專利名稱：固相化核酸檢測探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定在固體基片上寡核苷酸探針及其用此法制作的微陣列芯片，是一種檢測核酸序列信息的非標記的寡核苷酸探針。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供非一種標記的、低使用成本和高可靠性地檢測核酸序列基因芯片的固相化核酸檢測探針及其制備方法。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是一種固相化核酸檢測探針，在固體基片上通過手臂分子固定有熒光淬滅材料，在熒光淬滅材料表面上制備有由熒光基團、寡核苷酸探針分子的莖桿部、寡核苷酸探針的環(huán)部組成的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的一端固定在熒光淬滅材料表面上，寡核苷酸探針的另一端附近的堿基標記有熒光基團，寡核苷酸探針兩端附近的序列分別有3至15個堿基為互補序列，可使該寡核苷酸探針兩端附近的序列能夠形成雜交，寡核苷酸探針中間部分的堿基序列為被檢測的核酸序列的互補序列，寡核苷酸探針為多種探針組成的寡核苷酸探針陣列，即基因芯片，固定化寡核苷酸探針是脫氧核糖核酸，或核糖核酸、肽核酸或者是它們的組合，固定寡核苷酸探針的固體基片上的熒光淬滅材料可以是納米顆粒，包括金屬納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒、金屬鹽納米顆粒；也可以是包含有熒光淬滅基團的高分子材料和復(fù)合高分子材料，固定寡核苷酸探針的固體基片上的熒光淬滅材料可以是直接共價連接在固體基片上的熒光淬滅基團，固定有納米顆粒的固體基片，其材料為玻璃、硅、陶瓷、塑料、硝酸纖維、尼龍或橡膠中的一種，方法為a、用雙功能活性試劑通過化學反應(yīng)在固體基片表面鍵合上活性基團，即手臂分子，b、在具有活性基團的固體基片上固定熒光淬滅材料，c、在熒光淬滅材料的表面用雙功能基基團化學度劑進行修飾，形成手臂分子，d、將固相化學合成好的包含有至少一個熒光發(fā)色基團的特異性核酸序列的寡核苷酸探針的一端接在熒光淬滅材料上，使熒光淬滅材料表面制備上寡核苷酸探針，在熒光淬滅材料表面上制備寡核苷酸探針的方法是原位合成法，即直接在熒光淬滅材料表面化學合成DNA探針，寡核苷酸探針的3’端固定于熒光淬滅材料上，在熒光淬滅材料表面上制備寡核苷酸探針的方法是用化學方法將預(yù)先合成的寡核苷酸探針整體固定在熒光淬滅材料上，寡核苷酸探針可以是全部原位合成的，也可以是部分原位合成，然后通過化學基團連接而形成完整的寡核苷酸探針，在固體基片上制備納米金顆粒薄膜的方法是使用蒸鍍法將金屬等物質(zhì)蒸鍍在固體基片表面，形成緊密排列的納米顆粒薄膜。
本發(fā)明通過化學或物理的方法，將納米金屬顆粒固定在固體基片上，或者在固體基片上蒸鍍一層納米級厚度的金屬薄膜，在納米級的金屬顆?；虮∧け砻嫘揎椈瘜W基團，然后通過分子印章原位合成或其它原位合成的方法將核酸合成在固相基片表面。在合成最后幾個堿基時，有選擇地在其中一個堿基上合成一個氨基或?qū)晒鈽擞浀暮怂釂误w直接合成在核酸鏈上。由于設(shè)計的檢測用的探針在其的兩端有堿基序列是互補的，合成完成后，將芯片在緩沖液中可形成二級結(jié)構(gòu)，此時，納米金屬顆?；虮∧た捎行У厥购怂嵘闲揎椀臒晒饣鶊F發(fā)射的熒光淬滅，探針不能檢測到熒光。但當被檢測的靶基因與探針識別之后，靶基因與探針雜交后使熒光基團遠離納米金屬顆粒，從而使熒光基團可以被激發(fā)而檢測到其發(fā)出的熒光。
