專(zhuān)利名稱(chēng)：Ywk－ii蛋白/aplp2作為mis的新受體及其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為發(fā)現(xiàn)精子膜蛋白YWK-II蛋白/APLP2作為穆勒氏管抑制性物質(zhì)(MIS)的新受體及其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，涉及蛋白質(zhì)的新功能的研究與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
YWK-II蛋白是一種I型精子膜蛋白，最初是本組采用一株抗人精子蛋白的單克隆抗體(YWK-II)對(duì)大鼠睪丸λgt11cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選獲得。定位于人精子頭部的赤道區(qū)。序列分析發(fā)現(xiàn)YWK-II蛋白與Alzheimer’s病(老年性癡呆)A4蛋白前體(APP)存在廣泛的同源性和區(qū)域保守性，胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)有70.6％的同源性。其后自人胎盤(pán)中篩選的該蛋白被命名為淀粉樣蛋白前體同源蛋白(APPH)，并發(fā)現(xiàn)與大鼠淀粉樣蛋白前體樣蛋白2(APLP2)非常相似，為同一蛋白在不同種屬中的不同形式。人YWK-II蛋白與APLP2基因序列一致，染色體定位于11q24-25，并在多組織中均有表達(dá)，其cDNA命名為HSD-2(GenBankNumber AF168956)，長(zhǎng)3654bp，編碼763個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)YWK-II蛋白APLP2參與精卵相互作用。YWK-II抗體能夠?qū)е氯撕痛笫缶拥哪⒁种剖芫^(guò)程。以YWK-II蛋白/APLP2的片段(594-610/763)免疫小鼠，可有效地降低雄性和雌性小鼠的生殖能力。基因敲除實(shí)驗(yàn)顯示，YWK-II蛋白/APLP2與APP單獨(dú)敲除，小鼠仍具有生殖能力，而兩者聯(lián)合敲除則導(dǎo)致動(dòng)物不育。這一實(shí)驗(yàn)表明，YWK-II蛋白/APLP2在生殖細(xì)胞中發(fā)揮重要的生理功能。
體外研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2胞內(nèi)段能夠被PKC和cdc2激酶磷酸化，并可以和GTP結(jié)合蛋白Go蛋白相互作用，表明YWK-II蛋白/APLP2可能是一種與Go蛋白耦聯(lián)的受體。采用酵母雙雜交系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)YWK-II蛋白/APLP2與穆勒氏管抑制性物質(zhì)(MIS)存在相互作用。MIS是一種由Sertoli細(xì)胞和granular細(xì)胞表達(dá)分泌的糖蛋白，能夠誘導(dǎo)穆勒氏管的退化，在性別決定中發(fā)揮重要作用。兩者的相互作用經(jīng)GST Pull-down實(shí)驗(yàn)和表面等離子共振實(shí)驗(yàn)(SPR)在體外進(jìn)行了驗(yàn)證。MIS的功能是多方面的，已發(fā)現(xiàn)其可在體外促進(jìn)人精子的存活力和活動(dòng)力。研究表明，MIS在成熟精子上存在結(jié)合位點(diǎn)，但沒(méi)有證據(jù)顯示，精子中有MIS的II型受體的表達(dá)。我們推測(cè)，YWK-II蛋白/APLP2可能作為MIS的一種新的受體，介導(dǎo)MIS促進(jìn)精子存活力和活動(dòng)力的功能。
現(xiàn)有文獻(xiàn)主要集中于探討MIS與其II型受體相互作用經(jīng)NFκB通路抑制細(xì)胞的增殖。至今尚無(wú)有關(guān)YWK-II蛋白/APLP2為MIS的新受體的報(bào)道。
發(fā)明目的通過(guò)研究YWK-II蛋白/APLP2與MIS的受體-配體關(guān)系，了解兩者相互作用后的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可為YWK-II蛋白/APLP2與MIS的功能的多態(tài)性提供新的線索，為闡明MIS對(duì)精子的促進(jìn)存活力和活動(dòng)力的分子機(jī)制提供依據(jù)，進(jìn)而為在精子冷凍技術(shù)采用MIS作為精子的保護(hù)劑提供依據(jù)。
內(nèi)容與要求應(yīng)用分子克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)、抗血清制備、Western blot檢測(cè)、MTT檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)以及細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)等，克隆編碼YWK-II蛋白/APLP2和MIS的片段的cDNA，純化原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)，進(jìn)而通過(guò)共純化的方法驗(yàn)證兩者的體外結(jié)合；構(gòu)建融合表達(dá)小鼠IgGκ信號(hào)肽和綠色熒光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2的真核表達(dá)質(zhì)粒，并觀察重組蛋白的細(xì)胞定位；篩選穩(wěn)定表達(dá)重組EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞系；MTT法檢測(cè)MIS對(duì)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞增殖的影響；采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western blot檢測(cè)初步確定MIS與YWK-II蛋白/APLP2相互作用后的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
該基因/蛋白質(zhì)達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.原核細(xì)胞表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2的395-675氨基酸(HSD281)以及大鼠MIS的249-390氨基酸(rMIS142)在Resouce Q離子交換柱上分別由9％和3％NaCl洗脫。兩者以1∶2摩爾比于4℃孵育30min后，兩種蛋白質(zhì)的混合物在Resouce Q離子交換柱上以5％NaCl共洗脫(見(jiàn)圖1-1)。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，共洗脫物由YWK-II蛋白/APLP2和MIS共同組成(見(jiàn)圖1-2)。說(shuō)明兩種蛋白質(zhì)在體外可相互結(jié)合。
