專利名稱：用于生物樣品分析的蛋白指紋法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，具體指用于生物樣品分析的蛋白指紋法。本發(fā)明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質組并采用計算機可讀取的條碼格式(蛋白指紋)分析的蛋白指紋法。
背景技術：
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定細胞內表達的蛋白質的區(qū)別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行定性鑒定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內等電點聚焦先分離蛋白質，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行第二次分離。結果得到一張根據等電點范圍(凈電荷)和大小(質量)來區(qū)分蛋白質的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征一質量和等電點(pI)。其次，各維度(DIMENSION)的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質量差異小于5％或pI差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標記。但是，制備特異性結合標記并且能在復雜的混合物中鑒別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度(MULTI-DIMENSIONAL)分析卻困難而費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質譜的方法測定蛋白質是較新的方法，但目前的質譜分析方法只能對蛋白質進行定性分析，無法進行定量分析，尤其在是樣品中混合物復雜，蛋白質含量極小的情況下。
滯留層析法是上世紀90年代開發(fā)的一種新的生物分析方法(Singh TK，F(xiàn)ox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人將其用于分子生物學和細胞生物學的研究中。滯留層析中先將待測樣品與選定的吸附劑結合，然后檢測滯留在吸附劑上的分析物。與常規(guī)層析不同，進行滯留層析時無需將分析物先從吸附劑上洗脫，而是直接進行檢測。其優(yōu)點是能夠從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。但目前未見到文獻有用滯留層析法進行蛋白指紋鑒定分析。
蛋白指紋技術最早源于馬鈴薯/土豆品種鑒定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。當時用電泳技術來區(qū)別分不同品種土豆。因為不同品種的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合。由于人體細胞蛋白比土豆要復雜的多，故僅用電泳來鑒別疾病的蛋白指紋遠遠不能滿足臨床需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是準確鑒別出生物樣品中的蛋白質組。本發(fā)明的目的之二是建立在細胞內分子的復雜混合物中捕捉到所需待測蛋白的方法。本發(fā)明的目的之三是建立一種在生物樣品中檢測疾病的新方法。
本發(fā)明采用蛋白指紋法對蛋白質組進行鑒別。
蛋白指紋法是通過鑒別檢測特定的蛋白質組用于疾病診斷。蛋白質組學(Proteomics)的定義是研究一組蛋白質在細胞終身表達的變化狀態(tài)。蛋白質組學的目的之一是鑒定和描述由于不同細胞差異表達的有機生物分子。通過比較表達情況可以鑒定細胞內表達的蛋白質的區(qū)別。鑒別出可作為某種疾病標志的蛋白質組，可用于該疾病的診斷及治療藥物的篩選。
本發(fā)明所述的鑒別檢測蛋白質組的方法是質譜法。
本發(fā)明用滯留層析法從復雜的樣品混合物中準確地分辨出并捕獲到用于檢測的蛋白質組。滯留層析法是將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測系統(tǒng)所無法達到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細胞或組織液提取物中差異表達的蛋白質)。根據吸附劑/洗脫劑組合的化學特性測定包括分子量在內的理化特征的蛋白質。詳述本方法如下I吸附劑包含陰離子，陽離子，親水，疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質，配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內存在組氨酸殘基)。更具體的說，可以開發(fā)出化學生物特異性吸附劑以檢測重要的診斷標記。在某實施例中，基質可具有為診斷疾病或綜合征所用標記組合而選用的吸附位點排列。
II信息處理在特定洗脫條件下檢測被吸附結合的分析物提供了有關樣品中分析物及其化學特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結合特性。與吸附劑結合的分析物具有使得結合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結合。強陽離子分子只有在很強的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結合某種吸附劑的確定不僅通過分析物的彼此分離和與不具有結合所需的相應化學特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學特性的一類或單一分析物。采集有關分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細分辨混合物中的分析物，而且提供有關分析物的化學信息，這些信息本身就可以完成對他們的鑒定。這種數據被稱為“滯留數據”。
