專利名稱：一種測定還原糖濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定還原糖濃度的方法。
背景技術(shù)：
目前，還原糖的測定方法多采用斐林氏容量法、高錳酸鉀滴定法、二硝基水揚(yáng)酸比色法以及色譜法等，這些方法各具特點(diǎn)，如1)食品中還原糖測定通常采用的斐林氏容量法、高錳酸鉀滴定法屬化學(xué)法，這類方法要求食品中還原糖含量較高，需達(dá)1％以上，樣品還需水解和轉(zhuǎn)化糖的計(jì)算，測量過程中樣品的濃度、溫度、雜質(zhì)含量及顏色都會影響測量結(jié)果，測定時(shí)間長、步驟繁雜，因此滴定誤差大，靈敏度較低；2)二硝基水揚(yáng)酸比色法需先對樣品去除雜質(zhì)，高淀粉、高蛋白類樣品及色素類含量高的樣品結(jié)果重現(xiàn)性差，該類方法檢測靈敏度只有0.1mg左右。這些方法主要用于常量分析，并易受樣品中還原性雜質(zhì)及色素的干擾，而且由于二糖及多糖的水解，會干擾測定結(jié)果，或不能同時(shí)測定酮式及醛式還原糖。而且，這些方法檢測靈敏度低，對食品中含量低于0.01mg左右微量還原糖無法實(shí)現(xiàn)定量檢測(如低糖食品、飲品等)，需要借助特殊分析手段才能實(shí)現(xiàn)微量組分檢測；3)采用色譜法測定還原糖，靈敏、準(zhǔn)確，但測定費(fèi)時(shí)，成本高，屬特殊分析技術(shù)，不便于常規(guī)條件下的通用檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便快速、準(zhǔn)確靈敏的測定還原糖濃度的方法。
本發(fā)明所提供的測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟1)將樣品溶液與過量氯化四氮唑藍(lán)在pH為7.5-8.5條件下反應(yīng)；2)反應(yīng)后的溶液經(jīng)脫水，振蕩下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液測定吸光度，得樣品溶液中還原糖濃度。
其中，步驟1)所述反應(yīng)是將反應(yīng)液煮沸后反應(yīng)1-3min；所述pH優(yōu)選為8.0。
步驟2)所述反應(yīng)后的溶液脫水可采用多種方式進(jìn)行，通常可用無水Na2SO4進(jìn)行脫水。
步驟2)所述測定吸光度是在570-600nm波長進(jìn)行測定的；優(yōu)選為586nm。
在進(jìn)行具體測定時(shí)，通常可按如下過程進(jìn)行將樣品溶液2.5ml，質(zhì)量百分濃度為0.2％的氯化四氮唑藍(lán)溶液0.5ml(氯化四氮唑藍(lán)反應(yīng)靈敏度很高，0.2％氯化四氮唑藍(lán)0.5ml已過量約30％)，0.1mol/L的NaOH溶液1.0ml混勻，加熱至沸騰1min，冷卻至室溫；然后向其中加入無水Na2SO41.0g，乙酸乙酯5.0ml，振蕩取上清液在586nm下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到溶液中還原糖的濃度。
在進(jìn)行樣品測定時(shí)，一般使樣品溶液中還原糖的濃度范圍含量在1.0-10.0μg/ml為好。
氯化四氮唑藍(lán)(TTB)為無色或檸檬黃色結(jié)晶，分子量(C40H32Cl2N8O2)為727.67，與還原糖作用可生成不溶水的深藍(lán)色甲月替(Diformazan)，該反應(yīng)不受乙醛、肼、胲，檸檬酸、酒石酸、亞硫酸鹽等還原性物質(zhì)干擾，檢出限量可達(dá)0.2μg；所得的甲月替能溶于乙酸乙酯。本發(fā)明應(yīng)用上述原理來測定還原糖的濃度，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)方便快速，準(zhǔn)確靈敏，還原糖最小檢出量可達(dá)0.2μg；2)對于還原糖含量較高的樣品，可以進(jìn)行大倍數(shù)稀釋，不必除去雜質(zhì)即可分析，各種色素(如水溶性的花青素及脂溶性的葉綠素等)不干擾分析測定；對于還原糖含量少，且體積小的樣品(如各種生理體液)則可以采用本發(fā)明方法直接測定，測定簡便、快捷；3)在測定時(shí)，樣品與TTB在pH值偏堿性的條件下進(jìn)行煮沸反應(yīng)，能鈍化樣品中有生物活性的物質(zhì)，可以排除這些物質(zhì)對測定結(jié)果的影響；4)蔗糖測定實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氯化四氮唑藍(lán)(TTB)與之不反應(yīng)，說明本發(fā)明測定條件下二糖及多糖等不發(fā)生水解，避免了二糖及多糖等的水解對測定結(jié)果的干擾。本發(fā)明測定還原糖濃度的方法，靈敏度高，操作簡便，樣品溶液一般不必除去色素及其它雜質(zhì)，可廣泛用于各種樣品，特別是適合于樣品量小、還原糖含量低(微量)、樣品“雜質(zhì)”多、色素深的各種生物樣品中還原糖的測定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、氯化四氮唑藍(lán)法測定還原糖濃度1、主要儀器、材料分光光度計(jì)、水浴鍋、具塞試管(10～15ml)、0.2％氯化四氮唑藍(lán)(TTB)水溶液(質(zhì)量百分濃度)、0.1mol/L氫氧化鈉、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、果糖。
