專利名稱：谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，尤其是一種基于雙縮脲法和計算機色度識別軟件的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前，谷物蛋白質(zhì)含量是決定谷物食用品質(zhì)與營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)，在我國2002年開始實施的NY/T 593-2002《食用稻品種品質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)中，該參數(shù)被列為評定等級的指標(biāo)之一。針對稻米蛋白質(zhì)含量的測定，國家頒布了兩個檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，GB 2905-82《谷類、豆類作物種子粗蛋白測定法》和GB5511-85《糧食、油料檢驗粗蛋白質(zhì)測定法》，農(nóng)業(yè)部在NY/T 593-2002《食用稻品種品質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測方法NY/T 3-1982即為原GB 2905-82《谷類、豆類作物種子粗蛋白測定法》。這些方法的原理均為凱氏定氮原理，即待測樣品加濃硫酸或消化液消化，使蛋白質(zhì)和其他含氮物中的氮變成氨，同時與過量硫酸化合成硫酸銨，再加堿將氨蒸餾出來，用硼酸溶液吸收后，用中和滴定法測定總氮量，最后根據(jù)相應(yīng)的系數(shù)換算為蛋白質(zhì)含量。這種現(xiàn)行的蛋白質(zhì)含量的測定方法步驟繁瑣、操作復(fù)雜，需要配備較多的儀器與設(shè)備；且由于檢測時間長，接觸的藥品試劑具有較高危險性，測定過程中亦會產(chǎn)生大量有毒氣體，對測定環(huán)境的設(shè)置和操作人員的實驗技能均有較高要求，限制了其在更廣泛的場所得到方便的應(yīng)用，只適合于在環(huán)境條件良好，技術(shù)裝備精良的實驗室中由專業(yè)實驗技術(shù)人員完成。
雙縮脲法是一種常見的蛋白質(zhì)含量的測定方法，其原理為蛋白質(zhì)的肽鍵(與縮二脲結(jié)構(gòu)相似)在堿性溶液中與二價銅離子形成蘭紫色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)(1～15mg蛋白質(zhì))，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。利用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量，操作快速簡便、需用儀器設(shè)備少且對測定環(huán)境要求低；但目前主要用于液態(tài)樣品(如乳制品)中蛋白質(zhì)含量的測定，測定固體粉末狀樣品時，測量的結(jié)果精度較低，因而沒有廣泛的應(yīng)用在固體粉末狀樣品的測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，測量精度高，操作快速簡便，需用儀器設(shè)備少，成本低，對測定環(huán)境要求低，可適用于多類谷物蛋白質(zhì)含量的檢測，應(yīng)用范圍廣。
本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明將現(xiàn)代色度學(xué)原理與雙縮脲法有機結(jié)合，利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑形成蘭紫色的絡(luò)合物，不同蛋白質(zhì)含量的樣品，在堿性條件下與雙縮脲試劑生成深淺不同的蘭紫色溶液，其色度值與蛋白質(zhì)含量高度相關(guān)的原理，可以獲得與通過分光光度計測定吸光度值，計算蛋白質(zhì)含量的改良雙縮脲法相同的檢測精度。本發(fā)明具體的步驟如下步驟一配制顯色反應(yīng)所用的雙縮脲試劑；步驟二分別稱取已知蛋白質(zhì)含量的大米標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測大米樣品；步驟三制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為向大米標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測大米樣品中分別加入0.05M的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液、按步驟一方法制取的雙縮脲試劑，其中，樣品與氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液、雙縮脲試劑的用量比為0.5g10毫升40毫升，將混合后的溶液混勻，振蕩后靜置，使樣品充分反應(yīng)顯色；其中加入的10毫升0.05M的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液主要為顯色液提供一個堿性的反應(yīng)環(huán)境，并促進(jìn)米粉中蛋白的溶解。
步驟四將穩(wěn)定顯色后的標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液和待測樣品顯色液分別移取至位于圖像采集器上的比色池中，采集原始圖像信息；步驟五利用基于計算機色度識別的蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)，讀出采集的原始圖像信息，比較待測樣品顯色液與標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液色度值，得出待測樣品的蛋白質(zhì)含量。
在每1000毫升步驟一配制的雙縮脲試劑中，含有0.01摩爾的氫氧化鉀或氫氧化鈉、5克酒石酸鉀鈉和1.2克五水硫酸銅。其中，酒石酸鉀鈉為穩(wěn)定劑，用于使制得的雙縮脲試劑性狀穩(wěn)定，其配制的具體過程為步驟11配制10M的氫氧化鉀溶液、25％的酒石酸鉀鈉溶液和4％的CuSO4·5H2O溶液；步驟12在蒸餾水中以體積比為1∶2∶3的比例加入氫氧化鉀溶液10毫升、酒石酸鉀鈉溶液20毫升、硫酸銅溶液30毫升；步驟13將溶液定量移至1000毫升容量瓶中，加蒸餾水定容，得到所需的雙縮脲試劑。
所述的步驟二中待測樣品的稱取過程為先將待測樣品粉碎；而后過100目篩，取篩下物作為待測樣品。
為了消除某些類脂色素物質(zhì)對顯色的干擾，在所述的步驟三制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液過程中，在向標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品中加入氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液和雙縮脲試劑之前，加入1毫升四氯化碳。
