專(zhuān)利名稱(chēng)：電化學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定載體中分析物濃度的電化學(xué)方法并涉及一種用于實(shí)施該方法的裝置。
背景技術(shù)：
此處描述的發(fā)明是對(duì)我們共同未決的申請(qǐng)PCT/AU96/00365中所述的發(fā)明的改進(jìn)或修改，其內(nèi)容在此引入以供參考。
此處將特別結(jié)合一種用以測(cè)量血液中葡萄糖濃度的生物傳感器對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于這種特定應(yīng)用，也可以用于其它分析測(cè)量中。
為測(cè)量含水液體樣品中的待分析成分的濃度，公知方法是通過(guò)將樣品置于電化學(xué)電池的反應(yīng)區(qū)進(jìn)行測(cè)量，其中電化學(xué)電池具有兩個(gè)電極，其間具有使它們適于電流測(cè)量的阻抗。允許待分析成分直接與一個(gè)電極反應(yīng)，或者直接或間接與氧化還原劑反應(yīng)，從而形成一種可氧化的(或可還原的)物質(zhì)，其總量與待分析成分的濃度相對(duì)應(yīng)。然后通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)量存在的可氧化(或可還原的)物質(zhì)的分量。這種方法通常需要使電極充分分離，以使測(cè)量期間一個(gè)電極的電解產(chǎn)物不會(huì)到達(dá)另一電極而影響另一電極的反應(yīng)過(guò)程。
在我們共同未決的申請(qǐng)中，我們描述了一種用于測(cè)定在具有一個(gè)工作電極和一個(gè)與該工作電極隔開(kāi)的反電極(或反/參考電極)的電化學(xué)電池中還原(或氧化)形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的濃度的新方法。該方法包括如下步驟，在電極之間施加電位差，將工作電極與反電極隔開(kāi)以便反應(yīng)產(chǎn)物從反電極到達(dá)工作電極，以及選擇工作電極的電位使得還原形態(tài)的物質(zhì)的電解氧化(或氧化形態(tài)物質(zhì)的電解還原)速率受擴(kuò)散控制。通過(guò)在施加電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流之前測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流，然后估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度，前述方法使得能夠測(cè)定還原(或氧化)形態(tài)物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)和/或濃度。
在我們共同未決的申請(qǐng)中，結(jié)合使用了采用GOD/氰亞鐵酸鹽系統(tǒng)(GOD/Ferrocyanide system)的“薄層”電池對(duì)該方法進(jìn)行了舉例說(shuō)明。這里所用的術(shù)語(yǔ)“薄層電化學(xué)電池”是指具有小間距的電極從而使反應(yīng)產(chǎn)物可由反電極到達(dá)工作電極的電池。實(shí)際上，用于測(cè)量血液中葡萄糖濃度的這種電池中電極的間隔小于500微米，并且最好小于200微米。
例示的電化學(xué)電池中所用化學(xué)原理如下葡萄糖+GOD→葡糖酸+GOD*反應(yīng)1GOD*+2氰鐵酸鹽→GOD+2氰亞鐵酸鹽 反應(yīng)2其中GOD為葡萄糖氧化酶，GOD*為‘活化’酶。氰鐵酸鹽([Fe(CN)6]3)為使GOD*返回其催化狀態(tài)的‘介體’。反應(yīng)過(guò)程中只要存在過(guò)量介體，催化酶GOD就不會(huì)消耗。氰亞鐵酸鹽([Fe(CN)6]4)為整個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物。理論上開(kāi)始時(shí)沒(méi)有氰亞鐵酸鹽，但實(shí)際中常有少量。在反應(yīng)結(jié)束后，氰亞鐵酸鹽的濃度(以電化學(xué)方法測(cè)量)表示葡萄糖的初始濃度。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是反應(yīng)1和2之和反應(yīng)3“葡萄糖”具體指β-D-葡萄糖。
已有技術(shù)具有諸多缺點(diǎn)。首先，所需樣品尺寸大于所希望尺寸。通常希望能對(duì)較小體積的樣品進(jìn)行測(cè)量，因?yàn)檫@反過(guò)來(lái)使得能夠在獲取樣品時(shí)采用損失更小的方法。
