專(zhuān)利名稱(chēng)：用于低透射率樣品分析物檢測(cè)的雙束傅立葉變換紅外方法和設(shè)備的制作方法
引言血液分析物的濃度可以用各種不同的方法監(jiān)控，但越來(lái)越重要的是用非侵入性方法來(lái)監(jiān)控血液分析物的濃度。例如，由于在管理糖尿病方面的重要性，許多研究和努力都用在了開(kāi)發(fā)監(jiān)控血液分析物濃度的非侵入性的方法和設(shè)備上。
測(cè)量血糖的一種非侵入性方法涉及使用近紅外分光學(xué)，其中，使近紅外波長(zhǎng)區(qū)的光通過(guò)樣品或從樣品反射，所發(fā)射的信號(hào)用于推導(dǎo)出樣品中分析物的濃度。用近紅外分光學(xué)監(jiān)控血液分析物(包括血糖)的許多非侵入性裝置在業(yè)界已眾所周知，包括在有關(guān)文獻(xiàn)部分中列出的參考資料所介紹的那些設(shè)備。
為了測(cè)量在近紅外光譜的各個(gè)波長(zhǎng)區(qū)樣品對(duì)光的吸收，需要一種分離波長(zhǎng)成分的方法。先有技術(shù)中說(shuō)明的這種方法包括濾光輪，基于折射光柵的分光計(jì)，聲-光可調(diào)諧濾光器(AOTF)，以及傅立葉變換紅外分光計(jì)。如果分析物吸收光的能力很強(qiáng)，而且用分光法很易區(qū)別，則濾光輪裝置就可提供足夠的分立的波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定分析物的濃度。但如果在復(fù)雜的混合物中分析物是一種對(duì)光的吸收很弱的成分，例如組織中的葡萄糖，則必須分別分析大量的(大于10個(gè)，更通常是大于100個(gè))分立的波長(zhǎng)區(qū)才能測(cè)定分析物的濃度。
在這種情況下，可以使用基于折射光柵的、AOTF或FTIR分光計(jì)將光譜分解為多個(gè)波長(zhǎng)區(qū)。除了測(cè)量技術(shù)的波長(zhǎng)分辨率外，對(duì)高散射樣品的一個(gè)重要考慮就是通過(guò)分光計(jì)的光通量。在具有單個(gè)檢測(cè)元件的基于折射光柵的分光計(jì)中，分光計(jì)的光通量與波長(zhǎng)分辨率成反比。于是，如果要分辨大量的波長(zhǎng)區(qū)，到達(dá)檢測(cè)器的光的數(shù)量就很小?？梢允褂脵z測(cè)器陣列以增加分光計(jì)的光通量，但這種對(duì)近紅外波長(zhǎng)具有高靈敏度的陣列通常相當(dāng)昂貴。而且，陣列中不同檢測(cè)器元件的校準(zhǔn)和漂移成為分析物測(cè)定中不精確的來(lái)源。
在AOTF分光計(jì)中，是用調(diào)諧濾光器的方法對(duì)各個(gè)波長(zhǎng)區(qū)分別進(jìn)行測(cè)量。由于不是同時(shí)測(cè)量整個(gè)的光譜，所以樣品隨時(shí)間的變化就可能使測(cè)量的光譜失真。而且，與同時(shí)測(cè)量整個(gè)光譜的技術(shù)相比，需要分別測(cè)量波長(zhǎng)區(qū)會(huì)導(dǎo)致光通量的損失。
FTIR分光計(jì)只使用單個(gè)檢測(cè)器就具有高的光通量以及高的波長(zhǎng)分辨率的優(yōu)點(diǎn)。這樣，對(duì)于含有分析物的復(fù)雜混合物的低透射率的樣品，與濾光輪，AOTF，基于光柵的分光計(jì)等相比，F(xiàn)TIR更具優(yōu)越性。雖然近紅外FTIR裝置和方法在非侵入性分析物檢測(cè)領(lǐng)域顯示了很好的前景，但如果這種裝置要成為市售產(chǎn)品，還需要克服一些技術(shù)障礙。這些技術(shù)障礙包括儀器飄移問(wèn)題，需要超高精度的模-數(shù)變換器，等等。
因此，在開(kāi)發(fā)基于近紅外的分析物濃度檢測(cè)的新方法和設(shè)備方面一直有不間斷的興趣。
雙束傅立葉變換紅外(DB-FTIR)分光學(xué)在美國(guó)專(zhuān)利No.4,999,010中，以及在以下文章中有所說(shuō)明Beduhn & White，AppliedSpectroscopy(應(yīng)用分光學(xué))(1986)40628-632，Kuehl & Griffiths，Anal.Chem.(分析化學(xué))，(March 1978)50418-422，P.R.Griffiths and J.A.de Haseth，傅立葉變換紅外分光學(xué)，ChemicalAnalysis，Vol.83(1986)John Wiley and Sons，New York，pp298-311。也可參考FTIR傅立葉變換紅外持續(xù)發(fā)展的技術(shù)，SeanJohnston，Ellis Horwood，New York，(1991)，pp260-274?；诩t外分光學(xué)的非侵入性血液分析物檢測(cè)協(xié)議在以下美國(guó)專(zhuān)利中有所說(shuō)明美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,016,435；6,002,953；5,957,841；5,945,676；5,830,132；5,574,283；5,424,545；5,237,178；5,222,496；5,204,532；以及4,882,492；這些專(zhuān)利的內(nèi)容已作為參考包括在本文中，以及Klonoff，“非侵入性血糖監(jiān)控”，Diebetes Care(March，1997)20Z(3)433-7。
附圖簡(jiǎn)介

圖1示出人體前臂漫反射光譜(前向束)和水透射參照束(后向束)以及從它們得到的零束。
