專利名稱：特異結(jié)合分析方法及用于其的特異結(jié)合分析裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實施對試料中的分析對象物的定量或定性的特異結(jié)合分析方法及用于其的特異結(jié)合分析裝置。
背景技術(shù)：
近年來，隨著家庭及地區(qū)等醫(yī)療的充實及緊急性較高的臨床檢查等的增加，普遍希望開發(fā)出即使沒有臨床檢查專家在場，也能迅速簡便而且正確地實施的特異結(jié)合分析方法。
作為現(xiàn)有的特異結(jié)合分析方法，已知的有利用抗原抗體反應(yīng)的免疫分析、利用受體的受體分析及利用互補核酸配置的雜交的核酸探針分析等多種方法。上述方法根據(jù)其特異性的高低，被廣泛地用于臨床檢查至各種領(lǐng)域。
在作為一種免疫分析方法的色譜分析法中，比如，利用在由非溶化(固定)多孔性載體或微粒子充填型載體形成的基體中使特異結(jié)合物質(zhì)與液狀試料接觸，利用在基于毛細現(xiàn)象的浸透力的作用下，液狀試料沿基體浸透的現(xiàn)象，分析試料中的分析對象物是否存在(參照日本國專利第2504923號、日本國專利第2667793號、特公平7-78503號、特開平10-73592號、特開平8-240591號各公報)。
具體地說，首先，使由通過肉眼與光學(xué)方法等可任意探測的示蹤劑示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)與分析對象物發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)。這樣，使上述分析對象物通過上述第1特異結(jié)合物質(zhì)，與在上述基體中被固定化的結(jié)合材料發(fā)生結(jié)合。這樣，根據(jù)在上述基體中被固定的上述第1特異結(jié)合物質(zhì)的示蹤量，最終分析試料中的分析對象物是否存在。
由于由應(yīng)用該色譜分析法的基體構(gòu)成的載體的表面積較大，可以固定大量的特異結(jié)合物質(zhì)，因而引起特異結(jié)合反應(yīng)的反應(yīng)分子之間的沖撞頻度大于液相中的反應(yīng)的場合。因此，上述色譜分析法在測定敏感度與測定時間方面有利。
然而，上述的色譜分析法，第1，存在一個被稱為前界現(xiàn)象的問題。其主要是一個在試料中的分析對象物濃度較高的場合下發(fā)生的問題。所謂前界現(xiàn)象，是一種針對來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號的強度不能單義決定分析對象物的濃度的現(xiàn)象。
具體地說，在試料中分析對象物過剩的場合下，與被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的分析對象物及未與被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的分析對象物(單體)在基體中存在。這樣，與被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的分析對象物及單體分析對象物與被固定在基體中的結(jié)合材料(第2特異結(jié)合物質(zhì))競爭，發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)。這樣，作為單體的分析對象物與結(jié)合劑結(jié)合，與被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的分析對象物有時通過毛細現(xiàn)象在浸透力的作用下超越檢測部，從該檢測部流出。這樣，與結(jié)合材料結(jié)合的被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)的量將減少，基于第1特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度不能與被包含在試料中的分析對象物的量正確對應(yīng)。
因此，在試料中分析對象物過剩的場合下，根據(jù)示蹤量被特定的分析對象物的量將異常小，許多場合下不能正確把握試料中的分析對象物的存否及濃度。
為消除這種前界現(xiàn)象的影響，正確測定分析對象物的濃度等，提出了通過把試料稀釋成各種濃度，分別測定不同濃度下的試料的多個信號，確認分析對象物是否以高濃度存在的設(shè)想。然而存在著必須采用多個反應(yīng)容器，測定工序復(fù)雜，造成分析裝置大型化及復(fù)雜化的問題。
于是，本發(fā)明的第1目的在于提供由前界現(xiàn)象所產(chǎn)生的影響較小，對試料中的分析對象物進行迅速，簡便且正確的定量或定性的特異結(jié)合分析方法及用于其的特異結(jié)合分析裝置。
第2，上述的現(xiàn)有的光譜分析法存在一個由本底產(chǎn)生的影響的問題。其主要是一個在試料中的分析對象物濃度較低的場合下發(fā)生的問題。所謂本底是不含分析對象物的試料所表現(xiàn)出的行為。比如，在對來自特異結(jié)合物質(zhì)等的非特異吸附以及顯色的信號進行測定場合下的試料自身的顯色等所引起的信號強度與分析對象物自身的信號強度相加，其結(jié)果是測定敏感度下降。即原本底的信號強度被認為是零，與此相反，受在對來自特異結(jié)合物質(zhì)等的非特異吸附以及顯色的信號進行測定場合下的試料自身的顯色等的影響，本底的信號強度大于零。
比如，在發(fā)生非特異吸附的場合下，為降低上述非特異吸附，通過在反應(yīng)區(qū)涂布表面活性劑或密封材料等進行前期處理，添加試料，然后把反應(yīng)區(qū)洗凈。然而，即使實施上述操作，仍然會存在某種程度的非特異吸附，難以完全消除由本底所產(chǎn)生的影響。
此外，對于比如作為臨床檢查的試料要求頻度較高的全血，在使其自身顯色后的試料展開的免疫色譜分析的場合下，由檢測部的顯色所產(chǎn)生的信號與特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號相加后，將包含由本底所產(chǎn)生的信號。因此，在試料中的著色成分由于試料的流動而超越檢測部之前，即從檢測部流出之前，要想只探測出由特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號是困難的。為此，在可以無視來自本底的信號之前，有必要等待信號的探測結(jié)果，因而存在一個測定時間較長的問題。
與此相對，為降低由本底所產(chǎn)生的影響，提出了利用離心分離等的試料前期處理，通過過濾等除去試料中所含有的著色成分，或者對探測波長進行探討等各種方法。然而，如果利用上述方法，又會帶來諸如操作復(fù)雜化，色譜分析儀內(nèi)的試料展開性惡化，以及檢測部內(nèi)的信號強度減弱等新問題。
除此之外，雖然還有通過免疫色譜儀或外部測量儀掃描，讀取本底自身的信號強度與檢測部的信號強度之差的方法，但易造成測定裝置的大型化及復(fù)雜化。
此外，作為特異結(jié)合分析方法中的共同的問題點，還可舉出試料中的雜質(zhì)所產(chǎn)生的影響。所謂雜質(zhì)系指試料中所含有的分析對象物之外的不純物等物質(zhì)。雜質(zhì)與具有與分析對象物同樣行為的物質(zhì)(比如與分析對象物的構(gòu)造類似的物質(zhì)等)或分析對象物結(jié)合，妨礙分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合反應(yīng)。因此，由實際檢測部根據(jù)示蹤劑探測出的信號強度來自分析對象物及雜質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合反應(yīng)。這樣，雜質(zhì)的存在將大大影響特異結(jié)合分析方法下的定量或定性結(jié)果。
為降低由雜質(zhì)所帶來的影響，在通過前期處理，除去試料中的雜質(zhì)的場合下，操作較復(fù)雜。此外，雖然也有選擇只能與分析對象物發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)作為特異結(jié)合物質(zhì)的方法，但許多場合下，由于分析對象物的原因，選擇這種特異結(jié)合物質(zhì)的本身是困難的。
