專利名稱：鑒定微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及快速鑒定微生物(例如細菌)的方法。
背景技術(shù)：
有很多情況都需要能夠快速地檢測潛在的致病生物體，例如細菌和病毒。目前的實驗室方法典型地包括培養(yǎng)生物體和應(yīng)用免疫診斷測試，或者制備組織學樣本以及應(yīng)用特殊的染色和/或免疫組織化學技術(shù)。這些技術(shù)至少需要幾個小時，如果要培養(yǎng)生物體，則需要幾天。基于DNA的鑒定，例如PCR，雖然更靈敏，但仍然需要幾個小時，也需要相當多的實驗設(shè)備和專家。
通過特異性多克隆抗血清和單克隆抗體鑒定特異性微生物是標準的技術(shù)實踐。免疫組織化學方法可以鑒定組織中存在的生物體，利用例如酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)可以檢測體液中的病原體，或來源于它們的抗原。然而，除非只用于確定由其他診斷標準(criteria)(一般情況)暗示的特定病原體的存在，這些診斷技術(shù)需要應(yīng)用許多不同的特異性抗體并很難用于從潛在的目標中鑒定出特定的病原體。細胞成分的免疫親和純化在理論上也是本領(lǐng)域公知的，但由于通常需要有關(guān)的生物體的知識，一般不能成為以鑒定為目的的實用技術(shù)。
應(yīng)用交叉反應(yīng)血清鑒定微生物先前已有報道(Bonenberger等，2001)。其中，用抗分支桿菌的BCG菌株的多克隆抗血清在活組織樣本中對多種微生物進行染色。這項技術(shù)不能鑒定特定的個別生物體，只能一般地對一定范圍的細菌、真菌和原生動物病原體染色。
近幾年來質(zhì)譜(MS)在生物學上的應(yīng)用在增長。新的進展使得能夠分析大的生物分子(綜述見Bakhtier和Tse，2000)。特別是，基質(zhì)輔助的解析電離(MALDI)和電噴射質(zhì)譜以及與其相關(guān)的相對溫和的電離技術(shù)特別適合蛋白應(yīng)用(綜述見Rowley等，2000)。不久前，離子井(ion trap)質(zhì)譜的引入減少了分析生物分子混合物的時間，特別是只有少量物質(zhì)的時候(Henderson等，1999)。
WO 00/29987(Demirev/馬里蘭大學)公開了一種測量微生物中各種組分的分子量和應(yīng)用數(shù)據(jù)庫檢索試圖鑒定它們的方法。然而，這種方法的缺點是必須處理大量信息，而且必須區(qū)分相似分子量的大量組分。它沒有試圖通過攜帶信息的生物標記進行預選來簡化質(zhì)譜分析。
WO 96/37777(Nelson等)公開了一種用質(zhì)譜分析抗原/抗體分析物的方法。然而，該申請的目的確定特定的抗體和/或抗原是否存在，以及如果存在的話，測定它們存在的量。它沒有提出明確地鑒定未知生物體的方法。
通過與應(yīng)用特異性單克隆抗體和免疫親和純化相結(jié)合，用質(zhì)譜可以獲得許多分子的詳細結(jié)構(gòu)圖(綜述見Downard，2000)。特別是，已對許多的蛋白(例如鈣聯(lián)蛋白)進行了如下分析通過免疫親和層析分析感興趣的分子，然后對分離的分子進行質(zhì)譜分析(Yamashita等，1999)。在一些情況下，可以酶解通過免疫親和純化的蛋白，產(chǎn)生一組特定的肽，再對這些肽進行質(zhì)譜分析，例如，釀酒酵母的Ty1Gag蛋白(Yu等，1998)。Lacey等(2001)報道了通過免疫親和純化然后進行質(zhì)譜分析對運鐵蛋白的同種型進行分析，以確立與運鐵蛋白異種性有關(guān)的糖類修飾的結(jié)構(gòu)。然而這包括使用特異性的抗運鐵蛋白多克隆抗體，所述多克隆抗體與相同氨基酸序列的分子結(jié)合。分子間的區(qū)別在于糖蛋白的糖部分，并且抗體不是交叉反應(yīng)性的。
帶有共同結(jié)構(gòu)特性的分子的親和純化可用除固定化抗體之外的其他配體進行，并且是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。Bundy和Fenselau(2001)報道了利用外源凝集素從不同微生物中俘獲不同的復合糖類，以及用特定的糖類俘獲表達外源凝集素的細菌。用質(zhì)譜分析俘獲的分子，或它們通過酸水解產(chǎn)生的肽。雖然這些可被描述為用于俘獲不同分子以進行MS分析的一般配體，但該方法不能用于鑒定未知微生物。該方法中沒有選擇合適的生物標記用于鑒定未知微生物。該方法沒有講述如何鑒定生物標記。該方法沒有暗示所建議的配體具有足夠的特異性，使得可以純化所要求的特異性生物標記，或者所用的生物標記在本發(fā)明所要求的不同生物體中一致地存在。該方法沒有暗示使用一種或一小組生物標記能夠使大范圍的微生物的快速識別成為可能。