圖2示出根據(jù)本發(fā)明的一種設(shè)備的示意圖，對(duì)于與光起強(qiáng)散射相互作用的樣品特別有用。
圖3示出根據(jù)本發(fā)明的一種設(shè)備的示意圖，對(duì)于與光起弱散射但強(qiáng)吸收的相互作用的樣品特別有用。
圖4A和4B示出分別用單束FTIR(先有技術(shù)的方法)和雙束FTIR(本發(fā)明)測(cè)量的多分析物水溶液的光譜。
圖5示出用單束FTIR(先有技術(shù)的方法)和雙束FTIR(本發(fā)明)測(cè)量的多分析物水溶液中預(yù)計(jì)的和參照的葡萄糖濃度的比較。
圖6示出從利用單束FTIR(先有技術(shù)的方法)和雙束FTIR(本發(fā)明)技術(shù)測(cè)量多分析物水溶液的測(cè)量結(jié)果導(dǎo)出的葡萄糖濃度預(yù)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤差與因素?cái)?shù)目之間的關(guān)系的曲線表示。
圖7A和7B示出用單束FTIR(先有技術(shù))和雙束FTIR(本發(fā)明)技術(shù)在數(shù)周內(nèi)測(cè)量的多分析物溶液中葡萄糖的濃度的曲線表示(預(yù)計(jì)值與參照值的關(guān)系)。
在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于下述的具體實(shí)施例，可以對(duì)具體實(shí)施例作改動(dòng)并仍屬于所附的權(quán)利要求書(shū)范圍之內(nèi)。還應(yīng)理解所使用的術(shù)語(yǔ)是為了說(shuō)明具體實(shí)施例，而絕不是為了進(jìn)行限制。本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)確定。
在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另有明確說(shuō)明，單數(shù)的參考符號(hào)都包括多數(shù)。除非另有定義，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意義與具有對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域有一般了解的人所理解的意義相同。方法如上所述，本發(fā)明提出了在低透射率樣品中測(cè)定至少一種分析物的存在和/或濃度的方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提出一種利用傅立葉變換紅外(FTIR)分光學(xué)測(cè)定樣品中一種分析物的存在、甚至濃度的方法。更具體地說(shuō)，本方法是在低透射率樣品中測(cè)定至少一種分析物(例如組織樣品中的葡萄糖)的存在和濃度的雙束FTIR(DB-FTIR)方法。
在實(shí)現(xiàn)此方法時(shí)，第一步是由至少一個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束，當(dāng)前向束和后向束組合時(shí)，產(chǎn)生交流信號(hào)的抵消(或歸零)以及直流信號(hào)的加倍。本方法采用的紅外輻射可以從能在所需的紅外波長(zhǎng)內(nèi)提供輻射的任何常規(guī)紅外輻射源獲得，特別重要的波長(zhǎng)范圍從約0.7μm到3μm，經(jīng)常是從約1.3μm到2.4μm。
在一個(gè)實(shí)施例中，干涉儀用于從初始的單一的紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束。前向束和后向束的特征在于，在從干涉儀出來(lái)時(shí)，它們彼此準(zhǔn)確互補(bǔ)。即，在離開(kāi)干涉儀時(shí)后向束的相位相對(duì)于前向束相差180°。然后，由干涉儀產(chǎn)生的前向束和反向束分別進(jìn)入樣品和參照物，產(chǎn)生樣品束和參照束。
在另一實(shí)施例中，在進(jìn)入干涉儀前用兩個(gè)光源產(chǎn)生前向束和后向束。兩個(gè)光源可以用分束器或類(lèi)似的光學(xué)裝置從單一光源得到。然后前向束和反向束分別進(jìn)入樣品材料和參照材料，產(chǎn)生樣品束和參照束。然后將樣品束和參照束引入干涉儀。
在某些實(shí)施例中，前向束進(jìn)入的樣品是低透射率的樣品。低透射率樣品是指樣品具有高輻射損耗的特征，例如超過(guò)80％的輻射損耗，通常至少為大約99％，更經(jīng)常是大約99.9％。用本方法可以分析的低透射率樣品可以是高吸收的，高散射的，或是兼有二者的。
本方法可以用來(lái)分析各種不同的樣品。樣品可以是自然發(fā)生的也可以是合成的制品。本方法可以分析的有代表性的樣品包括工業(yè)產(chǎn)品，農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，環(huán)境和廢棄產(chǎn)物等等。感興趣的具體樣品材料包括固體和液體毒品配方，精細(xì)化學(xué)制品，塑料，聚合物，薄膜特別是含有痕量分析物，例如酶，油漆以及其他化學(xué)或物理復(fù)層的薄膜，液體產(chǎn)品包括石油及其各種餾分，包括加熱周油和汽油，礦物質(zhì)，天然和合成寶石例如鉆石，特別是呈粉末狀的，液體的制造廢棄物，天然和合成纖維，小麥和其他谷物，牛奶和奶制品，蛋，肉和其它食品，液體和固體肥料，湖泊和其它湖沼沉積物，以及有機(jī)試樣。在本方法的許多實(shí)施例中，樣品為生理樣品。生理樣品是指從活的多細(xì)胞的有機(jī)體中含有的，獲得的或?qū)С龅牟牧系臉悠?。在許多實(shí)施例中，樣品是組織樣品或其衍生物。在其它實(shí)施例中，樣品是生理液體樣品，例如血液，或其衍生物。根據(jù)采用的具體協(xié)議，樣品可以是從中取樣的多細(xì)胞器官的一部分，或從中分離出來(lái)的。