于是，本發(fā)明的第2目的在于提供由本底或雜質(zhì)所產(chǎn)生的影響較小，對試料中的分析對象物進行簡便、迅速且正確的定量或定性的特異結(jié)合分析方法及用于其的特異結(jié)合分析裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種特異結(jié)合分析方法，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于包括(a)按預(yù)先包含分析對象物的各種試料，生成至少包含以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)庫的工序由上述分析對象物與針對上述分析對象物具有特異鍵合性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm；(b)準備包含分析對象物的試料，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定與上述試料對應(yīng)的上述信號強度的測定模式的工序；(c)使上述分析對象物與特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)的工序；(d)在上述工序(c)后，基于上述測定模式，在基于上述特異鍵合反應(yīng)的信號強度達到飽和之前的期間內(nèi)，對上述信號強度至少測定2次的工序；(e)利用在上述工序(d)中得到的至少2個信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，對上述試料中的分析對象物的量進行確定的工序。
理想的是，在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出是具有上述極大值的場合下，上述測定模式至少在時間t1及t2(tm≤t1＜t2≤ts)分別對信號強度A1及A2進行測定，而且在上述時間ts對信號強度As進行測定，在上述工序(e)中，利用上述信號強度A1及A2的變化以及上述信號強度As，基于上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系，決定上述試料中的分析對象物的量。
再理想的是，在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出是沒有上述極大值的場合下，上述測定模式至少在時間t3及t4(t3＜t4＜ts)對信號強度A3及A4進行測定，在上述工序(e)中，基于上述信號強度A3及A4的變化以及上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系，決定上述試料中的分析對象物的量。
再理想的是，在上述工序(c)中，使上述分析對象物與被由示蹤劑示蹤的第1特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)，并使上述分析對象物與第2特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)。
再理想的是，上述特異結(jié)合分析方法，包括制作包含在上述工序(b)之前，點著上述試料的試料點著部，以及，對第2特異鍵合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并可對來自特異鍵合反應(yīng)的信號進行檢測的檢測部的試驗條的工序(X)，在上述工序(d)中，通過在上述試料點著部將上述試料點著，利用毛細現(xiàn)象使上述試料流入上述檢測部，來使與上述第1特異鍵合物質(zhì)鍵合后的分析對象物與上述第2特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)。
再理想的是，在上述工序(d)中，利用上述示蹤劑對上述信號強度進行測定。
再理想的是，在上述工序(X)中，在上述試料點著部與上述檢測部之間，設(shè)有具有被由示蹤劑示蹤的第1特異鍵合物質(zhì)的保持部。
而且，可以在上述工序(d)中，沿著上述試驗條上的上述試料的浸透方向在上述檢測部對上述信號強度進行連續(xù)測定。
而且，可以在上述工序(d)中，根據(jù)表示上述浸透方向的位置與上述信號強度的關(guān)系的檢量線，決定上述信號強度。
再理想的是，本發(fā)明提供一種特異鍵合分析裝置，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于包括(1)包括下述數(shù)據(jù)庫的存儲部，該數(shù)據(jù)庫按包含設(shè)想的分析對象物的各試料，至少包含由上述分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm；
(2)試驗條，其包括用于點著包含分析對象物的試料的試料點著部以及對特異鍵合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并可對來自特異鍵合反應(yīng)的信號進行檢測的檢測部；(3)第1探測器，其探測上述信號；(4)控制器，其基于上述數(shù)據(jù)庫決定上述信號強度的測定模式，依據(jù)上述測定模式由上述探測器探測上述信號，決定上述信號的強度；(5)解析部，其利用上述信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，對上述試料中的分析對象物的量進行確定。
理想的是，上述特異結(jié)合分析裝置，還包括用于探測對至上述試料點著部的試料的點著的第2探測器。


圖1是本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法的工序圖。
圖2是表示來自采用了特定濃度試料的特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度的經(jīng)時變化曲線圖。
圖3是表示信號強度的飽和值與分析對象物的濃度之間的關(guān)系曲線圖。
圖4是表示來自采用了特定濃度試料的特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度的經(jīng)時變化曲線圖。
圖5是表示信號強度的時間變化率與分析對象物的濃度之間的關(guān)系曲線圖。
圖6是本發(fā)明中采用的試驗條一例的概略斜視圖。
圖7是表示本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析裝置一例的構(gòu)成概念圖。
圖8是表示檢測部附近的上述浸透方向的位置與上述信號強度的關(guān)系(分布狀況)的檢量線。
圖9是表示來自采用了特定濃度試料的特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度的經(jīng)時變化曲線圖。
圖10是表示信號強度的飽和值與hCG濃度之間的關(guān)系曲線圖。
實施方式A.特異結(jié)合分析方法本發(fā)明是一種特異結(jié)合分析方法，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異結(jié)合特性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于配有(a)按照包括預(yù)先想定的分析對象物的各種試料，生成至少包括以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)庫的工序由上述分析對象物與針對該上述分析對象物具有特異結(jié)合性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm、(b)準備包含分析對象物的試料，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定與上述分析對象物對應(yīng)的上述信號強度的測定模式的工序、(c)使上述分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)的工序、(d)在上述工序(c)后，基于上述測定模式，在基于上述特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度達到飽和之前的期間內(nèi)，對上述信號強度至少測定2次的工序、(e)利用在上述工序(d)中得到的至少2個信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，對上述試料中的分析對象物的量進行特定的工序。
