專利名稱：檢棒分析中改良的目標(biāo)核酸的捕獲及檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的檢棒(dipstick)核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法用以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，例如鑒定病患是否感染致病微生物，如砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis，CT)。
用于檢測(cè)樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的一些常規(guī)測(cè)試依賴?yán)镁酆厦告準(zhǔn)竭B鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)核酸。此反應(yīng)可檢測(cè)小量的目標(biāo)核酸，然而得到結(jié)果前需耗時(shí)數(shù)小時(shí)，但因通常希望可盡快得到結(jié)果，例如使病人等待的時(shí)間減至最少，故此為其顯著缺點(diǎn)。這種方法的進(jìn)一步缺點(diǎn)是需要昂貴的專家設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)以及相當(dāng)高成本的試劑。
相反，檢棒可檢測(cè)未擴(kuò)增的目標(biāo)核酸，不需任何專家設(shè)備且能比基于PCR的方法更快速地得到結(jié)果。病人就可于同時(shí)接受治療，故特別有益于不喜歡或不能日后復(fù)診的病人。檢棒分析的成本也顯著低于PCR基礎(chǔ)的測(cè)試。
US 5,310,650所述的典型常規(guī)檢棒中，單股DNA捕獲探針固定于硝化纖維素濾器上遠(yuǎn)離過濾器末端(接觸端)的捕獲區(qū)。捕獲探針序列互補(bǔ)于欲測(cè)目標(biāo)核酸第一區(qū)域的序列。標(biāo)記的單股DNA檢測(cè)探針固定于硝化纖維素濾器上捕獲區(qū)及濾器接觸端間的探針區(qū)。檢測(cè)探針含有互補(bǔ)于目標(biāo)核酸第二區(qū)域序列(不同于第一區(qū)域)的序列。
在認(rèn)為含有目標(biāo)DNA的樣品溶液中檢測(cè)目標(biāo)DNA時(shí)，將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液。樣品溶液通過毛細(xì)作用進(jìn)入濾紙并經(jīng)過探針區(qū)及捕獲區(qū)。當(dāng)樣品溶液經(jīng)過探針區(qū)時(shí)，可使檢測(cè)探針移動(dòng)并使其與樣品溶液一起朝向捕獲區(qū)上升。然后移動(dòng)的檢測(cè)探針能雜交到樣品溶液中存在的任何目標(biāo)DNA的第二區(qū)域。
當(dāng)雜交的檢測(cè)探針及目標(biāo)DNA到達(dá)捕獲區(qū)時(shí)，目標(biāo)DNA的第一區(qū)域能雜交到固定的捕獲探針。由此在目標(biāo)核酸、捕獲探針及標(biāo)記的檢測(cè)探針之間形成三重復(fù)合物。捕獲區(qū)出現(xiàn)標(biāo)記時(shí)說明樣品溶液中存在目標(biāo)DNA。
至于第二類常規(guī)檢棒，標(biāo)記的DNA檢測(cè)探針未固定于硝化纖維素濾器上。而是在允許檢測(cè)探針雜交到樣品溶液中任何目標(biāo)核酸的條件下將檢測(cè)探針加入到樣品溶液中。然后將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液，且當(dāng)樣品溶液沿檢棒上移時(shí)，雜交到檢測(cè)探針的目標(biāo)核酸沿硝化纖維素濾器上升，并可通過捕獲探針在捕獲區(qū)捕獲。
雖然使用常規(guī)檢棒獲得結(jié)果比使用需擴(kuò)增目標(biāo)核酸的檢測(cè)方法還快，但常規(guī)檢棒的核酸檢測(cè)敏感度還是低。常規(guī)檢棒的雙鏈目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度特別低，尤其當(dāng)目標(biāo)核酸大小增加時(shí)，且認(rèn)為事實(shí)上環(huán)狀雙鏈目標(biāo)核酸使用常規(guī)檢棒無(wú)法檢測(cè)到。因此，樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在有時(shí)不能被檢測(cè)到，所以需要改良檢棒的目標(biāo)核酸檢測(cè)敏感度，尤其是雙鏈或環(huán)狀雙鏈目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度。
在最廣泛的意義中，本發(fā)明提供在檢棒分析中幫手探針(helperprobe)的用途，來(lái)增強(qiáng)捕獲和/或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“檢棒分析”是指使用檢棒的任何分析，其中樣品溶液與檢棒接觸以使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至檢棒的捕獲區(qū)，由此可使樣品溶液中的目標(biāo)核酸于捕獲帶中被捕獲及檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其提供方法以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及捕獲探針，其固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶，該捕獲探針能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列；b)在檢測(cè)探針能附著目標(biāo)核酸的條件下，孵育能附著目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針和樣品溶液，由此可利用檢測(cè)探針直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；且第一幫手探針能夠雜交至目標(biāo)核酸第二序列，并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第一幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使檢測(cè)探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，包括具有接觸端以接觸樣品溶液的層析片；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列；ii)第一幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列并因此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，及可選地iii)檢測(cè)探針，其能夠附著目標(biāo)核酸而允許利用該檢測(cè)探針直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“層析片”是指能通過毛細(xì)現(xiàn)象運(yùn)送溶液的任何多孔帶狀物質(zhì)。
檢測(cè)探針及第一幫手探針可以任何順序與樣品溶液孵育或同時(shí)添加入樣品溶液中。
其可了解，根據(jù)步驟(b)，在樣品溶液已與檢測(cè)探針及第一幫手探針孵育之后，一般將層析片的接觸端與樣品溶液接觸。然而，對(duì)于實(shí)施本發(fā)明來(lái)說是并非必需在步驟(b)完成后將接觸端與樣品溶液接觸，即層析片的接觸端可在步驟(b)之前或之中與樣品溶液接觸。
本發(fā)明的第一方面的捕獲探針可包含單一探針或一種以上的探針。例如捕獲探針可含有固定至層析片的通用探針(universal probe)及能雜交通用探針的吊鉤捕獲探針(hook capture probe)，該吊鉤探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列。
使用通用探針及吊鉤捕獲探針作為捕獲探針的優(yōu)點(diǎn)在于其上具有固定的通用探針的層析片可用于檢測(cè)任何目標(biāo)核酸。在層析片用以測(cè)試所需目標(biāo)核酸存在之前，簡(jiǎn)單選擇能夠雜交所需目標(biāo)核酸的吊鉤探針并將其雜交至通用探針。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，其提供方法以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分(capture moiety)；b)將樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在檢測(cè)探針附著目標(biāo)核酸的條件下能夠附著目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針，因此可利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；在捕獲探針雜交第一序列的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列的捕獲探針，當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)，該捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；及能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列的第一幫手探針，以增強(qiáng)捕獲探針雜交目標(biāo)核酸，而在第一幫手探針雜交第二序列的條件下，孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使得檢測(cè)探針、捕獲探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，包括具有接觸端以接觸樣品溶液的層析片；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)捕獲探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列，當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列，其能被捕獲部分結(jié)合；iii)第一幫手探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸第二序列，由此可增強(qiáng)捕獲探針對(duì)第一序列的雜交；及可選地iii)檢測(cè)探針，其能夠附著目標(biāo)核酸而允許直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸。
