專利名稱：Dna-固定化基質的再使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA-固定化基質的再使用方法。
背景領域迄今，一種DNA診斷的基質已用作基因分析等的方法。DNA-固定化基質接受大量的DNA片段和寡核苷酸排列在其固相表面，且在生物化學、分子生物學和基因工程或醫(yī)學檢查中得到廣泛的注意，這使得它可能以迅速且簡化的方式來處理大量的小的樣品并通過光譜學來分析反應數(shù)據(jù)。
盡管這樣的DNA-固定化基質極其昂貴，但再使用用過的基質以在其上再次固定任何其他DNA的方法尚未發(fā)展出來。因此，用過的基質通常被扔掉，且即使再使用，之前已經結合其上的DNA可能仍然保留在其上，且大多數(shù)用過的基質不再可實際利用。
本發(fā)明要解決上述問題，并提供用過一次的DNA-固定化基質的再使用方法以使得有效利用昂貴的DNA-固定化基質，其中再使用的DNA-固定化基質與新基質具有相同的性能且不具有實際應用中的問題，并且本發(fā)明減少DNA-固定化基質使用者的經濟和技術負擔。
發(fā)明公開我們本發(fā)明者經刻苦研究已達到上述的目標，并作為結果，發(fā)現(xiàn)了從已重復用于PCR擴增的DNA-固定化基質上完全去除DNA的方法和將DNA再固定在更新了的基質上的可能性。
具體地，權利要求1的發(fā)明提供DNA-固定化基質的再使用方法，它包括從攜帶通過酰胺鍵經寡核苷酸在其上固定了DNA的DNA-固定化基質上將固定的DNA去除以此更新基質，而使得它可接受新的DNA固定其上，且其特征在于基質-DNA之間的酰胺鍵是用酸或堿來水解的。
權利要求2的發(fā)明提供了DNA-固定化基質的再使用方法，它包括處理其上帶有通過酰胺鍵固定的DNA的DNA-固定化基質，由此用酸水解基質-DNA之間的酰胺鍵，然后浸入堿中以去除陰離子，從而將基質表面轉變?yōu)榘被鶊F修飾的表面。
權利要求3的發(fā)明提供DNA-固定化基質的再使用方法，它包括處理其上帶有通過酰胺鍵固定的DNA的DNA-固定化基質，由此用堿水解基質-DNA之間的酰胺鍵，從而將基質表面轉變?yōu)榘被鶊F修飾的表面。
本發(fā)明中用于水解的酸優(yōu)選為一或多種如在權利要求4中所述的無機酸和有機酸。
同樣優(yōu)選，用于水解的堿為如在權利要求5中所述的任何堿金屬氫氧化物和/或堿金屬鹽。
附圖簡述

圖1為遷移圖，顯示固定化和再固定化的證實結果。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明再使用DNA-固定化基質的方法包含從其上攜帶通過酰胺鍵經寡核苷酸固定的DNA的DNA-固定化基質上將固定的DNA去除由此更新基質，而使得它可接受新的DNA固定其上，且其特征在于基質-DNA之間的酰胺鍵用酸或堿來水解。
在本發(fā)明的再使用方法中要處理的DNA-固定化基質具有經酰胺鍵固定在其氨基基團修飾的基質表面上的DNA。
優(yōu)選，該氨基基團修飾的基質通過氨化以下基質的表面而制備，如金剛石、硅、玻璃，或金屬如金、銀、銅、鋁、鎢、鉬，或者覆蓋于金屬上的陶瓷層，或者塑料如聚碳酸酯、氟樹脂(fluororesin)。
除上述之外，任何其他化學穩(wěn)定的材料均可用作基質，如石墨和金剛石樣的碳。同樣可用塑料與上述金屬、陶瓷、金剛石等的混合物。同樣優(yōu)選用于此處的是硅、玻璃、金屬、石墨、塑料和其他用金剛石或金剛石樣的碳包被的材料。
在那些材料中，金剛石由于其導熱性而優(yōu)選。金剛石具有良好的導熱性并可接受快速地加熱和冷卻。因此，加熱或冷卻基質以在其上結合DNA的熱循環(huán)周期可有效地縮短。
具體地，基質材料的導熱性可為至少0.1W/cm·K，優(yōu)選至少0.5W/cm·K，更優(yōu)選至少1.0W/cm·K。
對于金剛石基質材料，可用任何合成的金剛石、高壓塑造的金剛石、天然的金剛石等。其結構可為單晶體或多晶體的任何形式。以其生產的觀點看，金剛石優(yōu)選通過氣相合成法生產，如通過微波等離子體輔助的CVD(microwave plasma-assisted CVD)。