雖然在實驗室設(shè)備中更快速地鑒定病原體是有利的，但也需要便攜的野外系統(tǒng)，能夠在和平時期用于人類或動物的流行病，或在軍用情況下，作為生物武器計量手段的一部分。就這一點而言，病原體，例如瘟疫或炭疽菌，可作為攻擊者，典型地以氣溶膠形式釋放。激光測量可用于檢測氣溶膠，但是氣溶膠也可能只是假(dummy)武器釋放的水霧(Willeke和Baron，1993)。人們需要在野外快速而準確地鑒定懷疑是生物武器的物質(zhì)，無論它是用什么方式釋放的。以前也報道過以離子井質(zhì)譜為基礎(chǔ)鑒定細菌的方法(Krishnamurthy等，1999)。其中，在通過反相微細管層析分離之后，在產(chǎn)生的波譜(spectrum)的基礎(chǔ)上直接分析并鑒定完整細菌。雖然作者提到了野外應(yīng)用設(shè)備的小型化的問題，但沒有建議應(yīng)用免疫親和選擇來簡化質(zhì)譜分析，并且使該分析適用于對大范圍的生物體進行快速鑒定。另外，也沒有提及可以用作生物標記的特定蛋白，沒有考慮在不同的環(huán)境條件下獲得的質(zhì)譜的可重復性。在沒有對所用的生物標記進行表征的情況下，這項技術(shù)在生物標記的表現(xiàn)(例如離子化特性)的不一致性上也存在缺陷，使得它的可靠性進一步降低。
病毒蛋白的直接質(zhì)譜分析也已被報道(WO 99/58727)，但是它沒有建議親和純化和使用共同的生物標記。細菌細胞裂解物的質(zhì)譜分析也已被報道(Chong等，1997)。在MALDI-TOF質(zhì)譜分析前用鹽酸胍和Triton X-100溶解細菌樣品。它沒有應(yīng)用任何形式的親和純化。它的目的是在大腸桿菌誘導和抑制蛋白合成，而不是鑒定未知的生物體。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種鑒定微生物的方法，包括確定從組成微生物的大量蛋白中提取的至少一種蛋白的分子量。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即在組成微生物的上千種的蛋白中，通過評估相對少量的蛋白，甚至一種蛋白，可以進行鑒定。眾所周知，一些蛋白，特別是那些在細胞中完成普遍存在的和至關(guān)重要的代謝功能的蛋白，在廣泛的物種中在結(jié)構(gòu)上是高度保守的。它們在具有共同的代謝途徑的不同物種中完成非常類似的功能，這一事實導致了進化上的壓力，以保留功能特性所依賴的結(jié)構(gòu)特征。這種高度保守的蛋白包括與基本細胞過程例如糖酵解(例如磷酸丙糖異構(gòu)酶)和核甘酸代謝(例如腺苷酸激酶)有關(guān)的酶、DNA聚合酶以及熱激蛋白。
這些蛋白的保守區(qū)域顯示了氨基酸序列的高度同源性。結(jié)果，它們帶有可與交叉反應(yīng)抗體結(jié)合的共同的免疫表位，使得可以從不同物種中用單一的單克隆抗體來鑒定或分離這些保守蛋白的任一家族。在一些情況下，一個單獨的抗體可與非常普遍的保守表位結(jié)合，因此可用于從許多物種中分離蛋白。然而，在許多情況下，為了使可鑒定物種的數(shù)目最大化，減少存在未鑒定的微生物的機會，可以將與相同或其他蛋白上的不同表位結(jié)合的一定數(shù)量的這樣的抗體組合使用。令人驚異的是，盡管它們的結(jié)構(gòu)高度保守，本發(fā)明表明，通過準確地測定它們的分子量，可以利用這些蛋白之間的微小差異快速而一致地鑒定產(chǎn)生它們的物種。質(zhì)譜達到的分辨力可以容易地鑒別出蛋白或來源于它們的多肽之間單一氨基酸的差別。因此，帶有共同表位的高度保守蛋白親和純化，以及隨后進行這樣的蛋白或來源于它們的多肽的質(zhì)譜分析，可形成鑒定微生物的快速而可靠的方法的基礎(chǔ)，其中所述蛋白得自所述微生物。以這樣的方式使用的蛋白或其他生物分子被稱為生物標記。
這種方法依賴于生物標記數(shù)據(jù)庫的獲得，所述數(shù)據(jù)庫將已知的生物標記的準確分子量與生物標記來源的物種聯(lián)系起來。在一些情況下，可能有必要使用一種以上的生物標記明確地鑒定一個物種、亞種或菌株。這些數(shù)據(jù)庫是通過以下方法產(chǎn)生的在一定的條件范圍內(nèi)生長相關(guān)的微生物，通過二維凝膠電泳對蛋白類(proteomes)做圖，用抗全微生物細胞裂解物的抗體進行western印跡分析。按以下的標準選擇的令人感興趣的標記可以被快速地鑒定，通過質(zhì)譜分析準確測定的它們的分子量，將分子量輸入數(shù)據(jù)庫。