其次，通常希望提高測(cè)量精度并且消除或減少由于例如電池不對(duì)稱(chēng)或者在批量生產(chǎn)微電池時(shí)引入的其它因素所導(dǎo)致的偏差。
再者，通常希望減少得到測(cè)量值所需的時(shí)間。目前市場(chǎng)上可獲得的電化學(xué)葡萄糖探測(cè)器中采用的測(cè)試議定書(shū)在開(kāi)始測(cè)試時(shí)包含一個(gè)預(yù)定的等待時(shí)間，此時(shí)酶與葡萄糖反應(yīng)以產(chǎn)生供電化學(xué)探測(cè)的物質(zhì)。此開(kāi)始時(shí)間設(shè)定為在所有使用條件下實(shí)現(xiàn)所需反應(yīng)所必需的最大值。
再次，希望消除由氧引起的偏差。氧可以富含于血液中，或者溶解在血漿中，或者與血紅蛋白結(jié)合。它也可以在“指刺”(finger sticking)時(shí)引入，其時(shí)小體積而大表面積的血滴在加入電池之前暴露于空氣中。因?yàn)檠跏荊OD的介體，所以氧會(huì)造成干擾。其反應(yīng)如下葡萄糖+GOD→葡糖酸+GOD*反應(yīng)4GOD*+氧+水→GOD+過(guò)氧化氫 反應(yīng)5其總體反應(yīng)由下式給出反應(yīng)6在多數(shù)場(chǎng)合，氧氣也用作介體的復(fù)雜狀態(tài)是不希望的，因?yàn)樽罱K氰亞鐵酸鹽的濃度已不再直接與初始葡萄糖濃度成正比。其結(jié)果是，初始葡萄糖濃度既與氰亞鐵酸鹽的最終濃度也與過(guò)氧化氫的最終濃度相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于測(cè)定載體中分析物濃度的方法，它避免或彌補(bǔ)了已有技術(shù)的缺點(diǎn)。本發(fā)明優(yōu)選形式的目的在于提供一種具有改進(jìn)精度、和/或可靠性和/或速度的生物傳感器。
根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明包括一種用于測(cè)定在具有一個(gè)工作電極和一個(gè)與該工作電極隔開(kāi)一予定間距的反電極的電化學(xué)電池中還原(或氧化)形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的濃度的方法，所述方法包括如下步驟(a)在電極之間施加電壓，其中該電極被隔開(kāi)以致于反應(yīng)產(chǎn)物從反電極通過(guò)擴(kuò)散到達(dá)工作電極，并且其中工作電極的電位使得還原形態(tài)(或氧化形態(tài))的氧化還原物質(zhì)的電解氧化速率受擴(kuò)散控制，(b)在施加電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流，(c)估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度，(d)中斷電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性，(e)重復(fù)步驟(b)和步驟(c)。
本發(fā)明緣于如下發(fā)現(xiàn)，即如果在達(dá)到初始穩(wěn)定狀態(tài)之后反轉(zhuǎn)極性(即陽(yáng)極變?yōu)殛帢O而陰極變?yōu)殛?yáng)極)，則可以觀察到第二暫態(tài)電流，并且在過(guò)一段時(shí)間后達(dá)到第二穩(wěn)定狀態(tài)。這已被證明對(duì)診斷是有幫助的，有助于降低電池不對(duì)稱(chēng)和其它影響暫態(tài)電流的因素所造成的影響。通過(guò)采用反轉(zhuǎn)電極允許重復(fù)進(jìn)行測(cè)量，還可以實(shí)現(xiàn)較高可靠性和/或精度的測(cè)量。類(lèi)似地，如果使電壓中斷一段足以使?jié)舛确植蓟謴?fù)隨機(jī)狀態(tài)的時(shí)間，然后再重新施加，則可以重復(fù)步驟(b)和步驟(c)。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明包括一種根據(jù)第一方面的方法，用于通過(guò)一個(gè)電池測(cè)量樣品中的葡萄糖濃度，其中該電池具有一個(gè)工作電極、一個(gè)反電極、催化酶和氧化還原介體，該方法包括使電池在高于氧化還原反應(yīng)電位的電位下工作的步驟，以便使過(guò)氧化氫在陽(yáng)極氧化，從而構(gòu)成一種根據(jù)第一方面的方法。
