)射信號與外部熒光源沒有明顯的相互作用。除了上面所說的優(yōu)點之外，使用長波長的熒光劑作為標記物還允許了不昂貴和緊湊的二極管激光器和經濟的光子檢測器的使用。
近紅外熒光化合物對本領域的專業(yè)技術人員來說是眾所周知的，可以用在本發(fā)明中作為編碼微粒的熒光標記物。適合的熒光化合物是根據上面的標準使用本領域的專業(yè)人員熟知的方法來選擇的，并可以用于本發(fā)明。例如Webb，J.P.等，Eastman Organic Chemical Bulletin，(1974)，Vol.46，No.3；Pierce，B.M.等，IEEE Journal of QuantumElectronics，(July 1982)，Vol.QE-18，No.7，pp.1164-1170；Strekowski等，J.Org.Chem.，(1992)，Vol.57，pp.4578-4580；以及美國專利Nos.2,887,479、2,895,955和5,061,618，描述了近紅外熒光化合物，在此引為參考。在一個實施方案中，花青染料被用做熒光標記物編碼珠子。這些花青生色團的結構在共同待決的申請No.09/990,678中有詳細描述。
用于多分析物檢測系統(tǒng)的示例性的珠子顯示在圖2中。如圖2所示，珠子12用熒光標記物14A、14B標記，分析物受體13被連接到珠子上。含有14A或14B以及分析物受體13的珠子然后被用來分析特定的樣品檢測所需的分析物15。熒光分析物檢測染料16也存在。當特異性針對受體的分析物也在樣品中出現時，分析物檢測染料16發(fā)射出熒光信號。
熒光分析物檢測染料對于本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。熒光分析物檢測染料可以是單個的熒光劑，也可以是被檢測系統(tǒng)中能量轉移所激活的供體-受體染料對，可以是合成的也可以是天然存在的熒光劑。本領域的專業(yè)人員可以參考本公開選擇適用于特定分析方法和用于本發(fā)明的適當的熒光分析物檢測染料。
熒光分析物檢測染料可以通過本領域的專業(yè)人員所熟知的各種方法復合到珠子上，這依賴于特定分析反應中所用的具體的分析方法。例如，熒光分析物檢測染料16可以結合到受體(未顯示)或分析物15(圖2B)上，或者分析物可以含有天然存在的熒光團(未顯示)。熒光分析物檢測染料也可以結合到雙重受體-分析物復合物(例如夾心)中的第二個受體上，如圖2A所示。
用于多分析物檢測系統(tǒng)的示例性的珠子顯示在圖2中。如圖2所示，珠子12用熒光標記物14A、14B標記，分析物受體13被連接到珠子上。含有14A或14B以及分析物受體13的珠子然后被用來分析特定的樣品檢測所需的分析物15。熒光分析物檢測染料16也存在。當對特異性針對受體的分析物也在樣品中出現時，分析物檢測染料16發(fā)射出熒光信號。
熒光分析物檢測染料對于本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。熒光分析物檢測染料可以是單個的熒光劑，也可以是被檢測系統(tǒng)中能量轉移所激活的供體-受體染料對，可以是合成的也可以是天然存在的熒光劑。本領域的專業(yè)人員可以參考本公開選擇適用于特定分析方法和用于本發(fā)明的適當的熒光分析物檢測染料。
熒光分析物檢測染料可以通過本領域的專業(yè)人員所熟知的各種方法復合到珠子上，這依賴于特定分析反應中所用的具體的分析方法。例如，熒光分析物檢測染料16可以結合到受體(未顯示)或分析物15(圖2B)上，或者分析物可以含有天然存在的熒光團(未顯示)。熒光分析物檢測染料也可以結合到雙重受體-分析物復合物(例如夾心)中的第二個受體上，如圖2A所示。
用于多分析物檢測系統(tǒng)的示例性的珠子顯示在圖2中。如圖2所示，珠子12用熒光標記物14A、14B標記，分析物受體13被連接到珠子上。含有14A或14B以及分析物受體13的珠子然后被用來分析特定的樣品檢測所需的分析物15。熒光分析物檢測染料16也存在。當對特異性針對受體的分析物也在樣品中出現時，分析物檢測染料16發(fā)射出熒光信號。
熒光分析物檢測染料對于本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。熒光分析物檢測染料可以是單個的熒光劑，也可以是被檢測系統(tǒng)中能量轉移所激活的供體-受體染料對，可以是合成的也可以是天然存在的熒光劑。本領域的專業(yè)人員可以參考本公開選擇適用于特定分析方法和用于本發(fā)明的適當的熒光分析物檢測染料。