在本發(fā)明中，在探測試料中含有的分析對象物在特異結(jié)合反應(yīng)中所顯示的信號，對上述分析對象物的量進行測定時，為解決上述的前界現(xiàn)象及本底的問題，預(yù)先生成包括來自各種試料的特異結(jié)合反應(yīng)的信號等的數(shù)據(jù)庫。這樣，在實施試料的定量時，根據(jù)該試料的種類等，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定上述信號的測定模式，實施實際信號測定，此外基于信號的測定值及上述數(shù)據(jù)庫，對上述分析對象物的量進行特定。
這里，本發(fā)明下的試料是分析對象物被包括并被預(yù)測的液態(tài)試料。比如可舉出尿、血清、血漿、全血、唾液、淚液、髓液、及乳頭等的分泌液等。對于粘液、體組織及細胞等固狀物、凝膠狀物及溶膠狀物，可以通過緩沖液、抽出液或溶解液等液體進行懸濁或溶解處理，配制成試料。
此外，本發(fā)明中的分析對象物可以是含有具有能與該分析對象物進行特異結(jié)合的特性的特異結(jié)合物的物質(zhì)。比如可以舉出具有抗體或抗原功能的各種蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白質(zhì)、多糖類、復(fù)合糖脂質(zhì)、核酸、效應(yīng)分子、受體分子、酶及抑制劑等。更具體地說，可舉出α-胎蛋白、癌胎兒性抗原(CEA)、CA125及CA19-9等腫瘤標記、β2-微球蛋白(β2m)及鐵蛋白等各種蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)或復(fù)合糖脂質(zhì)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、人體絨毛性腺刺激激素(hCG)、黃體形成激素(LH)及人體胎盤催乳激素(hPL)等各種激素、HBs抗原、HBs抗體、HBc抗原、HBc抗體、HCV抗體及HIV抗體等各種病毒抗原或病毒抗體、各種變應(yīng)原及與此對應(yīng)的IgE抗體、麻醉性藥物、醫(yī)療性藥物及其代謝產(chǎn)物、與病毒及腫瘤相關(guān)的多核苷酸結(jié)構(gòu)性核酸等。
接下來，本發(fā)明中的特異結(jié)合物質(zhì)可以是能與上述分析對象物特異結(jié)合的物質(zhì)，比如可舉出抗體、抗原、糖蛋白質(zhì)、多糖類、復(fù)合糖脂質(zhì)、核酸、效應(yīng)分子、受體分子、酶及抑制劑等。
在本發(fā)明中，最好采用由示蹤劑示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)及第2特異結(jié)合物質(zhì)，使被示蹤的上述第1特異結(jié)合物質(zhì)與上述第2特異結(jié)合物質(zhì)通過分析對象物被結(jié)合。根據(jù)這種方法，比如把第2特異結(jié)合物質(zhì)固定到某處后，通過只在被固定的部分中對上述示蹤劑所產(chǎn)生的信號進行探測及測定，便可以適宜地實施本發(fā)明的方法。
因此，從高特異性觀點出發(fā)，第1特異結(jié)合物質(zhì)與第2特異結(jié)合物質(zhì)中的至少一個最好是抗體。此外最好采用單克隆抗體。
第1特異結(jié)合物質(zhì)與第2特異結(jié)合物質(zhì)沒有必要一定要采用相同的物質(zhì)。此外，在分析對象物沒有多個同一表位的場合下，作為第1特異結(jié)合物質(zhì)與第2特異結(jié)合物質(zhì)，最好采用針對不同的表位分別具有不同的特異性的物質(zhì)。不過，在分析對象物具有多個同一表位的場合下，作為第1特異結(jié)合物質(zhì)與第2特異結(jié)合物質(zhì)，可以采用同一的特異結(jié)合物質(zhì)。此外，也可以不采用被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)，利用示蹤劑對分析對象物本身進行示蹤。
此外，在與第2特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合反應(yīng)中，也可以使與分析對象物具有相同行為的物質(zhì)或被示蹤的物質(zhì)與分析對象物共同存在。這樣，可以實施利用競爭反應(yīng)的定量，前界現(xiàn)象的回避也可被期待。
此外，在試驗條以外實施分析對象物與第1特異結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合的場合下，最好采用未被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)，與其它已被示蹤的特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。通過預(yù)先使分析對象物與非示蹤特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，可以減少與被示蹤的特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的分析對象物的量。因此，可以實施利用競爭反應(yīng)的定量，前界現(xiàn)象的回避也可被期待。
此外，也可以采用與生成不同于被保持在基體內(nèi)的特異結(jié)合物質(zhì)的示蹤劑的信號的示蹤劑結(jié)合后的第1特異結(jié)合物質(zhì)。在該場合下，可以選擇由檢測部5讀取的信號，可以實施利用競爭反應(yīng)的定量，前界現(xiàn)象的回避也可被期待。
本發(fā)明采用的示蹤劑，只要是能任意探測出其存在的物質(zhì)便可以?？梢耘e出比如自然狀態(tài)下用肉眼可以見到的示蹤劑，利用光學(xué)濾光鏡可以見到的示蹤劑，或通過附加紫外光等的刺激，促使產(chǎn)生熒光可見到的示蹤劑等的直接示蹤，以及通過添加基質(zhì)等展開試劑，探測出可視信號的示蹤劑等的間接示蹤。
在直接示蹤中，可以舉出含有染料溶膠、金屬溶膠或著色膠乳粒子等的細微著色粒子或熒光物質(zhì)的粒子。另一方面，在間接示蹤中，可以舉出堿性磷酸酶及辣根過氧化物酶等酶類。直接示蹤由于不添加其它試劑也可生成可被探測出的信號，因而可以在瞬間得到分析結(jié)果，此外，具有良好的穩(wěn)定性，因而最好采用它。其中，在采用膠體金等著色粒子的場合下，由于著色粒子較細微，因而可以使被示蹤部分集中在小區(qū)域內(nèi)或以小體積集中。
這里，為便于理解本發(fā)明，邊參照圖1所示的工序圖，邊對本發(fā)明作以說明。圖1是本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法的工序圖。
首先，在工序(a)中，按照包括預(yù)先設(shè)想的分析對象物的各種試料，生成至少包括以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)庫由上述分析對象物與針對該分析對象物具有特異結(jié)合特性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm。
這里，所謂飽和值系指分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)達到平衡狀態(tài)后所得到的該特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度。由于在特異結(jié)合反應(yīng)中，各同類反應(yīng)物互相接觸后，慢慢地進行，因而如果經(jīng)時性測定信號強度，則所得到的信號強度將依次變化。因此，由于特異結(jié)合反應(yīng)是平衡反應(yīng)，因而形成最終的平衡狀態(tài)后，信號強度幾乎不變化。換言之，所謂信號強度的飽和值是平衡狀態(tài)下的信號強度的終端值。
被包括在上述數(shù)據(jù)庫內(nèi)的定量信息可由比如圖2～5所示的曲線圖表示。
比如，在試料中的分析對象物的量過剩的場合下，雖然最初來自分析對象物的信號強度隨時間成比例(按一次函數(shù))增加，但由于未與特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的剩余的分析對象物的原因，信號強度將慢慢降低(前界現(xiàn)象)。這樣，如圖2所示，采用特定濃度p的試料，制成表示由特異結(jié)合反應(yīng)引起的信號強度的經(jīng)時變化曲線圖。此外，也有的部分象試料q那樣不發(fā)生前界現(xiàn)象，最終顯示出與試料p相同的信號強度。圖2所示的曲線圖中包括上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm。接下來，由于根據(jù)圖2可查出獲取信號強度的飽和值的時間，因而可制成表示試料中的分析對象物的濃度與信號強度的飽和值之間的關(guān)系曲線圖(圖3)。根據(jù)圖3也可以看出，在分析對象物的濃度較高的試料中發(fā)生前界現(xiàn)象。