通過(guò)此方法可以彌補(bǔ)氧氣影響，這在后面將進(jìn)一步說(shuō)明。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明包括一種根據(jù)第一或第二方面的方法，其中允許樣品與催化酶及氧化還原介體反應(yīng)，包括如下步驟(a)在填充電池之前或其間，在電極之間施加電壓，(b)測(cè)量作為時(shí)間函數(shù)的電流的增加，(c)根據(jù)步驟(b)中的測(cè)量結(jié)果確定或預(yù)計(jì)與所述催化劑反應(yīng)完成的時(shí)間，以及(d)然后中斷電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性。


下面僅以示例方式并且參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，附圖中圖1例示出在根據(jù)本發(fā)明的電池中發(fā)生的反應(yīng)。
圖2表示在根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)電池中，在施加電壓之前和施加電壓之后且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前的濃度分布以及在穩(wěn)定狀態(tài)的濃度分布。
圖3表示在施加電壓之前和之后電流隨時(shí)間變化的曲線。
圖4表示在根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)電池中，在極性反轉(zhuǎn)之前，反轉(zhuǎn)之后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，以及在穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)氰亞鐵酸鹽的濃度分布。
圖5表示在極性反轉(zhuǎn)之前和之后電流隨時(shí)間變化的曲線。
圖6表示在中斷所施加電壓15秒之前和之后電流隨時(shí)間變化的曲線。
圖7表示其中過(guò)氧化物被氧化的電化學(xué)電池中發(fā)生的反應(yīng)。
圖8表示在施加足以使過(guò)氧化氫氧化的初始電壓時(shí)電流隨時(shí)間變化的曲線。
圖9畫(huà)出了圖7中電池的平面圖。
圖10通過(guò)沿圖9中線10-10的剖面圖描述了適用于本發(fā)明的電池的一個(gè)圖11畫(huà)出了圖7中電池的端剖面圖。
具體實(shí)施例方式
參照?qǐng)D9、10和11，僅以示例方式畫(huà)出了(未按比例)適于本發(fā)明方法采用的一種電化學(xué)電池。
該電池包括一聚酯芯層4，大約18mm×5mm且厚約100微米，并且具有一直徑3.4mm的圓孔8。孔8限定了一個(gè)圓柱狀電池側(cè)壁10。在芯層4的一側(cè)粘接有一個(gè)帶有鈀濺射鍍層2的聚酯板1。濺鍍是在4至6毫巴壓強(qiáng)的氬氣氛中進(jìn)行的，以產(chǎn)生厚約100-1000埃的均勻鍍層。所述板通過(guò)粘合劑3粘接至芯層4，使鈀2與芯層4相鄰并覆蓋孔8。
具有第二鈀濺射鍍層6的第二聚酯板7，通過(guò)壓合式粘合劑5粘接至芯層4的另一側(cè)并覆蓋孔8。從而確定了一個(gè)具有圓柱狀側(cè)壁10和靠近的金屬鈀端部的電池。該組件在9處開(kāi)有凹口，以便使溶液可以進(jìn)入電池或者通過(guò)虹吸或毛細(xì)作用吸入，并且使空氣可以逸出。金屬膜2、6以適當(dāng)?shù)碾娺B接方式或形式加以連接，從而可以施加電壓并且可以用測(cè)量電流的方式對(duì)電壓進(jìn)行測(cè)量。對(duì)該電池裝以干燥形式的GOD和氰亞鐵酸鹽。圖1中簡(jiǎn)要畫(huà)出了此電池。
在使用時(shí)，根據(jù)本方法，在9處通過(guò)毛細(xì)作用向電池中加入一滴血液并使其反應(yīng)。
實(shí)施例可以參照?qǐng)D1考慮用于測(cè)量完全反應(yīng)后的氰亞鐵酸鹽濃度的電化學(xué)裝置。
在薄層電池中，氰亞鐵酸鹽和氰鐵酸鹽的濃度(在完成‘酶催化’反應(yīng)之后)在整個(gè)電池中都是相等的(所考慮軸線處在兩電極之間)。圖2給出了氰亞鐵酸鹽的濃度分布曲線。
當(dāng)在電池之中施加一定電壓時(shí)，氰鐵酸鹽在陰極處轉(zhuǎn)化為氰亞鐵酸鹽，而氰亞鐵酸鹽在陽(yáng)極處轉(zhuǎn)化為氰鐵酸鹽。其化學(xué)計(jì)量設(shè)置為在完全反應(yīng)后與氰亞鐵酸鹽相比仍然具有過(guò)量的氰鐵酸鹽。由于此原因，限制完全電化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程在于氰亞鐵酸鹽在陽(yáng)極處向氰鐵酸鹽的轉(zhuǎn)化，僅因?yàn)榍鑱嗚F酸鹽具有明顯較低的濃度。對(duì)氰亞鐵酸鹽反應(yīng)的速率限制措施還在于氰亞鐵酸鹽向陽(yáng)極的擴(kuò)散。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，氰亞鐵酸鹽和氰鐵酸鹽的濃度保持不變(見(jiàn)圖2)。
