專利名稱：一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法
技術領域：
本發(fā)明為一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，特別是指用紫外分光光度法來快速、定量測定的方法，涉及生物技術領域。
二.
背景技術：
有關靈芝[赤芝Ganoderma lucidum(Fr.)Karst]多糖類成分的分離純化，成份結構、藥理、免疫抗腫瘤活性的研究及臨床應用已廣泛見諸文獻，對于三萜類化合物的分離純化、結構鑒定和生物活性也有一些報道，并且一直是國際上靈芝研究的一個重要方向，其生物活性包括抑制腫瘤細胞增殖、抗病毒、抑菌、鎮(zhèn)痛、保肝護肝等。靈芝中三萜類化合物的提取工藝大致為靈芝子實體精粉經過乙醇提取，氯仿溶解，飽和NaHCO3萃取，HCl酸化，氯仿萃取，減壓蒸餾干燥等步驟，即可得到淡黃色固體結晶。(參見王幫武等。靈芝酸性組份的提取分離及抑菌活性研究。北京理工大學學報，2002，22(1)125-128)目前國內市場上靈芝產品種類繁多，很多產品以三萜類作為功效組份。由于對此類活性組份還沒有簡單實用的檢測方法，導致無法對其質量進行快速有效的檢測和定量測定，因此市場上經常出現名不副實的宣傳。本發(fā)明描述的是用紫外分光光度法來快速測定靈芝供試品中三萜類物質含量的一種方法，具有縮短測定時間，簡化檢測工藝，重復性好，成本較低，實施容易等優(yōu)點。
三.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于建立一種用紫外分光光度法快速定量測定靈芝供試品中三萜類化合物含量的方法。
1.本發(fā)明所用儀器為紫外可見雙光束分光光度計、高壓液相色譜儀、色譜柱、紫外檢測分析儀。
2.本發(fā)明所需材料為靈芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst)子實體；甲醇和醋酸為色譜純試劑；三氯甲烷、碳酸氫鈉等為分析純試劑；0.45μm微孔濾膜。
3.本發(fā)明所指測量對象為靈芝(Ganoderma lucidum(Fr.) Karst)子實體中的三萜類化合物，具有以下一些特征
A.其外觀為淡黃色固體結晶。
B.色譜特征薄層色譜條件GF-254硅膠板，展開劑V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5。在波長254nm檢測下，Rf值0.35～0.90。高壓液相色譜條件檢測波長250～260nm，譜帶寬度16，參比波長360nm，譜帶寬度100，甲醇溶解樣品，濃度1mg/mL，進樣量10μL，流速0.8mL/min，柱溫40℃；流動相5％醋酸—甲醇60∶40。惠普-1100型高壓液相色譜儀分析顯示8個主要特征峰，相對保留時間α分別為0.78、0.88、0.92、1.00、1.12、1.27、1.48、1.61，8個主峰面積百分數在70％以上。
C.光譜特征其甲醇、氯仿、飽和NaHCO3溶液的紫外可見光譜中，在250～260nm處均有一個最大吸收峰；其紅外光譜中，在3400cm-1，1025cm-1有羥基吸收峰，1710cm-1出現六元環(huán)酮，2955cm-1出現CH3-C-基團，2922cm-1和2851cm-1出現-C-CH2-C-強的伸縮振動峰。
D.化學結構有5種不同的母核結構，見附

圖1。圖1顯示了利用紫外分光光度法所檢測到的靈芝中三萜類化合物的五種結構母核，屬于高度氧化的羊毛甾烷類衍生物，按分子中所含碳原子數目可分為C30、C27和C24三大類。在這五種基本骨架結構中，環(huán)上的雙鍵大多位于Δ8(9)位，大部分在C11位和C23有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羰基或羥基所取代。而在三萜醇、醛和過氧化物的的結構中，環(huán)上大多存在二個不飽和雙鍵、其位置在Δ7(8)、Δ9(11)位，C11位和C23位也不存在羰基，而且環(huán)上的取代基明顯減少。
