專利名稱：陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在線檢測細(xì)胞或組織狀態(tài)的系統(tǒng)，具體是一種陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)。用于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
從陸生植物與海藻中提取的次生代謝產(chǎn)物是目前重要的藥用化合物來源，在當(dāng)今世界市場上已知300多種生物產(chǎn)品中，90％以上能從陸生植物與海藻中找到。但其中某些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難通過化學(xué)合成或半合成的方法獲得，從而使利用光生物反應(yīng)器在可控和工程優(yōu)化條件下培養(yǎng)陸生植物細(xì)胞或組織成為未來工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)獲得這些活性物質(zhì)的有效手段。同人工栽培獲得整株植物體相比，生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有可在線檢測、可控、產(chǎn)品質(zhì)量均一等優(yōu)點(diǎn)；尤其，在可控條件下的工程優(yōu)化為大幅度提高原本含量極微的次生物質(zhì)的產(chǎn)量提供了可能。在反應(yīng)器培養(yǎng)的過程中，實(shí)時了解細(xì)胞濃度和存活率情況是至關(guān)重要的。通過細(xì)胞濃度和存活率的數(shù)據(jù)，操作人員才能對細(xì)胞或組織生長情況進(jìn)行控制。然而在目前檢測反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞的生物狀態(tài)，絕大部分仍然通過手工取樣來完成，然后通過繁瑣的實(shí)驗(yàn)來確定反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞濃度和存活率，其有效性和即時性都不能滿足自動化生產(chǎn)的需求。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Huang YM等人在《Biotechnology Progress》2002，1862-71上發(fā)表的“Dynamics of Oxygen Evolution and Biomass Productionduring Cultivation of Agardhiella subulata Microplantlets in a Bubble-ColumnPhotobioreator under Medium Perfusion”(“在鼓泡式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Agardhiella subulata微繁殖體的生氧動力學(xué)和生物量”，《生物技術(shù)進(jìn)展》)一文中，提出了一種培養(yǎng)海洋藻類細(xì)胞或組織的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由罐體、光照系統(tǒng)、灌注系統(tǒng)、pH和溶氧、鼓氣裝置、取樣裝置等組成。其中溶氧系統(tǒng)用來檢測細(xì)胞的光合作用活性。該系統(tǒng)的不足之處在于不能實(shí)時檢測細(xì)胞濃度和存活率，測量細(xì)胞濃度要經(jīng)過取樣裝置取得樣品后在實(shí)驗(yàn)臺上測量細(xì)胞干重來解決，繁瑣而且不準(zhǔn)確。溶氧探測器僅能獲得培養(yǎng)罐內(nèi)的溶解氧濃度這一原始的數(shù)據(jù)，從而無法反映細(xì)胞的活性，不能得到準(zhǔn)確的細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù)。此外，頻繁的取樣增加了反應(yīng)器系統(tǒng)染菌的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，針對在現(xiàn)有光生物反應(yīng)器中測量細(xì)胞濃度和細(xì)胞存活率這兩個重要參數(shù)時自動化程度不高、速度慢、精確度低、需頻繁取樣的缺點(diǎn)，提供了一種陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，使其能實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測、全封閉運(yùn)行，無需頻繁取樣，測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確快速。