專利名稱：抗人血紅蛋白檢測(cè)試劑條及其含有的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，可直接用于法醫(yī)物證對(duì)人血的確證，更具體地，本發(fā)明涉及抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，其含有的抗人血紅蛋白單克隆抗體及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本發(fā)明也涉及檢測(cè)試劑條的制備方法。
背景技術(shù)：
在公安法醫(yī)工作中，案件物證的盡快檢驗(yàn)和鑒定，對(duì)于案件的及時(shí)偵破、抓捕犯罪分子或釋放犯罪嫌疑人具有決定性的作用。膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條出現(xiàn)前，同類免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)采用免疫電泳、免疫擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附分析(即ELISA)等方法進(jìn)行，這些方法或?qū)嶒?yàn)步驟相對(duì)較多、操作復(fù)雜、對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求程度高，或檢驗(yàn)所用時(shí)間較長(zhǎng)，而且全都必需在室內(nèi)進(jìn)行。因此，建立一新方法對(duì)上述這些問(wèn)題和缺點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)、加以克服是很有必要的。膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的研制及使用使得案件物證在現(xiàn)場(chǎng)就能檢驗(yàn)并做出鑒定、甚至可由此確定犯罪嫌疑人，因而能快速破案。但是目前國(guó)內(nèi)外的有些檢測(cè)人血紅蛋白的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，由于抗人血紅蛋白抗體特異性沒(méi)有達(dá)到公安或司法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，時(shí)有出現(xiàn)檢驗(yàn)錯(cuò)誤的情況，如將動(dòng)物的血鑒定成了人血。而眾所周知，公安或司法的檢驗(yàn)是不允許出現(xiàn)錯(cuò)檢的，因?yàn)檫@關(guān)系著某個(gè)人的前途或命運(yùn)。因此研制只對(duì)人血紅蛋白起反應(yīng)、完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求的抗人血紅蛋白單克隆抗體及試劑條，非常迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高度靈敏、特異的抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，本發(fā)明也提供了該試劑條的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種對(duì)人血紅蛋白高度特異的抗人血紅蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明也提供一種產(chǎn)生上述抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明使用的雜交瘤細(xì)胞株B9已經(jīng)于2003年7月1日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC 0970。
本發(fā)明提供了抗人血紅蛋白的單克隆抗體，可以用常規(guī)技術(shù)從具有保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，該試劑條包含本發(fā)明所述CGMCC 0970雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生的抗人血紅蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明提供了抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，該試劑條依次包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的本發(fā)明所述抗人血紅蛋白單克隆抗體區(qū)；反應(yīng)區(qū)，其包含檢測(cè)線和質(zhì)控線；吸附區(qū)；本發(fā)明檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)一端與包含包附膠體金的本發(fā)明所述抗人血紅蛋白單克隆抗體區(qū)一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)的一端與反應(yīng)區(qū)的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的另一端與吸附區(qū)的一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸附區(qū)固定在單面膠塑料墊板層上。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有單面膠帶層，其中反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層上標(biāo)有檢測(cè)時(shí)液面可達(dá)最大高度的MAX線。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆加樣區(qū)的一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面，反應(yīng)區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆吸附區(qū)另一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的本發(fā)明所述的抗人血紅蛋白單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是檢測(cè)線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線是另一抗人血紅蛋白多或單克隆抗體，其與包附膠體金的本發(fā)明所述抗人血紅蛋白的抗體針對(duì)的是相同的抗原，但其抗原結(jié)合位點(diǎn)或稱抗原決定簇不相同或相同。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的兔或羊抗人血紅蛋白多克隆抗體。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的本發(fā)明所述的抗人血紅蛋白單克隆抗體起特異反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙，本發(fā)明所用的是特定規(guī)格的厚濾紙。