熒光分析物檢測染料可以通過本領域的專業(yè)人員所熟知的各種方法復合到珠子上，這依賴于特定分析反應中所用的具體的分析方法。例如，熒光分析物檢測染料16可以結合到受體(未顯示)或分析物15(圖2B)上，或者分析物可以含有天然存在的熒光團(未顯示)。熒光分析物檢測染料也可以結合到雙重受體-分析物復合物(例如夾心)中的第二個受體上，如圖2A所示。
分析系統(tǒng)的優(yōu)點是多種分析物可以在自動系統(tǒng)中同時被檢測。例如，可以制備一板珠子，由多種珠子亞群組成，其中每個單獨的珠子亞群對不同的所需分析物具有特異性。允許珠子板與測試樣品反應，然后通過檢測系統(tǒng)。以這種方式，一板分析物可以被同時檢測和定量。因此，由于多個分析可以在一個反應中完成，本發(fā)明是省時的。本領域的專業(yè)人員熟知的可用于本發(fā)明的板的例子包括電解質板、激素板等。可以理解，其它的多分析物板對本領域的專業(yè)人員來說也是熟知的，可以參考本公開用于本發(fā)明的檢測系統(tǒng)。
在本檢測系統(tǒng)和方法中使用的優(yōu)選分析系統(tǒng)是流式細胞儀。流式細胞儀系統(tǒng)對本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。優(yōu)選的流式細胞儀是修改過的Coulter XL流式細胞儀，用785nm的激光代替了標準的氬離子激光。流式細胞儀以本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后就會明白的常規(guī)方式操作。
圖3是可以用于本發(fā)明的流式細胞分析系統(tǒng)的示例性的示意圖。在流式細胞儀中光能23由光學子系統(tǒng)中的激發(fā)光源20A、20B和20C、例如激光或弧光燈所提供。在優(yōu)選情況下，較長波長的激發(fā)激光被用來同時激發(fā)熒光標記物，以標記珠子21，一個或多個較短波長的激發(fā)激光被用來激發(fā)熒光分析物檢測染料。細胞儀裝置的光學子系統(tǒng)可以包含適當的激光線路濾光片、光束擴展器、反射鏡、透鏡和流動池，以及其它有利于細胞儀裝置操作的元件，本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后將會明白。
適當的較短波長的激光用來激發(fā)分析物染料，這對于本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。熒光分析物檢測染料的優(yōu)選激發(fā)波長是635nm的二極管激光，此外，650nm的二極管激光或633nm的氦氖激光也可以使用。此外，較短波長的488nm氬離子、或530nm雙重YAG激光可以使用。在本發(fā)明的另一方面，多個檢測激光可以被用來檢測激發(fā)波長不同的多個熒光染料。在本發(fā)明的這個方面，使用了較長波長和較短波長激光的組合。本發(fā)明這個方面的例子是650nm的激光和530nm的激光被用來激發(fā)不同珠子上的不同熒光染料。較長波長的激光(例如大于750nm)對本領域的專業(yè)人員來說是熟知的。優(yōu)選的激光激發(fā)波長是大約785nm。在本發(fā)明的一個優(yōu)選但不是必需的方面中，使用了具有532、650和780nm三種激光的流式細胞分析系統(tǒng)。
用于在檢測子系統(tǒng)中檢測特定的發(fā)射光24的適當的檢測器25是已知的，本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后將會明白。檢測器可以是發(fā)光二極管或光倍增器，或者能夠將光信號轉化為電脈沖、從而將檢測到的光與其熒光源相關聯的類似的裝置。用于檢測正向和側面散射光的檢測器對于本領域的專業(yè)人員來說是熟知的，可以用于檢測系統(tǒng)中檢測光的散射，本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后將會明白。對于檢測區(qū)域的每個珠子而言，光散射和熒光可以被同時檢測。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的但不是必需的方面中，在檢測子系統(tǒng)中使用正向散射檢測器、側面散射檢測器和光倍增管。檢測子系統(tǒng)也可以使用濾光片、反射鏡系統(tǒng)，以及其它有利于細胞儀裝置操作的元件，本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后將會明白。來自檢測器26的電信號一般被輸入到系統(tǒng)的電子器件中，進行信號和顯示處理、儲存和/或進一步加工。
