專利名稱：急性心肌梗塞早期診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)的抗體(包括單抗和多抗)的制備、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)及利用抗心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的抗體來早期診斷急性心肌梗塞(AMI)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種急性心肌梗塞早期診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
急性心肌梗塞已成為嚴(yán)重影響人類健康的心血管疾病，但目前對(duì)于此病的治療效果卻不夠理想，其中的一個(gè)主要原因是不能在AMI發(fā)作早期作出正確的診斷，以至于不能采取適當(dāng)?shù)闹委煼桨?。約有50％的AMI患者在發(fā)病的前2小時(shí)內(nèi)死亡，所以如果能在AMI發(fā)作早期作出正確的診斷，將大大改善治療效果及提高治愈率。診斷AMI主要靠心電圖檢查和生化指標(biāo)測(cè)定，但心電圖檢查的準(zhǔn)確率只有50％左右，世界上有差不多30％的心臟病患者就是因?yàn)樾碾妶D正常而沒有得到準(zhǔn)確的診斷，從而延誤了治療；目前用于臨床診斷AMI的生化指標(biāo)也不夠理想，它們主要有肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(troponin I)、肌鈣蛋白T(troponin T)和肌紅蛋白(myoglobin)等，CK-MB、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T對(duì)AMI的早期診斷缺乏敏感性，它們?cè)谛赝春?-8小時(shí)才濃度上升；而肌紅蛋白則缺乏特異性，它雖然在胸痛后2-3小時(shí)濃度上升，但對(duì)骨骼肌和心肌損傷不能區(qū)分，所以迫切需要一種新的高特異性和高敏感性的生化指標(biāo)來早期診斷AMI。大量研究表明，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)在AMI發(fā)作后2小時(shí)內(nèi)濃度開始上升，而且專一于心肌的損傷，對(duì)于早期診斷AMI具有高的特異性和敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種利用h-FABP及抗h-FABP的單抗和多抗作為AMI早期診斷的生化指標(biāo)、簡(jiǎn)便易得的試劑盒，來測(cè)定人血清中的h-FABP的濃度，以用來早期診斷AMI，提高AMI早期診斷的敏感性和特異性。
技術(shù)方案本發(fā)明的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)h-FABP；抗h-FABP的單克隆抗體；抗h-FABP的多克隆抗體；二抗標(biāo)記物；封閉液；酶底物溶液；包被緩沖液；終止液；洗滌液；酶標(biāo)板；其中抗h-FABP的多克隆抗體包被于酶標(biāo)板。
所述h-FABP標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用基因工程方法制成從心臟組織中利用RT-PCR的方法克隆h-FABP基因，將其插入到載體pET22b(+)上，經(jīng)測(cè)序確證基因正確后轉(zhuǎn)入到E.coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)的h-FABP利用Ni-Agarose親和層析柱分離純化。
所述抗h-FABP多抗用純化的h-FABP免疫兔子，得到含有抗h-FABP抗體的兔血清；先用(NH4)2SO4沉淀法從兔的血清中初步純化免疫球蛋白IgG，再用自制的h-FABP-Sepharose親和層析柱進(jìn)一步純化抗h-FABP的IgG，SDS-PAGE及western blotting鑒定分離純化的多抗。
所述抗h-FABP單抗用純化的h-FABP免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63-Ag8.653；利用HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞，并利用ELISA方法鑒定產(chǎn)生抗h-FABP抗體的細(xì)胞；保存所篩選到的產(chǎn)生與h-FABP高特異性結(jié)合的單抗的細(xì)胞株；利用細(xì)胞發(fā)酵裝置培養(yǎng)所保存的細(xì)胞株，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，先用(NH4)2SO4沉淀法從細(xì)胞培養(yǎng)上清中初步純化抗h-FABP的單抗，再利用Protein A-Sepharose親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中進(jìn)一步純化抗h-FABP的單抗，SDS-PAGE及westernblotting鑒定分離純化的單抗。
所述封閉液為1％白明膠溶液；所述酶底物溶液為TMB應(yīng)用液，即60ug/mlTMB，0.045％H2O2于0.1M pH6.0磷酸鹽緩沖液中；包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，即1升溶液中含1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3；終止液為2mol/L H2SO4溶液；洗滌液為0.01mol/L pH7.4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)，PBS內(nèi)含0.05％Tween-20，即1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5ml Tween-20。
發(fā)明原理及積極效果分析本發(fā)明是以h-FABP作為生化指標(biāo)，來早期診斷AMI。這包括制備上述h-FABP的多抗和單抗的方法，以及利用ELISA方法測(cè)定血清中的h-FABP的濃度，以診斷AMI。