本發(fā)明的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，包括以下步驟1)人血紅蛋白單克隆抗體的制備將保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9按常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)，注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；2)分離純化本發(fā)明抗人血紅蛋白單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進(jìn)行；3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；4)膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟2)中制得的單克隆抗體攪拌下加入膠體金溶液中，使抗體包附在膠體金顆粒表面上；5)試劑條原材料的預(yù)處理對(duì)與檢測(cè)過(guò)程直接相關(guān)的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進(jìn)行預(yù)處理；6)膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟4)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；7)在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線；8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的步驟5)處理過(guò)的空白玻璃纖維區(qū)及步驟6)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟6)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)的玻璃纖維一端與反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；9)8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；10)測(cè)試劑條的性能，確定其是否合格。
本發(fā)明所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟4)攪拌后，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況，加BSA和PEG溶液，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護(hù)液1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.1％BSA，0.01％NaN3，pH7.4重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟5)是在4℃，用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過(guò)夜，以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，無(wú)菌高效過(guò)濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，再以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過(guò)濾除菌。
本發(fā)明所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20，000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液(pH7.4)。
本發(fā)明所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的兔或羊抗人血紅蛋白多克隆抗體。
本發(fā)明所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生的抗人血紅蛋白單克隆抗體及制成的試劑條的靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但是特異性優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求，有利于迅速，準(zhǔn)確地檢驗(yàn)鑒定案件物證，快速破案，利國(guó)利民。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條對(duì)猴血特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖3是美國(guó)Pan Probe公司抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖4是加拿大IND公司抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖5是美國(guó)Medyl公司抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖6是美國(guó)Acon公司(杭州加工)抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖7是保存不同年限(分別為1963年、1974年、1980年、1989年的人血痕)的陳舊人血痕，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作(C)、Medyl(D)、Pan Probe(E)公司的搞人血紅蛋的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條進(jìn)行測(cè)定的檢驗(yàn)結(jié)果。
圖8是從人血痕、常見(jiàn)十種動(dòng)物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來(lái)自案件的人血痕等共32份中隨機(jī)抽取20份，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品檢測(cè)的結(jié)果。