用可編程計算機分析滯留試驗得出的數據是最簡單的。計算機程序一般包括一個儲存編碼的可讀介質。某計算機編碼進入存儲，其中包含了基質陣列上各種征點的位置，該處的吸附和用來洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某選擇性的一組特征。計算機還包括這樣的編碼，它們接受來自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號強度數據。這些數據指示所測分析物的數量，可能包括所測各分析物的信號強度和測得的分子量。
計算機還具有處理數據的編碼。實施例之一中，處理方法涉及形成一個分析物識別特征概況。例如，可將據分子量測得的特定分析物的滯留數據根據特定的結合特性(例如與陰離子吸附劑)分類。收集到的數據提供某特定分析物化學特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結構。例如，根據不同pH洗脫條件下在多種陽離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數據所揭示的信息可以得出某蛋白質的等電點。這進而反映出該蛋白質內離子氨基酸的大致數量。所以，計算機可能包含將結合信息轉化結構信息的編碼。而且，對分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識別特征，這可以由結合或質量差異反映出來。
得出的數據即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號強度顯示成分子量的函數圖。另一種格式又稱“條碼格式”，其中，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示，得出外觀類似商場上所用條碼帶讀取商品名稱。
III滯留層析涉及多種分離方法的組合，包括并行檢測和描述多種分析物。這些組合方法具有多種用途。發(fā)展靶分析物檢測法；差異蛋白質展示；毒理學篩選；多種診斷標記的同時檢測；藥物開發(fā)。
實施例對該方法進行了詳細的描述。細胞樣品通常包含數以百千計的蛋白質。人們可能希望準確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，吸附劑可以是陰離子交換劑。
從該滯留圖可以挑選出至少一種靶分析物被保留的選擇條件?？梢蕴暨x靶分析物發(fā)生最大結合的選擇性條件。但是，如果該選擇性條件對靶分析物的選擇性比其他選擇性條件更強，則宜選擇靶分析物吸附并非最大的條件。例如，假設滯留圖分析顯示，在中性pH附近，靶分析物被陰離子交換保留，但也弱吸附于親水性吸附劑。
IV鑒定生物材料間差異表達的分析物的方法本發(fā)明的另一方面內容提供了鑒定在兩種以上樣品中差異表達的有機生物分子，特別是蛋白質的方法?！安町惐磉_”指兩樣品間分析物量或質上的差異。這些差異可能緣于蛋白質表達的任一階段，該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組選擇性條件制備的分辨率越高，所以，可比較的分析物數量也越多。然后，比較識別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達的正調控或負調控。差異滯留還包括分析物質的差異。例如，蛋白質翻譯后修飾的不同會造成識別圖的不同，檢測時表現(xiàn)為結合特性差異(例如，如果蛋白質被糖基化與凝集素結合將不同)或質量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計算機進行。
該方法特別適用于檢測兩種細胞差異表達的蛋白。兩種細胞可以是正常細胞和病理細胞例如癌細胞，或不同水平的細胞，或不同發(fā)育或分化階段的細胞，或細胞周期內不同部分的細胞。但是。該方法也可用來檢測不同條件下的同種細胞。在這樣的方法中，一份生物樣品與測試試劑接觸，另一份不接觸。然后，比較兩者的滯留圖。根據滯留特性或質量的不同，該方法可以顯示蛋白質或其他生物分子表達的增加或減少，或發(fā)生了某種改變。
利用滯留圖獲得的差異表達蛋白質理化特性信息，用本發(fā)明方法可測定蛋白質的候選特征。
本方法適用于鑒定疾病的診斷標記。與正常樣品或細胞相比，患者樣品或病理培養(yǎng)細胞中差異表達的蛋白質可能就是診斷標記。
V通過分解代謝信號擴增提高靈敏度將大蛋白分裂成小片段然后檢測這些小片段能夠顯著提高檢測大蛋白在復雜混合物差異存在(例如，因為差異表達)的靈敏度。靈敏度的提高有幾個原因。首先，當樣品中所有蛋白質都被(例如)酶解而片段化時，大蛋白可能產生更多片段而不是小蛋白。其次，解吸譜法的整體靈敏度在低分子量時高于高分子量時。第三，蛋白片段化增加了來自靶分析物的信號數量，因此提高了測得分析物的可能性。第四，蛋白片段化提高了捕獲可能性，因此提高了測得靶分析物的可能性。第五，如果蛋白質在兩種樣品中差異存在，那么通過增加來自該蛋白的信號數量，量的差異更可能被測得。
人體內的疾病蛋白標志物往往會受血液中酶的降解。這樣，我們就可以用滯留層析法來捕獲這種分解代謝信號，從而提高蛋白指紋的靈敏度。滯留層析分辨的分析物的具體實例包括生物大分子，例如肽，蛋白質，酶，糖，寡糖，多糖；上述生物大分子的片段，例如肽片段和蛋白質片段；上述生物大分子復合物，蛋白質-DNA復合物，受體-配體復合物，酶-底物，酶抑制劑，肽復合物，蛋白質復合物，糖復合物和多糖合物；生物小分子，例如氨基酸，藥物，激素，合成小分子，例如藥學或治療上的有效藥物。
本發(fā)明提供一種統(tǒng)一的操作系統(tǒng)，用于蛋白質功能，細胞功能和生物整體功能的發(fā)現(xiàn)和診斷。