本發(fā)明的第二方面的捕獲部分可包含能雜交至捕獲帶的通用捕獲探針?；蛘撸坏┎东@探針已雜交了目標(biāo)核酸，該捕獲部分就可以能夠通過非堿基配對(duì)作用結(jié)合捕獲探針。
例如捕獲部分可包含能結(jié)合當(dāng)捕獲探針已雜交至目標(biāo)核酸時(shí)形成的雙鏈體的抗體或抗體片段。或者，捕獲探針可包含一捕獲配體，其能被捕獲部分結(jié)合。當(dāng)捕獲探針包含捕獲配體時(shí)，捕獲部分可包含抗體或抗體片段。如果捕獲配體包含生物素，則捕獲部分能包含抗生物素抗體或鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或其且保留生物素結(jié)合活性的衍生物。
本發(fā)明的第一及第二方面的第二序列應(yīng)位于目標(biāo)核酸中與的第一序列不同的區(qū)域。優(yōu)選第二序列相隔第一序列多達(dá)10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選第二序列緊接著第一序列。
在本發(fā)明的第一及第二方面的優(yōu)選方法中，樣品溶液與能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列的第二幫手探針孵育，由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第二幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液及第二幫手探針。
第三序列應(yīng)位于目標(biāo)核酸中與第一及第二序列不同的區(qū)域，優(yōu)選第二及第三序列位于第一序列兩側(cè)，更優(yōu)選第二及第三序列相隔第一序列各邊多達(dá)10個(gè)核苷酸，最優(yōu)選第二及第三序列緊接著第一序列各邊。
捕獲探針、檢測(cè)探針及幫手探針可包含核酸或核酸類似物。捕獲探針可包含單一探針或多于一種的探針。
本發(fā)明的第一及第二方面的檢測(cè)探針可為標(biāo)記，其共價(jià)附著目標(biāo)核酸，由此可直接檢測(cè)目標(biāo)核酸?；蛘?，檢測(cè)探針可為配體，其共價(jià)附著目標(biāo)核酸，由此可利用能結(jié)合配體的配體結(jié)合部分間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。檢測(cè)探針能以前體形式加至樣品溶液中，其與目標(biāo)核酸反應(yīng)以共價(jià)地將檢測(cè)探針附著至目標(biāo)核酸。
或者，檢測(cè)探針能夠通過非共價(jià)相互作用附著目標(biāo)核酸。例如檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第四序列。檢測(cè)探針能被標(biāo)記，由此當(dāng)檢測(cè)探針通過非共價(jià)相互作用已附著目標(biāo)核酸時(shí)，可直接檢測(cè)目標(biāo)核酸?；蛘撸瑱z測(cè)探針能包含配體，由此當(dāng)檢測(cè)探針通過非共價(jià)相互作用已附著目標(biāo)核酸時(shí)，可利用配體結(jié)合部分間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
優(yōu)選的標(biāo)記為非放射性標(biāo)記，適合的標(biāo)記的例子包括紡織染料、如膠體金的金屬溶膠，及如有色乳膠粒子的有色粒子。適合的配體的例子包括生物素(可檢測(cè)的例如通過抗生物素抗體或抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或其保留生物素結(jié)合活性的衍生物)、熒光素(可檢測(cè)的例如通過抗熒光素抗體)及2，4-二硝苯酚(DPN)(例如通過抗DPN抗體而可檢測(cè))。
如果樣品溶液與第三且優(yōu)選亦與第四幫手探針孵育，則可獲得進(jìn)一步改良的檢測(cè)目標(biāo)核酸的敏感度。第三幫手探針能夠雜交至目標(biāo)核酸第五序列，且第四幫手探針能夠雜交至目標(biāo)核酸第六序列，由此可增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第四序列的雜交。在第三與第四幫手探針雜交至目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液及第三與第四幫手探針。
只有當(dāng)目標(biāo)核酸第一及第四序列相隔至少200核苷酸時(shí)，使用第三及第四幫手探針才可能獲得檢測(cè)敏感度任何明顯的增強(qiáng)。
優(yōu)選的第五及第六序列位于第四序列兩側(cè)，更優(yōu)選第五及第六序列相隔第四序列各邊多達(dá)10個(gè)核苷酸，最優(yōu)選第五及第六序列緊接著第四序列各邊。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，其提供方法以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；b)樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列的檢測(cè)探針，由此可利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；且第一幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列，且由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交，在第一幫手探針雜交第三序列的條件下，孵育樣品溶液及第一幫手探針；
c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使得檢測(cè)探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試疑似含有目標(biāo)核酸的樣品溶液中目標(biāo)核酸存在，其包含i)檢棒，包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；ii)檢測(cè)探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列而可直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及iii)第一幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列，由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交。
本發(fā)明的第三方面的捕獲探針可包含單一探針或一種以上的探針，例如捕獲探針可包含固定于層析片的通用捕獲探針及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，該吊鉤探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，其提供提供方法以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針；b)樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在捕獲探針雜交第一序列的條件下能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列的捕獲探針，當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)，該捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；在檢測(cè)探針雜交至第二序列的條件下能夠雜交至目標(biāo)核酸第二序列的檢測(cè)探針，由此可利用該檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及第一幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列，并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第一幫手探針雜交第三序列的條件下，孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使檢測(cè)探針、捕獲探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲部分結(jié)合至復(fù)合物的捕獲探針而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中疑似含有目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)捕獲探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列，且當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)，其能被捕獲部分結(jié)合；iii)檢測(cè)探針，其能夠雜交至目標(biāo)核酸第二序列而可直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及iv)第一幫手探針，其能夠雜交至目標(biāo)核酸第三序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交。
本發(fā)明的第四方面的捕獲部分可包含能雜交捕獲探針的通用捕獲探針?；蛘撸坏┎东@探針已雜交了目標(biāo)核酸，捕獲部分能通過非堿基配對(duì)作用結(jié)合該捕獲探針。