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括支架、顯示面板、數(shù)據(jù)采集器、光合活性檢測系統(tǒng)、樣品入口、樣品出口、取樣閥、透射皿入口閥、入射光源、透射皿、透射皿出口閥、感光板、蠕動泵。其連接方式為樣品入口和樣品出口位于支架外，作為和外接反應(yīng)器罐體的接口，其余的組件均位于支架之內(nèi)，樣品入口、取樣閥、光合活性檢測系統(tǒng)、透射皿入口閥、透射皿、透射皿出口閥、蠕動泵和樣品出口之間通過生物無害的硅膠管道依次相連，培養(yǎng)液在蠕動泵的帶動下依次流經(jīng)以上組件，然后返回到外接反應(yīng)器中。透射皿正上方垂直固定入射光源。數(shù)據(jù)采集器的主體為x86兼容32位主機(jī)，具有COM1、COM2和COM3一共3個標(biāo)準(zhǔn)通訊接口。顯示面板和數(shù)據(jù)采集器通過螺絲固定在支架上，顯示面板和數(shù)據(jù)采集器的COM3端口通過數(shù)據(jù)線相連接。光合活性檢測系統(tǒng)通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器的COM1端口相連接。感光板和數(shù)據(jù)采集器的COM2端口通過數(shù)據(jù)線相連接。
光合活性檢測系統(tǒng)由溶氧探頭、遮光罩、攪拌槳、取樣室、冷光源組成。在取樣室的頂端安裝有溶氧探頭，通過密封的插口豎直插在取樣室頂部，并通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器的COM1端口相連接。光合活性檢測系統(tǒng)是整個系統(tǒng)中用來檢測細(xì)胞氧氣生成速率的部分。遮光罩為不透光、隔熱材料制成的圓柱形容器，取樣室為生物無害的玻璃材料制成的圓柱形容器，取樣室的側(cè)外表面直接粘貼在遮光罩的內(nèi)表面上，位于遮光罩的中段。攪拌槳為生物無害的磁性材料制作，安裝于取樣室頂部正中，其葉片下緣距攪拌室底部的距離為攪拌室高度的1/3。，攪拌槳以較低的速度攪拌取樣室內(nèi)的液體，保證其中的細(xì)胞或組織處于懸浮狀態(tài)。距取樣室的下表面5～10厘米處安裝有冷光源，用螺絲固定在遮光罩的內(nèi)壁底部。冷光源的光可以透過取樣室的底面進(jìn)入取樣室，供取樣室內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行光合作用。冷光源可以提供25～200μE/m2s的光強(qiáng)，基本覆蓋了所有陸生植物和海藻細(xì)胞培養(yǎng)所使用的光強(qiáng)范圍。當(dāng)冷光源關(guān)閉時，取樣室內(nèi)的細(xì)胞不進(jìn)行光合作用，僅通過呼吸作用消耗氧氣，取樣室內(nèi)的溶解氧含量即緩慢下降，當(dāng)冷光源打開時，細(xì)胞開始進(jìn)行光合作用，取樣室內(nèi)的溶解氧含量即緩慢上升。通過溶氧探頭探測到的溶解氧含量上升的速度即反映了細(xì)胞光合活性的大小。該信號通過數(shù)據(jù)采集器中搜集，作為計(jì)算細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù)之一。
入射光源、透射皿和感光板為整個系統(tǒng)中檢測細(xì)胞濃度的部分。透射皿為高度1厘米，直徑3至5厘米的石英玻璃圓柱形容器，上下兩表面的玻璃厚度不大于1毫米，外側(cè)表面玻璃厚度不小于2毫米。透射皿水平固定在支架上，正上方垂直固定入射光源，入射光源的鏡頭距透射皿上表面3厘米。正下方固定水平的感光板，感光板的上表面距透射皿下表面3厘米。光線入射點(diǎn)、透射皿上表面的中心點(diǎn)和感光板的中心點(diǎn)位于同一直線上。入射光源為波長可調(diào)的可見光和紫外光發(fā)生器，入射光通過透射皿后，繼續(xù)透射到下方的感光板上，感光板將檢測到光強(qiáng)數(shù)據(jù)返回到數(shù)據(jù)采集器。數(shù)據(jù)采集器將該光強(qiáng)信號和標(biāo)準(zhǔn)的光強(qiáng)信號進(jìn)行比較，即可以計(jì)算出透射皿內(nèi)細(xì)胞的濃度。然后和從光合活性檢測系統(tǒng)得到的溶解氧含量上升的速度聯(lián)合起來，就可以計(jì)算機(jī)出單位量細(xì)胞的氧氣生成速度，根據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)值的比較，進(jìn)一步計(jì)算出細(xì)胞的存活率。