選擇生物標記的一個重要因素是它們的分子量在不同的因素下是恒定的，所述不同的因素例如細胞循環(huán)、生長條件(如溫度或營養(yǎng)物的獲得)。這與在環(huán)境(例如生物武器)中鑒定微生物特別相關(guān)，所述環(huán)境的條件可能遠離生物體的最適條件，在這種條件的壓力下，微生物可能改變基因表達或翻譯后修飾的方式。因此，優(yōu)選地它們沒有通過磷酸化、脂化或核苷化而被短暫修飾，雖然這些修飾可能是已知的和一致性的，這并不排除應(yīng)用這樣的分子進行鑒定。在所有的條件下，生物標記都應(yīng)該是一致性地以足夠高的水平表達的，使提取和分離的量足夠多，使得可以進行鑒定。
根據(jù)這樣的考慮，熱激蛋白(Hsp)家族分子是特別合適的生物標記。例如Hsp60分子在物種間具有高度的保守性，不在翻譯后被修飾，是一致地和遍在地(ubiquitously)表達的。實際上，由于與細胞脅迫(cellular stress)有關(guān)，當生物體處于亞最適環(huán)境條件下時，它們的表達增加。Hsp60(GroEL，陪伴蛋白(chaperonin))和它的輔陪伴蛋白Hsp10(GroES)與新生多肽在ATP依賴性地翻譯后折疊成它們正確的三級結(jié)構(gòu)，以及非天然蛋白重新折疊成它們正確的天然構(gòu)象有關(guān)(Sigler et al，1998)。
除了應(yīng)用交叉反應(yīng)抗體從一定范圍的微生物中分離合適的生物標記之外，可以使用其他配體進行生物標記的親和俘獲。外源凝集素可用于俘獲在其糖類修飾中帶有特異性結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白或糖脂。固定化核酸可以用來俘獲DNA結(jié)合蛋白。依賴于所用的配體，這些蛋白可以是一般的DNA結(jié)合蛋白(如聚合酶)或者是序列特異性的結(jié)合蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子或限制性內(nèi)切核酸酶)。固定化的RNA aptamers和核酶也可以用于結(jié)合特異性的靶結(jié)構(gòu)(綜述見Hoffman等，2001)。人工染色配體能夠結(jié)合具有共同結(jié)構(gòu)特點(如輔因子結(jié)合凹(pocket))的不同分子(見“親和層析原理和方法”，Pharmacia LKBBiotechnology，1988)。例如，Cibacron Blue F3G-A結(jié)合不同的需要NAD或NADP的酶，以及對腺嘌呤基(adenylyl)底物有特異性的酶，如腺苷酸激酶，它是本發(fā)明有用的保守性生物標記。
用交叉反應(yīng)抗體或其他一般的結(jié)合配體從細胞裂解物中免疫親和純化一種或幾種高度保守的生物標記，然后參照數(shù)據(jù)庫對所用的一種或幾種生物標記進行質(zhì)譜分析(優(yōu)選離子井質(zhì)譜)，這兩者的結(jié)合提供了一種具有多種用途的，快速、可靠和可重復的鑒定微生物的方法。
在一個改變的實施方案中，俘獲的生物標記可被酶解，根據(jù)所用的酶和候選分子(來自經(jīng)記錄的物種范圍)的已知氨基酸序列產(chǎn)生一組可預定的肽。產(chǎn)生的質(zhì)譜是生物標記的指紋特征，可與數(shù)據(jù)庫進行參照，用于鑒定有關(guān)的微生物。使用固定化酶是一個方便的途徑，可以簡化過程，并降低待分析的肽混合物中存在的酶分子的復雜性。
對于野外生物戰(zhàn)中的計量應(yīng)用，希望以下整個過程可以在便攜單元裝置中自動進行從環(huán)境中取樣，濃縮和裂解細胞，親和純化感興趣的生物標記，洗脫上述的生物標記，對它們進行質(zhì)譜分析，記錄所獲得的質(zhì)譜，將質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫進行最佳匹配，最后參照這些信息，鑒定出被檢測的生物體。如果在第一次分析時沒有得到明確的鑒定結(jié)果，則自動進行其他步驟，例如俘獲的生物標記的酶促切割。保留親和純化步驟中初始洗脫物的一部分用于此目的。需要精確應(yīng)用時，最終的輸出可以是生物體或其菌株的精確鑒定。對于戰(zhàn)場應(yīng)用，簡單地輸出“安全”或“不安全”是合適的。
此外，自動單元可以被設(shè)計為用于其他應(yīng)用。例如，用于分析血液或醫(yī)院和實驗室所用的組織樣品的椅子上單元(bench-top unit)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種生物標記，其特征在于，來源于至少兩個微生物屬的大多數(shù)種的所述生物標記的種同系物(specieshomologues)是結(jié)構(gòu)上基本相似的，結(jié)構(gòu)上的相似性使得可以從不同種的微生物中分離出所述生物標記；其另一特征是來源于所述屬中各種微生物的生物標記具有獨特的分子量。