例如捕獲部分可包含能結(jié)合當(dāng)捕獲探針已雜交至目標(biāo)核酸形成的雙鏈體的抗體或抗體片段?；蛘?，捕獲探針可包含一捕獲配體，其能被捕獲部分結(jié)合。當(dāng)捕獲探針包含捕獲配體時(shí)，捕獲部分能包含抗體或抗體片段。如果捕獲配體包含生物素，則捕獲部分能包含抗生物素抗體或抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或其保留生物素結(jié)合活性的衍生物。
本發(fā)明的第三及第四方面的檢測(cè)探針可被標(biāo)記，由此當(dāng)檢測(cè)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，可直接檢測(cè)目標(biāo)核酸?；蛘?，檢測(cè)探針能包含配體，由此當(dāng)檢測(cè)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，可利用配體結(jié)合部分間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
本發(fā)明的第三及第四方面的第三序列優(yōu)選相隔第一序列多達(dá)10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選第三序列緊接著第二序列。
在本發(fā)明的第三及第四方面的方法中，優(yōu)選樣品溶液與能夠雜交至目標(biāo)核酸第四序列的第二幫手探針孵育，由此能夠增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第二幫手探針雜交第四序列的條件下，孵育樣品溶液及第二幫手探針。
對(duì)于本發(fā)明的第三及第四方面的方法，優(yōu)選第三及第四序列位于第二序列兩側(cè)，更優(yōu)選第四序列相隔第二序列多達(dá)10個(gè)核苷酸，最優(yōu)選第四序列緊接著第二序列。
只有當(dāng)目標(biāo)核酸第一及第二序列相隔至少200核苷酸時(shí)，以本發(fā)明的第三及第四方面的方法使用第一及第二幫手探針，才可能觀察到檢測(cè)敏感度任何明顯的增強(qiáng)。
如果本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)探針包含檢測(cè)配體，則試劑盒可進(jìn)一部包含能夠結(jié)合檢測(cè)配體的標(biāo)記的檢測(cè)配體結(jié)合部分，由此允許使用檢測(cè)探針及檢測(cè)配體結(jié)合部分檢測(cè)目標(biāo)核酸。檢測(cè)配體結(jié)合部分可為抗體、抗體片段或非抗體。
本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一部包含使用層析片可在樣品溶液中檢測(cè)目標(biāo)核酸所需的任何試劑。
根據(jù)本發(fā)明亦提供本質(zhì)上分離的核酸分子或核酸類似物，其具有序列相對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOS1-18任一的序列。
根據(jù)本發(fā)明亦提供本質(zhì)上分離的本發(fā)明的核酸分子或核酸類似物的用途，在測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在時(shí)，作為幫手探針以增強(qiáng)CT目標(biāo)核酸的檢測(cè)。
本發(fā)明所使用的幫手探針可增強(qiáng)捕獲或檢測(cè)探針結(jié)合單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸。當(dāng)目標(biāo)核酸為單鏈時(shí)，認(rèn)為通過保證目標(biāo)核酸中捕獲/檢測(cè)探針結(jié)合的區(qū)域不形成顯著的二級(jí)構(gòu)造，幫手探針能增強(qiáng)捕獲/檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的結(jié)合。
需知幫手探針結(jié)合的目標(biāo)核酸的區(qū)域并不總是接近或緊接著捕獲/檢測(cè)探針?biāo)Y(jié)合的區(qū)域。幫手探針雜交目標(biāo)核酸的一個(gè)區(qū)域可改變位于遙遠(yuǎn)位置區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，由此可使捕獲/檢測(cè)探針較容易結(jié)合至位于遙遠(yuǎn)位置的目標(biāo)核酸。
因此根據(jù)目標(biāo)核酸及捕獲/檢測(cè)探針而特性，幫手探針?biāo)Y(jié)合的目標(biāo)核酸的區(qū)域可能會(huì)不同。然而，通過用不同探針及不同探針長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易的決定最有效的幫手探針。
當(dāng)目標(biāo)核酸為雙鏈時(shí)，認(rèn)為通過打開目標(biāo)核酸中捕獲或檢測(cè)探針綴合區(qū)域的雙鏈，幫手探針雜交至目標(biāo)核酸增強(qiáng)了捕獲或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。因此對(duì)于雙鏈目標(biāo)核酸，通常期望幫手探針綴合區(qū)鄰近捕獲或檢測(cè)探針綴合區(qū)域。
為了使幫手探針增強(qiáng)捕獲或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的結(jié)合，幫手探針應(yīng)該在捕獲或檢測(cè)探針結(jié)合目標(biāo)核酸之前或之時(shí)雜交至目標(biāo)核酸，而不是在捕獲或檢測(cè)探針已經(jīng)結(jié)合了目標(biāo)核酸之后。
一些實(shí)施方案當(dāng)中，幫手探針能增強(qiáng)捕獲或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。例如如果幫手探針雜交至目標(biāo)核酸的區(qū)域介于捕獲及檢測(cè)探針之間，這是可以實(shí)現(xiàn)的。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，一或多種探針可以可釋放地固定于層析片上，而介于接觸端與捕獲帶之間，這些方法中，樣品溶液通過毛細(xì)作用由接觸端移動(dòng)至捕獲帶，使得各探針自層析片上釋放而進(jìn)入樣品溶液，然后釋放的探針可雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸。
對(duì)于本發(fā)明的具體例，提供幫手探針能增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，可以在樣品溶液已與層析片的接觸端接觸而可在捕獲帶捕獲目標(biāo)核酸后，將幫手探針(優(yōu)選與檢測(cè)探針一同)與層析片的捕獲帶接觸。這可通過將含有幫手探針(及檢測(cè)探針)的不同的幫手探針溶液直接運(yùn)用至捕獲帶，或在樣品溶液之后通過將層析片的接觸端接觸幫手探針溶液而能完成，由此使得幫手探針通過毛細(xì)作用移至捕獲帶。如果檢測(cè)探針不在幫手探針溶液中，則需要在幫手探針之后將其接觸捕獲帶。
然而，在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，在樣品溶液中探針雜交至目標(biāo)核酸(有別于捕獲探針被固定于捕獲帶上)在樣品溶液接觸層析片之前完成于樣品溶液中。優(yōu)選探針雜交完成于單一步驟。這樣簡(jiǎn)化方法，由此使方法的操作更快且更容易。
多步驟雜交可通過在樣品溶液中以不同探針對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行連續(xù)雜交，或通過將檢棒接觸各含有不同探針的不同溶液而完成。一般來(lái)說，多步驟雜交的后一種方法包含在每次與不同探針溶液接觸之間清洗檢棒的步驟。
盡管有多步驟雜交為優(yōu)選的情況，需知較為簡(jiǎn)單及快速的單一步驟雜交方式通常優(yōu)選。
最優(yōu)選樣品溶液的適合的組成允許使雜交反應(yīng)于單一雜交步驟中發(fā)生，亦允許非堿基配對(duì)作用發(fā)生(例如于檢測(cè)配體與檢測(cè)配體結(jié)合部分之間，及于捕獲配體與捕獲配體結(jié)合部分之間)，以及允許通過毛細(xì)作用運(yùn)送含有目標(biāo)核酸和一或多種雜交探針及(可選地)配體結(jié)合部分的復(fù)合物沿檢棒上移。
使用這種樣品溶液，需知在樣品溶液直接接觸檢棒的接觸端之前(不需要先稀釋或改變樣品溶液)，雜交反應(yīng)能在單一反應(yīng)中完成，且可發(fā)生任何配體-配體結(jié)合部分的相互作用。當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，如果需要配體-配體結(jié)合部分的相互作用能附加地或另外地在檢棒上發(fā)生，由此便于簡(jiǎn)單及快速的目標(biāo)核酸檢棒檢測(cè)。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果可以含具有鹽、去污劑及如BSA或奶粉的封阻蛋白的標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(如SSPE緩沖液或Tris緩沖液)的樣品溶液完成。使用此分析檢測(cè)目標(biāo)核酸的敏感度已發(fā)現(xiàn)大約等于或好于其它檢棒分析。
本發(fā)明的實(shí)施方案現(xiàn)參考附圖通過實(shí)施例描述，其中

圖1顯示依照本發(fā)明的實(shí)施方案用以檢測(cè)目標(biāo)核酸的檢棒；圖2列出依照本發(fā)明使用的幫手探針的序列；圖3顯示實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖4顯示實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖5顯示實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；