因此，存在兩個(gè)限制條件最初時(shí)20氰亞鐵酸鹽均勻地分布于整個(gè)電池中。接著，在電池中施加一個(gè)已知電壓，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，達(dá)到氰亞鐵酸鹽的穩(wěn)態(tài)濃度分布23?！^(guò)渡狀態(tài)’22反映隨著濃度從初始條件向最終穩(wěn)態(tài)條件23的調(diào)整，所測(cè)得的通過(guò)電池的電流。這在圖3中顯示為時(shí)間的函數(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在此‘過(guò)渡’期間，電流隨時(shí)間的變化決定于氰亞鐵酸鹽的總濃度和氰亞鐵酸鹽的擴(kuò)散系數(shù)。
通過(guò)解此條件下的擴(kuò)散方程，表明通過(guò)在有限的可計(jì)算時(shí)間范圍內(nèi)的下述方程可以充分描述此過(guò)渡狀態(tài)ln(iiss-1)=-4π2DtL2+ln(2)]]>方程1其中i為所測(cè)電流，iss為穩(wěn)態(tài)電流，D為氰亞鐵酸鹽在電池中的擴(kuò)散系數(shù)，L為陽(yáng)極和陰極之間的間隔距離，t為時(shí)間。
這是一般擴(kuò)散方程的簡(jiǎn)單解。然而，也有可能采用其它解。
最終的穩(wěn)態(tài)電流也決定于氰亞鐵酸鹽的總濃度和氰亞鐵酸鹽的擴(kuò)散系數(shù)。穩(wěn)態(tài)電流還可以根據(jù)擴(kuò)散理論建立模型，由下式給出iss=2DFCAL]]>方程2其中F為法拉第常數(shù)，C為氰亞鐵酸鹽的初始濃度，A為工作電極的面積。初始濃度表示未經(jīng)擾動(dòng)的濃度(如圖2中20所示)。
對(duì)過(guò)渡狀態(tài)以及穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)觀測(cè)的電流進(jìn)行分析，可以計(jì)算出氰亞鐵酸鹽的濃度和擴(kuò)散系數(shù)，從而可以計(jì)算出初始的葡萄糖濃度。
通過(guò)作出如下曲線可以進(jìn)行這種分析ln(iiss-1)]]>方程3時(shí)間函數(shù)在一個(gè)有限的和可計(jì)算的時(shí)間范圍內(nèi)基本上是線性的，并且可以通過(guò)線性最小二乘回歸法進(jìn)行分析。由于L對(duì)于給定電池是一個(gè)常數(shù)，所以測(cè)量作為時(shí)間函數(shù)的i以及iss，可以計(jì)算出氧化還原介體的擴(kuò)散系數(shù)值并且可以確定分析物的濃度。
另一種分析數(shù)據(jù)的可能方式是利用在向電極施加電壓差之后不久電流隨時(shí)間的變化。在此時(shí)間內(nèi)，其電流可以通過(guò)科特雷耳方程充分描述。也即i-FAD_C/(pi_t_) 方程4通過(guò)對(duì)i隨1/t_變化的曲線進(jìn)行最小二乘回歸，可以由該曲線的斜率估算出FAD_C/pi_的值。穩(wěn)態(tài)電流iss如前給出，因此通過(guò)結(jié)合上述曲線的斜率和穩(wěn)態(tài)電流，可以計(jì)算出氰亞鐵酸鹽的濃度值，它與電池中的氰亞鐵酸鹽擴(kuò)散系數(shù)無(wú)關(guān)。這由下式給出C＝2slope2pi/(FALiss) 方程5在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)例子中，將血樣引入一個(gè)薄層電池中，該電池中含有如前面結(jié)合圖7、8和9所述的GOD/氰亞鐵酸鹽系統(tǒng)。如圖3所示，進(jìn)行短時(shí)間20的反應(yīng)之后，在電極之間施加一電壓，當(dāng)在施加電壓21時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)電流，但是電流隨后作為一個(gè)過(guò)渡22降低至穩(wěn)態(tài)水平23。擴(kuò)散系數(shù)和/或葡萄糖濃度可以通過(guò)測(cè)量作為時(shí)間函數(shù)的電流和測(cè)量穩(wěn)態(tài)電流求得。
根據(jù)本發(fā)明，隨后中斷電流，或者例如通過(guò)一個(gè)適當(dāng)?shù)那袚Q開(kāi)關(guān)倒轉(zhuǎn)其極性。如果倒轉(zhuǎn)其極性，則隨后會(huì)觀察到一個(gè)第二過(guò)渡狀態(tài)，并且在經(jīng)過(guò)更長(zhǎng)時(shí)間后達(dá)到一個(gè)第二穩(wěn)定狀態(tài)，盡管其分布圖相反。圖4簡(jiǎn)要畫(huà)出了電池中氰亞鐵酸鹽濃度分布所經(jīng)歷的改變。電流反轉(zhuǎn)前的初始濃度分布為23。新的穩(wěn)態(tài)濃度分布顯示為25。過(guò)渡狀態(tài)的濃度分布由24給出例示。