如果將此種固定探針方法用于將不同被測核酸序列的探針構(gòu)成微陣列，即構(gòu)成一種原位合成的非標記基因芯片微陣列芯片。該新型固相化核酸探針的制備方法如下通過手臂分子將納米金屬顆粒固定到固相的材料上，將化學合成的兩種或兩種以上的標記熒光寡核苷酸探針通過共價鍵結(jié)合或物理吸附連接到固相載體上。該探針包括一個或多個熒光分子基團，由于能量傳遞或電子云重疊的作用，熒光分子基團的熒光信號被納米金屬顆粒所淬滅；固定的標記探針，可以是單鏈或自我形成二級結(jié)構(gòu)等多種形式，可構(gòu)成微陣列芯片。
其原理是在核酸探針中引入納米金屬顆粒及熒光發(fā)色基團，通過被測核酸的與探針的相互作用下，實現(xiàn)對生物樣品中被測核酸序列(靶序列)的非標記測定。該新型的核酸探針及其微陣列芯片可用于生物科學和醫(yī)學領(lǐng)域中核酸序列的非標記檢測。
3、技術(shù)效果本發(fā)明提出的固相化核酸探針及其制備方法具有以下特點被測基因不用進行熒光標記或同位素標記；可以通過被測基因與固定的探針進行競爭性雜交，大大提高單堿基的錯配識別能力；探針可通過不同形式直接固定在固體載體上，形成較高密度的微陣列芯片，利用空間分辯來區(qū)分不同的檢測位點，實現(xiàn)高通量并行檢測，避免了現(xiàn)有定量PCR儀器中熒光染料的選擇受限于激發(fā)波長范圍的問題；對于沒有與靶分子雜交的探針，其熒光分子基團的熒光可被納米金屬顆粒高效淬滅，因此整個芯片的熒光背景很低，檢測的靈敏度高；可進行靶基因的定量檢測；通過構(gòu)建微流體芯片，可有實現(xiàn)整個檢測過程的自動化。
和現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法具有以下的優(yōu)勢利用核酸雜交動力學原理，被檢測核酸競爭性與固定在納米金屬顆粒上的熒光基團標記核酸探針雜交，具有良好的信噪比，成功地解決了單堿基錯配檢測的技術(shù)難題。同時，該檢測方法可實現(xiàn)檢測樣本的非標記檢測(可實現(xiàn)樣本高通量、非標記的自動化檢測。)大大減少了檢測所需的時間，并具有實現(xiàn)微全分析的潛力等。不僅大大縮短了診斷時間，且大大提高了單堿基錯配檢測的準確性，降低了檢測成本，尤其可以腫瘤相關(guān)的單堿基錯配多態(tài)性的檢測。
本發(fā)明提出固相化核酸探針及其微陣列芯片，對后基因組時代非標記、實時、高通量的核酸序列檢測，特別是單堿基多態(tài)性檢測，腫瘤基因多態(tài)性檢測等都具有重要應(yīng)用價值。
圖2是固體基片1上熒光淬滅材料3表面合成的或固定的寡核苷酸探針與被檢測核酸雜交后，寡核苷酸探針上的熒光基團5遠離熒光淬滅材料3表面，在受激光的照射后發(fā)出熒光的示意圖。
以上的圖中有固體基片1，手臂分子2、4，熒光淬滅材料3，熒光基團5，寡核苷酸探針分子的莖桿部6，寡核苷酸探針的環(huán)部7，被測的核酸分子8。
在固體基片1上通過手臂分子2固定有熒光淬滅材料3，在熒光淬滅材料3表面上制備有由熒光基團5、寡核苷酸探針分子的莖桿部6、寡核苷酸探針的環(huán)部7組成的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的一端固定在熒光淬滅材料3表面上，寡核苷酸探針的另一端附近的堿基標記有熒光基團5，寡核苷酸探針兩端附近的序列分別有3至15個堿基為互補序列，可使該寡核苷酸探針兩端附近的序列能夠形成雜交，寡核苷酸探針中間部分的堿基序列為被檢測的核酸序列的互列。
1.固體基片的準備用于固定納米顆粒的材料要求表面具有可修飾化學活性基團、良好的光學性質(zhì)并具有一定的穩(wěn)定性。以玻璃片(glass slides)、硅片(silicon chip)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、或聚碳酸酯(polycarbonate)等為常用材料；2.固體基片的活化與合成用有雙功能活性試劑通過化學反應(yīng)在載體的表面鍵合上活性基團，以便與相應(yīng)的配基共價結(jié)合，形成具有不同的生物特異性的親和載體，用來固定不同的核酸探針。