圖6顯示實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖7顯示實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖8顯示實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖9顯示單一步驟雜交分析的結(jié)果；以下實(shí)施例說明使用本發(fā)明的方法以改良檢測(cè)目標(biāo)核酸的敏感度。實(shí)施例涉及檢測(cè)砂眼衣原粒(CT)隱性質(zhì)體的DNA片段。
CT為最常見的性傳染性疾病的病因，CT傳染病可引起不孕或懷孕時(shí)形成自然流產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。在新生兒方面，CT傳染病可引起視盲及慢性呼吸道疾病。大約10％感染的男性及高達(dá)70％感染的女性并不表現(xiàn)出CT感染的癥狀。因此，CT感染的正確診斷非常重要，以便可開始疾病的早期治療。
在下列實(shí)施例中，使用檢棒10在樣品溶液14中檢測(cè)雙鏈CT目標(biāo)核酸12。檢棒10包含硝化纖維條16，其具有接觸端18以接觸樣品溶液14，及固定于硝化纖維條16的捕獲帶22(遠(yuǎn)離接觸端18的另一端)的捕獲探針20。抗生物素抗體-染料綴合物24可釋放地固定于硝化纖維條的綴合區(qū)26(介于接觸端18及捕獲帶22之間)，捕獲探針20能夠雜交目標(biāo)核酸12單鏈(第一鏈)的第一序列。
各能雜交雙鏈目標(biāo)核酸12第一鏈的不同區(qū)域的檢測(cè)探針28及幫手探針30然后添加至樣品溶液14，檢測(cè)探針28包含偶聯(lián)至生物素的核酸(使用的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知)。包含檢測(cè)探針28及幫手探針30的樣品溶液14加熱至足夠?qū)㈦p鏈目標(biāo)核酸12的互補(bǔ)鏈相互分離，至少在第一鏈上檢測(cè)探針28及幫手探針30結(jié)合的區(qū)域，之后冷卻而使檢測(cè)探針28及幫手探針30能夠雜交雙鏈目標(biāo)核酸第一鏈。當(dāng)檢測(cè)探針及幫手探針雜交至第一鏈時(shí)，第二鏈再退火(re-annealing)至第一鏈，但避免再退火至第一鏈上檢測(cè)探針28及幫手探針30結(jié)合的區(qū)域。
檢棒10的接觸端18隨后與樣品溶液14接觸，樣品溶液14及任何雜交了檢測(cè)探針28及幫手探針30的目標(biāo)核酸12通過毛細(xì)作用上升至檢棒10。當(dāng)樣品溶液14通過綴合區(qū)26時(shí)，其帶動(dòng)抗生物素抗體-染料綴合物24。釋放的抗生物素抗體-染料綴合物24隨后能結(jié)合至生物素，后者偶聯(lián)雜交了目標(biāo)核酸12的檢測(cè)探針28。
在抗生物素抗體-染料綴合物24、檢測(cè)探針28、幫手探針30及目標(biāo)核酸12之間形成的復(fù)合物然后移至檢棒10的捕獲帶22，在那里復(fù)合物的目標(biāo)核酸可雜交至固定的捕獲探針20。捕獲探針20固定于捕獲帶22上，而使其當(dāng)樣品溶液14通過捕獲帶22時(shí)，不能被移動(dòng)。所以，結(jié)合捕獲探針的復(fù)合物停留在捕獲帶，且可通過抗生物素抗體-染料綴合物中染料的存在而于捕獲帶中被檢測(cè)出。
如果樣品溶液中沒有CT目標(biāo)核酸，則檢測(cè)探針28不能在捕獲帶22上被捕獲，故無(wú)法在捕獲帶上見到染劑。如果樣品溶液中有CT目標(biāo)核酸，但沒有充足的目標(biāo)核酸在捕獲帶被捕獲，樣品溶液中存在的目標(biāo)核酸將不會(huì)被檢測(cè)到。
上述的目標(biāo)核酸的捕獲在如下列實(shí)施例中稱作直接探針捕獲。下列實(shí)施例5中，使用兩種進(jìn)一步的捕獲方式，即通用探針捕獲及抗體捕獲。通用探針捕獲憑借著使用雜交固定于檢棒捕獲帶上的通用探針的吊鉤探針而捕獲目標(biāo)核酸。吊鉤探針能夠雜交目標(biāo)核酸。除了捕獲探針被換為通用與吊鉤探針，這種捕獲方法完全相同于直接探針捕獲。
關(guān)于抗體捕獲，抗體替代捕獲探針而固定于檢棒的捕獲帶上。捕獲探針包含的探針。其偶聯(lián)能被抗體結(jié)合的配體(如DNP)，且捕獲探針與幫手及檢測(cè)探針一起加至樣品溶液中。當(dāng)樣品溶液加熱并然后冷卻以便雜交幫手及檢測(cè)探針至目標(biāo)核酸上時(shí)，捕獲探針雜交至目標(biāo)核酸。
在樣品溶液中孵育捕獲、幫手及檢測(cè)探針后，將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸。包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針(結(jié)合有抗生物素抗體-染料綴合物)的復(fù)合物隨后于捕獲帶被固定于捕獲帶的抗體捕獲。樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在通過在捕獲區(qū)出現(xiàn)抗生物素抗體-染料綴合物而再次被檢測(cè)。因此，捕獲探針同目標(biāo)的雜交不發(fā)生于檢棒上，而是在樣品溶液中。
已發(fā)現(xiàn)如果目標(biāo)核酸上捕獲探針雜交區(qū)域與檢測(cè)探針雜交區(qū)域的間隔小于26個(gè)核苷酸時(shí)，目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度會(huì)降低。因此，優(yōu)選這些區(qū)域的間隔至少為26個(gè)核苷酸，且優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲形式直接探針捕獲(cp)，Seq ID No 13固定于檢棒上；檢測(cè)形式檢測(cè)探針(dp)包含偶聯(lián)至生物素的Seq ID No 14、15、16或17的核酸，以1012拷貝，且以抗生物素抗體-染料綴合物檢測(cè)檢測(cè)探針；目標(biāo)DNA872bp DNA，以1011-109拷貝。
幫手探針HP SEQ ID No 1’(24mer，G+C＝9個(gè)核苷酸，Tm＝72.2℃，當(dāng)雜交至目標(biāo)核酸時(shí)，其雜交于距離捕獲探針5’端11個(gè)核苷酸的目標(biāo)序列)，或HP SEQ ID No 1(24mer，G+C＝8個(gè)核苷酸，Tm＝70.5℃，當(dāng)雜交至目標(biāo)核酸時(shí)，其雜交于緊鄰于捕獲探針5’端的目標(biāo)核酸序列)，以1012拷貝。
結(jié)果目標(biāo)拷貝 101110105×109109對(duì)照(無(wú)幫手探針) 2.5 0.0 0.00.0HP SEQ ID No 1’ 3.0 1.0 0.00.0HP SEQ ID No 15.0 3.5 2.50.0結(jié)論幫手探針以大于10倍(10-fold)水平改良目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度。
HP SEQ ID No1，其當(dāng)雜交至目標(biāo)核酸時(shí)，雜交至緊鄰于捕獲探針5’端的目標(biāo)核酸序列，具有比HP SEQ ID No 1’，其當(dāng)雜交至目標(biāo)核酸時(shí)，雜交至距離捕獲探針5’端11個(gè)核苷酸的目標(biāo)序列，有更強(qiáng)的幫手效果，HP SEQ ID No1具有比HP SEQ ID No1’高2℃的Tm，然而認(rèn)為捕獲探針與幫手探針之間的間隔比Tm及G+C含量更為重要。
實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲形式直接探針捕獲(cp)(Seq ID No 14)固定于檢棒上；檢測(cè)形式檢測(cè)探針(dp)包含偶聯(lián)生物素的Seq ID No 13的核酸，以1012拷貝，及抗生物素抗體-染料綴合物；目標(biāo)DNA416bp DNA，以5×1010拷貝。
幫手探針幫手探針HP SEQ ID No 1、HP SEQ ID No 2、HP SEQ IDNo3、Seq ID No 15、Seq ID No 16及Seq ID No 17的聯(lián)合，以1012拷貝。
結(jié)果見圖4結(jié)論在此實(shí)施例中，雜交至目標(biāo)核酸中緊鄰于捕獲探針辨識(shí)序列的序列，幫手探針對(duì)于目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度具有最大的增強(qiáng)效果(比較信號(hào)4.5與作為控制組的無(wú)幫手探針的信號(hào)1.5)。
幫手探針雜交至目標(biāo)核酸中緊鄰于捕獲探針辨識(shí)序列的序列，其對(duì)目標(biāo)核酸檢測(cè)敏感度的效果強(qiáng)于幫手探針雜交至目標(biāo)核酸中遠(yuǎn)離捕獲探針辨識(shí)序列的序列時(shí)的效果(比較信號(hào)4.5與信號(hào)2.5)。
實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲形式直接探針捕獲(cp)Seq ID No 14(固定于檢棒上)；檢測(cè)形式檢測(cè)探針包含偶聯(lián)生物素的Seq ID No 13(d1)、15(d3)、16(d4)或17(d5)的核酸，以1012拷貝，及抗生物素抗體-染料綴合物；目標(biāo)DNA872 bp DNA，以1010拷貝。
幫手探針幫手探針h1＝HP SEQ ID No 1、h2＝HP SEQ ID No 2、h3＝HP SEQ ID No 3、h4＝HP SEQ ID No 4的聯(lián)合，計(jì)1012或1013拷貝。
結(jié)果
結(jié)論相較于僅使用一個(gè)幫手探針的檢測(cè)敏感度，雜交至目標(biāo)核酸中緊鄰于捕獲探針辨識(shí)序列的幫手探針(h2及h3)增強(qiáng)檢測(cè)的敏感度。
增加幫手探針的濃度(比較1013及1012拷貝)在本實(shí)施例中對(duì)于檢測(cè)的敏感度并無(wú)任何的效果。
實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲形式直接探針捕獲(cp)Seq ID No 14(固定于檢棒上)；檢測(cè)形式檢測(cè)探針包含偶聯(lián)生物素的Seq ID No 13(d1)、15(d3)、16(d4)或17(d5)的核酸，以1012拷貝，及抗生物素抗體-染料綴合物；幫手探針幫手探針h1＝HP SEQ ID No 1、h2＝HP SEQ ID No 2、h3＝HP SEQ ID No 3、h4＝HP SEQ ID No 4的聯(lián)合，以1012或1013拷貝。