參照物可以是任何種類(lèi)的材料或其合成物，它提供的參照束在樣品束和參照束組合時(shí)能將樣品束中至少部分(在許多實(shí)施例中基本上是全部)非樣品成分抵銷(xiāo)(null)，如下所述。只要符合上述參數(shù)，參照材料或單元的性質(zhì)可根據(jù)樣品的性質(zhì)而大不相同。在許多實(shí)施例中，參照物是含水組合物，其中，所述組合物可以是純水、水溶液或水分散體。在樣品是組織的實(shí)施例中，參照物可以有純水或其中含有組織樣品中存在的一種或多種成分的水，例如代謝物，蛋白，類(lèi)脂物，核酸等，以及其他模擬組織散射性能的成分，例如模擬組織散射性能的試劑。在樣品是組織的許多實(shí)施例中，參照物包含一種以水為主要成分的固體材料。在參照材料是液體組合物時(shí)，通常置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?。適當(dāng)?shù)娜萜骺梢杂啥趸?，氟化鈣，infrasil，晶體石英等制成。
在本方法中采用的參照材料可以是包含在具有可變路徑長(zhǎng)度或恒定路徑長(zhǎng)度的單元中的一種液體。當(dāng)參照單元具有靜態(tài)或恒定路徑長(zhǎng)度時(shí)，參照單元的路徑長(zhǎng)度，即反向束通過(guò)參照單元所經(jīng)過(guò)的距離，一般至少約為5μm，通常至少約為100μm，更經(jīng)常是至少1mm，其中所述距離可能長(zhǎng)達(dá)1m或更長(zhǎng)，但在許多實(shí)施例中不超過(guò)1cm，且通常不超過(guò)2mm。當(dāng)參照單元具有可變路徑長(zhǎng)度時(shí)，參照單元的長(zhǎng)度一般可調(diào)節(jié)多達(dá)一個(gè)數(shù)量級(jí)，在某些實(shí)施例中，一般可在至少1cm距離內(nèi)調(diào)節(jié)，經(jīng)常是在1mm，更經(jīng)常是在100μm的距離內(nèi)調(diào)節(jié)。這樣，路徑長(zhǎng)度的變化可多達(dá)一個(gè)數(shù)量級(jí)。但在許多實(shí)施例中，如果有路徑長(zhǎng)度的變化，此變化的系數(shù)一般不超過(guò)100％，經(jīng)常不超過(guò)30％，更經(jīng)常的是不超過(guò)10％。
或者，參照材料是一種固體散射材料?？梢允顾鰠⒄詹牧系墓鈱W(xué)散射和吸收特性與樣品相匹配。對(duì)于諸如組織等樣品，參照材料可以是一種以水為主要成分的固體，例如明膠。另一種類(lèi)型的參照材料可以包含多種單獨(dú)的材料。例如，可以使反向束射入各種材料并從中反射來(lái)產(chǎn)生參照束。
在許多實(shí)施例中，在這方面進(jìn)行調(diào)節(jié)以便使兩個(gè)束的能量基本上均衡，因而獲得最佳零位?！笆箖蓚€(gè)束的能量基本上均衡”是指調(diào)節(jié)在本方法中使用的設(shè)備的各種參數(shù)以獲得能量上的變化小于10％，通常小于5％，更經(jīng)常是小于2％的參照束和樣品束?！白罴蚜阄弧笔侵笟w零比至少為5∶1，通常至少為20∶1，更經(jīng)常至少為50∶1的零位，其中歸零比可高達(dá)200∶1或更高，但一般不超過(guò)50∶1。“歸零比”是指前向束中能量的已調(diào)制(A.C.分量)除以組合束中能量的已調(diào)制(A.C.分量)。為獲得最佳歸零比可進(jìn)行的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)參照單元路徑長(zhǎng)度和/或調(diào)節(jié)樣品束和參照束在重新組合或平行校準(zhǔn)時(shí)的重疊使之成為單個(gè)的零束；用可變衰減器調(diào)節(jié)樣品束或參照束的強(qiáng)度(在所述領(lǐng)域眾所周知的兩種可變衰減器實(shí)例是圓形梯度金屬涂復(fù)衰減器和爪形衰減器)以及調(diào)節(jié)參照材料的成分(例如，如果參照單元含有多種成分，改變參照單元中各組分的相對(duì)濃度)。如果調(diào)節(jié)參照單元的路徑長(zhǎng)度，最多可調(diào)節(jié)一個(gè)數(shù)量級(jí)。但在許多實(shí)施例中，調(diào)節(jié)的大小一般不超過(guò)1mm，通常大約為0.5mm，更經(jīng)常是50μm。
本方法的下一步就是檢測(cè)零束。在一個(gè)實(shí)施例中，參照束和樣品束在檢測(cè)器前的某一點(diǎn)以足以產(chǎn)生零束的方式組合成單束，所述零束的特征在于至少一部分非分析物成分不再存在，即它們被抵消了。一般，可用任何合適的光束引導(dǎo)工具，例如反射工具，分束器/準(zhǔn)直器，光纖等將兩束重新組合為單一的零束。或者，可以單獨(dú)檢測(cè)參照束和樣品束然后以電子學(xué)方法將它們組合。在本發(fā)明的雙光源實(shí)施例中，參照束和樣品束進(jìn)入干涉儀的前向和后向端口，接著檢測(cè)輸出束。
在檢測(cè)器檢測(cè)光束之后，下一步就是推導(dǎo)出有關(guān)樣品中所感興趣的一種或多種分析物的存在(常常還有數(shù)量)的信息。在推導(dǎo)步驟中，檢測(cè)的A.C.信號(hào)通常被放大而信號(hào)中的D.C.分量被剔除，信號(hào)中的A.C.分量用AD變換器從模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，得到的數(shù)字信號(hào)由電腦處理，以提供關(guān)于分析物在樣品中的存在和濃度的信息。