另一方面，在比如試料中的分析對象物的量較少的場合下，利用特定濃度為r的試料，制成表示來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度的經(jīng)時變化的圖4中所示的曲線圖。該曲線圖雖然包括上述飽和值被獲取的時間ts，但不能獲得上述信號強度的極大值。因此，也包括上述數(shù)據(jù)庫內(nèi)不存在上述極大值的信息。因此，根據(jù)圖4，由于來自分析對象物的信號強度根據(jù)分析對象物的濃度按比例增加，所以如圖5所示，制成表示信號強度的時間變化率與分析對象物的濃度之間的關(guān)系曲線圖。
此外，在圖2～5中，雖然把對信號強度連續(xù)監(jiān)視測定后的信號強度作為檢量線表示，但也可以在任意的多個時間內(nèi)測定信號強度，用線把各測定點連接起來，從而得到檢量線。
通過按上述方法生成數(shù)據(jù)庫，在為特異結(jié)合分析供應(yīng)試料時，可以預(yù)知該試料可表現(xiàn)出的行為等，通過針對該行為的測定模式，可根據(jù)最低限度的測定次數(shù)，避免上述的前界現(xiàn)象及本底等的影響。尤其是，在試料濃度較高的場合下，通過后述的第1測定模式，可避免由前界現(xiàn)象所引起的誤測定。此外，在試料濃度較低的場合下，雖然在特異結(jié)合反應(yīng)開始后經(jīng)過較長時間后，本底將逐漸減少，但如果等待，則需要較長的時間，因而可采用后述的第2測定模式進行迅速正確的測定。
因此，在接下來的工序(b)中，準備包括實際分析對象物的試料，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定與該試料對應(yīng)的適當?shù)男盘枏姸鹊臏y定模式。
這樣，在基于用于上述分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)(工序(c))的所決定的測定模式，基于上述特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度達到飽和之前的期間內(nèi)，對上述信號強度至少測定2次(工序(d))。接下來，利用在上述工序(d)中得到的至少2個信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定與信號強度的飽和值對應(yīng)的上述試料中的分析對象物的量(濃度)(工序(e))。
這里，如上所述，在本發(fā)明中，把上述測定模式主要分為2種模式。第1測定模式用于對能產(chǎn)生前界現(xiàn)象的試料進行測定，第2測定模式用于對不能產(chǎn)生前界現(xiàn)象的試料的信號強度進行測定。這樣，前界現(xiàn)象的有無可與上述數(shù)據(jù)庫中極大值的有無對應(yīng)。
(i)第1測定模式根據(jù)第1測定模式，在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出具有上述極大值，能產(chǎn)生前界現(xiàn)象的場合下，至少在時間t1及t2(tm≤t1＜t2≤ts)分別對信號強度A1及A2進行測定，而且在上述時間ts中對信號強度的飽和值A(chǔ)s進行測定，在上述工序(e)中，利用上述信號強度A1及A2的變化(變化率，差值及其正負等)以及上述信號強度的飽和值A(chǔ)s，基于上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系(比如圖2)，決定上述試料中的分析對象物的量。
具體地說，根據(jù)圖3，作為針對上述信號強度的飽和值A(chǔ)s的分析對象物的濃度，存在濃度CA和CB2種。由于確認出圖2的檢量線p所示的上述信號強度的變化率{(A2-A1)/(t2-t1)}以及差(A2-A1)為負值的場合下，將發(fā)生前界現(xiàn)象，因而可以把上述信號強度的飽和值A(chǔ)s與圖3的分析對象物的濃度確定到CB上。
此外，如圖2的檢量線q所示，如果試料具有與檢量線p相同的信號強度飽和值A(chǔ)s，而且不發(fā)生前界現(xiàn)象，則上述信號強度的變化率{(A2-A1)/(t2-t1)}以及差(A2-A1)將為正值，不會發(fā)生前界現(xiàn)象，因而可以把圖3中的分析對象物的濃度確定到CA上。
接下來對第1測定模式作以詳細說明。在上述試料中存在過剩的分析對象物，發(fā)生前界現(xiàn)象的場合下，存在其信號強度的變化持續(xù)為負值的時間帶。因此，通過對信號強度變化的正負(方向)的查明，可以判斷是否發(fā)生前界現(xiàn)象。信號強度變化的正負可以通過對信號強度的變化率及差值的求算查明。
信號強度的差值可以根據(jù)在不同的時間內(nèi)，比如至少在測定時間t1及t2下測定2次的信號強度A1及A2(A2-A1)求出。此外信號強度的變化率可以根據(jù)在不同的時間內(nèi)，比如至少在測定時間t1及t2(tm≤t1＜t2≤ts)下測定2次的信號強度A1及A2{(A2-A1)/(t2-t1)}求出。信號強度的變化率可以采用最小平方法等的直線回歸法求出。
因此，在第1測定模式中，為查明信號強度變化的正負性，至少要測定2次以上的信號強度。因此，對于被測定的信號強度的飽和值，在由數(shù)據(jù)庫(圖3)特定的濃度有多個的場合下，如果信號強度的變化是正向，則判斷出是信號強度的變化持續(xù)為負向的時間帶，即不發(fā)生前界現(xiàn)象，在被特定的多個濃度中，把低濃度特定為分析對象物的濃度。另一方面，如果信號強度的變化是負向，則判斷出是信號強度的變化持續(xù)為負向的時間帶，即發(fā)生前界現(xiàn)象，在被特定的多個濃度中，把高濃度特定為分析對象物的濃度。
此外，在利用信號強度的變化方向?qū)κ欠癜l(fā)生前界現(xiàn)象進行判斷的場合下，有必要在信號強度持續(xù)處于變小的期間內(nèi)對信號進行測定。為此，最好在信號強度達到極大值后，在達到飽和值以前的時間t1及t2(tm≤t1＜t2≤ts)，根據(jù)被測定的至少2個信號的強度判斷信號強度的變化。
即在第1測定模式中，有必要根據(jù)比如由計時器計數(shù)的經(jīng)時時間，至少實施1次用于獲取信號強度的飽和值的信號測定，并至少實施2次用于獲取信號強度的變化的信號強度的測定，共計3次。比如，根據(jù)圖2所示的數(shù)據(jù)庫，由于在從被點著至2分～3分后的時間帶內(nèi)，信號強度持續(xù)地減小，因而為求出信號強度的變化，在該時間帶內(nèi)至少測定2次信號強度。這樣，為求出飽和值，從分析對象物與第2特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合反應(yīng)達到飽和后，至少測定1次信號強度。此外，由于測定時間隨分析對象物及特異結(jié)合物質(zhì)而異，因而最好生成與上述條件對應(yīng)的多個數(shù)據(jù)庫。
(ii)第2測定模式另一方面，根據(jù)第2測定模式，在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出沒有上述極大值，不發(fā)生前界現(xiàn)象的場合下，至少在時間t3及t4(t3＜t4＜ts)對信號強度A3及A4進行測定，在上述工序(e)中，基于上述信號強度A3及A4的變化(變化率及差值)以及上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系(比如圖5)，決定上述試料中的分析對象物的量。
具體地說，如圖5所示，制成表示信號強度的時間變化率與分析對象物的濃度之間的關(guān)系曲線圖后，可計算出由圖4的檢量線r表示的上述信號強度的時間變化率Ax(＝{(A4-A3)/(t4-t3)})，根據(jù)圖5把分析對象物的濃度決定為Cc。
接下來對第2測定模式作以詳細說明。在試料中不存在過剩的分析對象物的場合下，尤其在試料中的分析對象物的濃度較低的場合下，信號強度在達到飽和值之前只經(jīng)時增加。因此，通過在達到飽和值之前的較早的時間帶內(nèi)對信號強度的測定，可以測定出信號強度的變化(差值或比率等)。反之，由于時間經(jīng)過之后，信號強度的本底將減小，因而在其前后，要從測定出的信號強度中減去源自本底的信號強度是困難的。此外，本底消失之前需要等待很長的時間。因此，在第2測定模式中，不管本底消失與否，至少測定2次信號強度。