通過(guò)解此條件下的擴(kuò)散方程，表明過(guò)渡電流可以描述如下ln(iiss-1)=-4π2DtL2+ln(2)]]>方程6因此，在反轉(zhuǎn)極性的情況下易于重新計(jì)算其擴(kuò)散系數(shù)和濃度。理論上，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)與過(guò)渡狀態(tài)或極性的形式無(wú)關(guān)。實(shí)際上，其結(jié)果由于影響過(guò)渡狀態(tài)的因素的原因會(huì)有所變化，例如由于樣品不均勻、電極狀態(tài)，或者更重要地由于電池結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱(chēng)性。因而此測(cè)量對(duì)于電池診斷是有用的，并且通過(guò)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量和以反轉(zhuǎn)極性取平均，還可以達(dá)到更高的精度。
類(lèi)似地，如果在達(dá)到穩(wěn)態(tài)后中斷電壓，其初始濃度分布將在短時(shí)間(例如4秒)內(nèi)重新建立起來(lái)。
一旦重新建立起(或者接近于)初始狀態(tài)之后，便可以施加電壓，從而重復(fù)上述步驟而無(wú)需電流反轉(zhuǎn)。圖6畫(huà)出了電流隨時(shí)間變化的曲線，類(lèi)似于圖3，但是其電壓在26處被中斷，15秒之后在27處被重新施加，從而產(chǎn)生一個(gè)新的過(guò)渡電流28和狀態(tài)29。
如前所述，血液中氧的存在是一個(gè)干擾因素，因?yàn)樽罱K的氰亞鐵酸鹽濃度不再直接正比于初始的葡萄糖濃度。初始葡萄糖濃度而是與氰亞鐵酸鹽加上過(guò)氧化氫一起的最終濃度有關(guān)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫可以在一個(gè)高于氰亞鐵酸鹽/氰鐵酸鹽氧化還原反應(yīng)電位的已知電位在陽(yáng)極處被氧化。圖7給出了其整個(gè)電化學(xué)途徑。過(guò)氧化氫反應(yīng)為過(guò)氧化氫→氧氣+2H++2e″ 反應(yīng)7如果在酶催化反應(yīng)過(guò)程中向電池中施加一個(gè)足以氧化過(guò)氧化氫的電壓，則在此期間將會(huì)發(fā)生下述過(guò)程(a)葡萄糖反應(yīng)變?yōu)槠咸撬帷?br> (b)產(chǎn)生氰亞鐵酸鹽和過(guò)氧化氫。
(c)氰亞鐵酸鹽/氰鐵酸鹽氧化還原反應(yīng)最終達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
(d)過(guò)氧化氫在陽(yáng)極被氧化，產(chǎn)生電子用于將氰鐵酸鹽轉(zhuǎn)化為氰亞鐵酸鹽。
總體上，在恒定電壓經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(在圖8中大約2_秒)之后，所有過(guò)氧化物將轉(zhuǎn)化為氧氣(氧氣隨后作為催化劑，用于接著完成更多的酶化學(xué)反應(yīng)直到葡萄糖完全消耗)，而電子將用于將氰鐵酸鹽轉(zhuǎn)化為氰亞鐵酸鹽。
在此階段(在圖8中60秒)施加一個(gè)反轉(zhuǎn)過(guò)渡狀態(tài)。也就是說(shuō)，切換電池的極性，但現(xiàn)在施加適于氰鐵酸鹽/氰亞鐵酸鹽氧化還原反應(yīng)的較低電壓。最終的穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)氰亞鐵酸鹽將再次反映初始的葡萄糖濃度。這可以用前述方式分析以確定初始樣品中的葡萄糖總體濃度。
采用本發(fā)明的方法，可以用電化學(xué)方法就地監(jiān)測(cè)測(cè)試的反應(yīng)階段，而無(wú)須干擾其測(cè)量階段。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)即可以進(jìn)行測(cè)量，而無(wú)需進(jìn)一步延遲?？紤]到不同電池之間酶活性的變化以及不同的溫度和葡萄糖濃度，其等待時(shí)間因測(cè)試而異，并且可以是任何特殊樣品和電池所必要的最少時(shí)間。這與現(xiàn)有技術(shù)形成了鮮明的對(duì)比，在現(xiàn)有技術(shù)中，在考慮到所有這些因素后，其測(cè)量需延遲到反應(yīng)所需的最長(zhǎng)時(shí)間。
在本方法中，電池剛開(kāi)始充滿(mǎn)樣品后便通過(guò)在兩個(gè)電極之間施加例如-300mV的電壓來(lái)監(jiān)測(cè)其反應(yīng)階段。