3.熒光淬滅材料用作固定本發(fā)明固相化核酸探針的熒光淬滅材料可以是納米金屬顆粒，如納米金顆粒，納米銀顆粒，其表面用雙功能基團化學試劑進行修飾；也可以是包含有熒光淬滅基團的有機分子或復(fù)合高分子材料。
4.固相化核酸探針的制備采用商業(yè)化固相化學合成方法合成設(shè)計好的包含有至少一個的熒光發(fā)色基團特異性核酸序列的寡核苷酸探針；制備核酸探針的方法也可以是采用原位合成法在熒光淬滅材料上直接進行核酸合成及熒光標記。
5.探針的固定固相化學合成好的探針通過機器等方式轉(zhuǎn)移到固體基片表面，在適當條件下與固體基片連接。每個點至少包含有兩種分別用不同的熒光標記的探針。
6.雜交和檢測在被測體系中加入適當?shù)碾x子、和緩沖液等，靶基因與本發(fā)明的固相化探針進行雜交反應(yīng)、酶切反應(yīng)或擴增反應(yīng)。對相應(yīng)的反應(yīng)體系進行熒光信號的檢測，通過相應(yīng)軟件分析其結(jié)果，得到被檢測的基因信息。
實施例一，原位合成的非標記基因芯片1.玻片清洗用洗液浸泡玻片過夜，沖凈，再用堿乙醇溶液浸泡兩小時，雙蒸水沖凈后，氮氣吹干備用。
2.玻片修飾取冼凈玻片，在三乙氧基氨基硅烷的丙酮溶液中浸泡5分鐘，洗凈，100度下烘烤40分鐘，戊二醛溶液浸泡2小時后，洗凈氮氣吹干。
3.納米金固定用巰基乙胺修飾的納米金溶液浸泡玻片過夜，洗凈氮氣吹干。
4.寡核苷酸探針合成用上述玻片在無氧無水手套箱中進行核酸序列合成，用分子印章法進行多種序列合成，制成芯片，其中最后一個堿基是帶有熒光素標記的核酸單體，因此，制成的芯片已經(jīng)標記了熒光素。
實施例二，已合成寡核苷酸探針的固定制作非標記基因芯片1.玻片清洗用洗液浸泡玻片過夜，沖凈，再用堿乙醇溶液浸泡兩小時，雙蒸水沖凈后，氮氣吹干備用。
2.玻片修飾取冼凈玻片，在三乙氧基氨基硅烷的丙酮溶液中浸泡5分鐘，洗凈，100度下烘烤40分鐘，戊二醛溶液浸泡2小時后，洗凈氮氣吹干。
3.納米金固定用巰基乙胺修飾的納米金溶液浸泡玻片過夜，洗凈氮氣吹干。
4.寡核苷酸探針合成用常規(guī)方法合成，在寡核苷酸探針的一端修飾了氨基，在另一端修飾了熒光素。
5.芯片制作用點樣法將已合成的寡核苷酸探針固定在固定了納米金的玻片上。
實施例三 納米金薄膜非標記基因芯片1.玻片清洗用洗液浸泡玻片過夜，沖凈，再用堿乙醇溶液浸泡兩小時，雙蒸水沖凈后，氮氣吹干備用。
2.納米金薄膜的制作用化學固相沉積法制備金納米薄膜。
3.寡核苷酸探針合成用上述玻片在無氧無水手套箱中進行核酸序列合成，用分子印章法進行多種序列合成，制成芯片，其中最后一個堿基是帶有熒光素標記的核酸單體，因此，制成的芯片已經(jīng)標記了熒光素。
權(quán)利要求
1.一種固相化核酸檢測探針，其特征在于在固體基片(1)上通過手臂分子(2)固定有熒光淬滅材料(3)，在熒光淬滅材料(3)表面上制備有由熒光基團(5)、寡核苷酸探針分子的莖桿部(6)、寡核苷酸探針的環(huán)部(7)組成的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的一端固定在熒光淬滅材料(3)表面上，寡核苷酸探針的另一端附近的堿基標記有熒光基團(5)，寡核苷酸探針兩端附近的序列分別有3至15個堿基為互補序列，可使該寡核苷酸探針兩端附近的序列能夠形成雜交，寡核苷酸探針中間部分的堿基序列為被檢測的核酸序列的互補序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相化核酸檢測探針，其特征在于寡核苷酸探針為多種探針組成的寡核苷酸探針陣列，即基因芯片，固定化寡核苷酸探針是脫氧核糖核酸，或核糖核酸、肽核酸或者是它