作為在單一檢測(cè)器上平衡兩束的光學(xué)強(qiáng)度的替代方案，前向束和后向束可以單獨(dú)檢測(cè)，并用電子學(xué)方法平衡和組合。電子信號(hào)可以用加法放大器組合。在此實(shí)施例中，如果要得到高的歸零比，兩個(gè)檢測(cè)器的光譜響應(yīng)必須類(lèi)似，這是非常重要的。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，可以使用兩個(gè)光源和兩個(gè)檢測(cè)器。
上述方法可以用能提供必須的前向和后向束，能固定感興趣的樣品和參照物，并能將樣品和參照束重新組合成零束的任何合適的裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)。以下詳細(xì)說(shuō)明適用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的代表性裝置。設(shè)備適用于實(shí)現(xiàn)本方法的設(shè)備至少包括以下部件(a)紅外輻射源；(b)干涉儀，用于產(chǎn)生前向和后向束或?qū)⑶跋蚝秃笙蚴敫缮鎯x；(c)參照材料；(d)取樣器具或裝置，例如容器，或視樣品性質(zhì)而定的其它裝置；(e)從參照束和樣品束產(chǎn)生零信號(hào)的裝置；以及(f)檢測(cè)器。此設(shè)備還可包括一個(gè)或多個(gè)在本發(fā)明中會(huì)用到的附加部件，例如模數(shù)變換器(ADC)，以及數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)處理或計(jì)算工具等?，F(xiàn)結(jié)合圖2和圖3詳細(xì)說(shuō)明所述設(shè)備的這些元件，圖2和圖3示出了本發(fā)明的代表性設(shè)備。
在圖2和圖3中，設(shè)備20包括紅外輻射源21。紅外輻射源可以是任何合適的光源，例如白光源，加熱燈絲，金屬碳化物棒等，只要它能發(fā)射具有所需波長(zhǎng)光譜的紅外光(即波長(zhǎng)在0.7到50微米的光)就行。
在設(shè)備20中還有Michelson干涉儀22，在圖2的設(shè)備中，它能接受前向束32和后向束33，在圖3的設(shè)備中，它能將來(lái)自紅外輻射源21的入射光束31轉(zhuǎn)換成前向束32和后向束33。Michelson干涉儀通常包括分束器22a、移動(dòng)鏡面22b和固定鏡面22c以及任選的用于將前向束導(dǎo)入或?qū)С龈缮鎯x的附加鏡面。圖中還示出了光學(xué)組織樣品24，可變路徑參照物23和檢測(cè)器26。
參考圖3的設(shè)備，干涉儀22的分束器22a產(chǎn)生前向束32和后向束33。前向束32從一個(gè)方向被引出干涉儀而后向束33沿輻射源21的入射光的路徑引出干涉儀。后向束不一定要與入射光的路徑重疊。例如，如果用直角鏡片代替干涉儀中的固定和移動(dòng)鏡面，則后向束的路徑就會(huì)偏離入射光的路徑。此時(shí)不需分束器就可收集后向束。這種布局的優(yōu)點(diǎn)是在收集后向束時(shí)入射光沒(méi)有損耗，與單束方法相比，收集光的總量加倍。能提供直角鏡片作干涉儀鏡面并容易接入后向束的市售干涉儀是Bomen Model MB-100?？梢允褂萌魏魏线m的干涉儀，適用的干涉儀包括在Perkin-Elmer2000FTIR分光計(jì)中使用的干涉儀等。
仍參考圖3的裝置，在輻射源的入射束中設(shè)置分束器25，當(dāng)入射束從干涉儀中出來(lái)時(shí)它與后向束相重合。分束器25足以引導(dǎo)部分后向束離開(kāi)入射光路徑，這樣至少有一部分離開(kāi)干涉儀的后向束能被引導(dǎo)通過(guò)可變路徑長(zhǎng)度參照單元23。分束器25一般是3％反射器，經(jīng)常至少是1％反射器，此處，分束器可反射高達(dá)50％或更高，但通常不超過(guò)50％。可以使用任何合適的分束器，例如未涂復(fù)的CaF2，部分金屬化的玻璃或石英等等。然后用任何合適的裝置，例如反射器或鏡面，將后向束中的重新引導(dǎo)部分引導(dǎo)到參照材料。
可變路徑長(zhǎng)度參照單元23在許多實(shí)施例中是可變路徑長(zhǎng)度的水單元，在參照單元中的水組合物中可能包括也可能不包括附加組合物，例如蛋白，類(lèi)脂物，代謝物，糖等，根據(jù)需要而定。本設(shè)備中可能使用的可變路徑長(zhǎng)度的水單元的代表性實(shí)例是配有氟化鈣窗口的可變路徑長(zhǎng)度透射水單元。參照束34來(lái)自可變路徑長(zhǎng)度參照單元。利用拋物面反射器41a和41b以及鏡面41c來(lái)引導(dǎo)后向束和參照束。
最理想的是參照材料的光學(xué)性能和樣品的光學(xué)性能十分匹配。例如，如果樣品是組織，可以將反向束引入高度散射的參照材料，并從中收集漫反射的光用作參照束。除了高度散射以外，參照材料可以含有類(lèi)似水的吸收特性，也可含有諸如因骨膠原，彈性硬蛋白，類(lèi)脂物等引起的吸收特性而與組織的特性更好地匹配。含有水，骨膠原和可能其他材料的凝膠材料可以作為適合的參照材料。為了最佳匹配，可以調(diào)節(jié)水和骨膠原的含量以及參照材料的其他成分以匹配被檢測(cè)的具體組織樣品。