優(yōu)選地，所述生物標記的特征是它是一種蛋白，結(jié)構(gòu)上的相似性基本上是氨基酸序列的相似性。優(yōu)選地，所述微生物是細菌。
優(yōu)選地，所述生物標記的特征是至少三個種同系物具有至少一個共同的表位，使得可以通過免疫親和層析分離。更優(yōu)選地，至少五個物種具有至少一個共同的表位。更優(yōu)選地，它是熱激蛋白，最優(yōu)選地它是Hsp60。
可選地，所述生物標記可以是腺苷酸激酶。
本發(fā)明也提供了鑒定微生物的方法，包括a.鑒定一種生物標記，其特征在于，來源于至少兩個微生物屬的大多數(shù)種的所述生物標記的種同系物是結(jié)構(gòu)上基本相似的，結(jié)構(gòu)上的相似性使得可以從不同種的微生物中分離出所述生物標記；其另一特征是來源于所述屬中各種微生物的生物標記具有獨特的分子量；b.通過針對結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域進行親和層析分離所述生物標記；c.通過質(zhì)譜測量所述生物標記的分子量，以及d.參照數(shù)據(jù)庫分析獲得的分子量數(shù)據(jù)組合，由此推斷存在的微生物的種類。
優(yōu)選地，所述生物標記是從細胞裂解物中分離的。
更優(yōu)選地，所述生物標記是通過免疫親和層析分離的，最優(yōu)選地，所述生物標記是通過固定化抗體分離的，所述固定化抗體特異性地與來源于多種微生物的標記分子上的交叉反應(yīng)表位結(jié)合。
可選地，這種方法可包括附加的步驟在通過質(zhì)譜測定其分子量之前，把分離的生物標記切割成特定的片段。優(yōu)選地，生物標記的切割是通過酶解進行的。
優(yōu)選地，生物標記或其片段的分子量的測量是通過離子井質(zhì)譜進行的。
本發(fā)明也提供了一種鑒定大分子毒素的方法，包括a.通過親和層析分離一種或幾種毒素；b.通過質(zhì)譜測量所述毒素的分子量；以及c.參照數(shù)據(jù)庫分析所得的分子量數(shù)據(jù)組合，由此推斷存在的毒素的身份(identity)。
本發(fā)明的另一個實施方案包括自動進行任一上述方法的設(shè)備，包括a.分離生物標記或毒素的裝置；b.包括能夠測定生物標記或毒素的分子量的質(zhì)譜的單元；c.能夠?qū)⒌玫降臄?shù)據(jù)與已知的分子量數(shù)據(jù)庫匹配，由此推斷微生物或毒素身份的數(shù)據(jù)處理裝置。
可選地，所述設(shè)備還包括一個單元，所述單元包括一種或者固定化的能夠切割所述生物標記的蛋白水解酶。
定義本文所用的“生物標記”指的是一種環(huán)境生物化學參數(shù)，它的檢測或定量可用于鑒定潛在的生物危害。在本發(fā)明中，它特別是指結(jié)構(gòu)保守的生物大分子，包括蛋白，它們可以從大范圍的微生物中分離，用于鑒定所述微生物。
本文所用的“親和層析”指的是“一種典型的吸附層析，其中待純化分子被一種固定在不溶支持物(基質(zhì))上的互補性結(jié)合物質(zhì)(配體)特異性地和可逆地吸附”(見“親和層析原理和方法”，PharmaciaLKB Biotechnology，1998)。
本文所用的“免疫親和層析”指的是親和層析的一種形式，其中固定化配體是抗體或其表位結(jié)合衍生物本文所用的“種同系物”指的是來自另一物種的等價基因或基因產(chǎn)物。這樣的同系物具有等價的功能，在氨基酸水平上具有一定程度的序列相似性。在本文中，沒有假設(shè)生物體之間在進化上的關(guān)系。
發(fā)明詳述以下參照附圖，以實施例的方式描述本發(fā)明。


圖1是利用本發(fā)明方法的系統(tǒng)中功能要素的示意圖。
圖2顯示的是不同的潛在病原菌中的Hsp60蛋白的分子量的圖示比較。
圖3顯示的是單克隆IgG1A57-E4對來自土拉熱弗朗西絲氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的重組Hsp60蛋白的結(jié)合親和性的間接ELISA測量。
圖4是流產(chǎn)布魯氏菌和表皮葡萄球菌的Hsp60蛋白的Arg-C消化產(chǎn)生的肽指紋的圖示比較。
圖5是從一定范圍的潛在致病微生物中獲得的腺苷酸激酶的分子量與人類的Hsp60的圖示比較。
實施例1 自動取樣和鑒定系統(tǒng)參照圖1，用一個真空裝置(沒有顯示)從懷疑含有病原菌的氣溶膠中獲取樣品。氣溶膠與載體液體混合，通過取樣器(2)將懸浮液輸入系統(tǒng)(1)。從那里，懸浮物被輸送到超聲發(fā)聲器(4)，在超聲發(fā)聲器中，用超聲打碎懸浮液中任何細菌的細胞壁，由此將細菌的組成蛋白釋放到裂解液中。無可避免地，裂解物中也含有碎片。因此，超聲發(fā)聲器(4)的下游是過濾器(5)，過濾器(5)阻止不需要的物質(zhì)通過。在一些情況下，通過使用去污劑可以促進裂解，這應(yīng)當不影響下游的免疫親和步驟。適合適的溫和的非離子去污劑是本領(lǐng)域公知的，包括基于聚氧乙烯的去污劑(例如Triton X-100和X-114、NonidetP40和Brij系列)和正辛基α-D-吡喃葡糖苷。