本發(fā)明工作時，樣品入口、樣品出口分別連接到外接的反應(yīng)器罐體上，蠕動泵將培養(yǎng)液從反應(yīng)器罐體內(nèi)抽入取樣室和透射皿，當(dāng)培養(yǎng)液充滿整個取樣室和透射皿時，入射光源打開，數(shù)據(jù)采集器首先從感光板獲得細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)。當(dāng)冷光源關(guān)閉時，取樣室內(nèi)的氧氣溶解量被細(xì)胞的呼吸作用逐漸耗盡，降低到接近零值，此時冷光源打開后，數(shù)據(jù)采集器即可采集取樣室內(nèi)氧氣溶解量上升的過程，然后計(jì)算出細(xì)胞的存活率。當(dāng)一個測量周期結(jié)束時，蠕動泵將系統(tǒng)內(nèi)所有的培養(yǎng)液泵回外接的反應(yīng)器，同時將取樣室和透射皿內(nèi)充滿新一批的培養(yǎng)液，進(jìn)行下一個周期的測量。
本發(fā)明將細(xì)胞的濃度和存活率的檢測集中到一個儀器之中，節(jié)省了分析的時間和人力，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的實(shí)時在線檢測。細(xì)胞濃度和存活率的數(shù)據(jù)不僅比手工實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，而且能夠進(jìn)行整個培養(yǎng)過程中的連續(xù)不間斷檢測，所檢測到的數(shù)據(jù)可以直接指導(dǎo)反應(yīng)器的操作人員通過改變反應(yīng)器的運(yùn)行狀態(tài)來提高細(xì)胞的產(chǎn)量和活性。整個系統(tǒng)全封閉運(yùn)行，培養(yǎng)液和外界不存在接觸和感染的機(jī)會，大大提高了操作人員的工作效率。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明更加模塊化，集中考慮到細(xì)胞濃度和存活率的檢測是一個一體的過程，將整個檢測過程整合到一個系統(tǒng)中，高效快速，非常適合大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)植物或海藻細(xì)胞的要求，可大大提高整個生產(chǎn)過程的自動化水平。


圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意2為本發(fā)明光合活性檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意3為本發(fā)明數(shù)據(jù)采集器結(jié)構(gòu)示意中，1.支架 2.顯示面板 3.數(shù)據(jù)采集器 4.光合活性檢測系統(tǒng) 5.樣品入口 6.樣品出口 7.取樣閥 8.透射皿入口閥 9.入射光源 10.透射皿11.透射皿出口閥 12.感光板 13.蠕動泵 14.溶氧探頭 15.遮光罩 16.攪拌槳 17.取樣室 18.冷光源 19.x86兼容32位主機(jī) 20.COM1端口 21.COM2端口 22.COM3端口。
具體實(shí)施例方式
如圖1-3所示，本發(fā)明包括支架1、顯示面板2、數(shù)據(jù)采集器3、光合活性檢測系統(tǒng)4、樣品入口5、樣品出口6、取樣閥7、透射皿入口閥8、入射光源9、透射皿10、透射皿出口閥11、感光板12、蠕動泵13。其連接方式為樣品入口5和樣品出口6位于支架1外，其余的組件均位于支架1之內(nèi)，樣品入口5、取樣閥7、光合活性檢測系統(tǒng)4、透射皿入口閥8、透射皿10、透射皿出口閥11、蠕動泵13和樣品出口6之間通過生物無害的硅膠管道依次相連，透射皿10正上方垂直固定入射光源9，顯示面板2和數(shù)據(jù)采集器3通過螺絲固定在支架1上，顯示面板2、光合活性檢測系統(tǒng)4、感光板12均通過數(shù)據(jù)線和數(shù)據(jù)采集器3相連接。