該基質可以任何已知的方法形成。例如，該方法包括微波等離子體輔助的CVD、ECRCVD、IPC、DC反應濺射法、ECR反應濺射法、離子電鍍、電弧離子電鍍、EB蒸汽沉積作用、電阻加熱蒸汽沉積作用等?？蓪⒔饘俜勰⑻沾煞勰┑扰c樹脂粘合劑混合，并可塑造為基質以用于此處。除此之外，可將金屬粉末、陶瓷粉末等起始材料通過用壓力機擠壓成未淬火的壓塊(green compact)，且該壓塊可在高溫進行燒結。
優(yōu)選，基質的表面故意制成粗糙樣。粗糙的表面由于其表面積增加而有利于固定大量的DNA等。基質的形狀沒有特定限定，且可為扁平的、線狀的、球形的、多角形的、粉狀的等。此外，基質的大小也沒有特定地限定。
在本發(fā)明中所用的金剛石基質可包括包含金剛石和任何其他物質的復合材料(如金剛石或金剛石樣的碳的兩相復合材料)。
基質表面的氨基基團修飾可通過如在氯氣中用UV射線照射該固體基質而氯化基質表面并隨后在氨氣中用UV射線進一步地照射以氨化而獲得。
氨基基團修飾的基質表面可通過用適當?shù)乃嵝月然雉然㈦S后將末端羧基基團與碳二亞胺或二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺脫水和縮合而用羧酸來修飾。
描述了根據(jù)本方法的脫水縮合的一個實例。將其表面已被修飾而具有羧基基團的固體基質浸入到1，4-二氧六烷溶液中，在其中溶解有碳二亞胺或二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺或對硝基酚，然后洗滌并干燥。這樣處理后，該基質即在其末端具有結合了N-琥珀酰亞胺酯基或對硝基酚酯的烴基基團。
上述方法中更優(yōu)選，預先在金剛石基質上形成了伯氨基基團，且這是用活化的二酯處理而使得該二酯的一個酯基通過脫水縮合結合到該伯氨基基團上。
該活化的二酯具有上文所述的兩個活化的酯基。優(yōu)選，該酯基位于該活化二酯的兩個末端，且各具有0～12，更優(yōu)選0～6個碳原子。同樣優(yōu)選，除酯基之外的主鏈部分為線性飽和脂肪酸。
在使用這樣的活化酯的方法中，可以用與上述相同的方式將基質氯化然后氨化，其后其中的氨基基團可與一個活化酯反應以獲得預期的基質，該活化酯預先通過用琥珀酸(二羧酸)對N-羥基琥珀酰亞胺的活化酯化反應而制備。
因而，具有羧酸修飾的表面并具有經寡核苷酸固定于其表面的DNA的基質將根據(jù)本發(fā)明來處理以供再次使用。
將要固定于基質上的DNA沒有特定的限定，且可為任何單鏈的cDNA(互補DNA)或雙鏈的gDNA(基因組DNA、染色體DNA)。
DNA的鏈長度沒有特定的限定。
該寡核苷酸應該依賴于要結合到基質上的DNA的類型而適當?shù)剡x擇。在單鏈cDNA固定到基質上的情況下，可利用以mRNA為模板的反轉錄，且可將作為反轉錄引物的寡脫氧胸苷酸等用作寡核苷酸。
另一方面，雙鏈gDNA的固定可通過使用限制性內切酶切割位點來實施。在這種情況下，所用的寡核苷酸應該在DNA結合一側具有限制性內切酶切割位點。
在本發(fā)明中，將用過的無用的DNA-固定化基質浸入酸或堿溶液中，由此基質-DNA之間的酰胺鍵被水解和切割，然后其表面由此更新為具有氨基基團修飾的表面。
用于水解的酸優(yōu)選為無機酸如鹽酸，但可為任何其他的能夠水解酰胺鍵的無機酸或有機酸。
在堿用于水解的情況下，優(yōu)選堿金屬氫氧化物，但可為任何其他的堿性鹽如堿金屬碳酸鹽。
描述了水解的條件。對于酸水解，將DNA-固定化的基質置于6M鹽酸中并在80～100℃反應幾個小時至24小時以由此完全水解基質-DNA之間的酰胺鍵。
對于堿水解，將DNA-固定化的基質置于2M NaOH中并在室溫反應幾個小時至24小時以借此水解基質-DNA之間的酰胺鍵。
在酸水解后，基質表面上有陰離子。因此，優(yōu)選將其浸入堿中以除去陰離子然后用水洗滌。
另一方面，堿水解的基質可用水洗滌而不需任何額外的處理。
因此，DNA-固定化的基質中基質-DNA之間的酰胺鍵即被水解，且因此基質的氨基基團修飾的表面暴露出來。
在這樣處理后，該基質可用上述的方式再用于羧酸修飾、寡核苷酸固定化和DNA固定化。
實施例本發(fā)明參考下面的實施例而詳細描述。
實施例1使用金剛石基質。下述的基質是金剛石基質。
將在其上固定了DNA的基質置于6N的鹽酸中并在95℃反應5小時以使其水解。然后將其洗滌(約3次)。在該條件下，該基質具有氯化氫。因此，將其浸入0.1N的氫氧化鉀溶液中以從中去除氯離子。隨即將基質用水洗滌(約3～5次)以，由此使其具有氨基基團修飾的表面。