另一種使參照材料的光學(xué)特性與諸如組織等復(fù)雜樣品的光學(xué)特性相匹配的方法是通過(guò)多種材料來(lái)傳輸和/或反射反向束。例如，可使反向束的傳輸通過(guò)兩個(gè)可變路徑長(zhǎng)度單元，一個(gè)含有水，另一個(gè)的水中含有類(lèi)脂物，然后反射和收集從散射材料漫反射的光。水和含類(lèi)脂物傳輸單元的路徑長(zhǎng)度可以加以調(diào)節(jié)以匹配樣品的光學(xué)特性。
前向束32在通過(guò)分束器25c引導(dǎo)后，由拋物面反射器42從干涉儀引導(dǎo)到含有待分析樣品的樣品容器24。樣品容器視所含樣品的特性及使用的參照物的性質(zhì)而各不相同。由任何合適的材料制成的任何合適的樣品容器都可使用。在許多實(shí)施例中，樣品容器是一種組織樣品容器，或是將前向束引導(dǎo)到組織樣品的裝置。樣品束35從樣品中產(chǎn)生，并由拋物面反射器42b和鏡面42c引導(dǎo)。
光纖裝置特別適合于發(fā)送和收集來(lái)自組織和其他散射材料的光。前向束一般聚焦到單光纖或一束光纖上，使輸入光束的焦點(diǎn)與光纖的數(shù)值孔徑很好匹配。光纖材料本身在所關(guān)心的光學(xué)區(qū)域中應(yīng)基本上是透明的。為了有效地注入光線，光纖或光纖束應(yīng)緊靠樣品，最好與樣品直接接觸。然后周單獨(dú)的光纖或光纖束收集注入的光。收集束通常是環(huán)形布置，圍繞輸入光纖?；蛘?，收集光纖或光纖束可以設(shè)置在輸入光纖的環(huán)形圈的中心。輸入和收集光纖也可以布置成隨機(jī)的或有序的網(wǎng)格。為了增加光通量，可以以相對(duì)于樣品平面的非正交角度設(shè)置輸入和輸出光纖。在輸入和輸出光纖之間可以設(shè)置與樣品接觸的不透明的屏蔽，以便防止光線還沒(méi)有首先通過(guò)樣品就直接從輸入光纖到達(dá)輸出光纖。
如圖3所示，參照束和樣品束，分別為34和35，在第二分束器25b處重新組合，分束器25b和第一分束器25可以是、也可以不是同一類(lèi)型。分束器25b應(yīng)足以重新組合參照束和樣品束以產(chǎn)生零束。
或者，參照束和樣品束可以不用分束器而直接在檢測(cè)器表面重新組合。直接重新組合的一個(gè)方便方法是使利用光纖取樣器獲得的參照束和樣品束緊靠或直接接觸檢測(cè)器。只要參照束和樣品束的強(qiáng)度匹配很好，且檢測(cè)器區(qū)域等于或大于樣品和參照光纖照射的區(qū)域，就可獲得極佳的零位。
在圖2所示的設(shè)備中，用單一光源和分束器在干涉儀之前產(chǎn)生前向和后向束。和圖3所示的設(shè)備一樣，前向和后向束與樣品和參照材料分別相互作用，產(chǎn)生樣品束和參照束。但是，不像在圖3所示的設(shè)備中在干涉儀后重新組合，現(xiàn)在將樣品束和參照束注入Michelson干涉儀的兩個(gè)端口，它們?cè)诟缮鎯x內(nèi)重新組合。
在圖2和圖3所示的設(shè)備中，將出現(xiàn)的零束36引導(dǎo)到檢測(cè)器26上，也任選擇通過(guò)透鏡26(a)將零束聚焦到檢測(cè)器上。檢測(cè)器是一個(gè)能將入射的零束轉(zhuǎn)換為模擬信號(hào)的檢測(cè)器。可以使用各種合適的檢測(cè)器，適用的檢測(cè)器包括砷化銦鎵(InGaAs)，銻化銦(InSb)，鍺等等。
檢測(cè)器產(chǎn)生的模擬信號(hào)的A.C.分量由放大器27放大而D.C.分量被剔除，放大器27的增益設(shè)定為滿足同在該設(shè)備中的模數(shù)變換器(ADC)28的要求。任何合適的放大器都可以適用在所述設(shè)備中，代表性的放大器包括AD797等。ADC可以是任何合適的ADC。由于所述設(shè)備的性能，ADC不必是超高精度的ADC，而只需要是16位的ADC。ADC的數(shù)字輸出然后由數(shù)據(jù)處理裝置29處理，例如計(jì)算裝置，它能獲取數(shù)字信號(hào)并推導(dǎo)出樣品中分析物的存在，更經(jīng)常的是樣品中分析物的數(shù)量。
處理數(shù)字信號(hào)的優(yōu)選方法包括以下步驟(1)任選的初始步驟從雙束樣品干涉圖中(在前向束中用樣品測(cè)量，在參照束中用背景材料測(cè)量)減去雙束背景干涉圖(在前向和后向束中都用背景材料測(cè)量)，得到校正的雙束樣品干涉圖。
(2)對(duì)雙束樣品干涉圖(或者已按第一步校正，或者未校正)進(jìn)行傅立葉變換，于是干涉圖變換為雙束樣品光譜。
(3)隨任選的初始步驟1而定的任選的隨后步驟對(duì)單束樣品干涉圖(在前向束中用樣品測(cè)量，后向束阻塞)進(jìn)行傅立葉變換，得到單束樣品光譜。
(4)雙束樣品光譜算法的計(jì)算，得到雙束樣品偽吸收率光譜。
(5)隨步驟3而定的任選的隨后步驟單束樣品光譜算法的計(jì)算，隨后從雙束樣品偽吸收率光譜中減去此光譜，得到雙束樣品吸收率光譜。
(6)將吸收率或偽吸收率光譜乘以比例函數(shù)，得到比例吸收率光譜。
(7)從比例吸收率光譜減去平均光譜，得到以平均值為中心的比例吸收率光譜。
(8)將以平均值為中心的比例吸收率光譜中的每個(gè)光譜點(diǎn)乘以回歸系數(shù)。
(9)將步驟8中所有光譜點(diǎn)的結(jié)果相加，得到樣品中分析物濃度的預(yù)計(jì)(值)。
比例函數(shù)，平均光譜以及回歸系數(shù)都在校準(zhǔn)階段確定。校準(zhǔn)階段涉及到測(cè)量分析物濃度已知的樣品的雙束FTIR光譜。比例函數(shù)，平均光譜以及回歸系數(shù)的確定應(yīng)使已知的分析物濃度與從雙FTIR光譜預(yù)計(jì)的分析物濃度之間的差別減至最小。實(shí)現(xiàn)上述的技術(shù)在所述領(lǐng)域已眾所周知，這些技術(shù)包括部分最小平方和主分量回歸。這兩種技術(shù)在“多元校準(zhǔn)”(Multivariate Calibration)H.Martens和T.Naes，Wiley and Sons，New York(1989)一書(shū)中有深入的討論。