接下來是免疫親和模塊(module)(6)，其中一種或幾種細菌生物標記(如果吸附液中存在的話)被分離。在模塊(6)中有一種或幾種對所述生物標記有特異性的固定化抗體。裂解液中的生物標記在經(jīng)過時被結(jié)合，余下的液體經(jīng)過后被丟棄。這一步驟不僅分離了相關(guān)的生物標記，而且把它們從可能非常稀的裂解液中有效地濃縮。在裂解液洗滌之后，可以向單元中少量的洗脫緩沖液，以除下結(jié)合的生物標記。
釋放的生物標記被輸送到脫鹽裝置(8)，在將它們送入離子井質(zhì)譜(10)之前，將它們脫鹽，在離子井質(zhì)譜(10)中確定它們的單獨的分子量。將得到的分子量的組合與一定范圍的細菌中相關(guān)生物標記的分子量的數(shù)據(jù)庫進行對照，鑒定出匹配的結(jié)果。輸出的可以是特定的鑒定結(jié)果，或者簡單地告知操作者該區(qū)域“安全”還是“不安全”，以便采取所需的保護措施。
如果分子標記蛋白對于單獨分析而言太大，洗脫的蛋白可以通過酶解裝置(12)送入脫鹽裝置(8)，在酶解裝置中，蛋白在氨基酸序列中的可預測位點被切割，分析得到的肽。當與預測的肽的數(shù)據(jù)庫比較時，產(chǎn)生的肽分子量的模式是診斷性的(見實施例3)實施例2 利用Hsp60作為生物標記來鑒定潛在的病原菌從多種生物體中獲得的Hsp60的平均分子量可以通過已知的氨基酸序列高度準確地預測(根據(jù)存在同位素混合物修正)或者用合適的純化的重組蛋白直接測量。雖然Hsp60在很多物種(不僅是細菌)中具有高度的保守性，質(zhì)譜分析可以高度準確地測定分子量，能夠區(qū)分只有三個分子量單位差別的蛋白分子。將這些測量值和已知值數(shù)據(jù)庫進行比較就可以鑒定有關(guān)物種，如表1所示。
表1

圖2所示的是多種生物體的Hsp60分子量的圖示比較，表明很多的物種可以單純地根據(jù)它們的Hsp60分子量(由質(zhì)譜測出)鑒定出夾然而，為了減少其他蛋白的背景(background)(這些蛋白中或許有一些具有容易混淆的相似分子量)，優(yōu)選地進行相關(guān)生物標記的親和純化。對于Hsp60中，可以通過交叉反應(yīng)抗體從細胞裂解液中免疫親和純化蛋白。例如，單克隆抗體A57-E4(Affinity Bioreagents Inc)與許多潛在致病生物體的Hsp60中存在的線性表位RGIDKA結(jié)合，所述生物體包括百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydophila pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydophilapsittaci)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、肺炎克氏桿菌(Kebsiella pneumoniae)，嗜肺菌團菌(Legionellapneumophila)、腦膜炎奈色球菌(Neisseria meningitidis)、假單胞銅綠菌(Pseudomonas aeruginosa)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、耶爾森腸炎菌(Yersinia enterocolitica)。
因此，應(yīng)用這樣的抗體可以從很大范圍的潛在病原體中純化Hsp60，并鑒定所述病原體。該抗體與土拉熱氏弗朗西絲氏菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌的Hsp60蛋白的結(jié)合已通過標準的比色間接ELISA確認并定量，如圖3所示。
表2來自沙眼衣原體的Hsp60的胰蛋白酶水解肽圖譜平均分子量* 位置 肽序列4029.607503-543 SALESAASVAGLLLTTEALIAEIPEEKPAAAPAMPGAGMDY3791.379231-265 DFLPVLQQVAESGRPLLIIA EDIEGEALATLVVNR3183.553197-224 GYLSSYFATNPETQECVLED ALVLIYDK2717.020142-167 EIAQVATISANNDAEIGNLI AEAMEK2575.881395-420 VDDAQHATIAAVEEGILPGG GTALIR2462.838421-442 CIPTLEAFLPMLTNEDEQIGAR2333.760286-307 AMLEDIAILTGGQLISEELG MK2111.31384-104 