圖9是本發(fā)明抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的最佳示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 產(chǎn)生人血紅蛋白單克隆抗體的CGMCC 0970雜交瘤細(xì)胞株B9的制備①免疫小鼠對(duì)每只BALB/C小鼠，先以加完全福氏佐劑的100μg人血紅蛋白(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)進(jìn)行四肢、皮下多點(diǎn)及腹腔內(nèi)注射，4周后加不完全佐劑同樣劑量腹腔內(nèi)注射，再過(guò)4周尾靜脈注射，3天后殺鼠取脾臟按常規(guī)方法與SP2/O細(xì)胞融合。
②篩選與克隆化融合細(xì)胞以HAT選擇、倒置相差顯微鏡觀察，挑選出活雜交細(xì)胞。以3μg/ml人血紅蛋白溶液包被96孔酶標(biāo)板(注留出一孔以5％牛血清白蛋白或10％脫脂奶粉包被作陰性對(duì)照)，間接ELISA法，即將包被人血紅蛋白的酶標(biāo)板37℃溫箱放1hr，倒出孔中液體，再以20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液
(pH7.4)洗滌各孔1～3次，于各孔中分別加入原液、5倍稀釋的雜交細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫箱放1hr，以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)洗滌各孔3～6次，而后各孔加入按說(shuō)明書(shū)規(guī)定的適宜工作濃度的羊抗鼠IgG，反應(yīng)30分鐘后同樣以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)洗滌各孔3～6次，再于各孔中加入DAB或ABTS，觀察各孔顏色變化情況，篩選出人血紅蛋白抗原陽(yáng)性雜交細(xì)胞。抗原陽(yáng)性細(xì)胞以滋養(yǎng)細(xì)胞和HT培養(yǎng)液進(jìn)行1毫升穩(wěn)定培養(yǎng)后，以有限稀釋法克隆化，制備出人血紅蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
③誘生腹水以分泌抗人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株接種BALB/C小鼠腹腔，10～15天后收集產(chǎn)生的腹水。
④分泌特異人血紅蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的建立正辛酸結(jié)合硫酸銨法從腹水中純化出人血紅蛋白單克隆抗體，分別以間接ELISA、抑制ELISA和斑點(diǎn)ELISA法(抗原均為10％的各種動(dòng)物單獨(dú)及混合血紅蛋白溶液；動(dòng)物血痕、人不同體液或相應(yīng)斑痕提取液)檢測(cè)對(duì)豬、狗、兔、羊、馬、牛、驢、騾、小鼠、猴等動(dòng)物血紅蛋白溶液和豬、狗、雞、火雞、兔、羊、馬、牛、驢、騾、小鼠、猴、貓、豚鼠、魚(yú)(甲魚(yú)、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鯽魚(yú)、鰻魚(yú)、黑魚(yú)、黃魚(yú))、烏龜?shù)葎?dòng)物血痕；人精斑、唾液、陰道分泌物、血清、初乳、尿液等人體液及相應(yīng)斑痕提取液的反應(yīng)性。由此鑒定出只對(duì)人血紅蛋白起反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，其中一株命名為B9，于2003年7月1日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC 0970。
⑤效價(jià)及抗體類型和亞類鑒定細(xì)胞培養(yǎng)上清倍比稀釋；腹水先200倍稀釋、再倍比稀釋，間接ELISA法測(cè)效價(jià)，結(jié)果CGMCC 0970雜交瘤細(xì)胞株B9為上清512、腹水1.28×105倍；濃縮10倍細(xì)胞培養(yǎng)上清以雙向擴(kuò)散法與抗小鼠IgG(Fc段)、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗體進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果抗體為小鼠IgG1。
實(shí)施例2 抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的制備①抗人血紅蛋白單克隆抗體腹水制備從液氮中取出CGMCC 0970雜交瘤細(xì)胞株B9，常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的適當(dāng)數(shù)量的培養(yǎng)細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)，7～10天后或觀察可以宰殺時(shí)處死小鼠、收集小鼠腹水。
②分離純化抗人血紅蛋白單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法進(jìn)行，后者具體是小鼠腹水中加入1/10體積的1.0mol/L Tris-HCI，pH 8.0緩沖液，而后再加入飽和硫酸銨溶液或固體硫酸銨至50％飽和度，放置2hr后，離心，沉淀以生理PBS(20mmol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，0.1mol/L NaCI，pH 7.4)緩沖液重溶并對(duì)該緩沖液充分透析。以透析緩沖液平衡HiTrapTMProteinG HP柱，透析后蛋白溶液上柱，而后先以平衡柱的緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白，再以0.1mol/L甘氨酸-HCI緩沖液(pH2.7)洗脫結(jié)合的蛋白，測(cè)A280值，合并該值在0.1以上的組份，此即為純化的本發(fā)明CGMCC 0970雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生的抗人血紅蛋白單克隆抗體，SDS-PAGE(即SDS聚丙烯酰胺凝膠變性電泳)測(cè)純度，對(duì)5mMNaCI溶液透析，濃縮至適宜的濃度，待用。
③膠體金制備稱取Sigma公司產(chǎn)氯金酸(貨號(hào)G-4022)并配成1％濃度，取適量加入超純水中，加熱煮沸，快速加入1％的檸檬酸鈉溶液，煮至溶液變?yōu)樽霞t色。冷卻，以0.2mol/L K2CO3調(diào)pH至8.0～8.2，0.45μm過(guò)濾。取適量稀釋1倍，測(cè)A530值為1.912。