目標(biāo)環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒pCTL15B(5.1Kbp)及pCTL131(6.3Kbp)、缺乏與捕獲及檢測(cè)探針互補(bǔ)的序列的質(zhì)粒pCTL130(6.3Kbp)作為負(fù)控制組，及雙鏈直線性DNA(872bp)以1011拷貝，作為正對(duì)照組。
結(jié)果
結(jié)論使用雜交至目標(biāo)核酸中緊鄰于捕獲探針辨識(shí)序列的幫手探針可檢測(cè)長(zhǎng)度超過5Kbp的環(huán)狀雙鏈DNA。
雜交至目標(biāo)核酸中遠(yuǎn)離捕獲探針辨識(shí)序列，但緊鄰于檢測(cè)探針辨識(shí)序列的幫手探針(幫手探針h1及h4)，在本實(shí)施例中并不能增強(qiáng)核酸檢測(cè)的敏感度。在本實(shí)施例的條件下，該幫手探針顯示主要增強(qiáng)在檢棒上捕獲探針對(duì)雙鏈環(huán)狀目標(biāo)核酸的雜交。
環(huán)狀雙鏈DNA目標(biāo)(5.1Kbp或6.3Kbp)的檢測(cè)敏感度低于直鏈雙鏈872bp DNA檢測(cè)敏感度。當(dāng)目標(biāo)核酸的大小增加時(shí)，檢測(cè)及捕獲探針雜交至目標(biāo)核酸的效率預(yù)期會(huì)下降。檢測(cè)探針對(duì)抗生物素抗體-染料綴合物的可接近性在目標(biāo)大小增加時(shí)，亦被認(rèn)為會(huì)降低。認(rèn)為雙鏈目標(biāo)核酸的檢測(cè)效率低于單鏈目標(biāo)核酸的檢測(cè)，因?yàn)闄z測(cè)探針及捕獲探針雜交目標(biāo)核酸的效率降低的緣故。認(rèn)為檢測(cè)探針對(duì)抗生物素抗體-染料綴合物的可接近性，對(duì)雙鏈相較對(duì)于單鏈目標(biāo)核酸亦會(huì)降低。
實(shí)施例5實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲序列SEQ ID No 15捕獲形式i)直接探針捕獲-探針Seq ID No 15(固定于檢棒上)；ii)通用探針捕獲-20個(gè)核苷酸通用探針(固定于檢棒上)雜交至吊鉤探針(其序列互補(bǔ)于通用探針的序列)及目標(biāo)DNA序列(Seq IDNo 15)；iii)抗體捕獲-抗-DNP抗體固定于檢棒上，捕獲探針包含Seq IDNo 15的核酸，其在樣品溶液中偶聯(lián)DNP且雜交目標(biāo)核酸；檢測(cè)形式檢測(cè)探針包含偶聯(lián)生物素的Seq ID No 13、14、16或17的核酸，以1012拷貝，及抗生物素抗體-染料綴合物；幫手探針HP SEQ ID No 3及HP SEQ ID No 4，以1012拷貝。
目標(biāo)872bp DNA，以1011-108拷貝。
結(jié)果見圖7結(jié)論使用直接探針捕獲(見上述(i))及通用探針捕獲(見上述(ii))，幫手探針改良了目標(biāo)核酸的檢測(cè)敏感度。
這些結(jié)果支持了實(shí)施例2、3及4的結(jié)論，即幫手探針在檢棒上增強(qiáng)核酸間的雜交。
實(shí)施例6
實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲形式直接探針捕獲(cp)(Seq ID No 10)固定于檢棒上；檢測(cè)形式檢測(cè)探針(dp)包含偶聯(lián)生物素的Seq ID No 13的核酸，以1012拷貝，及抗生物素抗體-染料綴合物；幫手探針幫手探針HP SEQ ID No 5及HP SEQ ID No 6，其雜交目標(biāo)核酸中鄰接于HP SEQ ID No 10辨識(shí)序列的序列；HP SEQ ID No 1及HP SEQ ID No 2，其雜交目標(biāo)核酸中鄰接于HP SEQ ID No 13辨識(shí)序列的序列，以1012拷貝。
目標(biāo)872bp DNA計(jì)5×1010拷貝。
結(jié)果見第8圖結(jié)論當(dāng)捕獲探針及檢測(cè)探針雜交至相隔大于200nt的目標(biāo)核酸序列時(shí)，目標(biāo)核酸的檢測(cè)敏感度會(huì)被幫手探針改善，其雜交目標(biāo)核酸中鄰接于檢測(cè)探針辨識(shí)序列的各邊。
實(shí)施例7幫手探針在CT檢測(cè)上的效果實(shí)驗(yàn)構(gòu)成捕獲序列Seq ID No 15捕獲形式直接探針捕獲探針包含偶聯(lián)固定于檢棒上的BSA的Seq ID No 15核酸；抗體捕獲抗DNP抗體(α-DPN捕獲)固定于檢棒膜上；捕獲探針包含偶聯(lián)DPN的Seq ID No 15核酸。
檢測(cè)形式檢測(cè)探針包含各偶聯(lián)至數(shù)個(gè)生物素檢測(cè)配體的Seq IDNo 18或13的核酸，及抗生物素抗體-染料綴合物。檢測(cè)探針1012拷貝；幫手探針HP SEQ ID No 3及HP SEQ ID No 4，以1012拷貝，幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸中鄰接于捕獲探針辨識(shí)序列的區(qū)域；
目標(biāo)CT原粒體2.4×107拷貝/測(cè)試。
結(jié)果
實(shí)施例7的結(jié)論利用直接探針捕獲或抗體捕獲的CT細(xì)胞隱性質(zhì)粒的檢測(cè)可通過使用幫手探針而改進(jìn)。
依照本發(fā)明使用幫手探針會(huì)增強(qiáng)檢棒膜上或溶液中所發(fā)生的雜交。
以上實(shí)施例1至7中，幫手探針與捕獲及檢測(cè)探針雜交至雙鏈目標(biāo)核酸中的同一鏈。在相似實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)幫手探針雜交至雙鏈目標(biāo)核酸中捕獲及檢測(cè)探針辨識(shí)鏈的相對(duì)鏈時(shí)未發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)目標(biāo)核酸的檢測(cè)敏感度。
實(shí)施例8砂眼衣原體的單一步驟核酸檢棒分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)構(gòu)成試劑捕獲形式以BSA載體固定于檢棒膜上的寡核苷酸探針捕獲；檢測(cè)形式多生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針；抗生物素抗體-膠體金綴合物；樣品制備于PBS緩沖液中制備砂眼衣原體(Ct)原粒體細(xì)胞的濃度為106拷貝/μl至103拷貝/μl，且于100℃加熱20分鐘；雜交/檢棒工作緩沖液標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液，含鹽、去污劑及如BSA或奶粉的封阻蛋白。
方法檢測(cè)探針、幫手探針及EB的5×106至103拷貝稀釋于雜交緩沖液并配制成80μl，且于100℃加熱7分鐘。之后混合物短暫離心以收集所有液體，且與20ml抗生物素抗體-膠體金混合，將整個(gè)100μl混合物吸至檢棒上，并使其顯示出信號(hào)。
結(jié)果及討論結(jié)果示于下表且圖9顯示約104拷貝的Ct EB可以在少于一小時(shí)內(nèi)(包括制備步驟)以單一步驟核酸檢棒分析檢測(cè)。
雖然如此出示的檢棒檢測(cè)分析具有大約相當(dāng)于其他夾心式雜交分析(sandwich hybridisaion assays)的檢測(cè)敏感度，但其具有快速及簡(jiǎn)單性的主要優(yōu)點(diǎn)。
公布于PCT WO 93/1322的檢測(cè)Ct夾心式雜交分析為復(fù)雜的多成分微滴定板式分析，其不能于5小時(shí)內(nèi)完成。此分析為多步驟分析，需要以確定的順序漸次添加其成分，且于添加每一新成分后需要孵育和清洗步驟。
本發(fā)明的核酸檢棒分析主題可于單一步驟內(nèi)完成，而不需要不同步驟以添加成分及清洗。此夾心式雜交分析并不需要多于一種的溶液條件，以使其有利于雜交和其它親合配對(duì)形式。相同的溶液條件也十分適合于各成分在檢棒膜上自由遷移。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法顯著增加目標(biāo)核酸的檢棒檢測(cè)敏感度。尤其是雙鏈核酸及環(huán)狀雙鏈目標(biāo)核酸的檢測(cè)大為改進(jìn)。
圖例說明圖7
圖9砂眼衣原體的單一步驟核酸檢棒分析檢測(cè)數(shù)字指示砂眼衣原體原粒體的數(shù)量*NC負(fù)對(duì)照?qǐng)D10表砂眼衣原體的單一步驟核酸檢棒分析檢測(cè)
權(quán)利要求
1.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及捕獲探針，固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育在檢測(cè)探針附著目標(biāo)核酸的條件下能附著目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及第一幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列，并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第一幫手探針雜交第二序列的條件下孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使檢測(cè)探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