2、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、果糖各半配制標(biāo)準(zhǔn)糖溶液，濃度為10.0μg/ml，按表1所列步驟加入各種反應(yīng)試劑，并進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取上清液。
將所得上清液進(jìn)行全波長掃描，確定在586nm波長下為分析微量還原糖的最佳吸收波長。在586nm波長下測定不同標(biāo)準(zhǔn)糖濃度的吸光值，吸光值與糖濃度的線性回歸方程為y＝0.103x-0.0016，相關(guān)系數(shù)r＝0.9994；其中y為吸光值，x為糖濃度(μg/ml)。
表1.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)步驟及加入不同試劑量(具塞試管10～15ml中)


3、樣品測定將樣品提取液2.5ml，TTB溶液0.5ml，NaOH溶液1.0ml加入到具塞試管中，混勻后，加熱至沸騰1min，冷卻至室溫；然后向其中加入無水Na2SO41.0g，乙酸乙酯5.0ml，振蕩2min，取上清液以表1的0號樣品為空白在586nm下測定吸光值，由回歸方程得到樣品提取液中還原糖的濃度。
給出二種不同的樣品提取液采用本發(fā)明方法測定結(jié)果及采用對照方法測定的結(jié)果見表2，結(jié)果表明，本發(fā)明方法與斐林氏法相比，檢測靈敏度高；檢測結(jié)果準(zhǔn)確，與毛細(xì)管電泳法、色譜法等方法的測定值相當(dāng)。
表2.幾種方法測定微量還原糖結(jié)果比較(μg/ml)

權(quán)利要求
1.一種測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟1)將樣品溶液與過量氯化四氮唑藍(lán)在pH為7.5-8.5條件下反應(yīng)；2)反應(yīng)后的溶液經(jīng)脫水，振蕩下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液測定吸光度，得樣品溶液中還原糖濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)所述反應(yīng)是將反應(yīng)液煮沸后反應(yīng)1-3min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述pH為8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述反應(yīng)后的溶液脫水用無水Na2SO4進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于步驟2)所述測定吸光度是在570-600nm波長進(jìn)行測定的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述測定波長為586nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定還原糖濃度的方法。本發(fā)明所提供的測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟1)將樣品溶液與過量氯化四氮唑藍(lán)在pH為7.5－8.5條件下反應(yīng)；2)反應(yīng)后的溶液經(jīng)脫水，振蕩下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液測定吸光度，得樣品溶液中還原糖濃度。本發(fā)明方法操作簡便，靈敏度高，樣品溶液一般不必除去色素及其它雜質(zhì)，可廣泛用于各種樣品中還原糖的測定。
文檔編號G01N31/00GK1614393SQ20041009633
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月30日
發(fā)明者王世平, 王增利 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)