一種用于富集糖基化肽段的親水磁性納米材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于富集糖基化肽段的親水磁性納米材料的制備方法，屬于納米材料和生物分離領(lǐng)域，其目的在于用于糖基化肽段的選擇性富集。其特征在于：采用“一鍋法”合成殼聚糖、纖維素、瓊脂糖等糖類化合物與四氧化三鐵配伍的親水磁性納米材料，由于材料中糖類化合物分子中-NH2和-OH極性基團的存在，該材料具有一定的親水性，可以從復(fù)雜的蛋白酶解液中特異地富集和純化糖基化肽段。本發(fā)明制得的富集材料在保證其良好吸附效果的同時，制備方法具有省時、低成本和操作簡便等優(yōu)點，可大量制備，特別適用于大規(guī)模的糖基化肽段的富集。
【專利說明】一種用于富集糖基化肽段的親水磁性納米材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及糖基化肽段的分離純化，具體涉及一種用于富集糖基化肽段的親水磁性納米材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點的鑒定是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要挑戰(zhàn)之一，糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后最重要的修飾之一。糖基化蛋白質(zhì)參與了細胞信號傳導(dǎo)、細胞粘附、分子清除、受體激活等許多重要的生命活動過程。糖基化的異常與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，目如發(fā)現(xiàn)的疾病標志物很多是糖基化蛋白質(zhì)，糖基化蛋白質(zhì)研究對于生物醫(yī)藥和疾病的診斷、治療有著很重要的意義。最近，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白糖基化的定性中，已經(jīng)發(fā)展成為重要的工具之一。在糖基化蛋白酶解產(chǎn)物的糖基化肽段質(zhì)譜分析中，由于酶解產(chǎn)物中存在大量的非糖基化肽段，這些肽段在離子化過程中產(chǎn)生的離子信號會淹沒糖基化肽段的離子信號，另一方面糖基化肽段在質(zhì)譜檢測中的離子化效率相對較低，這些因素導(dǎo)致了糖基化肽段在質(zhì)譜中很難被檢測到。從糖基化蛋白的酶解混合物中分離和富集糖基化肽段是目前進行糖基化研究的比較理想的方法，也是成功實現(xiàn)質(zhì)譜分析最關(guān)鍵的一步。
[0003]由于糖基化肽段的糖鏈上含有大量的羥基，使得糖基化肽段具有較強的親水性，相對而言，非糖基化肽段的疏水性較強，因此可以采用親水作用色譜法(HILIC)實現(xiàn)糖基化肽段的分離富集。親水作用色譜法能富集各種類型的糖基化肽段，操作簡單方便，并且不破壞糖鏈結(jié)構(gòu)(Yeh, C.H.等，Magnetic bead-based hydrophilic interaction liquidchromatography for glycopeptide enrichments， Journal of Chromatography A，1224(2012)，P70-78)。四氧化三鐵磁性納米材料是一類非常重要的無機功能材料，具有易于修飾的表面、優(yōu)良的磁響應(yīng)能力和巨大的比表面積。將磁性納米材料與親水作用色譜法結(jié)合得到的親水磁性納米材料因兼具兩者的優(yōu)點而受到青睞。目前，常用的親水磁性納米材料的合成需要經(jīng)過合成Fe3O4納米粒子后包覆SiO2，然后在SiO2表面進行官能團化后嫁接親水性分子等多步反應(yīng)，操作較為繁瑣耗時(Xiong Z.C.等，Synthesis of branched PEGbrushes hybrid hydrophilic magnetic nanoparticles for the selective enrichment ofN-1inked glycopeptides, Chemical Communications,48 (2012), P8138-8140)。本發(fā)明提供了一種更為簡單的制備這類材料的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于糖基化肽段富集的親水磁性納米材料的制備方法。該方法采用“一鍋法”合成了親水磁性納米材料，該材料具有很好的親水性，另外良好的磁響應(yīng)能力可以實現(xiàn)快速分離。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在保證材料良好的親水性和富集效果的同時，制備方法具有省時、低成本和操作簡便等優(yōu)點，可大量制備，特別適用于大規(guī)模的糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是: 一種用于糖基化肽段富集材料的制備方法，采用“一鍋法”合成了親水磁性納米材料，包括以下步驟:
1)將I?5g FeCl3.6H20加入25?100 mL乙二醇中，超聲溶解10?30min，形成黃色透明溶液；
2)加入I?10g NH4Ac和0.5?4 g殼聚糖或纖維素或瓊脂糖,在氮氣保護下130?180°C加熱攪拌I?4 h ;
3)轉(zhuǎn)入100mL反應(yīng)釜中150?250°C水熱反應(yīng)14?24 h ;
4)反應(yīng)完畢后，對冷卻的黑色溶液進行磁分離，將產(chǎn)物用高純水和無水乙醇分別進行洗滌，50-80°C真空干燥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1是合成的親水磁性納米材料的表征。(a)磁性親水納米材料的透射電鏡圖；(b)磁性親水納米材料的磁滯回線。
[0007]圖2是標準人血清IgG酶解物富集前后的MALD1-TOF MS質(zhì)譜圖。(a)人血清IgG酶解物富集前的MALD1-TOF MS質(zhì)譜圖；(b)人血清IgG酶解物富集后的MALD1-TOF MS質(zhì)譜圖，*代表糖肽。