2.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；b)將樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在檢測(cè)探針附著目標(biāo)核酸的條件下能附著目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；在捕獲探針雜交至第一序列的條件下能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列的捕獲探針，當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)，該捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；及第一幫手探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸第二序列并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第一幫手探針雜交第二序列的條件下，孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，以使檢測(cè)探針、捕獲探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求第1或2項(xiàng)的方法，其中第二序列與第一序列間隔多達(dá)10個(gè)核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求第3項(xiàng)的方法，其中第二序列緊鄰于第一序列。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將樣品溶液與第二幫手探針孵育，后者能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列的并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第二幫手探針雜交第三序列的條件下孵育樣品溶液及第二幫手探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求第5項(xiàng)的方法，其中第二及第三序列位于第一序列兩側(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求第6項(xiàng)的方法，其中第三序列與第一序列間隔多達(dá)10個(gè)核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求第7項(xiàng)的方法，其中第三序列緊鄰于第一序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)探針包含能夠雜交目標(biāo)核酸的吊鉤檢測(cè)探針，及能夠雜交吊鉤檢測(cè)探針的通用檢測(cè)探針。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)探針能夠雜交至目標(biāo)核酸的第四序列而將檢測(cè)探針附著于目標(biāo)核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求第10項(xiàng)的方法，其中樣品溶液與第三幫手探針孵育，后者能夠雜交目標(biāo)核酸第五序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第四序列的雜交，在第三幫手探針雜交第五序列的條件下孵育樣品溶液及第三幫手探針。
12.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸；b)將樣品溶液與幫手探針接觸，后者能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下將樣品溶液與幫手探針接觸；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，通過毛細(xì)作用使樣品溶液移至捕獲帶，而使幫手探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
13.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；b)將樣品溶液與以下內(nèi)容接觸在捕獲探針雜交至目標(biāo)核酸的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸的捕獲探針，當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，該捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；及幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將樣品溶液與幫手探針接觸；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，通過毛細(xì)作用使樣品溶液移至捕獲帶，而使捕獲探針、幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中捕獲探針包含雜交吊鉤捕獲的通用捕獲探針。
15.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；b)將樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列的檢測(cè)探針，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及第一幫手探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交，在第一幫手探針雜交第三序列的條件下孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使檢測(cè)探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
16.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；b)將樣品溶液與以下內(nèi)容孵育在捕獲探針雜交第一序列的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列的捕獲探針，當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)該捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；在檢測(cè)探針雜交至第二序列的條件下能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列的檢測(cè)探針，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及第一幫手探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸第三序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第一幫手探針雜交第三序列的條件下孵育樣品溶液及第一幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，而使檢測(cè)探針、捕獲探針、第一幫手探針及目標(biāo)核酸之間所形成的復(fù)合物能通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，且通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而結(jié)合至捕獲帶；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求第15或16項(xiàng)的方法，其中第三序列與第二序列間隔多達(dá)10個(gè)核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求第17項(xiàng)的方法，其中第三序列緊鄰于第二序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求第15至18項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中樣品溶液與第二幫手探針孵育，后者能夠雜交目標(biāo)核酸第四序列并由此能夠增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在第二幫手探針雜交第四序列的條件下孵育樣品溶液及第二幫手探針。
20.根據(jù)權(quán)利要求第19項(xiàng)的方法，其中第三及第四序列位于第二序列兩側(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求第20項(xiàng)的方法，其中第四序列與第二序列間隔多達(dá)10個(gè)核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求第21項(xiàng)的方法，其中第四序列緊鄰于第二序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求第15至22項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中捕獲探針包含雜交吊鉤捕獲探針的通用捕獲探針。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中探針同樣品溶液中目標(biāo)核酸的雜交于單一步驟中進(jìn)行。
25.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸；及幫手探針，可釋放地固定于層析片接觸端及捕獲帶之間，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交；b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放幫手探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的幫手探針雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，以使包含目標(biāo)核酸及幫手探針的復(fù)合物可通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而在捕獲帶被捕獲；及c)檢查捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
