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農(nóng)藥速滅威殘留量檢測(cè)方法

文檔序號(hào):5863613閱讀:361來源:國知局
專利名稱:農(nóng)藥速滅威殘留量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明農(nóng)藥速滅威殘留量ELISA檢測(cè)方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中速滅威(metolcarb)農(nóng)藥殘留量的高靈敏度快速檢測(cè),特別適用于大批量樣品檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。
背景技術(shù)
速滅威(metolcarb)屬于氨基甲酸酯類化學(xué)殺蟲劑,是我國大噸位生產(chǎn)的農(nóng)藥品種之一。速滅威制劑毒性中等,主要用于防治棉花、水稻、茶樹、柑橘等作物的害蟲,具有殺蟲譜廣、殘效長、殺死率高等特點(diǎn)。目前國內(nèi)許有廠家進(jìn)行原藥或其復(fù)配制劑的大規(guī)模生產(chǎn)并得到很好的推廣。
自20世紀(jì)70年代以來,由于有機(jī)氯農(nóng)藥受到禁用或限用,以及抗有機(jī)磷殺蟲劑的昆蟲品種日益增多,現(xiàn)在國家已經(jīng)對(duì)一些高毒性如克百威等農(nóng)藥進(jìn)行禁用,因而速滅威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的用量必然逐年增加,這就使得這類農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)倍受關(guān)注。速滅威雖然相對(duì)已經(jīng)被禁用的農(nóng)藥來說優(yōu)點(diǎn)明顯,但速滅威的大量使用及其具有的殘留期較長、毒性較高等特點(diǎn),都使得速滅威殘留量的檢測(cè)監(jiān)控顯得十分迫切和必要。
文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)速滅威有效成分檢測(cè)方法有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法等。但只靠這些常規(guī)的檢測(cè)方法已經(jīng)越來越不能滿足農(nóng)藥殘留大批量、快速檢測(cè)工作的需求。
1971年Ercegovich等首次用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法對(duì)DDT和馬拉硫磷進(jìn)行了殘留分析,這是免疫化學(xué)技術(shù)首次用于農(nóng)藥殘留分析。20世紀(jì)80年代后,免疫化學(xué)分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù),美國化學(xué)學(xué)會(huì)將免疫分析方法與GC、HPLC方法一起列為化學(xué)農(nóng)藥殘留分析的三大支柱技術(shù),是21世紀(jì)最具競(jìng)爭性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測(cè)技術(shù)。利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)方法不僅可以定性而且可以定量檢測(cè)樣品中的農(nóng)藥殘留,這種分析方法對(duì)儀器設(shè)備要求不高,快速簡便,一般無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理,靈敏度高,特異性強(qiáng)。而且價(jià)格便宜,易于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化和適于大容量樣本分析等優(yōu)點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道了60多種殺菌劑、殺蟲劑、除草劑等的ELISA檢測(cè)方法的建立,其檢測(cè)水平可達(dá)納克(ng)甚至皮克(pg)。國外一些公司已開發(fā)出商品化的農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒,如Immunosystems Inc.的Res-I-Mune試劑盒,NeoGen公司的Agriscreen Tickets試劑盒,Millipore公司的EnviroGard試劑盒,Environmental Diagnostics公司的EZ-Screen試劑盒等。我國在這方面起步較晚,只是90年代后才有越來越多的單位和研究人員重視并從事農(nóng)藥免疫速測(cè)技術(shù)研究,如劉曙照等已經(jīng)先后報(bào)道了氨基甲酸酯類殺蟲劑克百威和甲萘威的免疫檢測(cè)技術(shù)研究等等。
氨基甲酸酯類殺蟲劑免疫速測(cè)方法國外報(bào)道的除了克百威和甲萘威外,1998年,Antonio Abad等人制備出了甲硫威(methiocarb)抗原與單克隆抗體并建立甲硫威ELISA檢測(cè)方法;2001年,Maria J.Moreno等人報(bào)道了識(shí)別殘殺威(propoxur)的單克隆抗體的制備并建立了殘殺威ELISA檢測(cè)方法。2003年,劉鳳權(quán)、張奇等率先合成了速滅威人工抗原并在中國申報(bào)了速滅威人工抗原合成方法的專利,但速滅威ELISA檢測(cè)方法目前在國內(nèi)外還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題 現(xiàn)有的速滅威檢測(cè)方法要么操作較復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用較高、檢測(cè)效率低下,要么檢測(cè)準(zhǔn)確性不高、靈敏度較低、檢測(cè)極限不足,本發(fā)明的目的是為速滅威農(nóng)藥殘留找到一種既快速準(zhǔn)確又簡單低廉的超微量檢測(cè)方法。提供速滅威ELISA檢測(cè)方法,對(duì)速滅威農(nóng)藥的殘留量進(jìn)行檢測(cè),準(zhǔn)確度高、靈敏度高、檢測(cè)極限低、簡單、快速、低廉。