即在利用信號強度的變化，計算分析對象物的濃度時，最好在特異結(jié)合反應(yīng)實質(zhì)已結(jié)束，信號強度達到飽和值之前結(jié)束測定。所獲得的信號強度除了分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)所發(fā)生的特異結(jié)合反應(yīng)外，還受到雜質(zhì)及本底的影響。因此，在特異結(jié)合反應(yīng)開始后的較早的時間帶內(nèi)測定的信號強度之差成為來自分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生的特異結(jié)合反應(yīng)的信號的強度之差，可與本底及雜質(zhì)的影響相抵消。
這樣，與第1測定模式相同，信號強度的差值可以根據(jù)在不同的時間內(nèi)，比如至少在測定時間t3及t4(t3＜t4＜ts)測定2次的信號強度A3及A4(A4-A3)求出。此外信號強度的變化率可以根據(jù)在不同的時間內(nèi)，比如至少在測定時間t3及t4測定2次的信號強度A3及A4{(A4-A3)/(t4-t3)}求出。信號強度的變化率可以采用最小平方法等的直線回歸法求出。
上述本發(fā)明的特異結(jié)合分析方法可以采用具有特定構(gòu)造的試驗試劑用的試驗條實施。
因此，本發(fā)明的特異結(jié)合分析方法最好包括在上述工序(b)之前，制作包括用于點著上述試料的試料點著部以及對第2特異結(jié)合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并探測出來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號的檢測部的試驗條的工序(X)，在上述工序(d)中，通過在上述試料點著部內(nèi)將上述試料點著，利用毛細現(xiàn)象使上述試料流入上述檢測部，使與上述第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合后的分析對象物與上述第2特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)。
以下邊參照附圖邊對上述試驗條作以說明。圖6是本發(fā)明中采用的試驗條一例的概略斜視圖。本發(fā)明中的試驗條1是由比如產(chǎn)生毛細現(xiàn)象的基體2形成的片狀試驗片，在其一端點著液態(tài)試料后，通過毛細現(xiàn)象按照箭頭方向向另一端浸透并展開。
試驗條1配有試料點著部3、保持部4、檢測部5。試料點著部3是在基體2上試料被點著的區(qū)域。保持部4是被設(shè)置在試料點著部3與檢測部5之間，被點著的試料流入的區(qū)域，包含由示蹤劑示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)。然而，在采用預(yù)先示蹤的試料的場合下，不形成保持部4也可以。檢測部5是試料經(jīng)過保持部4流入的區(qū)域，第2特異結(jié)合物質(zhì)作為結(jié)合劑被固定化。
因此，作為構(gòu)成上述基體的材料，只要是構(gòu)成分析對象物及特異結(jié)合物質(zhì)被展開的區(qū)域的材料便可，比如可舉出多孔性載體，凝膠載體或微粒子充填型載體等。
其中，最好采用硝酸纖維素。由于硝酸纖維素具有即使不預(yù)先經(jīng)過敏化處理，也能與蛋白質(zhì)結(jié)合的固有能力，因而優(yōu)于紙張等其它基體材料。把抗體等特異結(jié)合物質(zhì)直接涂布到硝酸纖維素上后，可以可靠地固定化，完全沒有必要實施將會妨礙特異結(jié)合物質(zhì)所具有的特異結(jié)合能力的化學(xué)處理。在比如基體材料是紙張的場合下，為使抗體固定，有必要實施采用CNBr、羰基二咪唑或氯化トレシル等的化學(xué)結(jié)合。此外，由于可以從市場上購買到具有各種大小氣孔的硝酸纖維素片，因而可以根據(jù)試料的流量等必要條件，容易地選擇基體材料。在采用硝酸纖維素片的場合下，從強度及拿放的觀點出發(fā)，最好采用由硝酸纖維素片與在上述硝酸纖維素片的背面貼合塑料片等的襯片形成的復(fù)合片。這種復(fù)合片通過比如在襯片上形成硝酸纖維素薄膜，便可容易地制造。
為在保持部4上保持第1特異結(jié)合物質(zhì)，把比如包含第1特異結(jié)合物質(zhì)的液狀物涂布到基體2的規(guī)定區(qū)域內(nèi)，干燥后即可。這樣保持部4即使處于干燥狀態(tài)，試料在基體2上浸透并展開，流入保持部4內(nèi)后，保持部4將濕潤，第1特異結(jié)合物質(zhì)可在基體2上自由移動。
在檢測部5內(nèi)使第2特異結(jié)合物質(zhì)固定化后，該第2特異結(jié)合物質(zhì)最好將被固定部分以外的其它部分封閉起來，降低至基體2的非特異吸附。封閉過程可以通過涂布比如蛋白質(zhì)(比如牛的血清白蛋白、乳蛋白質(zhì)等)、聚乙烯醇或乙醇胺或它們的組合等實施。
因此，在工序(d)中，在試料點著部3內(nèi)將上述試料點著后，上述試料通過毛細現(xiàn)象流入檢測部5內(nèi)，與第1特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合后的分析對象物與被保持在檢測部5內(nèi)的第2特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)。
此外如上所述，也可以在試料點著部3內(nèi)點著試料中的分析對象物之前，預(yù)先與第1特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)，然后在試料點著部3內(nèi)點著試料。這種在試驗條1之外與試料中的分析對象物發(fā)生反應(yīng)的第1特異結(jié)合物質(zhì)也可以不與示蹤劑結(jié)合。此外，在基體2內(nèi)的保持部4中包含由示蹤劑示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)的場合下，也可以在試驗條以外采用與生成不同于該示蹤劑的信號的示蹤劑結(jié)合后的第1特異結(jié)合物質(zhì)。此外，在試驗條之外使被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)與試料預(yù)先發(fā)生反應(yīng)的場合下，也可以不設(shè)置包含第1特異結(jié)合物質(zhì)的保持部4。
到達檢測部5的試料中的分析對象物與第2特異結(jié)合物質(zhì)發(fā)生特異結(jié)合。這樣，分析對象物通過第2特異結(jié)合物質(zhì)被固定在檢測部5上。比如，作為被由膠體金示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)的抗hCG單克隆抗體與作為通過分析對象物hCG被固定在檢測部5上的第2特異結(jié)合物質(zhì)的抗hCG單克隆抗體結(jié)合。
這里，最好即使試料越過檢測部5，試料也能繼續(xù)流動并展開。為此，將足夠量的試料在試料點著部3中點著，比如未參與結(jié)合反應(yīng)的多余部分的被示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)超越檢測部5移動，利用試料本身通過檢測部5被沖洗。因此，在試驗條1上，在試料被展開的基體2的末端部，可以設(shè)置用于吸收從檢測部5流出的試料的吸收部。作為構(gòu)成吸收部的材料，只要是具有能通過檢測部5對分析對象物以外的試料進行充分沖洗的吸收能力的都可以。比如，可舉出玻璃纖維濾紙GA200(東洋株式會社生產(chǎn))等。設(shè)置上述吸收部后，由于未反應(yīng)物隨試料的流動一道被沖洗掉，因而在特異結(jié)合反應(yīng)后，無需實施未反應(yīng)物的分離操作，便可以通過檢測部5探測出來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號。
因此，在本發(fā)明的特異結(jié)合分析方法中，由分析對象物與特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的測定可以在實施特異結(jié)合反應(yīng)的區(qū)域的任何位置上實施。然而，從精度的觀點出發(fā)，最好通過在檢測部5內(nèi)，或者在包括檢測部5的較大的區(qū)域內(nèi)實施信號強度測定，對試料中的分析對象物進行定量或定性。