[0008]圖3是HeLa細胞蛋白酶解物富集后的HPLC-MS/MS基峰圖。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
將3 g FeCl3*6H20加入70 mL乙二醇中，超聲溶解20 min，形成黃色透明溶液，加入5 gNH4Ac和1.5 g殼聚糖，在氮氣保護下150°C加熱攪拌2.4 h后轉(zhuǎn)入100 mL反應(yīng)釜中190°C水熱反應(yīng)18 ho反應(yīng)完畢后,對冷卻的黑色溶液進行磁分離,將產(chǎn)物用高純水和無水乙醇分別進行洗滌，65°C真空干燥。材料的透射電鏡和磁滯回線見圖1:其尺寸約為140 nm，并且材料保持了良好的磁性。
[0010]實施例2
將I g FeCl3WH2O加入25 mL乙二醇中，超聲溶解10 min，形成黃色透明溶液，加入I gNH4Ac和0.5 g纖維素，在氮氣保護下180°C加熱攪拌4 h后轉(zhuǎn)入100 mL反應(yīng)釜中250°C水熱反應(yīng)14 ho反應(yīng)完畢后,對冷卻的黑色溶液進行磁分離,將產(chǎn)物用高純水和無水乙醇分別進行洗滌，50°C真空干燥。
[0011]實施例3
將5 g FeCl3*6H20加入100 mL乙二醇中，超聲溶解30 min,形成黃色透明溶液，加入10g NH4Ac和4 g瓊脂糖，在氮氣保護下130°C加熱攪拌I h后轉(zhuǎn)入100 mL反應(yīng)釜中150°C水熱反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢后，對冷卻的黑色溶液進行磁分離，將產(chǎn)物用高純水和無水乙醇分別進行洗滌，80°C真空干燥。
[0012]應(yīng)用例I
本實例以采用上述制備方法制得的親水磁性納米材料對標準糖基化蛋白進行富集，對富集效果進行評價，其具體步驟如下:
1、樣品溶液的制備 人血清IgG溶于50 mM NH4HCO3 (pH 8.2)形成終濃度為I mg/mL的蛋白溶液，沸水浴中加熱10 min,加入I M 二硫蘇糖醇(DTT)溶液，使DTT終濃度為10 mM,在60°C下變性I h，還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，接著加入碘代乙酰胺(IAA)，使IAA終濃度為20 mM，于室溫在暗處震蕩反應(yīng)30 min,按照酶/蛋白=1:25的比例加入胰蛋白酶，37°C酶解20 h，酶解液置于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0013]2、樣品吸附與洗滌
對人血清IgG蛋白酶解物的富集:500 Ug材料經(jīng)上樣液(乙腈/水/三氟乙酸=88:11.5:0.5, v/v/v)洗滌后分散于200 uL上樣液中，加入I Ug人血清IgG蛋白酶解物，于室溫下輕微震蕩吸附30 min后，磁分離，棄上清液，將材料用上樣液洗滌三次,每次200 uL。
[0014]3、樣品的洗脫與檢測
向吸附后的材料中加入10 UL洗脫液(乙腈/水/三氟乙酸=30:69.9:0.1, v/v/v),室溫震蕩洗脫10 min后磁分離，取上清液直接用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-TOFMS)分析。MALD1-TOF MS分析步驟:取0.5 uL富集后的糖基化肽段點靶，待干燥后，點0.5uL 2，5- 二羥基苯甲酸(DHB)基質(zhì)(含70%乙腈和0.1% H3PO4的12.5 mg/mL DHB溶液)，待干燥后送入AB Sciex 5800 MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜儀(AB Sciex, CA)中進行分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)在正離子模式下采集(激光脈沖波長為355 nm)。
[0015]檢測結(jié)果參見圖2，(a)是對300 fmol人血清IgG酶解物直接分析得到的質(zhì)譜圖，(b)是對人血清IgG酶解物富集后進行分析(約15 fmol)得到的質(zhì)譜圖。對人血清IgG酶解物進行直接分析，非糖基化肽段幾乎占據(jù)了整張質(zhì)譜圖，由于非糖基化肽段的抑制，僅有兩條糖基化肽段以極低的信噪比被檢測到。用合成的材料進行富集后，幾乎檢測不到非糖基化肽段，而糖基化肽段在質(zhì)譜圖中占主要地位，并且信號有了極大的增強，一共有21個糖基化肽段峰(表I)被鑒定到。這是由于親水性分子中大量的-NH2和-OH親水基團的存在，使材料具有良好的親水性，在富集過程中，可以利用糖基化肽段和非糖基化肽段的親水性差異實現(xiàn)糖基化肽段的分離富集。
[0016]表I
【權(quán)利要求】
1.一種用于富集糖基化肽段的親水磁性納米材料的制備方法，其特征在于采用“一鍋法”制備了親水磁性納米材料，制備流程如下: 1)將I?5g FeCl3.6H20加入25?100 mL乙二醇中，超聲溶解10?30min，形成黃色透明溶液； 2)加入I?10g NH4Ac和0.5?4 g殼聚糖或纖維素或瓊脂糖,在氮氣保護下130?180°C加熱攪拌I?4 h ; 3)轉(zhuǎn)入100mL反應(yīng)釜中150?250°C水熱反應(yīng)14?24 h ; 4)反應(yīng)完畢后，對冷卻的黑色溶液進行磁分離，將產(chǎn)物用高純水和無水乙醇分別進行洗滌，50-80°C真空干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親水磁性納米材料的制備方法，其特征在于選擇帶有-NH2或-OH等極性基團的親水性糖類化合物殼聚糖、纖維素、瓊脂糖等為原材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親水磁性納米材料制備方法，其特征在于親水性糖類化合物與四氧化三鐵配伍。
【文檔編號】B82Y40/00GK104001481SQ201410246132
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】封順, 方春麗, 徐世美, 王吉德 申請人:新疆大學(xué)