技術(shù)方案本發(fā)明農(nóng)藥速滅威殘留量ELISA檢測(cè)方法,包括1)速滅威多克隆抗體制備采用速滅威人工抗原的免疫原HOM-BSA,常規(guī)免疫方法免疫新西蘭白兔,制備得到抗速滅威的兔多克隆抗體抗血清;2)包被采用速滅威人工抗原的包被抗原HOM-OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl,4℃冰箱過夜,倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;3)封閉1%明膠作封閉物,微量分析板每孔100μl,37℃反應(yīng)2小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;4)加抗體及抗體與待測(cè)樣品的混合液用稀釋10000倍的速滅威抗血清與待測(cè)樣品和空白抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)PBST液等體積充分混合,后以每孔50μl加到微量分析板中,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;5)加酶標(biāo)二抗用pH7.4、0.15mol/L的常規(guī)洗滌緩沖液PBST將商品化的HRP-羊抗兔IgG稀釋2000倍,微量分析板每孔加50μl,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;6)顯色
TMB底物溶液50μl/孔,37℃顯色反應(yīng)10分鐘7)終止反應(yīng)并讀數(shù)加2mol/L的硫酸,50μl/孔終止顯色反應(yīng),酶聯(lián)儀上450nm處讀出吸光值,空白基質(zhì)作陽性對(duì)照吸光值Bo,待測(cè)樣品吸光值B;8)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出結(jié)合率B/Bo及Logit(B/Bo),Logit(B/Bo)=Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1代入如下檢測(cè)方程Logit(B/Bo)=-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C為微量分析板孔中測(cè)得的速滅威濃度,通過公式1和公式2可以求得;X=n·2C,n為反應(yīng)前樣品被稀釋的倍數(shù) 公式3待測(cè)樣品中以濃度X表示的速滅威殘留量可通過公式3求得。
上述農(nóng)藥速滅威殘留量ELISA檢測(cè)方法中,抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)PBST中甲醇含量為5%、pH值為7.4、離子強(qiáng)度為3.2mol/L,微量分析板中每孔50μl。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有速滅威檢測(cè)技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在(1)實(shí)用性好傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析主要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,其前處理過程煩瑣,分析速度慢、成本高,使用的大量有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染,且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器化程度和人員素質(zhì)要求較高,不能滿足農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易對(duì)快速、簡便、準(zhǔn)確、大量檢測(cè)的需求。而我們提供的速滅威ELISA檢測(cè)方法具有操作簡單、快速(以封閉好的微量分析板做檢測(cè)只需要2~3小時(shí)即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等優(yōu)點(diǎn),一般不需貴重儀器,可大量簡化甚至省去前處理過程,對(duì)使用人員的專業(yè)技術(shù)水平要求不高,容易普及和推廣,特別適用于大批量樣本檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。
(2)準(zhǔn)確性高與我國目前市場(chǎng)上常用的快速檢測(cè)方法速測(cè)靈、速測(cè)卡、速測(cè)儀等檢測(cè)方法相比,速滅威ELISA檢測(cè)方法準(zhǔn)確度較高,重復(fù)性較好(平均變異系數(shù)低于5%),速滅威抗體特異性識(shí)別速滅威農(nóng)藥,對(duì)其他農(nóng)藥幾乎不識(shí)別。
(3)靈敏性高檢測(cè)極限遠(yuǎn)低于其他常規(guī)方法,已經(jīng)達(dá)到0.013ppb,可以精確檢測(cè)到10-9(1ppb),遠(yuǎn)低于國家要求的10-7(100ppb)的檢測(cè)要求。檢測(cè)曲線的斜率在1左右,較為合理。
(4)檢測(cè)范圍寬適宜的檢測(cè)范圍為1~10000ppb
具體實(shí)施例方式
速滅威抗原(免疫原HOM-BSA和包被抗原HOM-OVA)的合成方法為1)間-甲基苯氧甲酰氯(分子式C8H7O2Cl,結(jié)構(gòu)式 的合成稱取雙光氣28g,小心加入0.135g活性碳,36℃水浴加熱,用51.5g甲苯收集光氣,甲苯液在23℃水浴中磁力攪拌,尾氣通入堿液(注意光氣劇毒,且氣味難聞,應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行)。至雙光氣反應(yīng)完,甲苯相增重16.5g,得24%光氣/甲苯溶液。稱取間-甲基苯酚7.7g,溶進(jìn)100ml 10%的NaOH水溶液,40℃水浴加熱磁力攪拌1小時(shí),冷卻到室溫后緩慢加入上光氣/甲苯溶液,40分鐘加完,開始計(jì)時(shí),4小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。取有機(jī)相減壓蒸餾得9.012g黃色油狀物。GC法測(cè)定目標(biāo)物的含量,5℃冰箱存放備用。