AGDGTTTATVLAEAIYTEGL R1842.076181-196 GFETVLDIVEGMNFNR1723.935484-499 DAYTDMLEAGILDPAK1379.617462-473 EGAIIFQQVMSR1309.430327-338 EDTTIVEGMGEK1287.279351-361 QIEDSSSDYDK1231.409105-116 NVTAGANPMDLK1174.400308-318 LENANLAMLGK1145.33665-74HENMGAQMVK1096.141474-483 SANEGYDALR1074.271133-141 ISKPVQHHK1049.227380-389 VGAATEIEMK1048.138171-180 NGSITVEEAK951.067 42-50SFGSPQVTK872.055 371-379 LSGGVAVIR828.987 125-131 VVVDQIR803.887 58-64EVELADK781.800 7-12 YNEEAR772.879 454-461 QIAANAGK731.867 21-27TLAEAVK719.775 277-283 APGFGDR710.851 36-41HVVIDK699.868 447-453 ALSAPLK689.786 51-57DGVTVAK688.758 339-344 EALEAR614.762 28-33VTLGPK579.689 345-349 CESIK

533.602 75-79VCAVK517.646 226-230 ISGIK排除分子量小于500的肽。
*平均同位素修正分子量(M+H)
表3來自肺炎衣原體的Hsp60的胰蛋白酶水解肽圖譜平均分子量* 位置 肽序列3805.406232-266DFLPVLQQVAESGRPLLIIAEEIEGEALATLVVNR3213.580198-225GYLSSYFSTNPETQECVLED ALILIYDK2722.019143-168EIAQVATISANNDSEIGNLI AEAMEK2728.109504-530SALESAASIAGLLLTTEALI ADIPEEK2561.854396-421VDDAQHATIAAVEEGILPGG GTALVR2405.786422-443CIPTLEAFLPMLANEDEAIG TR2319.733287-308AMLEDIAILTGGQLVSEELG MK2097.28685-105 AGDGTTTATVLAEAIYSEGL R1957.147328-345EDTTIVEGLGNKPDQAR1828.049182-197GFETVLDVVEGMNFNR1739.934485-500DAYTDMIDAGILDPTK1372.507531 544SSSAPAMPSAGMDY

1231.409106-117NVTAGANPMDLK1191.428309-319LENTTLAMLGK1145.33666-75 HENMGAQMVK1096.141475-484SANEGYDALR1074.271134-142ISKPVQHHK1049.227381-390VGAATEIEMK951.067 43-51 NGSITVEEAK875.951 59-65 EIELEDK872.055 372-380LSGGVAVIR801.958 126-132VVVDELK788.878 455-62 QIASNAGK781.800 8-13 YNEEAR731.867 22-28 TLAEAVK719.775 278-284APGFGDR713.895 448-454ALTAPLK710.851 37-42 HVVIDK689.786 52-58 DGVTVAK614.762 29-34 VTLGPK592.687 346-350CDNIK559.726 323-327VIVTK545.616 365-368LQER533.602 76-80 EVASK519.680 273-277VCAVK517.646 227-231ISGIK排除分子量小于500的肽。
*平均同位素修正分子量(M+H)實施例3 通過胰蛋白酶消化得到來源于Hsp60的Hsp60肽圖譜如表2和表3所示，具有相似總分子量的密切相關(guān)的Hsp60蛋白的酶解可以得到肽的區(qū)別模式(distinctive pattern)，可以通過質(zhì)譜分辨。胰蛋白酶在精氨酸和賴氨酸殘基的羧基-肽連接處切割肽(除非下一個殘基是脯氨酸)。在分子量精確度為0.01％的情況下，一些肽非常相似而難以識別(框內(nèi))。在其他情況下，一些非常短的肽具有相同的組成因此有相同的分子量，由切割還可以產(chǎn)生單一的游離氨基酸。即使如此，每一個肽組(set)構(gòu)成了獨特的指紋，所述指紋是產(chǎn)生所述肽的特定生物體的特征。