26.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端及捕獲帶之間，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，其能夠被捕獲部分結(jié)合；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育幫手探針，能雜交目標(biāo)核酸并由此可增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下；及c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放捕獲探針并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的捕獲探針雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針及幫手探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
27.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端于捕獲帶之間，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，能夠被捕獲部分結(jié)合；及幫手探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸賓由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交；及b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放捕獲探針及幫手探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的捕獲探針及幫手探針雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針及幫手探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；及c)檢查捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
28.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸并由此可增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液及幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放檢測(cè)探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的檢測(cè)探針雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
29.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交至目標(biāo)核酸；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及幫手探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交；及b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放幫手探針及檢測(cè)探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的幫手探針及檢測(cè)探針雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲探針雜交復(fù)合物的目標(biāo)核酸而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
30.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，能夠被捕獲部分結(jié)合；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸并由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸，在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下孵育檢測(cè)探針與樣品溶液；且?guī)褪痔结槪軌螂s交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下孵育樣品溶液與幫手探針；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放捕獲探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的捕獲探針雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
31.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育捕獲探針，能雜交至目標(biāo)核酸且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)能夠被捕獲部分結(jié)合，在捕獲探針雜交目標(biāo)核酸的條件下；及幫手探針，能雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸的條件下；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放檢測(cè)探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的檢測(cè)探針雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；及d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
32.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及幫手探針，可釋放地固定于層析片，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸，并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交；b)將樣品溶液同以下內(nèi)容孵育捕獲探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸且當(dāng)捕獲探針已雜交目標(biāo)核酸時(shí)能夠被捕獲部分結(jié)合，在捕獲探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將捕獲探針與樣品溶液孵育；及幫手探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將幫手探針與樣品溶液一同孵育；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放檢測(cè)探針及幫手探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的檢測(cè)探針及幫手探針雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；且d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
33.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交至目標(biāo)核酸，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且當(dāng)捕獲探針已雜交至目標(biāo)核酸，能夠被捕獲部分結(jié)合；b)將樣品溶液同幫手探針孵育，其能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，在幫手探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將幫手探針與樣品溶液孵育；c)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放檢測(cè)探針及捕獲探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的檢測(cè)探針及捕獲探針雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；且d)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
34.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；及固定于層析片遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交至目標(biāo)核酸，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及幫手探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該幫手探針能夠雜交至目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交；及捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，能夠被捕獲部分結(jié)合；b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放檢測(cè)探針、幫手探針及捕獲探針，并且當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，允許釋放的檢測(cè)探針、幫手探針及捕獲探針雜交至樣品溶液中的目標(biāo)核酸，而使包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物可通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物的捕獲探針而在捕獲帶被捕獲；且c)檢查捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