本發(fā)明利用抗h-FABP的單抗和多抗，其中利用多抗作為第一抗體，即包被抗體，這減少了實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)并簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工序，卻達(dá)到了與利用兩種單抗至少相同的效果；同時(shí)，我們利用基因工程的方法得到h-FABP，以作為抗原，這取代了從病人心肌中提取的方法，材料易得而且操作簡(jiǎn)單。利用h-FABP作為AMI早期診斷的生化指標(biāo)，提高了AMI早期診斷的敏感性和特異性。
本發(fā)明的方法利用制備的抗h-FABP的多抗和單抗，能在胸痛后2小時(shí)內(nèi)就可診斷出急性心肌梗塞，具有較高的特異性和敏感性，克服了目前所用于臨床的其他生化指標(biāo)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1)h-FABP的表達(dá)及純化將h-FABP基因克隆到表達(dá)載體pET22b(+)上并轉(zhuǎn)入到E.coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，h-FABP在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)；利用Ni-Agarose親和層析柱從E.coli的裂解液中分離純化h-FABP，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在18kD處有一條蛋白條帶(圖1)；利用抗h-FABP的抗體進(jìn)行免疫雜交，發(fā)現(xiàn)只在18kD處有一條雜交條帶(圖2)，這表明所得到的蛋白為h-FABP。心臟中h-FABP是15kD的小分子，本發(fā)明在E.coli中所表達(dá)、純化的h-FABP為18kD，這是由于其N端帶有一段信號(hào)肽，C端有6xHis-tag，這兩段序列是表達(dá)載體pET22b(+)所帶有的，而血清中的h-FABP則不具有此序列，但由于本發(fā)明分離純化的抗h-FABP的抗體所特異的抗原決定簇是序列抗原決定簇，所以這種重組的h-FABP和抗體的結(jié)合與血清中的h-FABP和抗體的結(jié)合相一致，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明利用基因工程的方法制備h-FABP，從而取代了從心肌中分離純化h-FABP的的方法，這不僅取材容易，而且簡(jiǎn)化了操作過程，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)耗資。
2)抗h-FABP的抗體的制備及純化i)抗h-FABP的單抗的制備及純化 本發(fā)明制備了高特異性和親和力的單抗IgG，并且利用(NH4)2SO4沉淀法和Protein A-Sepharose親和層析柱從雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離純化得到純的抗h-FABP的抗體，SDS-PAGE鑒定，在55kD及24kD處有兩條蛋白條帶，即為IgG的重鏈和輕鏈；同時(shí)，經(jīng)WesternBlotting鑒定，該IgG能夠與h-FABP雜交，這說明分離純化所得到的IgG是特異于h-FABP的抗體。
ii)抗h-FABP的多抗的制備及純化 本發(fā)明制備了高效價(jià)的多抗，并且利用(NH4)2SO4沉淀法和h-FABP-Sepharose親和層析柱從兔的血清中分離純化出了高特異性和親和力的抗h-FABP的抗體，SDS-PAGE鑒定，在55kD及24kD處有兩條蛋白條帶，即為IgG的重鏈和輕鏈；同時(shí)，經(jīng)Western Blotting鑒定，該IgG能夠與h-FABP雜交，這說明分離純化所得到的IgG是特異于h-FABP的抗體。
3)ELISA 檢測(cè)不同血樣中h-FABP的濃度，以診斷AMI利用所制備的抗h-FABP的多抗和單抗，采用三明治式ELISA方法，測(cè)定不同血清中的h-FABP的濃度。共檢測(cè)了126名正常人、41名冠心病患者及33名AMI患者的血清中h-FABP的濃度，并且AMI患者的血樣是從發(fā)病后1小時(shí)到24小時(shí)，平均每2小時(shí)取一次血。由測(cè)量結(jié)果可見，1)AMI患者血清中h-FABP在2小時(shí)內(nèi)開始上升，5-6小時(shí)內(nèi)達(dá)到最高值，12-24小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到正常水平(見圖3)；2)正常人和冠心病患者血清中的h-FABP濃度相近，并且明顯低于AMI患者的h-FABP濃度(見表1)；3)根據(jù)正常人血清中的h-FABP濃度，利用平均值+2倍方差的算法，求得以h-FABP作為AMI診斷生化指標(biāo)的截?cái)嘀?cut off value)是7.543ng/ml。另外，本發(fā)明以多抗作為第一抗體，以單抗作為第二抗體，這取得了與國(guó)外所報(bào)道的利用兩種單抗的方法相同甚至更好的效果，但本發(fā)明的方法卻簡(jiǎn)單、易行，耗資少。
表1正常人、冠心病患者和AMI患者血清中h-FABP的平均濃度值

注每份樣品都測(cè)三次.取平均值


圖1 SDS-PAGE(12％)鑒定h-FABP的表達(dá)、純化狀況示意圖1.蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是97 000Da，66 000Da，43000 Da，31 000Da，20 100Da，14 400Da。
2.經(jīng)Ni-Agarose親合層析柱分離純化后的h-FABP樣品圖2 Western-Blotting進(jìn)一步鑒定h-FABP的表達(dá)、純化狀況示意圖1.蛋白質(zhì)分子量marker，從大到小分子量分別是97 000Da，66 000Da，43 000Da，31 000Da，20 100Da，14 400Da。