2.YWK-II蛋白/APLP2的胞外近膜區(qū)226個(gè)氨基酸(HSD226)于大腸桿菌中獲得明顯表達(dá)，經(jīng)親和層析純化后的產(chǎn)物免疫新西蘭大白兔，制備了高滴度抗HSD226的抗體。
3.構(gòu)建融合表達(dá)小鼠IgG κ信號(hào)肽和綠色熒光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2的真核表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-N1-SYP)，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，融合表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2定位于細(xì)胞膜上(見(jiàn)圖2、3)。
4.重組YWK-II蛋白/APLP2基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-N1-SYP)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的細(xì)胞系(見(jiàn)圖4)。
5.MIS促進(jìn)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖5)。
6.MIS激活表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的細(xì)胞的ERK1/2(見(jiàn)圖6-1)。這一功能具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性(見(jiàn)圖6-2、6-3)。MIS與YWK-II蛋白/APLP2相互作用首先激活Go(見(jiàn)圖6-4、6-5)，導(dǎo)致Goα和Goβγ的分離，并主要通過(guò)Goβγ產(chǎn)生作用(見(jiàn)圖6-6)。Ras和PKC在MIS對(duì)ERK1/2的激活中獨(dú)立地發(fā)揮作用(見(jiàn)圖6-7、6-8、6-9)。
7.YWK-II蛋白/APLP2作為一種新受體參與介導(dǎo)MIS的功能。


圖1.HSD281和rMIS142的共洗脫結(jié)果1.HSD281和rMIS142的混合物經(jīng)Resouce Q離子交換柱純化的層析圖2.共洗脫物成分分析(SDS-PAGE)1蛋白質(zhì)Marker，2共洗脫物(HSD281和rMIS142)結(jié)果顯示HSD281和rMIS142以適當(dāng)比例混合后，能夠以單一蛋白的形式在Resouce Q離子交換柱上被洗脫。共洗脫物經(jīng)變性后通過(guò)SDS-PAGE分析顯示由HSD-281和rMIS142組成。
圖2.重組蛋白EGFP-YWK-II蛋白/APLP2結(jié)構(gòu)的示意圖A.小鼠IgG κ信號(hào)肽B.HSD226(YWK-II蛋白/APLP2胞外近膜區(qū)的226氨基酸)C.YWK-II蛋白/APLP2的跨膜區(qū)D.YWK-II蛋白/APLP2的胞內(nèi)區(qū)E.綠色熒光蛋白(EGFP)圖3.重組蛋白EGFP-YWK-II蛋白/APLP2在細(xì)胞膜上的定位直接熒光觀察pEGFP-N1-SYP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，固定，透化，PI標(biāo)記細(xì)胞核1.CHO細(xì)胞表達(dá)的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(綠色)2.PI標(biāo)記的CHO細(xì)胞核(紅色)3.A圖和B圖的迭加免疫熒光觀察pEGFP-N1-SYP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，固定4.CHO細(xì)胞表達(dá)的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(綠色)5.以兔抗HSD226的抗體為一抗，Rodamine標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，標(biāo)記CHO細(xì)胞表達(dá)的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(紅色)6.D圖和E圖的迭加(黃色)圖4.穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO細(xì)胞系的鑒定采用Wertern Blot方法分別檢測(cè)CHO細(xì)胞、表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞和表達(dá)EGFP的CHO細(xì)胞
1.一抗為HSD226抗體2.一抗為GFP抗體結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SYP的CHO細(xì)胞過(guò)量表達(dá)重組的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2，對(duì)照組均為陰性。
圖5.rMIS74對(duì)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞的增殖的作用結(jié)果顯示0.035nM rMIS74即可促進(jìn)穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞的增殖，且增殖作用與rMIS74濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系，與對(duì)照組相比有顯著差異。過(guò)量表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2放大了rMIS74的作用。
圖6.rMIS74對(duì)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的激活作用及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑1.rMIS74對(duì)表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞、表達(dá)EGFP的CHO細(xì)胞和CHO細(xì)胞中ERK1/2的影響。結(jié)果顯示只有過(guò)量表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2可被rMIS74明顯激活。