將0.1mmols的琥珀酸氯化物加入到1ml氯仿中，并將可再使用的氨基基團修飾的基質插入其中且在室溫反應30分鐘。下一步，將基質用氯仿洗滌，干燥，然后浸入到純水中放置1小時，最后用純水洗滌(約3～5次)以使其具有琥珀酸修飾的表面。
將0.1mmols水溶性的碳二亞胺和0.1mmols的羥基琥珀酰亞胺溶解于1ml 90％的1，4-二氧六烷中，并將琥珀酸修飾的基質浸入其中并在高的溫度下振蕩反應15分鐘。然后將基質取出并用1，4-二氧六烷(約2～4次)和純水(約3～5次)洗滌。
將基質浸入到寡核苷酸的水溶液中并于室溫反應1小時，該寡核苷酸具有限制性內切酶(EcoR I)位點和5’末端的(dA)3(濃度500fmol/μl，每一基質50μl)。
然后，將其于4℃浸入到與固定的寡核苷酸具有互補序列的寡核苷酸水溶液中(濃度＝500fmol/μl，每一基質50μl)30分鐘以進行雜交。
將基質浸入到EcoR I反應液體中并于37℃反應1小時。然后，將反應混合物冷卻到4℃，并將基質從中取出。將其用于4℃冷卻的無菌水洗滌(約3～5次)，然后用于4℃冷卻的60％的乙醇水溶液洗滌，其后稍微干燥(使乙醇蒸發(fā))。
將基質浸入到含有通過用EcoR I處理λDNA所獲得的21-kbp的片段的連接酶溶液中，并于4℃反應過夜以借此將DNA固定在基質上。
水解和DNA在基質上的再固定可證實如下將基質用能夠擴增21-kbp的λDNA片段中500-bp的片段的引物進行PCR，并在其上檢查擴增的DNA。圖1顯示了結果。
圖1是遷移圖，顯示固定化和再固定化的證實結果。在圖1中，在遷移圖下描述的標記M顯示100bp的滯后標記(lag marker)；泳道0顯示水解前的基質；泳道1和2顯示水解后的基質；以及泳道3和4顯示再固定化后的基質。
如圖1，證實了已固定在基質上的DNA被從水解的基質上去除了，并且新的DNA再固定在基質上。
工業(yè)應用根據(jù)本發(fā)明的結果，可從無用的DNA-固定化基質上將DNA完全去除，且新的DNA可結合到該更新的基質上。
此外，由于本發(fā)明的再使用方法不需要任何特殊的試劑和儀器，所以其簡單且便宜。
進一步地，由于昂貴的DNA-固定化基質可根據(jù)本發(fā)明而再使用，所以本發(fā)明促進了使用DNA-固定化基質進行基因診斷等的經濟的診斷和研究。
因此，本發(fā)明的再使用方法可用于醫(yī)學領域和其他各種分子生物學、生物化學和基因工程技術領域。
權利要求
1.DNA-固定化基質的再使用方法，它包括從其上攜帶有通過酰胺鍵經寡核苷酸固定的DNA的DNA-固定化基質上將固定的DNA去除而由此更新基質，以使得它可接受新的DNA固定于其上，且其特征在于基質-DNA之間的酰胺鍵用酸或堿來水解。
2.DNA-固定化基質的再使用方法，它包括處理其上攜帶有通過酰胺鍵固定的DNA的DNA-固定化基質，由此用酸水解基質-DNA之間的酰胺鍵，然后將其浸入堿中以去除陰離子從而將基質表面轉變?yōu)榘被鶊F修飾的表面。
3.DNA-固定化基質的再使用方法，它包括處理其上攜帶有通過酰胺鍵固定的DNA的DNA-固定化基質，由此用堿水解基質-DNA之間的酰胺鍵從而將基質表面轉變?yōu)榘被鶊F修飾的表面。
4.根據(jù)權利要求1或2的DNA-固定化基質的再使用方法，其中用于水解的酸為一種或多種無機酸和有機酸。
5.根據(jù)權利要求1或3的DNA-固定化基質的再使用方法，其中用于水解的堿為任何堿金屬氫氧化物和/或堿金屬鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供DNA－固定化基質的再使用方法，由此使得昂貴的DNA－固定化基質可有效被利用，且提供可再使用的DNA－固定化基質，該基質具有與新產品相同的性能且在實際應用中無任何問題。即，一種DNA－固定化基質的再使用方法，其特征在于從攜帶由酰胺鍵通過寡核苷酸固定的DNA的DNA－固定化基質上去除DNA而由此使得可以固定新的DNA，在基質和DNA之間的酰胺鍵用酸或堿來水解。
文檔編號G01N33/50GK1484764SQ01821551
公開日2004年3月24日 申請日期2001年12月17日 優(yōu)先權日2000年12月28日
發(fā)明者高橋浩二郎, 高井修, 丹花通文, 文 申請人:東洋鋼鈑株式會社, 高橋浩二郎, 日本帕克里津廣島株式會社