4.標準品以及標準曲線的制備A.標準品的制備與檢測結果。制備步驟大致為先按照文獻方法從靈芝精粉中提取總三萜類化合物，再利用反復硅膠柱色譜方法分離，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脫，收集98∶2洗脫出的餾分進行檢測。薄層色譜檢測選擇展開劑V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，紫外檢測分析儀(檢測波長254nm)和硅膠板GF-254。選擇檢測結果呈現單一斑點的餾分進行高效液相色譜制備得到一種單峰物質。用分析型高效液相色譜進行檢測，樣品濃度1mg·mL-1，上樣量10μL，流動相為5％醋酸-甲醇(60∶40)，流速1mL·min-1，檢測波長250～260nm，參比波長360nm。
檢測結果為薄層色譜結果顯示為單一斑點，Rf值為0.43。進一步用高壓液相色譜分析，結果顯示標準品純度達100％，其保留時間為22.26min。其紅外光譜中，在3400cm-1，1025cm-1有羥基吸收峰，1710cm-1出現六元環(huán)酮，2955cm-1出現CH3-C-基團，2922cm-1和2851cm-1出現-C-CH2-C-強的伸縮振動峰。
B.標準曲線的制備方法與繪制精確稱取三萜類化合物標準品，用飽和碳酸氫鈉溶液配成起始濃度200μg·mL-1。充分溶解后，2倍稀釋成系列濃度200、100、50、25、12.5μg·mL-1。以飽和碳酸氫鈉溶液為空白進行基線調零，光譜掃描范圍200～400nm，采樣間隔0.5nm，光譜帶寬2nm。確定最大吸收波長后，在此波長下進行標樣的定量測定，計算線性回歸方程并進行顯著性檢驗。
標準曲線繪制標準品系列濃度在200～400nm掃描波長范圍內都有1個最大吸收峰，其最大吸收波長范圍為250～260nm，線性回歸方程為y＝-0.00574+0.01048x，相關系數r在0.9990～0.9999之間，SD＝0.01355，P＜0.0001(n＝6)。
5.供試品制備方法根據附圖2，精確稱取0.2～2.0g靈芝供試品置于潔凈的試管中，加入氯仿，振蕩搖勻，浸泡0.5h～1h后于2000r·m-1離心，取樣器準確吸取上清液得提取液I，余液放入分液漏斗中，用飽和NaHCO3萃取2～3次，收集氯仿層和NaHCO3層得提取液II和III。
本發(fā)明的重點靈芝供試品中三萜類化合物含量快速檢測的標準程序為精確稱取0.2～2g靈芝子實體置于潔凈試管中，加入氯仿浸提0.5～1h，氯仿體積ml數與樣品重量g數之比為10∶1～20∶1。離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取2～3次，收集提取液III，即堿提的NaHCO3層為供試溶液，準確測量其體積后，稀釋，運用紫外分光光度法在最大吸收波長250～260nm下測定供試溶液的光吸收值，根據標準曲線即可計算出樣品中三萜類化合物的含量。本發(fā)明利用紫外分光光度法在提取三萜類化合物工藝的中間階段，即堿提的NaHCO3層進行檢測，省去了后面的酸化、氯仿萃取、減壓蒸餾干燥等步驟，使得測定時間大大縮短。
其中利用提取液III，即堿提的NaHCO3層來進行定量測定的原因為參照附圖2的提取液制備流程，分別對供試品的3種提取液I、II、III中所含的三萜類化合物進行了紫外分光光度定量測定，多次實驗結果表明提取液I和III的最大吸收波長是257nm，II則有兩個峰值247nm和283nm。組份II雖然在257nm沒有最大吸收，但吸收值也高達1.856，表明提取液I中非三萜類組份在257nm處也有較強的吸收，因此不能用來進行檢測。含有三萜類組份的提取液III與標準品一樣僅在257nm處有最大吸收，因此可以測定III中三萜類含量以代表樣品中三萜類的含量。
本發(fā)明的主要優(yōu)點如下1.簡便快速和重復性好。在提取三萜類化合物工藝的中間階段，即堿提的NaHCO3層進行檢測，省去了后面的酸化、氯仿萃取、減壓蒸餾干燥等步驟，具有縮短測定時間，簡化檢測工藝，易于重復等優(yōu)點，可以應用于靈芝及其相關產品的質量評估。
2.成本低分析所需樣品量較少，僅為0.2～2g；3.操作流程簡單，所用藥品與儀器均為常見易得，在普通實驗室或藥廠即可實施；四.說明書附1顯示了利用紫外分光光度法所檢測到的靈芝中三萜類化合物的五種結構母核。
圖2顯示了靈芝中三萜類化合物含量快速測定流程圖。
五.