2.rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2與作用時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示ERK1/2的激活在rMIS74作用5min時(shí)最強(qiáng)，之后逐漸減弱，直至下降至對(duì)照水平。
3.不同劑量rMIS74對(duì)表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的激活作用的影響。結(jié)果顯示0.0175nM的rMIS74作用5min即可激活ERK1/2，作用強(qiáng)度隨濃度增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。
4.Gi和Go的抑制劑百日咳毒素(PTX)(1000ng/mL)對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的影響。結(jié)果顯示PTX可抑制由YWK-II蛋白/APLP2介導(dǎo)的rMIS74對(duì)ERK1/2的激活作用。
5.G蛋白C端干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞的ERK1/2的影響。結(jié)果顯示Go1和Go2的C端11肽具有抑制rMIS74激活ERK1/2的作用，而Gi1/2的C端11肽無(wú)作用。
6.Goβγ的干擾蛋白βARK1對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的影響。結(jié)果顯示βARK1具有抑制rMIS74激活ERK1/2的作用。
7.Ras的持續(xù)抑制型和持續(xù)激活型突變體pCMV-RasN17和pCMV-RasV12對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞的ERK1/2的影響。結(jié)果顯示pCMV-RasN17和pCMV-RasV12分別抑制和增強(qiáng)rMIS74激活ERK1/2的作用。
8.PKC抑制劑GF109203X(3.5μM)對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的影響。結(jié)果顯示GF109203X也同樣可抑制rMIS74激活ERK1/2的作用。
9.Ras的持續(xù)抑制型突變體pCMV-RasN17和PKC抑制劑GF109203X共同作用對(duì)rMIS74(0.35nM)激活表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞中ERK1/2的影響。結(jié)果顯示兩者共同作用對(duì)rMIS74激活ERK1/2的抑制作用具有疊加效應(yīng)。
以上結(jié)果顯示rMIS74通過(guò)與YWK-II蛋白/APLP2相互作用激活細(xì)胞ERK1/2，這一作用是通過(guò)激活Go信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，其中主要經(jīng)Goβγ介導(dǎo)，進(jìn)而分別激活Ras和PKC，最終導(dǎo)致ERK1/2的激活。
具體實(shí)施例方式1.大鼠卵巢RNA的提取，RT產(chǎn)物的制備和MIS(249-390氨基酸)cDNA的擴(kuò)增取雌性大鼠一只。引頸處死后，快速切取卵巢，迅速液氮冷凍。然后用鈍器砸碎，稱(chēng)取100μg組織加入有1ml Trizol試劑(Life Technologies)的微量組織勻漿器中。按照Trizol試劑說(shuō)明所述提取總RNA。進(jìn)而按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明制備RT產(chǎn)物。采用引物GGATCCCCACCCACCGGGCCGAC和CTCGAGTTGGGAGGTCCCGCAGC以PCR的方法擴(kuò)增出MIS(249-390氨基酸)cDNA。
2.HSD281和rMIS142原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，蛋白的表達(dá)，共純化和成分分析將編碼HSD281(YWK-II蛋白395-675氨基酸)和rMIS142(大鼠MIS249-390氨基酸)的cDNA分別克隆到pET28a(+)和pET30a(+)，命名為pET28a(+)-HSD281和pET30a(+)-MIS142。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli strain BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂板上篩選出陽(yáng)性克隆。首先小量培養(yǎng)鑒定蛋白表達(dá)水平及該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形式，然后進(jìn)行大量表達(dá)，自經(jīng)過(guò)鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落入100mL新鮮LB的錐形瓶(含卡那霉素50μg/mL)。37℃，劇烈搖動(dòng)，培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌液按1/100比例接種到一個(gè)含500mL LB(含卡那霉素)的2000mL錐形瓶中，37℃，劇烈搖動(dòng)，培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的A600nm值達(dá)0.4-0.6。加入終濃度為0.5mmol/L IPTG于16℃誘導(dǎo)表達(dá)5h。收集培養(yǎng)液，5000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，菌體按照10mL/g重懸于裂解液中(20mM Tris-HClpH8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mM PMSF，1mM β-mercaptoethanol)，冰浴下以工作4s/冷卻6s/300W/120次超聲破碎菌體。12000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達(dá)形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 采用Novagen公司的His.Bind metal chelation resin產(chǎn)品進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的初步純化。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白質(zhì)以可溶性形式表達(dá)，以0.45μm濾膜過(guò)濾上清。輕混Ni-NTA樹(shù)脂，使其與保存液混勻呈完全懸浮狀態(tài)。吸取2.5mL樹(shù)脂懸液加到聚丙烯柱內(nèi)，使樹(shù)脂在重力作用下沉積。分別以3倍柱床體積去離子水、5倍體積Charging buffe r(50mM NiSO4)及3倍體積Binding buffer(5mM咪唑，0.SM NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)洗柱。當(dāng)Binding Buffer下降到柱床上緣時(shí)，加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的待純化樣品。調(diào)節(jié)流速約為10滴/min。分別以10倍體積的Binding Buffer、6倍體積的Washing Buffer(40mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris·HCl，pH7.9)洗柱。以6倍柱床體積或更少的Elution Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)，洗脫柱子。收集洗脫液。取少量行SDS-PAGE，鑒定蛋白質(zhì)純度為90％以上。