④膠體金-本發(fā)明抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物制備按30μg/ml將步驟②純化制備的抗人血紅蛋白單克隆抗體加入到膠體金溶液中，攪拌20～30分鐘，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況。加BSA(牛血清白蛋白)和PEG(聚乙二醇)溶液適量，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護(hù)液(1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.I％BSA，0.01％NaN3，pH 7.4)重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> ⑤試劑條原材料處理為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性，對(duì)與檢測(cè)過(guò)程直接相關(guān)的材料要進(jìn)行預(yù)處理。具體是以含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過(guò)夜(4℃)，以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，無(wú)菌高效過(guò)濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，再以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干。(注所有緩沖液均以0.45μm濾器過(guò)濾除菌)。
⑥膠體金-抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物的處理和載入玻璃纖維以稀釋液(含0.2％牛IgG、0.5％PVP40(或30)、0.1％PEG20,000、0.5％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4)將膠體金-單抗結(jié)合物稀釋6倍，均勻地加到處理過(guò)的玻璃纖維上(寬約15mm)，37℃烘干。
⑦在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線將效價(jià)在20,000以上、特異性合乎法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求的純化(以結(jié)合人血紅蛋白的CNBr活化瓊脂糖凝膠制成的親和柱進(jìn)行)兔或羊抗人血紅蛋白多克隆抗體(含量在3mg/ml以上)溶液(含0.2~1％蔗糖)1μl點(diǎn)在硝酸纖維素膜(寬約20mm)上，點(diǎn)距硝酸纖維素膜相近的寬度邊約6~8mm；在距該點(diǎn)約4~5mm的地方點(diǎn)1μl的羊抗鼠IgG(含量1mg/ml，也含0.2~1％蔗糖)；涼干后，膜置封閉液(PBS配制的1.0-10％脫脂奶粉)中，37℃溫育1小時(shí)，取出再以洗滌液(20mM磷酸緩沖液，pH7.0)洗兩次，涼干。(注以機(jī)器點(diǎn)樣時(shí)，兩個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)為約1mm寬噴涂而成的線，其中噴抗人血紅蛋白的線稱為檢測(cè)線，而噴羊抗鼠IgG的線稱為質(zhì)控線。)⑧組裝試劑條在單面膠塑料墊板層(寬約80mm、厚約0.8mm)上，先粘貼⑦處理好的硝酸纖維素膜(注意不要粘貼有樣品的一面)，使其點(diǎn)或噴有抗人血紅蛋白即檢測(cè)線的一端距該墊板臨近的寬度邊約30mm，點(diǎn)或噴有羊抗鼠IgG即質(zhì)控線的一端距板另一寬度邊也約30mm，形成反應(yīng)區(qū)；將⑥處理好的材料覆蓋點(diǎn)或噴有抗人血紅蛋白一端的硝酸纖維素膜約2mm，其余部分炶貼于墊板上，以⑤處理過(guò)的玻璃纖維(寬25mm)一端同墊板寬度邊找齊并向上粘貼，其余部分覆蓋已粘貼于墊板的按⑥處理好的材料，形成加樣區(qū)；在已粘貼的硝酸纖維素膜的另一端，以Whatman 3M或浙江產(chǎn)新華厚濾紙(寬約30mm)也覆蓋約2mm，其余部隊(duì)分粘貼于墊板上形成吸附區(qū)；以單面膠膠帶(其上應(yīng)標(biāo)示有指示檢測(cè)時(shí)液面可達(dá)的最大高度的MAX線，該線應(yīng)距墊板臨近寬度邊約15mm)在粘有玻璃纖維的墊板一端覆蓋約33-35mm再回折并粘貼于墊板背面，在粘有濾紙的墊板另一端以單面膠膠帶(通常帶不同顏色)覆蓋約33mm再回折并粘貼于墊板背面，注意膠帶與硝酸纖維素膜的兩個(gè)相接端一定要粘貼結(jié)實(shí)。由此而制成母版膠體金試劑條，而后按3～4mm寬度沿墊板寬度方向裁切，所得即為成品抗人血紅蛋白膠體金檢測(cè)試劑條，如圖9所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果成品試劑條的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)1 靈敏度測(cè)定以2002年8月份新配制的6人份混合人血紅蛋白溶液和SIGMA公司的標(biāo)準(zhǔn)人血紅蛋白溶液(貨號(hào)527-30)為檢測(cè)所用抗原；用本發(fā)明實(shí)施例2制得的品(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、Pan Probe(E)公司的抗人血紅蛋白膠體金試劑條進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖3至圖6和表1。
表1 靈敏度及與國(guó)外類似產(chǎn)品比較抗原稀 A B C D E釋倍數(shù) 1030 1030 1030103010301000 + ++ + + + + + + +2000 + ++ + + + + + + +5000 + ++ + + + + + + +10000 + ++ + + + + + + +50000 + ++ + + + + + + +100000 + ++ + + + + + + +200000 + ++ + + + + + ± ±300000 + ++ + + + + + - -抗原定量濃度(ng/ml)1000 + ++ + + + + + + +500+ ++ + + + + + + +200+ +± ±+ + + + + +150+ +- - + + + + + +100± ±- - + + + + - -注表中“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽(yáng)；10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論本發(fā)明抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的靈敏度相當(dāng)或優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)2 準(zhǔn)確性、特異性測(cè)試以十種常見(jiàn)動(dòng)物(牛、馬、羊、驢、狗、兔、豬、雞、鴨、鵝)血溶液(每種動(dòng)物的抗凝血經(jīng)凍融后離心上清液)為檢測(cè)所用抗原，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人血紅蛋白膠體金試劑條進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)對(duì)猴血溶液進(jìn)行了特異性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1至圖6和表2。