這樣，在分析對象物與第2特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)達到平衡狀態(tài)后，在包括檢測部5的區(qū)域內(nèi)探測信號強度的分布狀況，根據(jù)信號強度的分布狀況可對試料中的分析對象物進行定量或定性。
B.特異結(jié)合分析裝置接下來，對可用于實施上述本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法的特異結(jié)合分析裝置作以說明。通過采用該特異結(jié)合分析裝置，可以更適宜地實施上述特異結(jié)合分析方法。
本發(fā)明是一種特異結(jié)合分析裝置，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異結(jié)合特性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于包括(1)包括數(shù)據(jù)庫的存儲部，該數(shù)據(jù)庫按照包括設(shè)想的分析對象物的各試料，至少包括由上述分析對象物與針對該分析對象物具有特異結(jié)合特性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm、(2)試驗條，包括用于點著包含分析對象物的試料的試料點著部和對特異結(jié)合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并探測出來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號的檢測部、(3)第1探測器，用于探測上述信號、(4)控制器，基于上述數(shù)據(jù)庫決定上述信號強度的測定模式，根據(jù)上述測定模式由上述探測器探測上述信號，決定上述信號的強度、(5)解析部，利用上述信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定上述試料中的分析對象物的量。
此外上述特異結(jié)合分析裝置最好還包括用于探測至上述試料點著部的試料點著的第2探測器。
以下，邊參照附圖，邊對本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析裝置作以說明。圖7是表示本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析裝置一例的構(gòu)成概念圖。
圖7所示的特異結(jié)合分析裝置包括光源10、作為第1探測器的光檢測器11、包括存儲部9a和控制器9b及解析部9c的計算機9、試驗條1。還設(shè)有作為用于探測至試料點著部3的試料點著的第2探測器的測定開始探測器8。
在計算機9的存儲部9a中，根據(jù)包括設(shè)想的分析對象物的各試料，至少包括由上述分析對象物與針對該分析對象物具有特異結(jié)合特性的特異結(jié)合物質(zhì)之間的特異結(jié)合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系，以及上述信號強度的經(jīng)時變化。此外，在上述存儲部9a中，還包括把上述特異結(jié)合反應(yīng)開始時或試料點著時等的規(guī)定時間設(shè)為零時上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm。
這樣，計算機9通過控制部9b，根據(jù)所用試料的種類等，并基于上述數(shù)據(jù)庫決定信號強度的測定模式，基于所決定的該測定模式，在特異反應(yīng)或信號探測開始后經(jīng)過規(guī)定時間后向光檢測器11發(fā)出探測命令。這樣，光檢測器11對探測出的信號的強度進行認知。然后解析部9c利用認知后的信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫決定上述試料中分析對象物的量。因此，計算機9具有計時器的功能。
光源10對檢測部5進行光照，光檢測器11探測來自檢測部5的反射光。光源10在測定中可以持續(xù)地對檢測部5的周圍進行光照，也可以只在信號強度測定所必需的時間內(nèi)進行照射。
此外，測定開始探測器8配有第1電極6及第2電極7，測定試料點著部3的導(dǎo)電率，并基于導(dǎo)電率的變化探測至試料點著部3的試料的點著。在試料點著前，對干燥狀態(tài)下的試料點著部3的導(dǎo)電率及試料點著后濕潤狀態(tài)下的試料點著部3的導(dǎo)電率進行預(yù)先測定，把所獲得的測定值作為測定開始信息存儲到測定開始探測器8內(nèi)。這樣，把包含分析對象物的試料在試料點著部3點著，試料點著部3從干燥狀態(tài)轉(zhuǎn)為濕潤狀態(tài)后，第1電極6及第2電極7監(jiān)視的試料點著部3的導(dǎo)電率發(fā)生變化后，通過參照導(dǎo)電率的變化及測定開始信息，測定開始探測器8探測出試料在試料點著部3被點著。
此外也可以計算機9的存儲部9a把干燥狀態(tài)的導(dǎo)電率與濕潤狀態(tài)的導(dǎo)電率作為測定開始信息予以存儲，解析部9b參照實際的導(dǎo)電率變化及測定開始信息，使控制部9c開始實施測定。
以下對本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析裝置的運作方法作稍詳細的說明。雖然至試料點著部3的試料的點著最好在把試驗條1安裝到特異結(jié)合分析裝置內(nèi)后實施，但也可以把試料已點著的試驗條1安裝到特異結(jié)合分析裝置內(nèi)。
測定開始探測器8探測出試料點著后，計算機9把探測出試料點著的時間設(shè)為0，使計時器(圖中未示出)開始計時，對光源10及光檢測器11進行控制，每隔規(guī)定的時間間隔，測定一次信號強度。
光源10向包括檢測部5的區(qū)域照射規(guī)定波長(比如520nm)的光，光檢測器11對該反射光進行探測。測定波長也可以選用與檢測部5中的試料及示蹤劑的顯色相適應(yīng)的波長。
這里，作為信號，只要是由示蹤劑產(chǎn)生影響的反應(yīng)生成的可探測出的信號即可，比如，可由熒光光度計測定的熒光、可由熒光光度計測定的發(fā)光、可由檢測部5中的目視判定或用色差計測定的顯色等都可以。在該場合下，在檢測部5中，對反射光、熒光或發(fā)光的強度等進行探測。
對于該信號的探測，也可以在與試驗條1上的試料的浸透(前進)方向平行的方向上，一邊使試驗條1的位置與光源10及光檢測器11的位置發(fā)生相對變化，一邊連續(xù)實施?？梢允乖囼灄l1或光源10中的任意一方在與試料的浸透方向平行的方向上移動，也可以使二者共同移動。
光檢測器11把探測出的信號傳送給計算機9。計算機9內(nèi)的解析部9c通過解析來自光檢測器11的信號，對信號強度進行解析。解析部9c基于解析后的信號強度，對被存儲在存儲部9a內(nèi)的數(shù)據(jù)庫中的信號強度的飽和值及信號強度的變化率等進行解析。
這里，圖8表示用于表示上述檢測部附近的上述浸透方向的位置與上述信號強度的關(guān)系(分布狀況)的檢量線。該檢量線通過一邊對試驗條1或光源10掃描，一邊在基體2上照射來自光源10的光，并通過計算機9對由光檢測器11探測出的反射光進行解析而生成。在該檢量線上，縱軸表示檢測部5附近的信號強度，橫軸表示試驗條1中試料在浸透方向上的位置(相對試料點著部3的距離)。對于該檢量線的高度h，可以作為基于特異結(jié)合反應(yīng)的信號的強度予以測定。此外，也可以把該檢量線的面積S作為基于特異結(jié)合反應(yīng)的信號的強度。
此外，在后述的本發(fā)明實施方式中，對試驗條1或光源10掃描，對包括檢測部5的區(qū)域內(nèi)的反射光進行連續(xù)測定，獲取信號強度。因此，比如在上述檢量線上，用直線把從檢測部5至試料點著部3附近的上流側(cè)部分的信號強度與其相反側(cè)的下流側(cè)部分的信號強度連接起來。這樣，從檢測部5中的最高值的高度中減去直線的高度后所求出的高度h及檢量線與直線圍成的面積S便成為基于從檢測部5中的信號強度中減去來自本底的信號強度后的特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度。這樣在測定信號強度后，即使試料是全血等的著色試料，也可以不受本底的影響及來自雜質(zhì)的影響，對試料中的分析對象物進行定量或定性。
此外，也可以把檢測部5以外的基體2上的任意位置上的信號強度假設(shè)成來自本底的信號強度，將該信號強度減去。作為來自本底的信號強度，可以選擇比如處于檢測部5附近的信號強度中的最小值。