采用AKTA Prime System(Amersham Pharmacia)對(duì)上述收集的蛋白質(zhì)進(jìn)行再純化。通過(guò)G-25 column，將蛋白質(zhì)的緩沖液由洗脫液轉(zhuǎn)換成為buffer A(50mM Tris-HCl pH8.0，80mM NaCl，1mMβ-mercaptoethanol)，經(jīng)Resouce Q離子交換柱純化(洗脫緩沖液50mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，1mMβ-mercaptoethanol)。將洗脫液濃縮，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以摩爾比1∶2的比例混合HSD-281和rMIS142，于4℃孵育30min，將混合物于Resouce Q離子交換柱純化，混合物以單一蛋白質(zhì)的形式洗脫(圖1A)，共洗脫物變性后行SDS-PAGE，顯示由兩個(gè)蛋白質(zhì)組成即HSD-281和rMIS142(圖1B)。
3.YWK-II蛋白/APLP2胞外近膜段(HSD226)抗血清的制備將pET30a(+)-HSD226轉(zhuǎn)化E.coli strain BL21(DE3)，如實(shí)施例2中方法誘導(dǎo)表達(dá)及純化His6-HSD226(1mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h)。
取三只2kg重的新西蘭大白兔(兩只作為實(shí)驗(yàn)組，一只為對(duì)照組)。分別于免疫前從耳緣靜脈取0.5mL正常血清做陰性對(duì)照。將純化的His6-HSD226與福氏完全佐劑混合，采用背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，約20-30點(diǎn)。對(duì)照組取溶解His6-HSD226用的緩沖液與佐劑混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)抗體滴度，Western Blot檢測(cè)抗體的反應(yīng)性和特異性。
將免疫用樣品行12％SDS-PAGE電泳(反應(yīng)性檢測(cè)His6-HSD226每泳道上樣量為1μg；特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)化pET30a(+)-HSD226并誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液，每泳道上樣量為50μg)。SDS-PAGE結(jié)束后，將塑料支架平放，依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊，趕走各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，230mA，1.5h(PVDF膜需經(jīng)100％甲醇浸透5min，電轉(zhuǎn)液平衡15min后方可使用)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于去離子水中漂洗5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脫色至可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時(shí)分子量的參照。轉(zhuǎn)移的濾膜勿干，準(zhǔn)備用于雜交。將做好標(biāo)記的濾膜經(jīng)TBS漂洗后，加入適量封閉液(含5％脫脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室溫輕搖2h。將濾膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入一抗(反應(yīng)性檢測(cè)將抗血清1∶500、1∶1000、1∶2000；1∶5000稀釋?zhuān)惶禺愋詸z測(cè)1∶1000稀釋抗血清)。除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過(guò)夜。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入塑料袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體。趕除氣泡，封口。室溫輕搖2h。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用顯色緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)平衡膜5min。將濾膜浸入含100μL ReagentA與100μL Reagent B(Bio-Rad)的10mL顯色緩沖液中，于室溫下輕輕搖晃使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，蒸餾水中漂洗，4℃避光保存并掃描。
4.與小鼠IgGκ信號(hào)肽和綠色熒光蛋白融合表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2的重組質(zhì)粒的構(gòu)建，CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染，以及重組蛋白細(xì)胞定位的觀察合成小鼠IgGκ信號(hào)肽基因序列的5’端GTCGACACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTC和3，端的互補(bǔ)序列，GAATTCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCA，于1×PCR buffer，dNTPs和Taq DNA polymerase的體系中，退火溫度44℃條件下，進(jìn)行overlap。經(jīng)PAGE檢測(cè)序列長(zhǎng)度正確的反應(yīng)產(chǎn)物，采用壓碎浸泡法回收后，連接入pEGFP-N1載體。采用引物GAATTCATGGTTAAAGCTTTAGAG和GGATCCCGAATCTGCATCTGCTCCAG，PCR擴(kuò)增YWK-II蛋白/APLP2的序列，并克隆入pEGFP-N1載體小鼠IgGκ信號(hào)肽基因序列之后。