表2準(zhǔn)確性、種屬特異性及與國(guó)外同類產(chǎn)品比較抗原及稀 A B C D E釋倍數(shù) 10 3010 30 10 30 10 30 10 30豬100 -- --------500 -- --------1000-- --------5000-- --------羊100 -- --------500 -- --------1000-- --------5000-- --------牛100 -- ----++--500 -- ----++--1000-- ----++--5000-- ----± ±--馬100 -- ------++500 -- ------++1000-- --------5000-- --------驢100 -- --------500 -- --------1000-- --------5000-- --------狗100 -- --------500 -- --------1000-- --------5000-- --++----兔100 -- ----++++500 -- ----++++1000-- ----++++5000-- ----++++雞100 -- --------500 -- --------1000-- --------5000-- ++------鴨100 -- ------++500 -- ------++1000-- ------++5000-- ------++鵝100 -- ------++500 -- ------++1000-- ------++5000-- ------++猴100 --500 --1000--5000--生理鹽水-- --------
注表中“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽(yáng)；10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論本發(fā)明抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的準(zhǔn)確性和特異性優(yōu)于同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)3 陳舊人血痕檢驗(yàn)保存不同年限(分別為1963年、1974年、1980年、1989年的人血痕)的陳舊人血痕，分別編為一、二、三、四號(hào)，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、Pan Probe(E)公司的抗人血紅蛋白膠體金試劑條進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7和表3。
表3與國(guó)外同類產(chǎn)品對(duì)陳舊人血痕的檢測(cè)比較不同年 A B C D E代人血痕530530103010301030一 ++ ++ ++ - - - -二 ++ ++ ++ - - - -三 ++ ++ ++ - - - -四 ++ ++ -±- - - -注表中“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽(yáng)；5、10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論本發(fā)明抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條在檢測(cè)陳舊血痕方面性能相當(dāng)或優(yōu)于同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)4 隨機(jī)盲測(cè)從人血痕、常見(jiàn)十種動(dòng)物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來(lái)自案件的人血痕等共32份中隨機(jī)抽取20份，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8和表4。
表4盲測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果編號(hào) 檢材名稱 結(jié)果 編號(hào) 檢材名稱 結(jié)果1人血斑 + 11人精斑 -2唾液斑 - 12狗血痕 -3陰道分泌物 - 13雞血痕 -4人精斑 - 14人血斑 +5兔血痕 - 15豬血痕 -6空白檢材 - 16輝血樣 +7人初乳 - 17人精斑 -8常見(jiàn)十種動(dòng)物混合血斑 - 18羊血痕 -9死者賈繼兵血樣 + 19陰道分泌物 -10 人精斑 - 20牛血痕 -結(jié)論本發(fā)明抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條對(duì)盲測(cè)檢材做出了準(zhǔn)確檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的抗人血紅蛋白膠體金檢測(cè)試劑條靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但特異性則優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，國(guó)外產(chǎn)品都或多或少存在非特異反應(yīng)；而對(duì)陳舊人血痕的檢驗(yàn)也說(shuō)明其達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平；對(duì)實(shí)際檢材的盲測(cè)完全正確。證明了其在法醫(yī)學(xué)上的獨(dú)特價(jià)值。
權(quán)利要求
1.具有保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9。
2.抗人血紅蛋白單克隆抗體，其可以從具有保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生。
3.抗人血紅蛋白的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，其特征是該試劑條中包含權(quán)利要求2所述的抗人血紅蛋白單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑條，其特征在于其包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的權(quán)利要求2所述抗人血紅蛋白單克隆抗體區(qū)；反應(yīng)區(qū)，其包含檢測(cè)線和質(zhì)控線；吸附區(qū)。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的權(quán)利要求2所述抗人血紅蛋白單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑條，其特征是檢測(cè)線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