具體實施例方式
實施例11儀器與材料1.1儀器 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計；高壓液相色譜儀(惠普1100series)；ODS RP-C18色譜柱5μm填料，250mm×4.6mm。手提式紫外檢測分析儀UV-III型(檢測波長254nm)。
1.2材料 靈芝(Ganoderma lucid um(Fr.)Karst)子實體(產地山東泰安)。甲醇和醋酸為色譜純試劑，三氯甲烷、碳酸氫鈉等為分析純試劑。0.45μm微孔濾膜(國產)。
2實驗方法2.1標準品制備與檢測先按照文獻方法從靈芝精粉中提取總三萜類化合物，再利用反復硅膠柱色譜方法分離，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脫，收集98∶2洗脫出的餾分進行檢測。薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)檢測選擇展開劑V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，紫外檢測分析儀(檢測波長254nm)，硅膠板GF-254。選擇檢測結果呈現單一斑點的餾分進行高效液相色譜制備得到一種單峰物質。用分析型高效液相色譜進行檢測，樣品濃度1mg·mL-1，上樣量10μL，流動相為5％醋酸-甲醇(60∶40)，流速1mL·min-1，檢測波長257nm，參比波長360nm。
2.2標準曲線制備精確稱取三萜類化合物標準品，用飽和碳酸氫鈉溶液配成起始濃度200μg·mL-1。充分溶解后，2倍稀釋成系列濃度200、100、50、25、12.5μg·mL-1。以飽和碳酸氫鈉溶液為空白進行基線調零，光譜掃描范圍200～400nm，采樣間隔0.5nm，光譜帶寬2nm。確定最大吸收波長后，在此波長下進行標樣的定量測定，計算線性回歸方程并進行顯著性檢驗。
2.3供試品制備根據圖2，精確稱取1g靈芝供試品置于潔凈的試管中，加入氯仿15mL，振蕩搖勻，浸泡0.5h后于2000r·m-1離心10min，取樣器準確吸取上清液得提取液I(體積V1為9.7mL)。取300μL提取液I稀釋20倍后進行光譜掃描和定量測定，余液放入50mL分液漏斗中，用飽和NaHCO3萃取，每次10mL，共3次，收集氯仿層和NaHCO3層得提取液II和III(III體積V2為30.0mL)，II和III分別稀釋3倍和4倍后進行光譜掃描和定量測定。
3結果3.1標準品檢測結果TLC結果用254nm紫外燈檢測，標準品顯示單一斑點，Rf值為0.43。進一步用高壓液相色譜分析，結果顯示標準品純度達100％，其保留時間為22.26min。其紅外光譜中，在3400cm-1，1025cm-1有羥基吸收峰，1710cm-1出現六元環(huán)酮，2955cm-1出現CH3-C-基團，2922cm-1和2851cm-1出現-C-CH2-C-強的伸縮振動峰。
3.2標準曲線繪制標準品系列濃度在200～400nm掃描波長范圍內都有1個最大吸收峰，其最大吸收波長為257nm，各峰最大吸收波長的重現性較好，儀器精度較高。
將0～200.0μg/mL三萜類化合物標準品溶解在飽和NaHCO3中，在最大吸收峰257nm處測光吸收值，經Origin 6.1軟件處理分析，其線性回歸方程為y＝-0.00574+0.01048x，相關系數R＝0.99988，SD＝0.01355，P＜0.0001(n＝6)。表明標準品溶液的濃度與吸光度呈顯著性線性相關，該法在此濃度范圍內測定結果比較準確。
3.3供試品制備條件的確定為了探討提取液I是否能夠直接用于測定靈芝供試品中的三萜類化合物的含量，在本實驗中對3種提取液I、II、III進行了紫外分光光度測量。結果表明提取液I和III的最大吸收波長是257nm，II則有兩個峰值247nm和283nm。組份II雖然在257nm沒有最大吸收，但吸收值也高達1.856，表明提取液I中非三萜類組份在257nm處也有較強的吸收，因此不能用來進行檢測。含有三萜類組份的提取液III與標準品一樣僅在257nm處有最大吸收，因此可以測定III中三萜類含量以代表樣品中三萜類的含量。三萜類化合物含量可以根據以下公式計算出來 結論 1g靈芝精粉用15mL氯仿浸泡0.5h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取3次，257nm檢測提取液III中三萜類的含量。經3次測定，三萜類平均含量為1.48％。