將蓋玻片分次置于濃酸中浸泡2h，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片置于10倍稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液中，室溫放置5min后取出，置于60℃干燥1h或室溫過(guò)夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
實(shí)驗(yàn)前兩天將處理過(guò)的蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板板中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)至70％飽和度。用50μL無(wú)抗生素?zé)o血清DMEM分別稀釋3μg質(zhì)粒和3.5μL Lipofectamine 2000。室溫放置2min后將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫放置20min。將上述混合物滴加到6孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。
細(xì)胞熒光直接觀察1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)去離子水漂洗，2×5min。4)封片取10μL封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周?chē)弥讣子头庾　?)用激光共聚焦顯微鏡觀察(圖3ABC)。
細(xì)胞免疫熒光染色1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃過(guò)夜。6)一抗孵育anti-HSD226抗體按1∶100稀釋?zhuān)?7℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育Rodamin標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體按1∶50稀釋37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)去離子水漂洗，2×5min。11)封片取10μL封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周?chē)弥讣子头庾　?2)用激光共聚焦顯微鏡觀察(圖3DEF)。
5.穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO細(xì)胞系的篩選采用Lipofectamine 2000將pEGFP-N1-SYP和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞48h后，在培養(yǎng)基中加入geneticin(G418)(500ng/mL)，每3-4天換液一次，加入同樣濃度的G418。2-3周后，挑選同時(shí)具有抗生素抗性和綠色熒光的細(xì)胞克隆，使之?dāng)U增為細(xì)胞系，通過(guò)熒光觀察和Western Blot進(jìn)行鑒定。離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(1％NP-40，150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA pH8.0，1mM DTT，1mM PMSF，1μg/mL Aprotinin and 1μg/mL Leupeptin)，冰上裂解3h后，4℃，12000rpm，離心10min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并在蛋白溶液中加入1×SDS-sample buffer和5％2-Mercaptoethanol，于100℃變性10min，儲(chǔ)存于-70℃。每組細(xì)胞以50μg總蛋白行12％SDS-PAGE。SDS-PAGE結(jié)束后，將塑料支架平放，依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊，趕走各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，230mA，1.5h(PVDF膜需經(jīng)100％甲醇浸透5min，電轉(zhuǎn)液平衡15min后方可使用)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于去離子水中漂洗5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脫色至可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時(shí)分子量的參照。轉(zhuǎn)移的濾膜勿干，準(zhǔn)備用于雜交。將做好標(biāo)記的濾膜經(jīng)TBS漂洗后，加入適量封閉液(含5％脫脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室溫輕搖2h。將濾膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入1∶1000的一抗(抗HSD226抗體，兔IgG；抗GFP抗體，兔IgG)。除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過(guò)夜。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入塑料袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體。趕除氣泡，封口。室溫輕搖2h。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用顯色緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)平衡膜5min。將濾膜浸入含100μL ReagentA與100μL ReagentB(Bio-Rad)的10mL顯色緩沖液中，于室溫下輕輕搖晃使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，蒸餾水中漂洗，4℃避光保存并掃描(圖4)。