數(shù)據(jù)采集器3主體為x86兼容32位主機(jī)19，具有COM1接口20、COM2接口21和COM3接口22，顯示面板2和數(shù)據(jù)采集器3的COM3端口22通過數(shù)據(jù)線相連接，光合活性檢測系統(tǒng)4通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器3的COM1端口20相連接，感光板12和數(shù)據(jù)采集器3的COM2端口21通過數(shù)據(jù)線相連接。
光合活性檢測系統(tǒng)4由溶氧探頭14、遮光罩15、攪拌槳16、取樣室17、冷光源18組成。取樣室17的頂端設(shè)置溶氧探頭14，通過密封的插口豎直插在取樣室17的頂部，并通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器3的COM1端口20相連接。遮光罩15為不透光、隔熱材料制成的圓柱形容器，取樣室17為生物無害的玻璃材料制成的圓柱形容器，取樣室17的側(cè)外表面直接粘貼在遮光罩15的內(nèi)表面上，位于遮光罩15的中段。攪拌槳16用無毒的生物相容性塑料制作，距取樣室17的下表面5～10厘米處有冷光源18，用螺絲固定在遮光罩15的內(nèi)壁底部。攪拌槳16設(shè)置在取樣室17頂部正中，其葉片下緣距攪拌室17底部的距離為攪拌室17高度的1/3。
透射皿10水平固定在支架1上，為高度1厘米，直徑3至5厘米的石英玻璃圓柱形容器，上下兩表面的玻璃厚度不大于1毫米，外側(cè)表面玻璃厚度不小于2毫米。入射光源9的鏡頭距透射皿10上表面3厘米。透射皿10正下方固定水平的感光板12，感光板12的上表面距透射皿10下表面3厘米。光線入射點(diǎn)、透射皿10上表面的中心點(diǎn)和感光板12的中心點(diǎn)位于同一直線上。
本發(fā)明固定安裝好后，將樣品入口5、樣品出口6分別連接到外接的反應(yīng)器罐體上，打開取樣閥7、透射皿入口閥8和透射皿出口閥11，然后打開蠕動泵13，將培養(yǎng)液從反應(yīng)器罐體內(nèi)抽入取樣室17和透射皿10，當(dāng)培養(yǎng)液充滿整個取樣室17和透射皿10時，關(guān)閉取樣閥7、透射皿入口閥8、透射皿出口閥11和蠕動泵13，打開入射光源9，數(shù)據(jù)采集器3首先從感光板12獲得細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)，并將此數(shù)據(jù)顯示到顯示面板2上。與此同時，取樣室17內(nèi)的溶解氧含量不斷下降，數(shù)據(jù)采集器3將此信息反映到顯示面板2上，約30分鐘之后，取樣室17內(nèi)的氧氣溶解量降低到接近零值，此時打開冷光源18，數(shù)據(jù)采集器3通過溶氧探頭14開始采集取樣室17內(nèi)氧氣溶解量上升速度信息，并將氧氣的生成速度與細(xì)胞濃度的比值記錄下來，同標(biāo)準(zhǔn)值相比，計(jì)算出細(xì)胞的存活率。此時一個測量周期結(jié)束，打開取樣閥7、透射皿入口閥8和透射皿出口閥11，然后打開蠕動泵13，將系統(tǒng)內(nèi)所有的培養(yǎng)液泵回外接的反應(yīng)器，同時將取樣室17和透射皿10內(nèi)充滿新一批的培養(yǎng)液，可進(jìn)行下一個周期的測量。
用本發(fā)明監(jiān)測7升光生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)日本海帶配子體細(xì)胞的細(xì)胞濃度和細(xì)胞存活率，灌注用培養(yǎng)基的氮濃度選擇0.5935mmol/L，氮磷摩爾比選擇16∶1，光強(qiáng)選擇40μE/m2s。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20％的培養(yǎng)基更新率下，到培養(yǎng)至第36天時灌注培養(yǎng)的細(xì)胞濃度比接種時增長11.8倍，細(xì)胞存活率達(dá)到98.4％，一個數(shù)據(jù)點(diǎn)的測量僅耗時50分鐘。
權(quán)利要求