7.如權(quán)利要求4或6所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線是另一抗人血紅蛋白多或單克隆抗體，其與包附膠體金的權(quán)利要求2所述抗人血紅蛋白的抗體針對(duì)的是相同的抗原，但抗原結(jié)合位點(diǎn)或稱抗原決定簇不相同或相同。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的兔或羊抗人血紅蛋白多克隆抗體。
9.如權(quán)利要求4或6所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的權(quán)利要求2所述的抗人血紅蛋白單克隆抗體起特異反應(yīng)的物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
11.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙。
12.制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，包括以下步驟(1)抗人血紅蛋白單克隆抗體的制備將保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9按常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)，注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；(2)分離純化本發(fā)明抗人血紅蛋白單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進(jìn)行；(3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；(4)膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟(2)中制得的抗人血紅蛋白單克隆抗體攪拌下加入膠體金溶液中，使抗體包附在膠體金顆粒表面上。(5)試劑條原材料的預(yù)處理對(duì)與檢測(cè)過(guò)程直接相關(guān)的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進(jìn)行預(yù)處理。(6)膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟(4)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；(7)在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線；(8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的(5)處理過(guò)空白玻璃纖維區(qū)和步驟(6)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟(6)制得的膠體金—抗人血紅蛋白單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)帶膠體金的玻璃纖維一端與反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；(9)將(8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；(10)檢測(cè)試劑條的性能，確定其是否合格。
13.如權(quán)利要求12所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其中步驟(5)是在4℃，用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過(guò)夜，以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，無(wú)菌高效過(guò)濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液，pH7.4，浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，再以無(wú)菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過(guò)濾除菌。
14.如權(quán)利要求12所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其中步驟(6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20,000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4。
15.如權(quán)利要求12所述的制備抗人血紅蛋白膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的兔或羊抗人血紅蛋白多克隆抗體，反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了具有保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9，由具有保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生的抗人血紅蛋白的單克隆抗體，和含有該抗人血紅蛋白單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條及該試劑條的制備方法。本發(fā)明由保藏號(hào)為CGMCC 0970的雜交瘤細(xì)胞株B9產(chǎn)生的抗人血紅蛋白單克隆抗體及其試劑條的靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但是特異性優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求，有利于迅速，準(zhǔn)確地檢驗(yàn)鑒定案件物證，快速破案，利國(guó)利民。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1490407SQ03153440
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者李兆隆, 王儉, 張英蘭, 徐秀蘭, 王香菊, 常彩琴, 嚴(yán)紅, 蒯應(yīng)松, 陳艷 申請(qǐng)人:公安部第二研究所