上述設(shè)備可以是實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的裝置，或小型化設(shè)備供現(xiàn)場(chǎng)使用，例如醫(yī)生辦公室，家庭使用等。實(shí)用性本方法和設(shè)備可以用在需要檢測(cè)并測(cè)定低透射率樣品中一種或多種分析物濃度的各種不同的應(yīng)用中。在這方面，本方法和設(shè)備可用于檢測(cè)各種不同類(lèi)型樣品中的分析物，例如環(huán)境樣品例如土壤和水中的污染物或有毒物質(zhì)，農(nóng)業(yè)和食物產(chǎn)品中的有毒物質(zhì)或病原體，檢測(cè)工業(yè)產(chǎn)品中的雜質(zhì)等等。一種特別重要的應(yīng)用就是用本發(fā)明的方法和設(shè)備來(lái)檢測(cè)在活體內(nèi)和不在活體內(nèi)的生理樣品(如血液，組織或其衍生物)中一種或多種血液分析物。
用本方法可以檢測(cè)各種不同的分析物，有代表性的分析物包括酒精，甲醛，葡萄糖，谷氨酸，甘油，β-羥基丁酸鹽，L-乳酸鹽，亮氨酸，蘋(píng)果酸，丙酮酸，類(lèi)固醇，抗壞血酸，丙酮和其它酮體，葉酸鹽，氨，膽紅素，肌酸酐(肌酸酐)，血紅蛋白，類(lèi)脂物，苯基丙氨酸，蛋白質(zhì)(包括白蛋白和球蛋白)，甘油三酸脂，尿素，以及濫用的藥物和毒品。雖然原則上本方法可以用來(lái)測(cè)定各種不同的生理樣品(例如尿，眼淚，唾液等)中一種分析物的存在及其數(shù)量，但是，它特別適用于測(cè)定血液或一丁點(diǎn)血液以及組織或一丁點(diǎn)組織中分析物的濃度。一個(gè)特別重要的應(yīng)用就是用本發(fā)明的方法和設(shè)備來(lái)檢測(cè)在活體內(nèi)和不在活體內(nèi)的組織樣品中葡萄糖的存在并測(cè)定其數(shù)量。
按本方法檢測(cè)血液分析物可以應(yīng)用在各種不同的醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，包括疾病診斷，疾病管理等。
現(xiàn)提供以下實(shí)例，作為說(shuō)明，而非作為限制。實(shí)驗(yàn)I.在弱散射水性樣品中分析物的檢測(cè)對(duì)于弱散射強(qiáng)吸收的樣品，例如與近到中紅外波長(zhǎng)的光相互作用的分析物(如血漿)的水溶液，前向束和后向束均可采用透射方式。舉例來(lái)說(shuō)，我們對(duì)含有與生理有關(guān)的三種分析物(肌酸酐，葡萄糖和尿素)的水性溶液作了單束(先有技術(shù))和雙束FTIR的預(yù)計(jì)能力的比較。
用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的儀器配置示于圖3。將市售的單束FTIR分光計(jì)(Perkin Elmer Spectrometer2000)改作雙束儀器使用。儀器置于大氣環(huán)境中(21+/-1℃，40+/-5％RH)。用50％“圓點(diǎn)花紋”(polka dot)分束器(Oriel Instrument，model no.38106)分離光源和后向束。前向束也由50％“圓點(diǎn)花紋”分束器反射，以均衡兩個(gè)光束的強(qiáng)度。復(fù)金拋物面反射器分別將前向束和后向束聚焦到樣品和參照單元上。樣品和參照單元的路徑長(zhǎng)度為0.5mm，是由它們的透明石英窗口之間的間距來(lái)定義的。樣品和參照單元的溫度調(diào)節(jié)到22.0℃+/-0.1℃。然后用復(fù)金拋物面反射器重新準(zhǔn)直前向束和后向束。然后用50％“圓點(diǎn)花紋”分束器組合此兩個(gè)光束，并用硅透鏡(2”直徑，約25mm焦距)將光束聚焦到InSb檢測(cè)器上(7mm直徑有效區(qū)，冷卻到77K)。
信號(hào)中的D.C.分量被去除，A.C.分量被放大到接近符合模數(shù)(A/D)變換器的要求。本組實(shí)驗(yàn)的零位比大約為40∶1。因此用雙束信號(hào)符合A/D變換器所需的放大約為用單束信號(hào)的40倍。將每個(gè)樣品的單束和雙束干涉圖逐個(gè)交錯(cuò)。按照已經(jīng)描述的步驟(包括任選步驟)處理光譜(見(jiàn)“裝置”一節(jié))。
由含有肌酸酐，尿素和葡萄糖的27種溶液組成的樣品以三種濃度溶于水中(肌酸酐370,650和930mg/dL；尿素230,585和940mg/dL；葡萄糖0,250和500mg/dL)。參照單元含純水。整組27種溶液共測(cè)三天，每天測(cè)一次。這三個(gè)測(cè)量日共跨越大約7周。含純水的樣品用作背景樣品。背景樣品在每組27種溶液的測(cè)量開(kāi)始和結(jié)束時(shí)進(jìn)行測(cè)量。27種溶液在每個(gè)測(cè)量日當(dāng)天新配制并以不同的隨機(jī)順序進(jìn)行測(cè)量。
與水相比，三種分析物的光吸收很弱。這樣，27種樣品的單束光譜用肉眼幾乎無(wú)法區(qū)分。相反，雙束光譜中實(shí)際上由于光學(xué)歸零(optical nulling)效果，燈發(fā)射光譜和水吸收效果已大部分去除，故雙束光譜顯示出清晰而明顯的隨分析物濃度的變化而發(fā)生的光譜變化。圖4A和4B分別示出三個(gè)樣品在4000-5000cm-1區(qū)域中單束和雙束的光譜，在所述三個(gè)樣品中，肌酸酐和尿素的濃度固定在其最低水平，而葡萄糖濃度在其三種濃度水平之間變化。隨變化的葡萄糖濃度而發(fā)生的最大光譜變化區(qū)域(4700cm-1)對(duì)應(yīng)于葡萄糖在水中的已知吸收波段。