在分析子系統(tǒng)中，硬件例如微處理器27與內存存儲器28例如硬盤驅動器組合在計算機中，用來收集檢測數據和處理數據。適合于用在分析系統(tǒng)中的硬件是現有的，本領域的專業(yè)人員在參考了本公開后將會明白。用于數據和信號處理的分析系統(tǒng)軟件，可以將檢測數據與現有數據相關聯，從而產生分析結果。分析子系統(tǒng)可以從與每個珠子相關的電信號收據數據。基于珠子類型的共同特征可以建立珠子的類別。從已知類別的珠子獲得的數據可以與從未知類別的樣品珠子中檢測到的數據進行比較。處理后的數據和解釋的結果可以作為輸出29提供給用戶。
上述內容只是為了描述，而不是限制本發(fā)明的范圍。事實上，本領域的專業(yè)技術人員可以根據本文的描述，不經過實驗就容易地想象和產生更多的實施方案。
實施例1通式(5)的熒光傳感分子按照圖1所示的合成路線進行制備，并在下面進行詳細描述。
N-苯甲基-己烷-1，6-二胺的制備將六亞甲基-1，6-二胺(17.15g，148mmol)和苯甲醛(3.0ml，29.5mmol)的四氫呋喃(THF)(300ml)和乙醇(75ml)溶液在充氮氣的情況下于室溫攪拌24小時。除去溶劑，將油狀物在真空下干燥。將干燥后的殘留物溶解在THF(100ml)中，并在溶液中加入硼氫化鈉(5.58g，148mmol)。溶液在充氮氣的情況下于室溫攪拌7小時。在溶液中加入甲醇和水，在真空下將溶劑去除。獲得的油狀物溶解在氯仿中，并用水洗滌。溶液用硫酸鎂干燥，然后在真空下將溶劑除去，得到無色的油狀物(4.49g，74％)。核磁共振數據為1H NMR(CDCl3)δ/ppm 1.1-1.5(8H，m，(CH2)4)，2.55(2H，t，NHCH2)，2.65(2H，t，ArCNCH2)，3.75(2H，s，ArCH2)，7.1-7.25(5H，m，ArH)。
N-苯甲基-N′-芘基-1-基亞甲基-己烷-1，6-二胺的制備將N-苯甲基-己烷-1，6-二胺(500mg，2.42mmol)和1-pyrenecalboxaldehyde(670mg，2.90mmol)的四氫呋喃和甲醇(各12.5ml)溶液在充氮氣的情況下于室溫攪拌20小時。在真空下除去溶劑，殘留物用甲醇洗滌。將沉淀過濾掉，將濾液取出并在真空下干燥，得到黃色的油狀物(940mg，93％)。核磁共振數據為1H NMR(CDCl3)δ/ppm 1.45-1.62(6H，m，(CH2)3)，1.85(2H，m，＝HCCH2)，2.65(2H，t，NHCH2)，3.78(2H，s，PhCH2)，3.85(2H，t，＝NCH2)，7.15-7.25(5H，m，Ph-H)，7.95-8.23，8.53，8.88(分別對應于7H，1H，1H，m，d，d，Py-H)，9.27(1H，s，N＝CH)。13C NMR(CDCl3)δ/ppm 27.31，27.49，30.12，31.16，49.50，54.13，62.77，122.64，125.00，125.59，125,84，126.12，126.24，126.91，127.50，128.16，128.42，128.59，130.64，131.30，140.50，159.54；m/z(TOF)419([M+H]+，100％).
N-苯甲基-N′-芘基-1-基甲基-己烷-1，6-二胺的制備將N-苯甲基-N′-芘基-1-亞甲基-己烷-1，6-二胺(420mg，1.00mmol)和硼氫化鈉(190mg，5.00mmol)的甲醇(10.0ml)溶液在充氮氣的情況下于室溫攪拌3小時。在真空下除去溶劑，將殘留物溶解在氯仿中，并用水洗滌，然后用硫酸鎂干燥。將溶劑除去，將殘留物在真空下干燥，得到黃色的油狀物(386/mg，92％)。核磁共振數據為1H NMR(CDCl3)δ/ppm 1.32(4H，m，(CH2)2)，1.45(2H，m，BnNCCH2)，1.55(2H，m，PyCNCCH2)，2.55(2H，t，BnNCH2)，2.75(2H，t，PyCNCH2)，3.75(2H，s，PhCH2)，4.50(2H，s，PyCH2)，7.15-7.25(5H，m，Ph-H)，7.95-8.10，8.15-8.22，8.37(分別對應于4H，4H，1H，m，m，d，Py-H)。13C NMR(CDCl3)δ/ppm 27.35，30.16，49.46，50.02，51.94，54.13，54.13，123.19，124.72，125.00，125.09，125.89，126.89，127.03，127.50，127.64，128.14，128.40，129.06，131.34，134.15；m/z(EI)420([M])+，7％).