很快便可獲得還原介體在電池中的線性濃度分布曲線。隨著與葡萄糖的酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的還原介體的增多，此線性濃度分布曲線變得更加陡峭，并且電流也隨著增加。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)電流不再增加。該點(diǎn)可以由熟知的電子手段加以檢測(cè)，接著便可開(kāi)始該測(cè)試的測(cè)量階段。
通過(guò)將理論上的分子運(yùn)動(dòng)方程擬合至在測(cè)試的此階段獲得的電流時(shí)間曲線，還可以估算反應(yīng)的結(jié)束點(diǎn)。此方程可以預(yù)測(cè)任何時(shí)刻的反應(yīng)進(jìn)行程度，因而可以得知該結(jié)束點(diǎn)何時(shí)發(fā)生，而不必等到那時(shí)。這進(jìn)一步縮短了測(cè)試時(shí)間。例如，可以將方程擬合至所測(cè)得的前脈沖電流隨時(shí)間變化的曲線。該方程因而可以預(yù)測(cè)，在時(shí)刻X反應(yīng)將完成例如90％。如果測(cè)量時(shí)刻X的濃度，可以將答案除以0.90以得到真實(shí)濃度。
該系統(tǒng)中的濃度測(cè)量通過(guò)反轉(zhuǎn)電壓進(jìn)行，即在電極之間施加+300mV電壓。接著得出電流時(shí)間曲線，它與雙瞬態(tài)實(shí)驗(yàn)中的第二過(guò)渡狀態(tài)的曲線相同，即通過(guò)轉(zhuǎn)換在測(cè)量階段所測(cè)的電流i，可以獲得ln(i/iss-1)隨時(shí)間變化的曲線，它具有-4pi^2D/l^2的斜率和ln(4)的截距。因而可以利用正常分析得出葡萄糖的濃度。
在某些情況下難于或不可能知道電化學(xué)電池中電極間的距離。例如，很難重復(fù)制造或測(cè)量非常小的間隔(大約10微米)。在這些情況下，如果其中一個(gè)電池在加入樣品之前含有已知濃度的分析物或者相應(yīng)的還原介體，則可以利用來(lái)自?xún)蓚€(gè)鄰接電池的信息，計(jì)算樣品中分析物的濃度，而無(wú)須知道電池的間隔。或者，也可以在向電池中加入樣品之前，向?qū)⒂糜趦呻姵刂坏臉悠分屑尤胍阎康脑摲治鑫锘蜻€原介體。另一種替代方法是，如果兩個(gè)電池都含有一定濃度的分析物或還原介體，但是每個(gè)電池具有的濃度不同。再一個(gè)替代方法是，如果向兩等份樣品中加入兩份不同既定量的分析物或還原介體，然后將該兩等份樣品加入鄰接電池。
然后以通常方式利用這兩個(gè)電化學(xué)電池，并且在每個(gè)電池中測(cè)量下列參數(shù)穩(wěn)態(tài)電流(iss)和由ln(i/iss-1)隨時(shí)間變化曲線限定的直線的斜率，其中i為所測(cè)電流。當(dāng)知道這些值以及知道兩個(gè)電池中的分析物或還原介體的濃度差之后(其濃度是已知的，它等于特意加入一個(gè)電池中的值)，就有可能計(jì)算出樣品中分析物或還原介體的濃度，而無(wú)須知道電極的間隔距離。
上述結(jié)構(gòu)可以與一個(gè)第三電池結(jié)合使用，該第三電池用于測(cè)量由于如下原因引起的背景電流或濃度例如，通過(guò)施加和干燥化學(xué)品形成的還原介體，金屬表面的催化作用，金屬表面的氧化，影響分析物或介體的樣品成分，樣品的電化學(xué)響應(yīng)成分等等。從上述兩個(gè)電池所測(cè)量的值中減去該背景濃度或電流，對(duì)于每個(gè)電池計(jì)算出樣品中分析物所產(chǎn)生的真實(shí)值，在其中一種情況下還計(jì)算出特意加入電池或樣品中的分析物或還原介體所產(chǎn)生的真實(shí)值。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處教導(dǎo)會(huì)很清楚，此方法適于與自動(dòng)測(cè)量設(shè)備一起使用。所述種類(lèi)的電池可以用電連接方式連接至配有微處理器的裝置或者用以使所需測(cè)量進(jìn)行所需計(jì)算并顯示其結(jié)果的其它編程電子控制和顯示電路。除了可以測(cè)量血液中葡萄糖濃度之外，此方法還可以用于測(cè)量液體中其它分析物的濃度。
