專利名稱：胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及單克隆抗體制備方法，尤其是關(guān)于胸腺肽α1的單克隆抗體制備方法，具體涉及胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法及用途。
近年國外學者將胸腺肽提純?yōu)閹追N單獨成分，發(fā)現(xiàn)其中胸腺肽α1的生物學活性比胸腺肽混合物活性高10～1000倍。胸腺肽α1屬于胸腺肽第五組分，具有免疫調(diào)節(jié)作用，在體外可以促進致敏細胞生成淋巴因子，如a-IFN，r-INF，IL-2；增強細胞因子高親和力受體的表達；調(diào)控骨髓前體細胞和脾細胞的末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)活性；增強骨髓前體細胞的Thy 1和Lyt1，2，3的表達；加速NK細胞的生成，促進NK細胞的活性；通過增強輔助T細胞的活性可以促進混合淋巴細胞的反應；拮抗胸腺細胞成熟過程中的凋亡。體內(nèi)應用結(jié)果也表明其在T細胞發(fā)育和功能重建中具有重要意義；可促進淋巴細胞分泌IL-2和IL-2受體的表達；增強宿主的抗感染能力；促進病毒清除；增強免疫功能；有抗氧化、抑制癌細胞生長等重要作用；臨床上常應用于治療腫瘤，抗病毒及免疫缺陷病人的輔助治療，并可作為疫苗增強劑使用。Chien等用胸腺肽α1治療慢性乙型肝炎患者，其HBV DNA血清清除率和HBeAg陰轉(zhuǎn)率高于未用胸腺肽α1治療對照組，且病理學檢查亦發(fā)現(xiàn)治療組炎癥及纖維生成情況均顯著低于對照組。在治療肝纖維化方面胸腺肽α1也有獨到之處。目前發(fā)現(xiàn)對肝纖維化只有IFN有一定療效，但其存在低反應性和劑量限制等缺點，Sherman等將IFN和α1合用，治療慢性丙型肝炎，隨機分組，雙盲對照，觀察到合用組各項檢測指標均優(yōu)于單用IFN組和未處理對照組，其中HCV RNA清除率為37.1％，明顯高于單用IFN組的18.9％。胸腺肽α1對肝癌也有治療作用，Stefanini等用它治療了12例肝癌患者，發(fā)現(xiàn)其存活期顯著延長。
胸腺肽α1的抗腫瘤和抗炎癥作用十分明顯，但是，胸腺肽α1作用機理至今尚未清楚，胸腺肽α1在不同的人體內(nèi)含量有何不同，它是如何進入細胞，在胞內(nèi)如何作用的等問題有待進一步研究。而胸腺肽α1單克隆抗體的缺乏嚴重制約了這方面的研究進展。
本發(fā)明胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法包含以下步驟(1)制備抗原采用戊二醛交聯(lián)法將胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交聯(lián)，交聯(lián)物用透析袋透析，測定蛋白質(zhì)濃度。
(2)免疫小鼠取10周齡BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1∽0.3ug胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏完全佐劑乳化，腹腔注射，再分別間隔20-40天用胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏不完全佐劑乳化，同樣腹腔注射做第二次免疫和第三次免疫。并于融合前2-4天加倍量抗原尾靜脈加強免疫。
(3)細胞融合、克隆化培養(yǎng)按常規(guī)免疫取1×108免疫小鼠脾細胞和1×107處于對數(shù)生長期FO小鼠骨髓瘤細胞，在聚乙二醇作用下融合，在小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基下培養(yǎng)，經(jīng)過三次抗體陽性篩選后擴大培養(yǎng)，并以1×106/ml細胞，0.5ml/只腹腔注射誘生腹水產(chǎn)生。
(4)抗體檢測和特異性鑒定采用ELISA間接法，Western免疫印跡法等方法對所得到的胸腺肽α1單克隆抗體進行鑒定，并用單克隆抗體Ig亞類鑒定法證實所表達單克隆抗體Ig亞類為IgG2b。
本發(fā)明的另一個目的是利用獲得的胸腺肽α1單克隆抗體，制備成多種檢測試劑，包括ELISA試劑盒、放免試劑盒等，用于研究胸腺肽α1作用機理以及胸腺肽α1表達水平的檢測。
本發(fā)明有兩個顯著特點1.本發(fā)明制備的單克隆抗體是針對胸腺肽α1 28肽的單克隆抗體；2.利用本發(fā)明可以獲得大量純的胸腺肽α1單克隆抗體。
實施例1本發(fā)明涉及到的胸腺肽α1單克隆抗體的一個制備方法(1)制備抗原采用戊二醛交聯(lián)法將胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交聯(lián)，交聯(lián)物用透析袋透析，測定蛋白質(zhì)濃度。
(2)免疫小鼠取10周齡BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1ug胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏完全佐劑乳化，腹腔注射，每只小鼠0.2ml，再分別間隔一個月用胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏不完全佐劑乳化，同樣劑量腹腔注射，做第二次免疫和第三次免疫。并于融合前3天加倍量抗原尾靜脈加強免疫。
(3)細胞融合、克隆化培養(yǎng)按常規(guī)免疫取1×108免疫小鼠脾細胞和1×107處于對數(shù)生長期FO小鼠骨髓瘤細胞，在50％聚乙二醇(PEG，MW 4000，Sigma)作用下融合，在20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基下培養(yǎng)，經(jīng)過三次100％抗體陽性篩選后擴大培養(yǎng)，并以1×106/ml細胞，0.5ml/只腹腔注射誘生腹水產(chǎn)生。
(4)抗體檢測和特異性鑒定采用ELISA間接法，Western免疫印跡法等方法對所得到的胸腺肽α1單克隆抗體進行鑒定，并用單克隆抗體Ig亞類鑒定法證實所表達單克隆抗體Ig亞類為IgG2b。