所述的步驟四中顯色液的具體移取過程為取充分顯色完畢的顯色液20-30毫升置入離心管，并安放到離心機上進(jìn)行分離，取離心后的上清液3-6毫升，移取至位于圖像采集器上的比色池中。
所述的步驟五的具體過程為步驟51計算機讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息，利用該信息，通過蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)創(chuàng)建圖像的色度值表；步驟52輸入標(biāo)準(zhǔn)樣的蛋白質(zhì)含量；步驟53蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)利用標(biāo)準(zhǔn)樣品的色度值和蛋白質(zhì)含量自動求解色度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的回歸方程；步驟54蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)根據(jù)被測樣品的色度值用回歸方程計算出蛋白質(zhì)含量；步驟55蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)輸出蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)需要打印輸出。
其中，步驟53中求解色度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的回歸方程的方法為最小二乘法。
以上所述的圖像采集器為掃描儀。
需要說明的是，雙縮脲試劑的配制方法并不唯一，但總而言之，雙縮脲試劑就是堿性硫酸銅，其堿性環(huán)境由堿液提供，常用的為氫氧化鉀或氫氧化鈉。針對不同的被測樣品，雙縮脲試劑中的成份含量略有不同。
本方法基于雙縮脲反應(yīng)原理，繼承了傳統(tǒng)雙縮脲法操作簡便快速、測定環(huán)境與條件要求低等優(yōu)點；并由于改良了測定中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備使本發(fā)明在測定精度、測定時間、測定成本與操作步驟上得以進(jìn)一步優(yōu)化；利用普通的辦公用計算機與掃描儀代替了實驗室專用的精密儀器分光光度計，省去了雙縮脲法中通過人工制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算蛋白質(zhì)含量的步驟，樣品原始圖像采集后信息參數(shù)的處理、蛋白質(zhì)含量的計算以及結(jié)果的輸出均由軟件系統(tǒng)在計算機上自動完成，檢測步驟大為簡化，在保證檢測精度的基礎(chǔ)上又將測定的時間與成本進(jìn)一步降低，尤其適用于稻米品質(zhì)分級時的快速定級的實現(xiàn)。另外，與現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法繁瑣復(fù)雜的操作步驟、造價較高的儀器設(shè)備、較為危險的操作環(huán)境及對測定環(huán)境和人員的高要求相比，本發(fā)明在秉承傳統(tǒng)雙縮脲法操作簡便、成本低廉、測定安全的基礎(chǔ)上，保證了檢測精度，并進(jìn)一步降低了檢測在技術(shù)條件和環(huán)境條件方面的要求，使該指標(biāo)的檢測場所可以從現(xiàn)有的裝備精良的實驗室擴大到技術(shù)裝備尚不夠先進(jìn)和完善的糧食檢測場所，應(yīng)用范圍顯著拓寬。針對于目前測定谷物蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法均為基于凱氏定氮法的原理，本發(fā)明的測定原理同樣適用于其他多類谷物中蛋白質(zhì)含量的測定，對于谷物中蛋白質(zhì)含量的測定提出了一種更加簡便的方法。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
首先，分別配制0.05M(摩爾濃度)的氫氧化鉀溶液，10M的氫氧化鉀溶液，25％的酒石酸鉀鈉溶液和4％的五水硫酸銅溶液；其次，配制雙縮脲試劑，在約800毫升蒸餾水中加入10M氫氧化鉀溶液10毫升和25％的酒石酸鉀鈉溶液20毫升，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30毫升，將上述液體移入1000毫升容量瓶中，定容，即為雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應(yīng)嚴(yán)密貯存，若有沉淀出現(xiàn)，則應(yīng)重新配制。
然后，準(zhǔn)確稱取采用GB 2905-82標(biāo)定的已知蛋白質(zhì)含量的大米標(biāo)準(zhǔn)樣0.5000±0.0002克大米標(biāo)準(zhǔn)樣與若干個經(jīng)粉碎過100目篩且干燥至恒重的待測樣品0.5000±0.0002克，分別置于150毫升錐形瓶中。
而后，再分別向各瓶中加入1毫升四氯化碳和10毫升0.05M的氫氧化鉀溶液，然后各加入40毫升雙縮脲試劑，蓋上瓶塞，在振蕩器中震蕩10分鐘，再于室溫下靜置40分鐘使之充分顯色，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液。
接下來，分別取標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的適量顯色液(約20毫升)倒入離心管中，在離心機上以3500轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，將完全澄清的上清液5毫升移入比色池中，依次置于掃描儀上，待液面平靜后，啟動掃描儀采集圖像。
最后，在計算機中調(diào)用用于計算機色度識別的RQS1.0軟件系統(tǒng)，讀取所得原始圖像的信息，處理所得圖像，創(chuàng)建圖像的色度值表；輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品的蛋白質(zhì)含量，軟件系統(tǒng)利用標(biāo)準(zhǔn)樣的色度值和蛋白質(zhì)含量，用最小二乘法自動求解色度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的回歸方程；然后，軟件根據(jù)被測樣品的色度值用回歸方程計算蛋白質(zhì)含量；軟件系統(tǒng)輸出蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)需要打印輸出。
本發(fā)明所采用的測定蛋白質(zhì)含量的軟件系統(tǒng)RQS1.0還具有可同時完成堊白度、堊白粒率、整精米率、黃粒米、粒型及直鏈淀粉含量等指標(biāo)檢測的功能，使現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中彼此相對獨立的多項指標(biāo)的檢測由一套系統(tǒng)一并完成。