實施例4 布魯氏菌屬的布魯氏桿菌和表皮葡萄球菌的Arg-CHsp60肽的比較內(nèi)肽酶Arg-C(核菌蛋白酶)，如其名稱暗示的那樣，切割精氨酸的羧基-肽鍵。圖4是Arg-C消化布魯氏桿菌和表皮葡萄球菌Hsp60得到的肽指紋的圖示比較。如圖3所示，來自這些生物體的完整Hsp60蛋白的分子量是相似的(分別為57649和57529，包括N-末端蛋氨酸)。然而，獲得的肽組是非常不同的，表征了相關(guān)的生物體。
實施例5 用腺苷酸激酶作為診斷性生物標記圖5所示的是從不同微生物(細菌和原生動物寄生蟲Shistosomamansoni)中獲得的高度保守的胞內(nèi)酶-腺苷酸激酶-及人蛋白的分子量的比較。腺苷酸激酶是一種核苷單磷酸激酶，它可以催化腺苷單磷酸、二磷酸和三磷酸之間的可逆的磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。該酶在多種細胞代謝過程所需的核苷合成，以及RNA和DNA的合成方面起著十分重要的作用。腺苷酸激酶滿足本發(fā)明的可用的生物標記的標準，因為它在物種之間具有高度的保守性而，并且每一個物種都具有可以通過分子量區(qū)分的獨特的蛋白。它也是一致性地表達的，并且是代謝所必需的。
實施例6 通過電噴射質(zhì)譜測量完整Hsp60生物標記的分子量，從而鑒定大腸桿菌為了表明本發(fā)明的實用性，用抗Hsp60免疫親和柱和電噴射質(zhì)譜鑒定細菌，具體如下方法抗體柱的制備在與柱結(jié)合之前，配體(單克隆抗體A57-E4，Affinity BioreagentsInc)經(jīng)過0.2M碳酸氫鈉，0.5M氯化鈉，pH8.3的緩沖液(偶聯(lián)緩沖液)透析。最佳體積為1毫升，最佳濃度為1至10mg/ml。
使用在Fast Flow Hi-Trap柱中的1毫升NHS活化的Sepharose 4(Pharmacia Biotech)。用3×2毫升的1mM的鹽酸清洗柱，除去存儲液(異丙醇)，保持流速低于兩秒鐘1滴，以避免擠壓基質(zhì)。向柱中注入配體溶液并在室溫下溫育30分鐘。通過用0.5M的乙醇胺，0.5M的氯化鈉，pH8.3(緩沖液A)和0.1M的乙酸鹽，0.5M的氯化鈉，pH4.0(緩沖液B)交替清洗來清洗柱并使柱失活(3×2毫升的緩沖液A，3×2毫升的緩沖液B，然后是3×2毫升的緩沖液A)。然后用含有0.1％(w/v)疊氮鈉的磷酸緩沖液平衡并保存柱子。
樣品的純化方法所有的樣品都在AKTA prime system(Pharmacia Biotech)中經(jīng)過NHS活化柱。在20mM，pH7.5的磷酸鈉中上樣，并用3M尿素，在pH8.0或pH2.0下洗脫。1毫升的樣品通過樣品環(huán)加入柱中，用5毫升的磷酸緩沖液洗去雜質(zhì)。用6毫升的洗脫緩沖液過柱，第一個1毫升的緩沖液作為廢液丟掉，收集隨后的2毫升用于電噴射質(zhì)譜分析。通過用4毫升的磷酸緩沖液，然后用10毫升的3M尿素，再用10毫升磷酸緩沖液清洗使柱得以再生，用于下一樣品。所有步驟的流速是1ml/min。
質(zhì)譜實驗方法免疫親和柱的洗脫液以2毫升的級分收集，在4℃下存儲過夜。將樣品注入2毫升的保持環(huán)(holding loop)中。將保持環(huán)中的內(nèi)容物在20％B(A＝0.1％溶于水的TFA，B＝0.1％溶于乙腈/水90/10(v/v)的TFA)中以1ml/min的流速加到C8 cartridge(Hichrom)內(nèi)。在洗去緩沖鹽后，將蛋白用90％B以25μl/min的流速洗脫到Quattro II型串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(Micromass，UK Ltd)中。以連續(xù)方式獲得數(shù)據(jù)。掃描范圍m/z 700-2000，每次掃描5秒。毛細管(capillary)電壓是3千伏，錐體電壓是在掃描的m/z范圍內(nèi)從33伏到74伏。源溫度是80℃，LMRes和HM Res被設(shè)為15.5。來自cartridge的洗脫峰大約持續(xù)1分鐘。用馬心肌紅蛋白校準儀器。
結(jié)果抗體與Hsp60生物標記的交叉反應(yīng)如圖6所示，標準的結(jié)合測試表明來自一些細菌種類的Hsp60與單克隆抗體交叉反應(yīng)，所述單克隆抗體抗沙眼衣原體Hsp60，并結(jié)合保守表位(RGIDKA)。結(jié)合曲線表明這樣的抗體適用于從一定范圍的細菌種類中免疫純化Hsp60生物標記。