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固相化核酸檢測探針，其特征在于固定寡核苷酸探針的固體基片(1)上的熒光淬滅材料(3)可以是納米顆粒，包括金屬納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒、金屬鹽納米顆粒；也可以是包含有熒光淬滅基團的有機分子或復(fù)合高分子材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固相化核酸檢測探針，其特征在于固定寡核苷酸探針的固體基片(1)上的熒光淬滅材料(3)可以是直接共價連接在固體基片(1)上的熒光淬滅基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的固相化核酸檢測探針，其特征在于固定有納米顆粒的固體基片(1)，其材料為玻璃、硅、陶瓷、塑料、硝酸纖維、尼龍或橡膠中的一種。
6.一種固相化核酸檢測探針的制備方法，其特性在于方法為a、用雙功能活性試劑通過化學反應(yīng)在固體基片(1)表面鍵合上活性基團，即手臂分子(2)，b、在具有活性基團的固體基片(1)上固定熒光淬滅材料(3)，c、在熒光淬滅材料(3)的表面用雙功能基基團化學度劑進行修飾，形成手臂分子(4)，d、將固相化學合成好的包含有至少一個熒光發(fā)色基團的特異性核酸序列的寡核苷酸探針的一端接在熒光淬滅材料(3)上，使熒光淬滅材料(3)表面制備上寡核苷酸探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固相化核酸檢測探針的制備方法，其特征在于在熒光淬滅材料(3)表面上制備寡核苷酸探針的方法是原位合成法，即直接在熒光淬滅材料(3)表面化學合成DNA探針，寡核苷酸探針的3’端固定于熒光淬滅材料(3)上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固相化核酸檢測探針的制備方法，其特征在于在熒光淬滅材料(3)表面上制備寡核苷酸探針的方法是用化學方法將預(yù)先合成的寡核苷酸探針整體固定在熒光淬滅材料(3)上。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固相化核酸檢測探針的制備方法，其特征在于寡核苷酸探針可以是全部原位合成的，也可以是部分原位合成，然后通過化學基團連接而形成完整的寡核苷酸探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固相化核酸檢測探針的制備方法，其特征在于在固體基片(1)上制備納米金顆粒薄膜的方法是使用蒸鍍法將金屬等物質(zhì)蒸鍍在固體基片(1)表面，形成緊密排列的納米顆粒薄膜。
全文摘要
固相化核酸檢測探針及其制備方法是一種固定在固體基片上寡核苷酸探針及其用此法制作的微陣列芯片，是一種檢測核酸序列信息的非標記的寡核苷酸探針，該探針在固體基片1上通過手臂分子2固定有熒光淬滅材料3，在熒光淬滅材料3表面上制備有由熒光基團5、寡核苷酸探針分子的莖桿部6、寡核苷酸探針的環(huán)部7組成的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針的一端固定在熒光淬滅材料3表面上，寡核苷酸探針的另一端附近的堿基標記有熒光基團5，寡核苷酸探針兩端附近的序列分別有3至15個堿基為互補序列，可使該寡核苷酸探針兩端附近的序列能夠形成雜交，寡核苷酸探針中間部分的堿基序列為被檢測的核酸序列的互補序列。
文檔編號G01N21/64GK1435493SQ0311292
公開日2003年8月13日 申請日期2003年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月5日
發(fā)明者劉全俊, 陸祖宏, 肖鵬峰 申請人:東南大學