最后所應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟步驟一配制顯色反應(yīng)所用的雙縮脲試劑；步驟二分別稱取已知蛋白質(zhì)含量的大米標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測大米樣品；步驟三制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為向大米標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測大米樣品中分別加入0.05M的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液、按步驟一方法制取的雙縮脲試劑，其中，樣品與氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液、雙縮脲試劑的用量比為0.5g∶10毫升∶40毫升，將混合后的溶液混勻，振蕩后靜置，使樣品充分反應(yīng)顯色；步驟四將穩(wěn)定顯色后的標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液和待測樣品顯色液分別移取至位于圖像采集器上的比色池中，采集原始圖像信息；步驟五利用基于計算機色度識別的蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)，讀出采集的原始圖像信息，比較待測樣品顯色液與標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液色度值，得出待測樣品的蛋白質(zhì)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于在每1000毫升所述的步驟一中的雙縮脲試劑中，含有0.01摩爾的氫氧化鉀或氫氧化鈉、5克酒石酸鉀鈉和1.2克五水硫酸銅。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的步驟一配制顯色反應(yīng)所用的雙縮脲試劑的具體過程為步驟11配制10M的氫氧化鉀溶液、25％的酒石酸鉀鈉溶液和4％的CuSO4·5H2O溶液；步驟12在蒸餾水中以體積比為1∶2∶3的比例加入氫氧化鉀溶液10毫升、酒石酸鉀鈉溶液20毫升、硫酸銅溶液30毫升；步驟13將溶液定量移至1000毫升容量瓶中，加蒸餾水定容，得到所需的雙縮脲試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的步驟二中待測樣品的稱取過程為先將待測樣品粉碎；而后過100目篩，取篩下物作為待測樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的步驟三制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液過程中，在向標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品中加入氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液和雙縮脲試劑之前，加入1毫升四氯化碳。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的步驟四中顯色液的具體移取過程為取充分顯色完畢的顯色液20-30毫升置入離心管，并安放到離心機上進(jìn)行分離，取離心后的上清液3-6毫升，移取至位于圖像采集器上的比色池中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的步驟五的具體過程為步驟51計算機讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息，利用該信息，通過蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)創(chuàng)建圖像的色度值表；步驟52輸入標(biāo)準(zhǔn)樣的蛋白質(zhì)含量；步驟53蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)利用標(biāo)準(zhǔn)樣品的色度值和蛋白質(zhì)含量自動求解色度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的回歸方程；步驟54蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)根據(jù)被測樣品的色度值用回歸方程計算出蛋白質(zhì)含量；步驟55蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)輸出蛋白質(zhì)含量，并根據(jù)需要打印輸出。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述步驟53中求解色度值與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的回歸方程的方法為最小二乘法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或6或7或8所述的谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，其特征在于所述的圖像采集器為掃描儀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷物蛋白質(zhì)含量的檢測方法，包括配制顯色反應(yīng)所用的雙縮脲試劑；稱取已知蛋白質(zhì)含量的大米標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測大米樣品；制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的顯色液；將穩(wěn)定顯色后的標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液和待測樣品顯色液分別移取至位于圖像采集器上的比色池中，采集原始圖像信息；利用基于計算機色度識別的蛋白質(zhì)含量測定軟件系統(tǒng)，讀出采集的原始圖像信息，比較待測樣品顯色液與標(biāo)準(zhǔn)樣品顯色液色度值，得出待測樣品的蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明測量精度高，操作快速簡便，需用儀器設(shè)備少，成本低，對測定環(huán)境要求低，可適用于多類谷物蛋白質(zhì)含量的檢測，應(yīng)用范圍廣。
文檔編號G01N21/31GK1715883SQ20041004824
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日
發(fā)明者侯彩云, 孫建平, 常國華, 周小豐, 岳冉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)