更具體的說，根據分析物在至少兩種不同選擇條件下吸附固定相的能力(例如陰離子/陽離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質譜)根據質量在第二維度上分離分析物，進一步檢測已分離的分析物。分析物所吸附的性質提供了分析物的物理化學信息。
在實施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測滯留的分析物。III)檢測步驟包括用激光解吸質譜測定分析物的質量。
洗脫條件的差異在于pH，緩沖能力，離子強度，水結構特征，除垢劑種類，除垢劑強度，疏水性或介電常數。
本發(fā)明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否差異存在(例如差異表達)的方法。該方法可以用于通過差異蛋白質展示檢測差異蛋白表達的組合方法。該方法包括A)測定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；B)測定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和C)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在。
實施例之一是測定某種蛋白是否在兩種不同樣品，包含細胞的第一和第二樣品或來自細胞的材料中差異表達。在實施例中，第一生物樣品來自健康者，第二生物樣品來自某種病癥的患者。樣品可選自例如血液，尿液，血清和組織。以在患者樣品中增加的分析物作為侯選診斷標記。通常，確認一種診斷標記需在多個受試者中檢測到該標記物。
本發(fā)明在可分析的樣品類型上沒有限制。本發(fā)明特別適用于分辨生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物；還特別適用于分辨非生物有機組合物中的分析物，尤其是有機分子和無機分子的組合物。
滯留層析及蛋白指紋方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的滯留層析及蛋白指紋方法的一個操作方案實例。
1.樣品處理將生物樣品稀釋在溶液中。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點樣在基質(包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑)一個位點上。
3.洗滌用結合溶劑洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2uL洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留15秒。用移液管吸進10次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2uL洗滌液重復以上步驟。
用水徹底洗滌整個陣列。
自然干燥芯片。
加0.5uL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的標準溶液)。
自然干燥芯片。
用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀用氮激光儀(335nm)和80cm飛行管分析陣列分析滯留與各位點的蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。
本發(fā)明滯留層析及蛋白指紋法可用于細胞和臨床疾病的診斷，如腫瘤的診斷。
中國目前有1.3億乙型肝炎的攜帶者，其中包括2千3百萬乙型肝炎引起的肝硬化。肝細胞性肝癌主要由乙型肝炎導致的肝硬化引起。目前用于輔助診斷肝癌的甲胎蛋白試劑盒的特異性與敏感性都很差，無法用于鑒別肝癌與肝硬化。用本方法可鑒別正常及由乙型肝炎引起的肝硬化與肝癌，詳見實施例。
本發(fā)明提供的方法的特點為(1)準確滯留層析的一個特點是能夠從復雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，滯留層析可提供有關滯留分析物化學或結構特征的直接信息。
滯留層析與常規(guī)層析存在以下區(qū)別。首先，滯留層析中檢測的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規(guī)層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進行檢測。用常規(guī)方法檢測不出吸附劑上洗脫下的分析物。第二，吸附層析與解吸質譜檢測相結合提供了毫微微摩爾級的優(yōu)良靈敏以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因為允許直接檢測分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度描述。第四，吸附劑可以于預先確定的排列，可定址位置附著于基質上。這就能夠對在不同洗脫條件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點”)的分析物進行并行處理。
質譜直接分析有很強的準確性，一般誤差率只有0.1Da。例如，檢測出帶有正電的3935Da及8939Da的蛋白被陰離子表面的基質所捕捉，由于質譜差率只有0.1Da，正電蛋白3935Da及8939Da不可能是存在第二種蛋白質。因為蛋白質是由氨基酸組成的而氨基酸的平均質量為100Da，因此，必須有50Da以上的差距，才可能是第二種蛋白質。
(2)方便本方法將血清蛋白分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析。
(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進行疾病血清診斷時，無需對蛋白質進行測序。本發(fā)明采用了計算機“條碼格式”，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的診斷，如可用此“蛋白指紋”或條碼格式進行法醫(yī)學分析、人群基因的變異分析、結核菌耐藥株在人群中的變化分析等。