N-苯甲基-N，N′-雙-(2-硼苯甲基)-N′-芘基-1-基甲基-己烷-1，6-二胺的制備(圖1，化合物1或通式(5))N-芘基-1-基甲基-己烷-1，6-二胺(291mg，0.69mmol)、2-(2-溴代甲基-苯基)-[1，3，2]dioxaborinane(422mg，1.66mmol)和碳酸鉀(380mg，2.76mmol)的無水乙腈(10ml)溶液在充氮氣的情況下加熱回流20小時。在真空下除去溶劑，將殘留物溶解在氯仿中并用水洗滌。溶劑用硫酸鎂干燥，在真空下除去溶劑。殘留物溶解在THF(10ml)中。在THF溶液中加入水(10ml)，溶液在室溫攪拌3小時。用氯仿抽提有機相，用水洗滌，用硫酸鎂干燥。在真空下將溶劑除去。殘留物用正己烷從氯仿中重新沉淀，得到黃白色的粉末(172mg，35％)。核磁共振數據為1H NMR(CDCl3)δ/ppm 1.25-1.48(8H，m，(CH2)4)，2.25(2H，t，BnNCH2)，2.48(2H，t，PyCNCH2)，3.45(2H，s，PhB(OH)CH2NBn)，3.58(2H，s，PhB(OH)CH2NCPy)，3.85(2H，s，PhCH2)，4.21(2H，s，PyCH2)，7.02-7.41和7.88-8.19(22H，m，Ar-H)，8.86(4H，bs，BOH)。13C NMR(CDCl3)δ/ppm 51.69，52.99，54.42，56.42，57.11，61.03，61.86，67.85，122.90，124.55，124.99，125.79，127.31，128.28，128.57，129.43，130.00，130.55，136.32，141.56；發(fā)現C，76.56；H，6.69；N，3.80，C44H46B2N2O4要求C，76.76；H，6.73；N，4.07％；m/z(FAB)1230([M+H+4(3-HOCH2C6H4NO2)-4(H2O)]+，100％)；熔點165-168℃.
實施例2按照實施例1制備的通式(5)的傳感分子的相對熒光強度在具有不同D-葡萄糖濃度的52.1wt％甲醇和磷酸緩沖液(pH8.21)中進行了測量(圖3)。磷酸緩沖液按照D.D.Perrin和B.Dempsey，Buffers forpH and Metal Ion Control(用于pH和金屬離子控制的緩沖液)，Chapmanand Hall，London，1974中的描述來制備。隨著增量D-葡萄糖加入到溶液中時，熒光光譜被記錄。測量混合溶液在342nm的激發(fā)。發(fā)現熒光強度與溶液中總的D-葡萄糖濃度相關。
實施例3帶有葡萄糖結合傳感分子的珠子的制備(預期的實施例)結合到珠子上的葡萄糖結合傳感分子的制備在圖1中進行了詳細的圖解。珠子是直徑5.6微米的聚(苯乙烯/5.5％二乙烯基苯/5％甲基丙烯酸)，可以從Bangs實驗室，Inc.of Fishers，Indiana獲得。圖1所示的化合物2是通過將交聯的羧酸鹽修飾的聚合物珠(200mg)、1，3-二異丙基碳二亞胺(DIPC)(170mg)、1-羥基-1H-苯并三氮唑(HOBt)(200mg)和4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)(8mg)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(5ml)中形成的懸浮液在充氮氣的情況下在冰上攪拌30分鐘來制備的。接下來，在溶液中加入雙-(環(huán)己烷)-三胺(1.0g)，在室溫攪拌1天。反應混合物被注入四氫呋喃(THF)中，在室溫攪拌1小時。將混合液離心，留下珠子，將上清液丟棄，將珠子重新懸浮在甲醇中。珠子通過再次離心洗滌，棄去上清，將珠子重懸于甲醇中。