使用部分最小平方(PLS)來(lái)分析在4000-8000cm-1光譜范圍內(nèi)NIR光譜的預(yù)計(jì)含量。選擇某一樣品作預(yù)計(jì)，其余26個(gè)樣品用作校準(zhǔn)，以評(píng)估在某一實(shí)驗(yàn)日內(nèi)對(duì)分析物的預(yù)計(jì)。用這種方式對(duì)所有27個(gè)樣品輪流進(jìn)行，以評(píng)估“交叉有效“的預(yù)計(jì)性能。對(duì)單束和雙束方式獲得的光譜作葡萄糖濃度的預(yù)計(jì)在圖5中作了比較。從雙束和單束光譜作葡萄糖濃度的預(yù)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEP)分別為11.3和22.8mg/Dl(即，預(yù)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差是預(yù)計(jì)濃度和參照濃度之間均方差的平方根)。與單束FTIR相比除了預(yù)計(jì)性能有改進(jìn)外，雙束FTIR的校準(zhǔn)模型也簡(jiǎn)單得多。這一點(diǎn)從PLS模型中SEP與因素?cái)?shù)的關(guān)系圖中可以看出(圖6)。在最佳雙束校準(zhǔn)模型中只用了5個(gè)因素，而單束校準(zhǔn)模型用到13個(gè)因素時(shí)仍未達(dá)到最小的SEP值。
用第一日的數(shù)據(jù)作為校準(zhǔn)組并預(yù)計(jì)隨后的兩日，以評(píng)估經(jīng)過(guò)多日的分析物預(yù)計(jì)。單束和雙束技術(shù)分別在12和4個(gè)因素時(shí)的結(jié)果匯總在圖7A和7B?？傊?，與單束FTIR相比，雙束技術(shù)顯示出無(wú)論短期(當(dāng)天)或長(zhǎng)期(超過(guò)7周)都具有更好的對(duì)水溶液中分析物濃度的預(yù)計(jì)能力。
II.組織中葡萄糖的檢測(cè)對(duì)于含有弱吸收分析物的強(qiáng)散射樣品，例如哺乳動(dòng)物組織中的葡萄糖，前向或樣品束可以采用反射模式，而反向或參照束可以是透射方式。
用來(lái)進(jìn)行所述測(cè)量的儀器配置示于圖2。用一個(gè)氟化鈣薄板將光分為前向束和后向束。由于在高散射組織中大部分光都會(huì)損失掉，故干涉儀總通量的96％用作前向束，其余4％用作通過(guò)參照單元的后向束。
參照單元的溫度應(yīng)調(diào)節(jié)到待測(cè)組織表面同樣的溫度，因?yàn)樵诠庾V的近紅外部分，水的光譜對(duì)溫度十分敏感?？梢栽谌我粋€(gè)或兩個(gè)光束中使用衰減器以平衡檢測(cè)器上的能量。利用氟化鈣透鏡將前向束聚焦到光纖束的輸入端。光纖束將前向束引導(dǎo)到例如，被測(cè)量的人體的前臂上。在組織表面與輸入光纖交織的是輸出光纖，輸出光纖將散射的且部分被吸收的光從組織引導(dǎo)到檢測(cè)器。在檢測(cè)器處與輸出光纖交織的是參照(反向束)光纖，參照光纖將已通過(guò)參照單元的光也引導(dǎo)到檢測(cè)器。檢測(cè)器的選擇應(yīng)使其表面積略大于由交織的輸出光纖束照射的總面積。樣品和參照束在檢測(cè)器表面直接組合，形成零束。
信號(hào)中的D.C.分量以電子學(xué)方式去除，A.C.分量以電子學(xué)方式放大到接近符合模數(shù)(A/D)變換器的要求。即使樣品束由散射光組成而參照束由基本上沒(méi)有任何散射地透射過(guò)參照單元的光組成，零位比很容易達(dá)到約20∶1。用雙束信號(hào)符合A/D變換器所需的放大約比用單束信號(hào)高20倍。以模擬方式測(cè)量物體在隨機(jī)的但已知的葡萄糖水平時(shí)的零位光譜，以進(jìn)行校準(zhǔn)，溶液光譜校準(zhǔn)在下面說(shuō)明。
從上述結(jié)果和討論顯而易見(jiàn)，本發(fā)明在利用FTIR作分析物檢測(cè)方面提出了重要的突破。具體地說(shuō)，本方法和設(shè)備克服了周FTIR測(cè)定組織中葡萄糖所遇到的原有問(wèn)題，例如儀器漂移問(wèn)題，需要使用高精度的ADC等，重要的是，本方法和設(shè)備能夠提供血液分析物、例如葡萄糖等的高精確非侵入測(cè)量。在這方面，本發(fā)明是對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)。
在本說(shuō)明中引用的所有公開(kāi)和專(zhuān)利均作為參考包括在本文中，如同每一份單獨(dú)的公開(kāi)和專(zhuān)利均單獨(dú)和分別作為參考包括在本文中一樣。任何公開(kāi)的引用是關(guān)于其在提交日之前的公開(kāi)，不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)由于原有的發(fā)明而本發(fā)明無(wú)權(quán)先期利用這類(lèi)公開(kāi)。