實施例2按所述相同步驟重復進行實施例1，但靈芝供試品與氯仿投料比1(g)∶20(ml)，氯仿浸泡0.5h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取3次，收集提取液III，即NaHCO3層，257nm檢測中三萜類的含量。經三次測定，三萜類平均含量為1.51％。
實施例3按所述相同步驟重復進行實施例1，但靈芝供試品與氯仿投料比1(g)∶10(ml)，氯仿浸泡0.5h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取3次，收集NaHCO3層，257nm檢測提取液III中三萜類的含量。經三次測定，三萜類平均含量為1.49％。
實施例4按所述相同步驟重復進行實施例1，但靈芝供試品與氯仿投料比1(g)∶15(ml)，氯仿浸泡1h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3層，257nm檢測提取液III中三萜類的含量。經三次測定，三萜類平均含量為1.50％。
實施例5按所述相同步驟重復進行實施例1，但靈芝供試品與氯仿投料比1(g)∶20(ml)，氯仿浸泡1h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3層，257nm檢測提取液III中三萜類的含量。經三次測定，三萜類平均含量為1.52％。
實施例6按所述相同步驟重復進行實施例1，但靈芝供試品與氯仿投料比1(g)∶10(ml)，氯仿浸泡1h后，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3溶液萃取2次，收集NaHCO3層，257nm檢測提取液III中三萜類的含量。經三次測定，三萜類平均含量為1.50％。
權利要求
1.一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，其特征在于用紫外分光光度法對靈芝三萜類化合物進行快速、定量的測定。
2.根據權利要求1所述的一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，其特征在于紫外定量檢測的最大吸收波長范圍在250nm～260nm。
3.根據權利要求1所述的一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，其特征在于利用紫外分光光度法在提取三萜類化合物工藝的中間階段，即堿提的NaHCO3層進行檢測，省去了后面的酸化、氯仿萃取、減壓蒸餾干燥等步驟，使得測定時間大大縮短。
4.根據權利要求1所述的一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，其特征在于標準品采用飽和碳酸氫鈉溶液溶解；并且標準品在0～400.0μg·mL-1濃度范圍內，相關系數r在0.9990～0.9999之間。
5.根據權利要求4所述的一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法中的標準品，其制備方法的特征在于靈芝子實體精粉經過乙醇提取、氯仿溶解、飽和NaHCO3萃取和HCl酸化得到總三萜，再利用反復硅膠柱色譜方法分離，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脫，收集餾分進行薄層色譜檢測，選擇較純餾分通過高壓液相色譜制備得到單體物質。
6.根據權利要求1所述的一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，其特征在于靈芝供試品制備方法為，精確稱取靈芝供試品置于潔凈的試管中，加入氯仿浸提0.5～1h，氯仿體積ml數與樣品重量g數之比為10∶1～20∶1，離心得上清液，用等量飽和NaHCO3萃取2～3次，收集NaHCO3層并準確測量其體積，即為供試溶液。
全文摘要
本發(fā)明為一種快速定量測定靈芝中三萜類化合物含量的方法，特別是指用紫外分光光度法來定量測定的方法，涉及生物技術領域。其技術方案為將靈芝供試品置于潔凈試管中，加入氯仿浸提0.5～1h，離心得上清液，用等量飽和NaHCO
文檔編號G01N21/31GK1546992SQ20031011711
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權日2003年12月3日
發(fā)明者楊新林, 黃書銘, 朱鶴孫, 徐建蘭 申請人:北京理工大學, 無錫市三聯高科技開發(fā)有限公司