6.MTT法檢測(cè)MIS促進(jìn)表達(dá)YWK-II蛋白的細(xì)胞的增殖將CHO細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的CHO細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞以5000/孔的密度種植于96孔培養(yǎng)板中。血清饑餓24h后，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的rMIS74(0nM，0.035nM，0.35nM，3.5nM和35nM)。繼續(xù)培養(yǎng)1天后，在200μL培養(yǎng)基中加入20μL 5mg/mL thiazolyl blue tetrazoliumbromide(MTT)，于37℃反應(yīng)4h。棄去培養(yǎng)基，加入100μL DMSO裂解細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm的OD值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每種細(xì)胞的對(duì)照組設(shè)為100％，各實(shí)驗(yàn)組則以與之相比所得的百分?jǐn)?shù)表示(圖5)。
7.Western Blot檢測(cè)MIS對(duì)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的細(xì)胞ERK1/2的激活及其相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路分別合成編碼Gαi1/2，Gαo1，Gαo2C末端11個(gè)氨基酸殘基的cDNA及其互補(bǔ)序列，并加入了核糖體結(jié)合通用序列(5’-GCCGCCACC-3’)，轉(zhuǎn)錄起始密碼子(ATG)，一個(gè)在轉(zhuǎn)錄時(shí)保護(hù)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和在翻譯時(shí)保護(hù)新合成的肽免于被蛋白酶降解的編碼甘氨酸的三核苷酸(GGA)，以及一個(gè)終止密碼子(TGA)。序列的5’和3’端酶切位點(diǎn)分別為BamHI和XhoI?；パa(bǔ)序列在體外于1×PCR緩沖液中退火后，克隆入pcDNA 3.1(+)，分別命名為pcDNA 3.1(+)-Gαi1/2，pcDNA 3.1(+)-Gαo1，pcDNA 3.1(+)-Gαo2。以CHO細(xì)胞的RT產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)引物GAATTCGCCGCCACCATGGGAATCAAGTTACTGGAC和GGATCCTCAGAGGCCGTTGGCACT，PCR擴(kuò)增CHO細(xì)胞的βARK1片段，克隆入pCMV。命名為pCMV-CHOβARK1。
將CHO細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的CHO細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)板中，血清饑餓24h后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。在CHO細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)EGFP的CHO細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的(0，0.035nM，0.35nM)rMIS74，于37℃作用5min。在穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5，10，15，20，25，30min。在穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的(0，0.0175nM，0.035nM，0.35nM，3.5nM，35nM)rMIS74，于37℃作用5min。以1μg/mL PTX預(yù)處理穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞24h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。將pcDNA3.1(+)-Gαi1/2，pcDNA3.1(+)-Gαo1，pcDNA 3.1(+)-Gαo2轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞24h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。將pCMV-CHOβARK1轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II protein/APLP2的CHO細(xì)胞24h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。以3.5μM GF109203X預(yù)處理穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞2h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。將pCMV-RasN17和pCMV-RasV12轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞24h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。將pCMV-RasN17轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞24h，繼而以3.5μM GF109203X預(yù)處理細(xì)胞2h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。
棄細(xì)胞培養(yǎng)基，以用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，刮取細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液(1％NP-40，150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，10mM NaF，1mM Na2VO3，2mM EDTA pH8.0，1mM DTT，1mM PMSF，1μg/mL Aprotinin and 1μg/mL Leupeptin)，在冰上裂解3h。4℃，12000rpm，離心10min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并在蛋白溶液中加入1×SDS-Sample buffer和5％2-Mercaptoethanol，于100℃變性10min，儲(chǔ)存于-70℃。