本方法可以使用其它方案和/或結(jié)構(gòu)的電池，以及使用不同于例示的已知催化劑和氧化還原引發(fā)系統(tǒng)來(lái)實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定在樣品中的還原或氧化形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的濃度的方法，所述方法包括如下步驟(a)在第一電化學(xué)電池的工作電極和反電極之間施加電壓，其中這些電極被隔開(kāi)，使得反應(yīng)產(chǎn)物從反電極通過(guò)擴(kuò)散到達(dá)工作電極，且工作電極的電位使得還原或氧化形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的電解氧化速率受擴(kuò)散控制；(b)在施加電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流；(c)估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度；(d)中斷或者重新施加電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性；(e)重復(fù)步驟(b)和步驟(c)；以及(f)利用包含已知濃度的氧化還原物質(zhì)或已知濃度的還原的氧化還原介體的第二電池校準(zhǔn)第一電池。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中反轉(zhuǎn)其極性。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中電極間隔小于500微米。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中電極間隔小于200微米。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中工作電極在平行于且面向反電極延伸的平面的平面內(nèi)延伸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中電壓重復(fù)反轉(zhuǎn)，且由每次反轉(zhuǎn)之前測(cè)得結(jié)果的平均值計(jì)算物質(zhì)濃度。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中第一電池中含有酶和氧化還原介體。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中第一電池中含有葡萄糖氧化酶。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中第一電池中含有氰鐵酸鹽。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括以下步驟使氧化還原物質(zhì)與催化酶和氧化還原介體反應(yīng)，且所述方法還包括使電池工作在比氧化還原反應(yīng)電位高的電位，以使過(guò)氧化氫在陽(yáng)極處氧化的前置步驟。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中向第一電池加入含有催化劑的樣品，使催化劑反應(yīng)以生成電化學(xué)可氧化的物質(zhì)或電化學(xué)可還原的物質(zhì)，該方法還包括如下步驟(g)在填充電池之前或其間，在電極之間施加電壓；(h)測(cè)量作為時(shí)間函數(shù)的電流的變化；(i)根據(jù)步驟(h)中的測(cè)量結(jié)果確定或預(yù)測(cè)所述反應(yīng)基本上完成的時(shí)間和/或在所述反應(yīng)基本上完成時(shí)測(cè)得的電流的大小；以及(j)中斷或者重新施加電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性；(k)在重新施加電壓或反轉(zhuǎn)電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流；(l)估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度；(m)基于步驟(i)、(k)、(l)的結(jié)果估算樣品中催化劑的濃度。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(g)和(i)之間，在電極之間連續(xù)地施加電壓。