化合物3的制備首先將化合物2(200mg)和苯甲醛(50mg)在THF和甲醇(各7ml)的懸浮液中在室溫攪拌5小時。在反應中加入硼氫化鈉(57mg)，在室溫攪拌1小時。減壓除去溶劑，將殘留物懸浮在氯仿中。懸浮液用水洗滌，用硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑。殘留物在甲醇中通過離心、棄上清和重懸浮洗滌兩次。
化合物1的制備是通過將化合物3(95mg)、碳酸鉀(116mg)和2-(2-溴代苯甲基)-1，3-二氧-2-硼烷(93mg)的THF(5ml)和乙腈(3ml)的懸浮液加熱回流7小時?；旌衔锢鋮s到室溫，減壓除去上清液。殘留物懸浮在氯仿中，用水洗滌?；旌衔镉昧蛩徭V干燥，然后減壓除去溶劑。殘留物重新懸浮在氯仿和正己烷中，通過離心和傾倒來清洗。洗過的珠子重新懸浮在pH被調整到7.2的50mM Tris緩沖液中。
實施例4使用葡萄糖傳感珠的競爭性分析(預期的實施例)將大約5000珠子、130納克葡萄糖類似物熒光劑二-(-D-吡喃葡萄糖苷)(Sigma-Aldrich Company，St.Louis，MO)和20微升懷疑含有葡萄糖的樣品在180微升含有0.01％Tween 20的pH7.2的50mM Tris緩沖液中混合形成了反應混合液。被傳感分子包被的珠子與分析物或其類似物結合?；蛘?，可以加入葡萄糖以改變分析信號的范圍。這是有用但不是必需的。反應混合液使用Beckman Coulter EPICS XL流式細胞儀讀數，該細胞儀在FS上觸發(fā)，在珠子上門控，并使用FL1檢測通道。
出于同樣的目的，對分析方法也可以進行改變，使用熒光標記的[2-[2-[2-巰基-(1，2-丙二醇)-3-[(1，3-二氫-3-3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-叉基)乙叉基]-1-環(huán)己烯-1-基]乙烯基]3，3-二甲基-1-丙基吲哚鎓]碘化物。這種丙烷二元醇閉環(huán)花青染料的結構顯示如下
盡管參考其某些優(yōu)選方案，對本發(fā)明已經進行了相當詳細的描述，但還有其它可能的方案。因此，附隨的權利要求的精神和范圍不限于這里描述的優(yōu)選方案。
在本說明書、包括權利要求、摘要和圖中公開的所有特點，以及公開的任何方法或工藝中的所有步驟，都可以以任何組合方式進行組合，除非在組合中至少某些這樣的特點和/或步驟是相互排斥的。在本說明書、包括權利要求、摘要和圖中公開的每個特點，除非有明確的陳述，都可以被服務于同樣的、相當的或類似的目的的可替換的特點所代替。因此，除非有明確的陳述，每個公開的特點都僅僅是一系列等同或相似的特點的一個例子。
權利要求中任何沒有明確陳述為執(zhí)行特定功能的“裝置”或執(zhí)行特定功能的“步驟”，都不應該被解釋為35U.S.C.′112中所規(guī)定的“裝置”或“步驟”條款。
權利要求
1.一種檢測糖類的分析系統(tǒng)，包括a)已知含有或懷疑含有糖類的樣品；b)一個或多個固相基質，固相基質上已經連接有一個或多個糖類傳感分子，傳感分子具有下列通式 其中Z選自氫、烷基和芳香基基團；Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團；N是氮原子；Sp是脂肪族間隔物；An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團；S是固相基質；以及n＝1或2，m＝1或2，y＝1或2，并且x是整數；以及c)檢測至少一個結合到傳感分子上的糖或未結合到傳感分子上的糖的裝置。
2.權利要求1的傳感分子，其中Bd1是R1-B(OH)2，Bd2是R2-B(OH)2，Bd1和Bd2能夠與糖分子結合形成穩(wěn)定的1∶1的復合物，R1和R2是彼此獨立選擇的脂肪族或芳香族官能團，B是硼原子。
3.權利要求2的系統(tǒng)，其中R1和R2選自甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、甲氧基、乙氧基、丁氧基和苯氧基。
4.權利要求1的系統(tǒng)，其中Sp是直鏈烷基。