Western Blot檢測(cè)細(xì)胞磷酸化ERK1/2和總ERK1/2的含量，分析相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。每組細(xì)胞以100μg總蛋白行10％SDS-PAG電泳。SDS-PAGE結(jié)束后，將塑料支架平放，依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿墊，趕走各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，230mA，1.5h(PVDF膜需經(jīng)100％甲醇浸透5min，電轉(zhuǎn)液平衡15min后方可使用)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于去離子水中漂洗5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脫色至可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時(shí)分子量的參照。轉(zhuǎn)移的PVDF膜勿干，準(zhǔn)備用于雜交。將做好標(biāo)記的PVDF膜經(jīng)TBS漂洗后，加入適量封閉液(含5％脫脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室溫輕搖2h。將PVDF膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入1∶1000的一抗(抗pERK1/2抗體，小鼠IgG)。除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過(guò)夜。取出PVDF膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入塑料袋內(nèi)，按照0.1mL/cm2加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體。趕除氣泡，封口。室溫輕搖2h。取出PVDF膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用TBS平衡膜5min。采用ECL法檢測(cè)，按照0.1ml/cm2將A和B液等體積混合液滴加在PVDF膜上，室溫作用1min，使用X光片曝光，顯影后定影。pERK1/2檢測(cè)完畢后，洗滌PVDF膜(147mM NaCl and 10mM This-HCl pH2.3)。使用抗ERK1/2抗體(兔IgG)再雜交，并以ECL法檢測(cè)，作為對(duì)照。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明為發(fā)現(xiàn)精子膜蛋白YWK-II蛋白/APLP2作為穆勒氏管抑制性物質(zhì)(MIS)的新受體及其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述發(fā)明，其特征在于原核細(xì)胞表達(dá)的YWK-II蛋白/APLP2的395-675氨基酸以及MIS的249-390氨基酸在Resouce Q離子交換柱上分別由9％和3％NaCl洗脫。兩者以1∶2摩爾比于4℃孵育30min后，兩種蛋白質(zhì)的混合物在Resouce Q離子交換柱上由5％NaCl共洗脫。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，共洗脫物由YWK-II蛋白/APLP2和MIS共同組成。說(shuō)明兩種蛋白質(zhì)在體外可相互結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述發(fā)明，其特征在于重組表達(dá)的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2定位于細(xì)胞膜上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、所述發(fā)明，其特征在于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述發(fā)明，其特征在于MIS促進(jìn)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2的細(xì)胞的增殖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述發(fā)明，其特征在于MIS對(duì)表達(dá)YWK-II蛋白/APLP2細(xì)胞的ERK1/2具有激活作用。這一功能具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。MIS與YWK-II蛋白/APLP2相互作用首先激活Go，導(dǎo)致Goα和Goβγ的分離，并主要通過(guò)Goβγ產(chǎn)生作用。Ras和PKC在MIS對(duì)ERK1/2的激活中獨(dú)立地發(fā)揮作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述發(fā)明，其特征在于YWK-II蛋白/APLP2作為一種新受體參與介導(dǎo)MIS的功能，對(duì)于了解MIS促進(jìn)精子存活力和活動(dòng)力的功能的分子機(jī)制以及YWK-II蛋白/APLP2與MIS的功能的多態(tài)性具有重要的意義，為在精子冷凍技術(shù)采用MIS作為精子的保護(hù)劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明為發(fā)現(xiàn)YWK－II蛋白/APLP2作為MIS的新受體及其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，涉及蛋白質(zhì)新功能的研究與應(yīng)用領(lǐng)域。內(nèi)容包括體外共洗脫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩種蛋白質(zhì)的相互作用；構(gòu)建表達(dá)EGFP－YWK－II蛋白/APLP2的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，熒光和免疫熒光觀察顯示，表達(dá)的重組蛋白定位于細(xì)胞膜上；篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP－YWK－II蛋白/APLP2的CHO細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)MIS促進(jìn)該細(xì)胞系的增殖；MIS通過(guò)與YWK－II蛋白/APLP2相互作用激活細(xì)胞ERK1/2，這一作用是通過(guò)G
文檔編號(hào)G01N33/566GK1667415SQ20041000479
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者尹雪茜, 楊茂君, 繆時(shí)英, 王琳芳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所