35.試劑盒，用于在疑似含有目標(biāo)核酸的樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有用以接觸樣品溶液的接觸端；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；ii)幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交，可選擇地iii)檢測(cè)探針，能夠附著目標(biāo)核酸，而允許直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求第35項(xiàng)的試劑盒，其中幫手探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
37.試劑盒，用于在疑似含有目標(biāo)核酸的樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有用以接觸樣品溶液的接觸端；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列；ii)檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列，而允許直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及iii)幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交。
38.根據(jù)權(quán)利要求第37項(xiàng)的試劑盒，其中檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
39.根據(jù)權(quán)利要求第37項(xiàng)的試劑盒，其中檢測(cè)探針及幫手探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
40.試劑盒，用于在疑似含有目標(biāo)核酸的樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有用以接觸樣品溶液的接觸端的；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)捕獲探針，能夠雜交目標(biāo)核酸的第一序列，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸的第一序列時(shí)，其能夠被捕獲部分結(jié)合；iii)幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)第一序列的雜交，及可選地iii)檢測(cè)探針，能夠附著目標(biāo)核酸，而允許直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求第40項(xiàng)的試劑盒，其中捕獲探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
42.根據(jù)權(quán)利要求第40項(xiàng)的試劑盒，其中捕獲探針及幫手探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
43.試劑盒，用于在疑似含有目標(biāo)核酸的樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有用以接觸樣品溶液的接觸端；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)捕獲探針，能夠雜交至目標(biāo)核酸的第一序列且當(dāng)捕獲探針已雜交了第一序列時(shí)，其能夠被捕獲部分結(jié)合；iii)檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第二序列而允許直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及iv)幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸第三序列并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)第二序列的雜交。
44.根據(jù)權(quán)利要求第43項(xiàng)的試劑盒，其中捕獲探針和/或檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
45.根據(jù)權(quán)利要求第43項(xiàng)的試劑盒，其中幫手探針及檢測(cè)探針，及可選地捕獲探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間。
46.層析片，用于在樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含用以接觸樣品溶液的接觸端；固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸；及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探針，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
47.層析片，用于在樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含用以接觸樣品溶液的接觸端；固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸；及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探針，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
48.層析片，用于在樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含用以接觸樣品溶液的接觸端；固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠結(jié)合雜交了目標(biāo)核酸的捕獲探針；可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交至目標(biāo)核酸，及可選地可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的幫手探針，該幫手探針能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)捕獲探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
49.層析片，用于在樣品溶液中測(cè)試目標(biāo)核酸的存在，其包含用以接觸樣品溶液的接觸端；固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠結(jié)合雜交了目標(biāo)核酸的捕獲探針；可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的檢測(cè)探針，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸，由此允許利用檢測(cè)探針來(lái)直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸；及可選地i)可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，且能夠被捕獲部分結(jié)合；和/或ii)幫手探針，能夠雜交目標(biāo)核酸并由此增強(qiáng)檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
50.探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
51.根據(jù)權(quán)利要求第50項(xiàng)的用途，其中幫手探針增強(qiáng)捕獲探針或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的雜交。
52.實(shí)質(zhì)上分離的核酸分子或核酸類似物，其具有序列對(duì)應(yīng)于SEQID NOS1-18任何一項(xiàng)的序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求第52項(xiàng)的實(shí)質(zhì)上分離的核酸分子或核酸類似物的用途，在測(cè)試樣品溶液中CT目標(biāo)核酸的存在時(shí)作為幫手探針以增強(qiáng)對(duì)CT目標(biāo)核酸的檢測(cè)。
54.根據(jù)權(quán)利要求第35至49項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或?qū)游銎挠猛?，以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
全文摘要
本發(fā)明敘述檢棒分析中幫手探針的用途。在檢棒分析中測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，樣品溶液與檢棒的接觸端接觸，使樣品溶液通過毛細(xì)作用移至檢棒的捕獲帶而使目標(biāo)核酸被捕獲。通過能雜交目標(biāo)核酸的捕獲探針，目標(biāo)核酸能于捕獲帶中被捕獲。能夠雜交目標(biāo)核酸的標(biāo)記檢測(cè)探針可用以在捕獲帶檢測(cè)目標(biāo)核酸。幫手探針可用以增強(qiáng)捕獲和/或檢測(cè)探針對(duì)目標(biāo)核酸的結(jié)合，由此改良目標(biāo)核酸檢測(cè)的敏感度。亦述及檢棒及試劑盒。
文檔編號(hào)G01N30/94GK1498275SQ01815305
公開日2004年5月19日 申請(qǐng)日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者海倫·李, 瑪格塔·阿納斯達(dá)索瓦·狄尼瓦, 沙恩·克里斯托菲爾·哈瑟伍德, 阿納斯達(dá)索瓦 狄尼瓦, 克里斯托菲爾 哈瑟伍德, 海倫 李 申請(qǐng)人:海倫·李, 海倫 李