實施例2胸腺肽α1單克隆抗體的幾個應用應用該發(fā)明技術(shù)，獲得的胸腺肽α1單克隆抗體，可以制備成ELISA試劑盒，放免試劑盒等，用于檢測人外周血中胸腺肽α1的含量；也可用于研究胸腺肽α1的作用機理等，評價胸腺肽α1治療流行性感冒，慢性肝炎，免疫功能低下，惡性腫瘤等疾病的療效，具有極大的社會效益和經(jīng)濟效益。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻[1]Goldstein A L，Low TL，McAdoo M，et al.Thymosin alphalisolationand sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide[j].Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)725[2]傅華林，甘人寶。胸腺素α1及其臨床應用。生命的化學1997，1743-45[3]Garaci E，Pica-F，Mastino A，et al.Combination treatment withzidovudine thymosin alpha 1 and interferon-alpha in humanimmunodeficiency virus infection.Int J Immunother 1993，13(1)7[4]Korba BE，Tennant BC，Cote PJ，et al.Treatment of chronic woodchackhepatitis virus infection with thymosin alpha 1[J].Hepatology，1990，12880[5]Stefanini G F，F(xiàn)aschi F G，Castelli E，et al.Thymosin a1 andtranscatheter aterial chemombolization in hepatocellular carcinomapatientsa preliminary experience.Hepatogastroenterology 1998，45209-215[6]Frederick E，Weller，Milton G，et al.Mi croELISA method for measuementof human serum thymosin a1.Journal of Immunological Methods 1985，80，45-53[7]Genevieve S，Incefy，Kazumi Ishimura.A radioimmunoassay for thymosinalphal-1.Journal of Immunological Methods 1986，87，9-17[8]Baumann C A，Badanchian M，Goldstein A L.Thymosin a1.antagonizesdexamethasune and CD3-induced apoptosis of CD4+，CD8+thymocytes throughthe activation of cAMP and protein kinase C dependent second messengerpathways.Mech Aging Dev 1997；9485-101[9]梁喆，王德堂，米力，等，系列雜色法分析人-(人-鼠)雜交瘤C8的染色體。第四軍醫(yī)大學學報，1994，158[10]Andreakos E，Taylor PC，F(xiàn)eldmann M.Monoclonal antibodies in immuneand inflammatory diseases.Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)615-20[11]Ando T，Latif R，Pritsker A，et al.A monoclonal thyroid-stimulatingantibody.J Clin Invest.2002 Dec；110(11)1667-74.
權(quán)利要求
1.一種胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法及用途，其特征是由胸腺肽α1合成肽純品免疫的Balb/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的融合細胞所表達，獲得胸腺肽α1單克隆抗體，利用獲得的胸腺肽α1單克隆抗體可制備多種檢測試劑，用于研究胸腺肽α1作用機理以及胸腺肽α1表達水平的檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法，其特征是該方法包含以下步驟(1)制備抗原采用戊二醛交聯(lián)法將胸腺肽α1合成肽和牛血清白蛋白交聯(lián)，交聯(lián)物用透析袋透析，測定蛋白質(zhì)濃度。(2)免疫小鼠取BALB/C小鼠，第一次免疫用0.1∽0.3ug胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏完全佐劑乳化，再分別間隔20-40天用胸腺肽α1交聯(lián)物和福氏不完全佐劑乳化，做第二次免疫和第三次免疫，并于融合前2-4天加倍量抗原加強免疫。(3)細胞融合、克隆化培養(yǎng)按常規(guī)免疫取免疫小鼠脾細胞和處于對數(shù)生長期FO小鼠骨髓瘤細胞，在聚乙二醇作用下融合，在小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基下培養(yǎng)，經(jīng)過三次抗體陽性篩選后擴大培養(yǎng)，腹腔注射誘生腹水產(chǎn)生。(4)抗體檢測和特異性鑒定采用ELISA間接法，Western免疫印跡法等方法對所得到的胸腺肽α1單克隆抗體進行鑒定，并用單克隆抗體Ig亞類鑒定法證實所表達單克隆抗體Ig亞類為IgG2b。
3.如權(quán)利要求1所述的胸腺肽α1單克隆抗體的用途，其特征是用本發(fā)明獲得的胸腺肽α1單克隆抗體，可制備成包括ELISA試劑盒、放免試劑盒等檢測試劑，用于研究胸腺肽α1作用機理以及胸腺肽α1表達水平的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種胸腺肽α1單克隆抗體的制備方法及用途，是由胸腺肽α1合成肽純品免疫的Balb/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的融合細胞表達獲得胸腺肽α1單克隆抗體，用該方法獲得的胸腺肽α1單克隆抗體，可制備成多種檢測試劑，用于研究胸腺肽α1作用機理以及胸腺肽α1表達水平的檢測。
文檔編號G01N33/577GK1424327SQ02159878
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者陳智, 陳 峰 申請人:浙江大學