除上述方法之外，如果對比如檢測部5等的信號強度測定部位固定，不移動實施特異結(jié)合反應(yīng)的區(qū)域或測定裝置，實施信號強度的測定，則可以簡單地構(gòu)成小型的測定裝置，可以降低成本，可提高普及率。
以下，雖然利用實施例，對本發(fā)明作更具體的說明，但本發(fā)明并不局限于此。
實施例1在本實施例中，用尿作為試料，用人體絨毛性腺刺激激素(hCG)作為試料中含有的分析對象物。此外，作為第1特異結(jié)合物質(zhì)與第2特異結(jié)合物質(zhì)，采用了參與同hCG的組合反應(yīng)得到的抗hCG單克隆抗體，作為示蹤劑采用了膠體金。由于在第2特異結(jié)合物質(zhì)與通過分析對象物結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)中作為示蹤劑的膠體金被結(jié)合，因此在檢測部5中，可以利用來自膠體金產(chǎn)生影響的反應(yīng)的信號，正確實施對hCG的定量或定性。
工序(a)首先，為通過工序(a)生成數(shù)據(jù)庫，制作了包含由具有圖6所示構(gòu)造的硝酸纖維素形成的基體2的試驗條1。在保持部4中，保持了作為由具有與hCG免疫學(xué)結(jié)合特性的膠體金示蹤的第1特異結(jié)合物質(zhì)的抗hCG單克隆抗體(a-hCG)。具體地說，在基體上涂布a-hCG后使其干燥。此外，在檢測部5中也涂布作為第2特異結(jié)合物質(zhì)的a-hCG，使其干燥，并使a-hCG固定化。
作為包含預(yù)先設(shè)想的分析對象物的試料，準備了具有各種hCG濃度的6種尿液。hCG的濃度設(shè)為100(IU/L)、500(IU/L)、1000(IU/L)、1500(IU/L)、2000(IU/L)或2500(IU/L)。
這樣，利用圖7所示的特異結(jié)合分析裝置，通過測定開始探測器8探測至試料點著部3的尿液的點著，對由檢測部5中的特異結(jié)合反應(yīng)所獲得的信號強度進行了測定。對于上述6種尿液，求出上述信號強度的經(jīng)時變化、上述特異結(jié)合反應(yīng)開始后上述飽和值被求出的時間ts及上述信號強度極大值被求出的時間tm，如圖9所示。
hCG的濃度為100(IU/L)的尿液的信號強度以◆表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線21表示。hCG的濃度為500(IU/L)的尿液的信號強度以■表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線22表示。hCG的濃度為1000(IU/L)的尿液的信號強度以▲表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線23表示。hCG的濃度為1500(IU/L)的尿液的信號強度以口表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線4表示。hCG的濃度為2000(IU/L)的尿液的信號強度以*表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線25表示。hCG的濃度為2500(IU/L)的尿液的信號強度以●表示，上述信號強度的經(jīng)時變化以曲線26表示。
在尿液的hCG濃度較低的場合下，信號強度隨著時間的增加而增大，最后信號強度達到了飽和。被示蹤的a-hCG與在保持部4內(nèi)結(jié)合后的hCG在檢測部5內(nèi)被依次展開，信號強度隨時間增加，然后，hCG與作為第2特異結(jié)合物質(zhì)的a-hCG的特異結(jié)合反應(yīng)達到平衡狀態(tài)，信號強度達到了飽和。
根據(jù)曲線21，尿液的hCG濃度為100(IU/L)的場合下，由于7分鐘后，特異結(jié)合反應(yīng)達到了平衡狀態(tài)，因而信號強度的飽和值被獲取的時間ts是7分鐘。此外，根據(jù)曲線22，23，24，在尿液的hCG濃度為500(IU/L)、1000(IU/L)、1500(IU/L)的場合下，分別在8分鐘后特異結(jié)合反應(yīng)達到了平衡狀態(tài)(ts＝8分鐘)。
與此相對，在尿液中hCG的濃度較高的場合下，信號強度隨著時間而增加，一定時間后變小，然后達到飽和。信號強度之所以發(fā)生這種變化，被認為是由于未與被示蹤的a-hCG結(jié)合的hCG在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)過剩所致。即在尿中的hCG濃度較高的場合下，在一開始，被示蹤的a-hCG與在保持部4內(nèi)結(jié)合后的hCG在檢測部5內(nèi)被依次展開，信號強度隨時間增加。然而由于未與被示蹤的a-hCG結(jié)合的hCG在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)過剩，因而與被示蹤的a-hCG結(jié)合后的hCG與未與被示蹤的a-hCG結(jié)合的hCG競爭，與在檢測部5內(nèi)被固定化的a-hCG發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)，其結(jié)果是，來自由檢測部5探測出的示蹤劑產(chǎn)生影響的反應(yīng)的信號強度下降。這樣，當hCG與作為第2特異結(jié)合物質(zhì)的a-hCG發(fā)生的特異結(jié)合反應(yīng)達到平衡狀態(tài)后，信號強度達到了飽和。
根據(jù)曲線25，由于在尿液的hCG濃度為2000(IU/L)的場合下，2分鐘后，信號強度達到極大值(tm＝2分鐘)，其后信號強度降低，3分鐘后特異結(jié)合反應(yīng)達到平衡狀態(tài)，因而飽和值被獲取的時間ts為3分鐘。此外根據(jù)曲線26，由于在尿液的hCG濃度為2500(IU/L)的場合下，1.5分鐘后，信號強度達到極大值(tm＝1.5分鐘)，其后信號強度降低，5分鐘后特異結(jié)合反應(yīng)達到了平衡狀態(tài)，因而飽和值被獲取的時間ts為5分鐘。即上述場合被確認是一個存在極大值，信號強度的變化為負值的區(qū)域。
這樣，由于上述試料中含有發(fā)生前界現(xiàn)象的試料，因而接下來，求出信號強度的飽和值與hCG濃度之間的關(guān)系，如圖10所示。根據(jù)圖9，由于使尿液滴到試料點著部3上10分鐘后信號強度達到飽和值，因此圖10所表示的是尿液滴下10分鐘后測定的信號強度與hCG濃度之間的關(guān)系。根據(jù)圖10，與信號強度的飽和值40000對應(yīng)的hCG濃度是點A所示的1200(IU/L)及點B所示的2500(IU/L)2個。從中還可看出，具有2500(IU/L)濃度的尿液發(fā)生前界現(xiàn)象。即在該場合下，由于尿液中存在過剩的hCG，因而未與由膠體金示蹤的a-hCG結(jié)合的hCG同已與由膠體金示蹤的a-hCG結(jié)合的hCG在與在檢測部5內(nèi)被固定化的a-hCG發(fā)生的特異結(jié)合反應(yīng)中競爭，由在檢測部5內(nèi)被結(jié)合的膠體金示蹤的a-hCG的量減少，膠體金產(chǎn)生影響的信號強度下降，由檢測部5探測出的信號強度未反映出尿液中的hCG量。
按上述方法，生成了圖9及圖10所示的數(shù)據(jù)庫。
工序(b)接下來，從被驗者提取尿樣1作為試劑，對被驗者的尿液中的hCG濃度進行了測定。由于該hCG是能發(fā)生前界現(xiàn)象的分析對象物，因而基于上述數(shù)據(jù)庫，決定了針對上述尿液的信號強度的測定模式。
即由于認為尿樣1具有發(fā)生前界現(xiàn)象的可能性，因而把信號強度飽和值的獲取時間ts設(shè)為8分鐘，把信號強度的極大值的獲取時間tm設(shè)為2分鐘，決定了在滿足tm≤t1＜t2≤ts的時間t1(＝2分鐘)和t2(＝3分鐘)及ts(＝8分鐘)測定信號強度(第1測定模式)。
工序(c)把在工序(b)中提取的尿樣1滴落到安裝在圖7所示的特異結(jié)合分析裝置內(nèi)的試驗條1的試料點著部3上，通過毛細現(xiàn)象，上述尿樣向保持部4以及檢測部5浸透。此時，作為尿樣1中的分析對象物的hCG被預(yù)期在保持部4內(nèi)與由膠體金示蹤的a-hCG發(fā)生特異結(jié)合，并與在檢測部5中被固定化的a-hCG發(fā)生了特異結(jié)合。