1.一種陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，包括支架(1)、顯示面板(2)、數(shù)據(jù)采集器(3)、樣品入口(5)、樣品出口(6)、取樣閥(7)、蠕動泵(13)，其特征在于，還包括光合活性檢測系統(tǒng)(4)、透射皿入口閥(8)入射光源(9)、透射皿(10)、透射皿出口閥(11)、感光板(12)，其中樣品入口(5)和樣品出口(6)位于支架(1)外，其余的組件均位于支架(1)之內(nèi)，樣品入口(5)、取樣閥(7)、光合活性檢測系統(tǒng)(4)、透射皿入口閥(8)、透射皿(10)、透射皿出口閥(11)、蠕動泵(13)和樣品出口(6)通過硅膠管道依次相連，透射皿(10)正上方垂直固定入射光源(9)，顯示面板(2)和數(shù)據(jù)采集器(3)通過螺絲固定在支架(1)上，顯示面板(2)、光合活性檢測系統(tǒng)(4)、感光板(12)均通過數(shù)據(jù)線和數(shù)據(jù)采集器(3)相連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，其特征是，數(shù)據(jù)采集器(3)主體為x86兼容32位主機(jī)(19)，具有COM1接口(20)、COM2接口(21)和COM3接口(22)，顯示面板(2)和數(shù)據(jù)采集器(3)的COM3端口(22)通過數(shù)據(jù)線相連接，光合活性檢測系統(tǒng)(4)通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器(3)的COM1端口(20)相連接，感光板(12)和數(shù)據(jù)采集器(3)的COM2端口(21)通過數(shù)據(jù)線相連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，其特征是，光合活性檢測系統(tǒng)(4)由溶氧探頭(14)、遮光罩(15)、攪拌槳(16)、取樣室(17)、冷光源(18)組成，取樣室(17)的頂端設(shè)置溶氧探頭(14)，通過密封的插口豎直插在取樣室(17)的頂部，并通過數(shù)據(jù)線與數(shù)據(jù)采集器(3)的COM1端口(20)相連接，取樣室(17)的側(cè)外表面直接粘貼在遮光罩(15)的內(nèi)表面上，位于遮光罩(15)的中段，冷光源(18)設(shè)置在取樣室(17)的下表面，用螺絲固定在遮光罩(15)的內(nèi)壁底部，攪拌槳(16)設(shè)置在取樣室(17)頂部正中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，其特征是，遮光罩(15)為不透光、隔熱材料制成的圓柱形容器，取樣室(17)為生物無害的玻璃材料制成的圓柱形容器，距取樣室(17)的下表面5～10厘米處設(shè)置冷光源(18)，攪拌槳(16)葉片下緣距攪拌室(17)底部的距離為攪拌室(17)高度的1/3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，其特征是，透射皿(10)為高度1厘米，直徑3至5厘米的石英玻璃圓柱形容器，上下兩表面的玻璃厚度小于或者等于1毫米，外側(cè)表面玻璃厚度大于或者等于2毫米，透射皿(10)水平固定在支架(1)上，正上方垂直固定入射光源(9)，入射光源(9)的鏡頭距透射皿(10)上表面3厘米，透射皿(10)正下方固定水平的感光板(12)，感光板(12)的上表面距透射皿(10)下表面3厘米，光線入射點(diǎn)、透射皿(10)上表面的中心點(diǎn)和感光板(12)的中心點(diǎn)位于同一直線上。
全文摘要
一種陸生植物與海藻細(xì)胞反應(yīng)器在線生物狀態(tài)檢測系統(tǒng)，包括支架、顯示面板、數(shù)據(jù)采集器、光合活性檢測系統(tǒng)、樣品入口、樣品出口、取樣閥、透射皿入口閥、入射光源、透射皿、透射皿出口閥、感光板、蠕動泵。樣品入口和樣品出口位于支架外，其余的組件均位于支架之內(nèi)，樣品入口、取樣閥、光合活性檢測系統(tǒng)、透射皿入口閥、透射皿、透射皿出口閥、蠕動泵和樣品出口通過硅膠管道依次相連，透射皿正上方垂直固定入射光源，顯示面板和數(shù)據(jù)采集器固定在支架上，顯示面板、光合活性檢測系統(tǒng)、感光板均和數(shù)據(jù)采集器相連接。本發(fā)明將整個檢測過程整合到一個系統(tǒng)中，高效快速，適合大規(guī)模工業(yè)化要求，可大大提高整個生產(chǎn)過程的自動化水平。
文檔編號G01N27/409GK1632573SQ200410093429
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者趙銳, 齊瀚實(shí), 陳思曄, 張寶紅, 黃娜 申請人:上海交通大學(xué)