13.一種用于測(cè)定在樣品中的還原或氧化形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的濃度的方法，所述方法包括如下步驟(a)在電化學(xué)電池的工作電極和反電極之間施加電壓，其中這些電極被隔開(kāi)，使得反應(yīng)產(chǎn)物從反電極通過(guò)擴(kuò)散到達(dá)工作電極，且工作電極的電位使得還原或氧化形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的電解氧化速率受擴(kuò)散控制；(b)在施加電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流；(c)估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度；(d)中斷或者重新施加電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性；(e)重復(fù)步驟(b)和步驟(c)；以及(f)向樣品加入已知濃度的氧化還原物質(zhì)或已知濃度的還原的介質(zhì)，對(duì)電化學(xué)電池進(jìn)行校準(zhǔn)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在步驟(d)中反轉(zhuǎn)其極性。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中電極間隔小于500微米。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中電極間隔小于200微米。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中工作電極在平行于且面向反電極延伸的平面的平面內(nèi)延伸。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中電壓重復(fù)反轉(zhuǎn)，由每次反轉(zhuǎn)之前測(cè)得結(jié)果的平均值計(jì)算物質(zhì)濃度。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中電池中含有酶和氧化還原介體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中電池中含有葡萄糖氧化酶。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中電池中含有氰鐵酸鹽。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中還包括以下步驟使氧化還原物質(zhì)與催化酶和氧化還原介體反應(yīng)，且所述方法還包括使電池工作在比氧化還原反應(yīng)電位高的電位，以使過(guò)氧化氫在陽(yáng)極處氧化的前置步驟。
23.如權(quán)利要求13所述的方法，其中向電池加入含有催化劑的樣品，使催化劑反應(yīng)以生成電化學(xué)可氧化的物質(zhì)或電化學(xué)可還原的物質(zhì)，該方法還包括如下步驟(g)在填充電池之前或其間，在電極之間施加電壓；(h)測(cè)量作為時(shí)間函數(shù)的電流的變化；(i)根據(jù)步驟(b)中的測(cè)量結(jié)果確定或預(yù)測(cè)所述反應(yīng)基本上完成的時(shí)間和/或在所述反應(yīng)基本上完成時(shí)測(cè)得的電流的大?。灰约?j)中斷或者重新施加電壓，或者反轉(zhuǎn)電壓極性；(k)在重新施加電壓或反轉(zhuǎn)電壓之后并且在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流；(l)估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度；(m)基于步驟(i)、(k)、(l)的結(jié)果估算樣品中催化劑的濃度。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中在步驟(g)和(i)之間，在電極之間連續(xù)地施加電壓。
全文摘要
一種用于測(cè)定樣品中的還原或氧化形態(tài)的氧化還原物質(zhì)的濃度的方法，包括如下步驟在電化學(xué)電池的工作電極和反電極之間施加電壓，其中這些電極被隔開(kāi)以致于反應(yīng)產(chǎn)物從反電極到達(dá)工作電極，使得氧化還原物質(zhì)的電解氧化受擴(kuò)散控制；測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流；估算穩(wěn)態(tài)電流的強(qiáng)度；反轉(zhuǎn)電壓；再次測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的電流并且估算穩(wěn)定狀態(tài)的反轉(zhuǎn)電壓。
文檔編號(hào)G01NGK1445541SQ03106170
公開(kāi)日2003年10月1日 申請(qǐng)日期1996年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月16日
發(fā)明者阿拉思泰·麥金德·霍杰斯, 托馬斯·威廉姆·伯克, 奧德瓦·約翰森, 伊恩·安德魯·馬克思沃爾 申請(qǐng)人:利費(fèi)斯坎公司