5.權利要求4的系統(tǒng)，其中的直鏈烷基含有從1到9個碳原子。
6.權利要求5的系統(tǒng)，其中的直鏈烷基含有6個碳原子。
7.權利要求1的系統(tǒng)，其中與固相基質結合的糖類傳感分子具有下面的通用結構 其中An是將傳感分子結合到固相基質上的錨定基團，S是固相基質。
8.權利要求1中的系統(tǒng)，其中與固相基質結合的糖類傳感分子具有下面的通用結構 其中p和q是整數，p/q比率是1或大于1。
9.權利要求1的系統(tǒng)，其中Bd1、Bd2、Sp、m和q經過選擇，為糖類傳感分子提供了與葡萄糖的選擇性結合。
10.權利要求9的系統(tǒng)，還含有標記的葡萄糖類似物，它與葡萄糖競爭同糖類傳感分子的結合。
11.權利要求1-10任一項的系統(tǒng)，其中的固相基質是一個或多個帶有鑒定標記物的珠子，鑒定標記物包括a)熒光分析物檢測染料，分析物檢測染料能夠被第一個激發(fā)波長的光所激發(fā)，并且當被激發(fā)時能夠發(fā)射峰值波長的光，以及b)兩種或兩種以上熒光標記物以相對量進行第一組合，熒光標記物能夠被相同的第二激發(fā)波長的光所激發(fā)，并且能夠發(fā)射出第一和第二峰值波長的光，第一和第二峰值波長彼此之間可以分辨開，其中分析物檢測染料發(fā)射光的峰值波長與熒光標記物發(fā)射光的第一和第二峰值波長的差別至少為100nm，第一和第二峰值波長的差別至少為100nm，以及其中一個激發(fā)波長大于大約750nm。
12.權利要求11的系統(tǒng)，其中檢測樣品中的顆粒和糖類的裝置包括a)激發(fā)熒光染料的儀器；b)激發(fā)第一和第二熒光標記物的儀器；c)檢測發(fā)射光的儀器；以及d)將檢測到的發(fā)射光與被分析的特定珠子相關聯的儀器。
13.權利要求11的系統(tǒng)，其中的分析物檢測染料從外部復合在珠子的外部，而熒光標記物則包埋于珠子內部。
14.權利要求11的系統(tǒng)，其中的熒光標記物都是發(fā)射光波長大于750nm的花青染料。
15.權利要求11的系統(tǒng)，其中第一激發(fā)波長的光基本上不引起熒光標記物發(fā)射光，以及第二激發(fā)波長的光基本上不引起分析物檢測染料發(fā)射光。
16.糖類傳感珠，其上連接有具有下面通式的糖類傳感分子 其中S是珠子；Z選自氫、烷基、芳香基團和熒光團；N是氮原子；Bd1和Bd2是獨立選擇的結合基團，其中結合基團能夠結合糖類分子；Sp是脂肪族間隔物；An將傳感分子與珠子連接的錨定基團；以及n＝1或2，m＝1或2，y＝1或2，和p是整數。
17.權利要求16的珠子，其中的糖傳感珠具有下面的通式 其中An是將葡萄糖結合傳感分子連接到顆粒上的錨定基團，而Z選自氫、烷基和芳香基團。
18.檢測糖類的方法，包括a)提供已知含有或懷疑含有糖類的樣品；b)提供權利要求1的分析系統(tǒng)；以及c)檢測樣品中的糖類。
19.權利要求18的檢測糖類的方法，其中被檢測的樣品中的糖是葡萄糖。
20.權利要求19的檢測分析物的方法，其中的分析系統(tǒng)還含有標記的葡萄糖類似物，它與葡萄糖競爭同糖類傳感分子的結合，并且葡萄糖通過競爭性分析方法來檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測糖類的分析系統(tǒng)。該分析系統(tǒng)包括連接到固相基質上的糖類傳感分子，以及檢測至少一個結合到傳感分子或未結合到傳感分子上的糖的裝置。在一個實施方案中，糖傳感分子優(yōu)選檢測葡萄糖。本發(fā)明還提供了其上結合有糖傳感分子的珠子，以及使用該系統(tǒng)檢測葡萄糖的方法。
文檔編號G01N33/66GK1784601SQ200480011844
公開日2006年6月7日 申請日期2004年4月28日 優(yōu)先權日2003年5月1日
發(fā)明者邁克爾·L·貝爾, 托尼·D·詹姆士, 有森奏 申請人:貝克曼考爾特公司