2.經(jīng)Ni-Agarose親合層析柱分離純化后的h-FABP樣品圖3 AMI患者在發(fā)病后不同時(shí)間血清中h-FABP的濃度變化注圖中的數(shù)值是33名AMI患者的h-FABP濃度值的平均值實(shí)施方案1.克隆、表達(dá)、純化及鑒定h-FABP從Gene Bank搜索人的h-FABP基因，根據(jù)所搜索到的基因序列設(shè)計(jì)引物為5′-AGCTGGATCCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC-3′5′-CTAGGAATTCTGCCTCTTTCTCATAAGTGCG-3′然后從心臟組織中利用RT-PCR的方法克隆h-FABP基因，通過常規(guī)的酶切、連接等分子生物學(xué)操作將所得到的h-FABP基因插入到載體pET22b(+)上，經(jīng)測(cè)序確證基因正確后，得到重組的原核表達(dá)載體pET22b(+)-hFABP，利用CaCl2轉(zhuǎn)化的方法將此重組載體轉(zhuǎn)入到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的h-FABP利用Ni-Agarose親和層析柱分離純化，SDS-PAGE及western blotting鑒定分離純化的h-FABP。
2.制備、純化及鑒定抗h-FABP的抗體i)制備、純化及鑒定抗h-FABP的單抗用純化的h-FABP利用腹腔注射方法免疫BALB/c小鼠，每隔三周免疫一次，共免疫四次；然后取出免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，利用PEG-4000融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63-Ag8.653；利用HAT選擇培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上選擇雜交瘤細(xì)胞，并利用ELISA方法鑒定產(chǎn)生抗h-FABP抗體的細(xì)胞；保存所篩選到的產(chǎn)生與h-FABP高特異性結(jié)合的單抗的細(xì)胞株；利用細(xì)胞發(fā)酵裝置培養(yǎng)所保存的細(xì)胞株，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，先用(NH4)2SO4沉淀法從細(xì)胞培養(yǎng)上清中初步純化抗h-FABP的單抗，再利用Protein A-Sepharose親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中進(jìn)一步純化抗h-FABP的單抗，SDS-PAGE及western blotting鑒定分離純化的單抗。
ii)制備、純化及鑒定抗h-FABP的多抗用純化的h-FABP免疫兔子，免疫兩次，間隔一個(gè)月；取兔的全血。先用(NH4)2SO4沉淀法從兔的血清中初步純化免疫球蛋白IgG，再用自制的h-FABP-Sepharose親和層析柱進(jìn)一步純化抗h-FABP的IgG，SDS-PAGE及western blotting鑒定分離純化的多抗。
3.ELISA測(cè)定血清中的h-FABP濃度，以診斷AMI1)各種緩沖液及試劑的配制方法i)包被緩沖液0.05M pH9.6的Na2CO3-NaHCO3
Na2CO3(MW 105.99) 1.59克NaHCO3(MW 84.01) 2.93克蒸餾水溶至1000mlii) 洗滌液pH7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW 58.44) 8.0克KH2PO4(MW 136.09) 0.2克Na2HPO4·12H2O(MW 358.14) 2.9克(或者NaHPO41.14克)KCl(MW 74.56) 0.2克Tween 200.5ml蒸餾水溶至1000mliii) 封閉液1％白明膠溶液白明膠 1克洗滌液溶至100mliv) 酶底物溶液TMB(3，3’，5，5’四甲替聯(lián)苯胺)應(yīng)用液a.0.1M pH6.0磷酸鹽緩沖液NaHPO4·2H2O1.09克NaH2PO4·H2O 6.05克蒸餾水溶至500mlb.TMB貯液TMB 60毫克DMSO溶至10ml4℃貯存c.TMB應(yīng)用液磷酸鹽緩沖液 10mlTMB貯液 100ul30％H2O215ul(臨用前現(xiàn)配)v)終止液2M H2SO4濃硫酸(95％-98％)22.2ml
蒸餾水 177.3ml(配時(shí)將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊混勻)2)操作步驟i)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線將純化的抗h-FABP多抗溶液用包被液稀釋到1ug/ml，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100ul，37℃包被2小時(shí)或4℃過夜；洗滌液洗板3次，甩干，加入1％白明膠封閉，每孔200ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入不同濃度的h-FABP(0-20ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)抗原，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入抗h-FABP單抗溶液(用洗滌液稀釋到1ug/ml)，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入二抗溶液(用洗滌液1∶1000稀釋)，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗處顯色5分鐘，加入終止液，每孔50ul，利用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定光吸收值(A450nm)；以濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)，A450nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ii)測(cè)定血清中的h-FABP濃度將純化的抗h-FABP多抗溶液用包被液稀釋到1ug/ml，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100ul，37℃包被2小時(shí)或4℃過夜；洗滌液洗板3次，甩干，加入1％白明膠封閉，每孔200ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入適當(dāng)倍數(shù)稀釋的血清，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入抗h-FABP單抗溶液(用洗滌液稀釋到1ug/ml)，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入二抗溶液(用洗滌液1∶1000稀釋)，每孔100ul，室溫保溫2小時(shí)；洗滌液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100ul，暗處顯色5分鐘，加入終止液，每孔50ul，利用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定光吸收值(A450nm)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由所測(cè)得的A450nm求得血清中h-FABP的濃度值。iii)結(jié)果判定根據(jù)h-FABP作為急性心肌梗塞診斷指標(biāo)的截?cái)嘀?cut off value)7.543ng/ml，濃度高于該值的可判定為急性心肌梗塞，低于該值的則不是急性心肌梗塞。