具體實施例方式
實施例1 乙型肝炎引起的肝硬化與肝癌區(qū)分(1)實驗方法將1uL血清加入9M尿素，在4℃-6℃下使蛋白質與尿素作用30分鐘。然后將上述樣品加入結合溶劑(50mM醋酸鈉，pH4.0～6.0)簡稱BB中。接著，將己稀的血清加入陰離子吸附劑(氧化硅包被的鋼基質上的陰離子吸附劑SO3-，即陰離子交換吸附劑)的芯片上，在室溫下與帶陰離子的芯片結合。用BB洗兩次，然后用HPLC級別的dH2O洗兩次。讓芯片自然干燥。加入0.5uL的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。用質譜儀直接分析。結果用計算機分析質譜數據。
(2)實驗結果用統(tǒng)計學方法，分析所得數據的形式是用計算機讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述五種蛋白指紋可以用于區(qū)分肝硬化與肝癌(P小于0.01)。
2045 Da3935 Da4469 Da8687 Da8933 Da用已知的五項蛋白指紋，雙盲測試40例乙肝引起肝硬化與乙肝引起的肝癌測試。

敏感性90％ 特異性85％(3)結論將來自具有統(tǒng)計意義的患者群的樣品與正常樣品比較，用陰離子芯片所捕獲的五種血清蛋白指紋，可以用于鑒別診斷。肝硬化的治療方法是保守治療，而肝癌必須通過手術治療，本方法準確率為85-90％。因此，這是目前最好的無創(chuàng)性診斷方法。
實施例2 正常與肝癌區(qū)分(1)實驗方法將1uL血清加入9M尿素，在4℃-6℃下使蛋白質與尿素作用30分鐘。然后將上述樣品加入結合溶劑(50mM醋酸鈉，pH4.0～6.0)簡稱BB中.接著，將己稀的血清加入陰離子吸附劑(氧化硅包被的鋼基質上的陰離子吸附劑SO3-，即陰離子交換吸附劑)的芯片上，在室溫下與帶陰離子的芯片結合。用BB洗兩次，然后用HPLC級別的dH2O洗兩次。讓芯片自然干燥。加入0.5uL的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。用質譜儀直接分析。結果用計算機分析質譜數據。
用統(tǒng)計學方法，分析所得數據的形式是用計算機讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述三種蛋白指紋可以用于區(qū)分正常與肝癌(P小于0.001)。
3158 Da4793 Da5812 Da用已知的三項蛋白指紋，雙盲測試30例正常與肝癌測試。

敏感性90％特異性93.3％實施例3 正常與乙型肝炎引起的肝硬化區(qū)分(1)實驗方法將1uL血清加入9M尿素，在4℃-6℃下使蛋白質與尿素作用30分鐘。然后將上述樣品加入結合溶劑(50mM醋酸鈉，pH4.0～6.0)簡稱BB中。接著，將己稀釋的血清加入陰離子吸附劑(氧化硅包被的鋼基質上的陰離子吸附劑SO3-，即陰離子交換吸附劑)的芯片上，在室溫下與帶陰離子的芯片結合。用BB洗兩次，然后用HPLC級別的dH2O洗兩次。讓芯片自然干燥。加入0.5uL的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％TFA)，任其自然干燥。用質譜儀直接分析。結果用計算機分析質譜數據。
用統(tǒng)計學方法，分析所得數據的形式是用計算機讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。
通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述三種蛋白指紋可以用于區(qū)分正常與乙型肝炎引起的肝硬化(P小于0.01)。
3158 Da3934 Da4793 Da用已知的三項蛋白指紋，雙盲測試30例正常與40例乙型肝炎引起的肝硬化。

敏感性87.5％ 特異性90％
權利要求
1.一種生物樣品中蛋白質分析方法，其特征是采用蛋白指紋法對樣品中蛋白質組進行鑒別檢測。
2.權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的鑒別檢測蛋白質組的方法是質譜法。
3.權利要求1或2所述的蛋白質分析方法，其特征是用滯留層析法捕獲樣品中蛋白質組進行分析。
4.權利要求3所述的蛋白質分析方法，在滯留層析法中所用的吸附劑包括陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價金屬螯合劑作用吸附劑。
5.權利要求3所述的蛋白質分析方法，分析所得數據的形式是可用計算機讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。
6.權利要求3所述的蛋白質分析方法，在滯留層析法中可用多種分離方法組合，從樣品中分辨出待分析物。
7.用權利要求3的方法分析生物樣品中特異的蛋白質組以檢測組織病變的用途。
8.用權利要求3的方法分析生物樣品中特異的蛋白質組以檢測腫瘤細胞的用途。
9.用權利要求3的方法分析生物樣品中特異的蛋白質組以檢測正常肝細胞、肝硬化細胞和肝癌細胞的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生物樣品分析的蛋白指紋法。本發(fā)明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質組進行分析的蛋白指紋法。本方法用質譜法進行鑒別檢測蛋白質組。分析所得數據的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發(fā)明的方法可用于細胞和臨床疾病的診斷，如腫瘤的診斷。本方法準確、方便且快捷。
文檔編號G01N30/00GK1566953SQ0314837
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月2日 優(yōu)先權日2003年7月2日
發(fā)明者許洋 申請人:許洋