工序(d)基于在上述工序(b)中決定的第1測定模式，在基于上述特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度達到飽和之前的期間內(nèi)，在時間t1(＝2分鐘)及t2(＝3分鐘)測定信號強度，分別為49900(A1)及40900(A2)。此外，在時間ts所測定的信號強度的飽和值為40000(As)。
工序(e)根據(jù)在工序(d)中得到的信號強度，通過(A2-A1)/(t2-t1)＝(49900-40900)/(2-3)＝-9000，得知信號強度的變化是負值。另一方面，根據(jù)圖10，與信號強度的飽和值40000對應(yīng)的hCG濃度是1180(IU/L)及2500(IU/L)。這里，由于信號強度的變化是負值，因而決定了hCG濃度為2500(IU/L)。
如上所述，如果采用本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法及特異結(jié)合分析裝置，可以降低由分析對象物引起的前界現(xiàn)象和本底及雜質(zhì)的影響，能對試料中的分析對象物迅速、簡便、正確地實施定量或定性。
此外雖然在上述中為特定分析對象物的量采用濃度單位，但表示分析對象物的量的單位并不局限于濃度。在本發(fā)明中，可以采用任意單位作為表示量的單位。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法不限于采用了色譜分析的分析方法，也可以在使含有分析對象物的試料與特異結(jié)合物質(zhì)在溶液中進行直接特異結(jié)合反應(yīng)的免疫比濁法中使用。
此外，如果采用本發(fā)明涉及的特異結(jié)合分析方法及特異結(jié)合分析裝置，不僅在醫(yī)院，即使在一般家庭等也能容易且簡便地進行尿檢查等。
權(quán)利要求
1.一種特異鍵合分析方法，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于包括(a)按預(yù)先包含分析對象物的各種試料，生成至少包含以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)庫的工序由上述分析對象物與針對上述分析對象物具有特異鍵合性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm；(b)準備包含分析對象物的試料，基于上述數(shù)據(jù)庫，決定與上述試料對應(yīng)的上述信號強度的測定模式的工序；(c)使上述分析對象物與特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)的工序；(d)在上述工序(c)后，基于上述測定模式，在基于上述特異鍵合反應(yīng)的信號強度達到飽和之前的期間內(nèi)，對上述信號強度至少測定2次的工序；(e)利用在上述工序(d)中得到的至少2個信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，對上述試料中的分析對象物的量進行確定的工序。
2.權(quán)利要求1中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出是具有上述極大值的場合下，上述測定模式至少在時間t1及t2(tm≤t1＜t2≤ts)分別對信號強度A1及A2進行測定，而且在上述時間ts對信號強度As進行測定，在上述工序(e)中，利用上述信號強度A1及A2的變化以及上述信號強度As，基于上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系，決定上述試料中的分析對象物的量。
3.權(quán)利要求1中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(b)中的試料通過上述數(shù)據(jù)庫判斷出是沒有上述極大值的場合下，上述測定模式至少在時間t3及t4(t3＜t4＜ts)對信號強度A3及A4進行測定，在上述工序(e)中，基于上述信號強度A3及A4的變化以及上述數(shù)據(jù)庫中的上述關(guān)系，決定上述試料中的分析對象物的量。
4.權(quán)利要求1中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(c)中，使上述分析對象物與被由示蹤劑示蹤的第1特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)，并使上述分析對象物與第2特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)。
5.權(quán)利要求4中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于包括制作包含在上述工序(b)之前，點著上述試料的試料點著部，以及，對第2特異鍵合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并可對來自特異鍵合反應(yīng)的信號進行檢測的檢測部的試驗條的工序(X)，在上述工序(d)中，通過在上述試料點著部將上述試料點著，利用毛細現(xiàn)象使上述試料流入上述檢測部，來使與上述第1特異鍵合物質(zhì)鍵合后的分析對象物與上述第2特異鍵合物質(zhì)發(fā)生特異鍵合反應(yīng)。
6.權(quán)利要求4中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(d)中，利用上述示蹤劑對上述信號強度進行測定。
7.權(quán)利要求5中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(X)中，在上述試料點著部與上述檢測部之間，設(shè)有具有被由示蹤劑示蹤的第1特異鍵合物質(zhì)的保持部。
8.權(quán)利要求5中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(d)中，沿著上述試驗條上的上述試料的浸透方向在上述檢測部對上述信號強度進行連續(xù)測定。
9.權(quán)利要求8中記載的特異鍵合分析方法，其特征在于在上述工序(d)中，根據(jù)表示上述浸透方向的位置與上述信號強度的關(guān)系的標準線，決定上述信號強度。
10.一種特異鍵合分析裝置，其根據(jù)由試料中的分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號對上述試料中的分析對象物進行定量，其特征在于包括(1)包括下述數(shù)據(jù)庫的存儲部，該數(shù)據(jù)庫按包含設(shè)想的分析對象物的各試料，至少包含由上述分析對象物與針對該分析對象物具有特異鍵合特性的特異鍵合物質(zhì)之間的特異鍵合反應(yīng)所產(chǎn)生的信號強度的飽和值或變化與上述分析對象物的濃度的關(guān)系、上述信號強度的經(jīng)時變化以及上述特異鍵合反應(yīng)開始后上述飽和值被獲取的時間ts及上述信號強度的極大值被獲取的時間tm；(2)試驗條，其包括用于點著包含分析對象物的試料的試料點著部以及對特異鍵合物質(zhì)進行實質(zhì)性固定并可對來自特異鍵合反應(yīng)的信號進行檢測的檢測部；(3)第1探測器，其探測上述信號；(4)控制器，其基于上述數(shù)據(jù)庫決定上述信號強度的測定模式，依據(jù)上述測定模式由上述探測器探測上述信號，決定上述信號的強度；(5)解析部，其利用上述信號強度，基于上述數(shù)據(jù)庫，對上述試料中的分析對象物的量進行確定。
11.權(quán)利要求9中記載的特異鍵合分析裝置，其特征在于還包括用于探測對至上述試料點著部的試料的點著的第2探測器。
全文摘要
為提供減少前界現(xiàn)象、本底及雜質(zhì)的影響，能對試料中的分析對象物簡便、迅速且正確地定量或定性的特異結(jié)合分析方法及用于其的特異結(jié)合分析裝置，預(yù)先按包含設(shè)想的分析對象物的各試料，生成與來自特異結(jié)合反應(yīng)的信號強度有關(guān)的數(shù)據(jù)庫，基于上述數(shù)據(jù)庫決定試料的信號強度的測定模式，從而決定上述試料中的分析對象物的濃度。
文檔編號G01N33/543GK1401078SQ01802892
公開日2003年3月5日 申請日期2001年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者権丈紀子, 龜井明仁, 河村達朗, 瀨岡正剛, 高橋三枝, 田中宏橋 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社