權(quán)利要求
1.一種急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)h-FABP蛋白；抗h-FABP的單克隆抗體；抗h-FABP的多克隆抗體；二抗標(biāo)記物；封閉液；酶底物溶液；包被緩沖液；終止液；洗滌液；酶標(biāo)板；其中抗h-FABP多抗包被于酶標(biāo)板。
2.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述h-FABP標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用基因工程方法制成從心臟組織中利用RT-PCR的方法克隆h-FABP基因，將其插入到載體pET22b(+)上，經(jīng)測(cè)序確證基因正確后轉(zhuǎn)入到E.coli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)的h-FABP利用Ni-Agarose親和層析柱分離純化。
3.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述抗h-FABP單抗用純化的h-FABP免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾臟細(xì)胞，融合該脾臟細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63-Ag8.653；利用HAT選擇培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞，并利用ELISA方法鑒定產(chǎn)生抗h-FABP抗體的細(xì)胞；保存所篩選到的產(chǎn)生與h-FABP高特異性結(jié)合的單抗的細(xì)胞株；利用細(xì)胞發(fā)酵裝置培養(yǎng)所保存的細(xì)胞株，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，先用(NH4)2SO4沉淀法從細(xì)胞培養(yǎng)上清中初步純化抗h-FABP的單抗，再利用Protein A-Sepharose親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中進(jìn)一步純化抗h-FABP的單抗，SDS-PAGE及western blotting鑒定分離純化的單抗。
4.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述抗h-FABP多抗用純化的h-FABP免疫兔子，得到含有抗h-FABP抗體的兔血清；先用(NH4)2SO4沉淀法從兔的血清中初步純化免疫球蛋白IgG，再用自制的h-FABP-Sepharose親和層析柱進(jìn)一步純化抗h-FABP的IgG，SDS-PAGE及westernblotting鑒定分離純化的多抗。
5.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述封閉液為1％白明膠溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述酶底物溶液為60ug/ml TMB，0.045％H2O2于0.1M pH6.0磷酸鹽緩沖液中。
7.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，即1升溶液中含1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3。
8.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。
9.如權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，其特征在于所述洗滌液為0.01mol/L pH7.4磷酸鹽-NaCl緩沖液，PBS內(nèi)含0.05％Tween-20，即1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5ml Tween-20。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種急性心肌梗塞早期診斷試劑盒，利用h－FABP作為AMI早期診斷的生化指標(biāo)，包括標(biāo)準(zhǔn)h－FABP蛋白；抗h－FABP的單克隆抗體；抗h－FABP的多克隆抗體；二抗標(biāo)記物；封閉液；酶底物溶液；包被緩沖液；終止液；洗滌液；酶標(biāo)板；其中抗h－FABP多抗包被于酶標(biāo)板。利用基因工程的方法得到h－FABP，以作為抗原，取代了從心肌中提取的方法，材料易得而且操作簡(jiǎn)單。利用抗h－FABP的多抗作為包被抗體，減少了實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)并簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工序，卻達(dá)到了與利用兩種單抗至少相同的效果；提高了AMI早期診斷的敏感性和特異性。可廣泛應(yīng)用于急性心肌梗塞的早期診斷。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1396453SQ0211744
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者謝雍, 胡美浩, 王顯花, 崔紅蓮 申請(qǐng)人:胡美浩, 謝雍