2)β-(間-甲基苯氧甲酰)氨基丙酸(HOM)(分子式C11H13O4N,結(jié)構(gòu)式 的合成稱取間-甲基苯氧甲酰氯3.275g(約12.1mmol),溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得A液;稱取β-丙胺酸1.989g(約22.3mmol),溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得B液;另取3ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得C液。將A液與C液均分成5等份,每間隔5~10分鐘向B液中同時(shí)各加入1份,整個(gè)反應(yīng)置冰水中,磁力攪拌下進(jìn)行。加樣全部完成開始記時(shí),2小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)終液的pH值為4,目標(biāo)產(chǎn)物用乙酸乙酯(3個(gè)50ml份)抽提;乙酸乙酯相用稀HCl洗滌數(shù)次,用1MNaHCO3溶液(2個(gè)50ml份)抽提;水相再用濃鹽酸酸化,乙酸乙酯再抽提;無水Na2SO4干燥,所得物減壓蒸餾濃縮至13.8ml,向濃縮液中逐漸加入31ml正己烷,白色結(jié)晶物析出,過濾。結(jié)晶物經(jīng)低溫干燥得3.898g;再經(jīng)過甲苯與去離子水5℃下洗滌,低溫干燥后稱重得到H速較純品1.871g,回收率為48%。
3)速滅威人工抗原(HOM-OVA、HOM-BSA)的合成稱取H速結(jié)晶物223mg和NHS 130mg,用1000μl DMF溶解于反應(yīng)裝置中;稱取300mg DCC,用500μlDMF溶解;將DCC/DMF溶液滴加到上反應(yīng)裝置中。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行7小時(shí)(過夜)。反應(yīng)終液置5℃冰箱冷卻2小時(shí)以上,經(jīng)1.2萬rpm離心5分鐘,取上清活潑酯液并將其均分為2等份,分別緩慢滴加到2.5ml 12mg/ml的BSA溶液與2.5ml 12mg/ml的OVA溶液中反應(yīng),反應(yīng)緩沖液為0.2M pH8.0的PB液。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí)(從加樣結(jié)束開始記時(shí))。將反應(yīng)液置透析袋內(nèi),于0.2M pH6.8的PB中4℃攪拌透析,每4小時(shí)換一次透析液,共透析60小時(shí)。透析結(jié)束后將透析袋中的白色乳狀液裝于若干1ml離心管中,于-20℃冰箱中存放備用。所合成的速滅威人工抗原(HOM-OVA、HOM-BSA)保存期限為3年。
實(shí)施例1河水樣品中檢測(cè)速滅威殘留量速滅威ELISA反應(yīng)體系主要條件HOM-OVA包被物0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl,速滅威抗血清稀釋20000倍作為工作濃度,1%明膠作封閉物,抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)(PBST)中甲醇含量為5%、pH值為7.4、離子強(qiáng)度為3.2mol/L,微量分析板中每孔50μl。待測(cè)樣品準(zhǔn)備河水樣品量取河水1L,加入速滅威凈重50μg,配制成50ppb的液體樣品。采用速滅威ELISA檢測(cè)方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè),操作如下1)包被HOM-OVA作為包被物,0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl,4℃冰箱過夜,倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;2)封閉1%明膠作封閉物,微量分析板每孔100μl,37℃反應(yīng)2小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;3)加抗體及抗體與待測(cè)樣品的混合液取待測(cè)樣品200μl加到800μl反應(yīng)基質(zhì)中配制成待測(cè)液,稀釋10000倍的速滅威抗血清與待測(cè)液和空白基質(zhì)液等體積充分混合,后以每孔50μl加到微量分析板中,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;4)加酶標(biāo)二抗用pH7.4、0.15mol/L的PBST緩沖液液將商品化的HRP-羊抗兔IgG稀釋2000倍,微量分析板每孔加50μl,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干。
5)顯色TMB底物溶液50μl/孔,37℃顯色反應(yīng)10分鐘6)終止反應(yīng)并讀數(shù)加2mol/L的硫酸,50μl/孔終止顯色反應(yīng),酶聯(lián)儀上450nm處讀出吸光值,空白基質(zhì)作陽性對(duì)照,Bo=0.798,待測(cè)樣品吸光值B=0.561。
7)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出結(jié)合率B/Bo=70.3%,代入公式1Logit(B/Bo)=Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1得到Logit(B/Bo)=0.861代入如下檢測(cè)方程Logit(B/Bo)=-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C為微量分析板孔中測(cè)得的速滅威濃度,求得C=4.95ppb。待測(cè)樣品中速滅威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得X=5×2C 公式3求得待測(cè)樣本濃度X=49.5ppb,結(jié)果與實(shí)際濃度相當(dāng)。