通過分子量鑒定大腸桿菌Hsp60 K12圖7顯示了從用細菌蛋白上樣的抗Hsp60免疫親和柱的洗脫液中檢測的質(zhì)譜。標明的分子量峰57203.1±1.8Da與Burland等1995年報道的大腸桿菌K12變異體的Hsp60匹配。標準的大腸桿菌Hsp60分子量，如Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫登錄號P06130中詳細給出的，是57137Da。然而，Burland等報道的變異體有兩個突變A261L和I266M，給出的預期分子量是57197。這在儀器的已知分子量精度(±0.01％)范圍內(nèi)，使得不僅可以明確地鑒定生物體，而且能鑒定單獨的菌株和突變體。
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權(quán)利要求
1.一種生物標記，其特征在于來源于至少兩個微生物屬的大多數(shù)種的所述生物標記的種同系物是結(jié)構(gòu)上基本相似的，結(jié)構(gòu)上的相似性使得可以從不同種的微生物中分離出所述生物標記，來源于所述屬中各種微生物的生物標記具有獨特的分子量。
2.權(quán)利要求1的生物標記，其特征在于它是一種蛋白，所述結(jié)構(gòu)相似性在于氨基酸序列基本相似。
3.權(quán)利要求1或2的生物標記，其特征在于所述微生物是細菌。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的生物標記，其特征在于至少三個種同系物具有至少一個共同的表位，使得可以通過免疫親和層析分離。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的生物標記，其特征在于它是熱激蛋白。
6.權(quán)利要求6的生物標記，它是Hsp60。
7.權(quán)利要求1-4中任一項的生物標記，其特征在于它是腺苷酸激酶。
8.一種鑒定微生物的方法，其包括a.鑒定一種生物標記，其特征在于，來源于至少兩個微生物屬的大多數(shù)種的所述生物標記的種同系物是結(jié)構(gòu)上基本相似的，結(jié)構(gòu)上的相似性使得可以從不同種的微生物中分離出所述生物標記，來源于所述屬中各種微生物的生物標記具有獨特的分子量；b.通過針對結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域進行親和層析分離所述生物標記；c.通過質(zhì)譜測量所述生物標記的分子量，以及d.參照數(shù)據(jù)庫分析獲得的分子量數(shù)據(jù)組合，由此推斷存在的微生物的種類。
9.權(quán)利要求8的鑒定微生物的方法，其特征在于所述生物標記是從細胞裂解物中分離的。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中生物標記是通過免疫親和層析分離的。
11.權(quán)利要求10的方法，其中固定化抗體特異性地結(jié)合標記分子上存在的交叉反應(yīng)表位，所述標記分子來源于不同的微生物物種。
12.權(quán)利要求8-11中任一項的方法，其特征在于以下附加步驟在通過質(zhì)譜測定分子量之前，將分離的生物標記切割成確定的片段。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述生物標記的切割是通過酶解完成的。
14.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中生物標記或其片段的分子量是通過離子井質(zhì)譜測量的。
15.一種鑒定大分子毒素的方法，其包括a.通過親和層析分離一種或幾種毒素；b.通過質(zhì)譜測量所述毒素的分子量；以及c.參照數(shù)據(jù)庫分析所得的分子量數(shù)據(jù)組合，由此推斷存在的毒素的身份。
16.一種自動進行上述權(quán)利要求中任一項的方法的設(shè)備，其包括a.分離生物標記或毒素的裝置；b.包括能夠測定生物標記或毒素的分子量的質(zhì)譜的單元；c.能夠?qū)⒌玫降臄?shù)據(jù)與已知的分子量數(shù)據(jù)庫匹配，由此推斷微生物或毒素身份的數(shù)據(jù)處理裝置。
17.權(quán)利要求11的設(shè)備，其特征在于它還包括一個單元，所述單元包括一種或者固定化的能夠切割所述生物標記的蛋白水解酶。
全文摘要
一種通過生物標記的質(zhì)譜快速鑒定未知微生物的方法，所述生物標記分離自微生物的裂解物，所述方法基于生物標記在物種之間的結(jié)構(gòu)上的相似性。本發(fā)明也公開了所述生物標記，特別是Hsp60。
文檔編號G01N27/62GK1535380SQ02814880
公開日2004年10月6日 申請日期2002年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月22日
發(fā)明者R·W·蒂特巴爾, D·德斯佩羅克斯, R W 蒂特巴爾, 古迓蘅慫 申請人:英國國防部