雖然為了清楚地理解的目的已經(jīng)通過(guò)圖示和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作了較詳細(xì)的說(shuō)明，但是，對(duì)于本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然，在不背離所附權(quán)利要求書(shū)的精神或范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定低透射率樣品中分析物濃度的方法，所述方法包括(a)從低透射率樣品中產(chǎn)生樣品束，從參照物中產(chǎn)生參照束；(b)從所述樣品束和參照束產(chǎn)生零信號(hào)；以及(c)從所述零信號(hào)推導(dǎo)出在所述低透射率樣品中所述分析物的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括利用由至少一個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生的前向束和后向束來(lái)產(chǎn)生所述樣品束和參照束。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法還包括使光通過(guò)干涉儀。
4.如權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其特征在于所述前向束和后向束是由單一紅外輻射源產(chǎn)生的。
5.如權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其特征在于所述前向束和后向束是由兩個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生的。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述零信號(hào)是通過(guò)在單一檢測(cè)器檢測(cè)之前組合所述樣品束和參照束用光學(xué)方法產(chǎn)生的。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述零信號(hào)是所述樣品束和參照束在兩個(gè)分開(kāi)的檢測(cè)器上檢測(cè)后以電子學(xué)方法產(chǎn)生的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括(a)用干涉儀從單一紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束；(b)將所述前向束引導(dǎo)到所述低透射率樣品并且將所述后向束引導(dǎo)到參照物，并分別收集樣品束和參照束；(c)組合所述樣品束和參照束，產(chǎn)生零束；(d)用單一檢測(cè)器檢測(cè)所述零束，獲得檢測(cè)到的零信號(hào)；以及(e)從所述檢測(cè)到的零信號(hào)推導(dǎo)出在所述低透射率樣品中所述分析物的存在。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括(a)從至少一個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束；(b)引導(dǎo)所述前向束通過(guò)所述低透射率樣品并且引導(dǎo)所述后向束通過(guò)參照物，以分別產(chǎn)生樣品束和參照束；(c)將所述樣品束和參照束引入干涉儀，在它們從所述干涉儀出來(lái)后由所述樣品束和參照束產(chǎn)生零信號(hào)；以及(d)從所述零信號(hào)推導(dǎo)出在所述低透射率樣品中所述分析物的存在。
10.如上述權(quán)利要求中任何一個(gè)所述的方法，其特征在于所述低透射率樣品是高反射樣品和高吸收樣品中的至少一種。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述樣品是生理樣品。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述生理樣品是從由血液、組織或其衍生物組成的組中選擇的。
13.如上述權(quán)利要求中任何一個(gè)所述的方法，其特征在于所述參照物包括水。
14.如上述權(quán)利要求中任何一個(gè)所述的方法，其特征在于所述分析物是葡萄糖。
15.一種用于測(cè)定低透射率樣品中分析物濃度的雙束紅外分光計(jì)設(shè)備，所述設(shè)備包括從至少一個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束的裝置；從所述前向束和后向束產(chǎn)生樣品束和參照束的裝置；以及從所述樣品束和參照束產(chǎn)生零信號(hào)的裝置。
全文摘要
提出了用于測(cè)定低透射率樣品中至少一種分析物的存在和/或濃度的方法和設(shè)備。在這些方法中，由至少一個(gè)紅外輻射源產(chǎn)生前向束和后向束或?qū)⑵湟氲礁缮鎯x中。前向束通過(guò)樣品、然后被收集、產(chǎn)生樣品束，而后向束通過(guò)參照物、然后被收集、產(chǎn)生參照束。樣品束和參照束或者光學(xué)重新組合成為零束、由單一檢測(cè)器檢測(cè)，或者通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的檢測(cè)器檢測(cè)后用電子方法歸零。然后從檢測(cè)到的零束推導(dǎo)出至少一種分析物的存在、更經(jīng)常是推導(dǎo)出其濃度。還提出了實(shí)現(xiàn)上述方法的設(shè)備。本方法和設(shè)備適用于各種不同的應(yīng)用，包括檢測(cè)生理樣品(如血液、組織及其衍生物)中一種或多種分析物的存在和數(shù)量。
文檔編號(hào)G01N21/45GK1444726SQ01813602
公開(kāi)日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2001年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月1日
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