實(shí)施例2土壤樣品中檢測(cè)速滅威殘留量速滅威ELISA反應(yīng)體系主要條件同實(shí)施例1。
待測(cè)樣品準(zhǔn)備土壤樣品稱取1kg田間自然土壤,加入速滅威凈重500μg,配制成500ppb的固體樣品。
采用速滅威ELISA檢測(cè)方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè),操作如下步驟1)、2)同實(shí)施例1。
3)加抗體及抗體與待測(cè)樣品的混合液稱取待測(cè)樣品0.1g,用0.2ml甲醇浸泡1小時(shí)左右,取100μl加到900μl反應(yīng)基質(zhì)中配制成待測(cè)液,稀釋10000倍的速滅威抗血清與待測(cè)液和空白基質(zhì)液等體積充分混合,后以每孔50μl加到微量分析板中,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;步驟4)、5)、6)同實(shí)施例1;7)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出結(jié)合率B/Bo=63.0%,代入公式1Logit(B/Bo)=Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)]公式1得到Logit(B/Bo)=0.533代入如下檢測(cè)方程Logit(B/Bo)=-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C為微量分析板孔中測(cè)得的速滅威濃度,求得C=11.05ppb。待測(cè)樣品中速滅威殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得X=20×2C 公式3求得待測(cè)樣本濃度X=442ppb,與實(shí)際濃度基本接近。
權(quán)利要求
1.農(nóng)藥速滅威殘留量ELISA檢測(cè)方法,包括1)速滅威多克隆抗體制備采用速滅威人工抗原的免疫原HOM-BSA,常規(guī)免疫方法免疫新西蘭白兔,制備得到抗速滅威的兔多克隆抗體抗血清;2)包被采用速滅威人工抗原的包被抗原HOM-OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加50μl,4℃冰箱過夜,倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;3)封閉1%明膠作封閉物,微量分析板每孔100μl,37℃反應(yīng)2小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;4)加抗體及抗體與待測(cè)樣品的混合液用稀釋10000倍的速滅威抗血清與待測(cè)樣品和空白抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)PBST液等體積充分混合,后以每孔50μl加到微量分析板中,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;5)加酶標(biāo)二抗用pH7.4、0.15mol/L的常規(guī)洗滌緩沖液PBST將商品化的HRP-羊抗兔IgG稀釋2000倍,微量分析板每孔加50μl,37℃反應(yīng)1小時(shí),倒凈,以常規(guī)洗滌緩沖液PBST洗滌3~6次并倒置、在吸水紙上拍干;6)顯色TMB底物溶液50μl/孔,37℃顯色反應(yīng)10分鐘7)終止反應(yīng)并讀數(shù)加2mol/L的硫酸,50μl/孔終止顯色反應(yīng),酶聯(lián)儀上450nm處讀出吸光值,空白基質(zhì)作陽性對(duì)照吸光值Bo,待測(cè)樣品吸光值B;8)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出結(jié)合率B/Bo及Logit(B/Bo),Logit(B/Bo)=Ln[(B/Bo)/(1-B/Bo)] 公式1代入如下檢測(cè)方程Logit(B/Bo)=-0.9404LogC+1.5146 公式2其中C為微量分析板孔中測(cè)得的速滅威濃度,通過公式1和公式2可以求得;X=n·2C,n為反應(yīng)前樣品被稀釋的倍數(shù)公式3待測(cè)樣品中以濃度X表示的速滅威殘留量可通過公式3求得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)藥速滅威殘留量ELISA檢測(cè)方法,其特征在于,抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)PBST中甲醇含量為5%、pH值為7.4、離子強(qiáng)度為3.2mol/L,微量分析板中每孔50μl。
全文摘要
本發(fā)明速滅威(metolcarb)ELISA檢測(cè)方法屬于農(nóng)藥殘留分析及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)范疇。檢測(cè)方程為Logit(B/Bo)=-0.9404LogC+1.5146(其中B為樣品孔吸光值,Bo為陽性對(duì)照吸光值,C為板孔中測(cè)出的速滅威濃度),檢測(cè)條件為速滅威包被抗原HOM-OVA 0.6μg/ml在微量分析板中每孔加 50μl,速滅威抗血清稀釋20000倍作為工作濃度,1%明膠作封閉物,抗原抗體反應(yīng)基質(zhì)(PBST)中甲醇含量為5%、pH值為7.4、離子強(qiáng)度為3.2mol/L,本方法具較強(qiáng)的特異性、靈敏性及穩(wěn)定性,為速滅威超微量檢測(cè)提供了快速、靈敏、特異的技術(shù)方法。
文檔編號(hào)G01N21/31GK1609618SQ200410065318
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 胡白石, 張奇, 徐麗娜, 姜英華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
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