專利名稱：Exendin-4偶聯(lián)超順磁性氧化鐵納米顆粒制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及材料化學(xué)，具體為通過合成聚乙二醇修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(Polyethylene glycol Coated Superparamagnetic Iron Oxide PEG-SPIO)，并將exendin-4偶聯(lián)其上，制備出具有beta細(xì)胞靶向性的超順磁性氧化鐵納米顆粒SPIO-exendiM，應(yīng)用該造影劑實(shí)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)受體高表達(dá)的胰島素瘤的靶向顯像。本發(fā)明還涉及該材料對(duì)beta細(xì)胞的體外標(biāo)記應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰島素瘤是來源于beta細(xì)胞的內(nèi)分泌腫瘤，盡管其發(fā)病率較低(1 4/106)，但卻是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤。胰島素瘤多呈散發(fā)的，局限于胰腺內(nèi)的實(shí)性、良性小腫瘤(直徑多小于2. 0cm)。手術(shù)是胰島素瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方式，可達(dá)到75 98%的治愈率，而對(duì)胰島素瘤的定位(包括原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶)則是準(zhǔn)確手術(shù)切除的先決條件。對(duì)胰島素瘤常用的臨床術(shù)前定位通常采用B超，CT,MRI等，增強(qiáng)CT掃描診斷敏感性可達(dá)到57 94%，增強(qiáng)MRI則有30 98%的敏感性。但對(duì)于Icm以內(nèi)的胰島素瘤，兩者的敏感性則大大降低，對(duì)于散在、 多發(fā)的微小病灶的定位則更加困難；而且，有10 27%為隱匿性胰島素瘤。而發(fā)展一類可靶向顯像胰島素瘤的特異探針則對(duì)微小及隱匿胰島素瘤的定位具有現(xiàn)實(shí)意義。GLP-I受體在90%以上的胰島素瘤上均有較高水平的表達(dá)(為生長(zhǎng)抑素受體2 表達(dá)水平的2倍)，而在胰腺外分泌腺表達(dá)較低，這為實(shí)現(xiàn)胰島素瘤(區(qū)別于胰腺外分泌腺的)顯像提供了良好的靶點(diǎn)。目前，國(guó)際上已采用標(biāo)記的eXendin-4(GLP-l類似物) 欲實(shí)現(xiàn)人胰島素瘤的SPECT成像；也有研究者采用68Ga標(biāo)記exendin-3 (另一種GLP-I的類似物)，在小鼠胰島素瘤模型上應(yīng)用PET進(jìn)行腫瘤顯像。SPECT及PET盡管敏感性高，但空間分辨率低，同時(shí)，放射性核素對(duì)受試者也存在一定影響。磁共振(MRI)擁有優(yōu)秀的空間分辨率，且無創(chuàng)，不涉及核素顯像，因而應(yīng)用MRI實(shí)現(xiàn)胰島素瘤的特異顯像具有更好的前景。既往國(guó)際文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的采用核素(如111In)標(biāo)記exendin-4實(shí)現(xiàn)胰島素瘤的靶向顯像，但核素顯像存在空間分辨率低及造影劑體內(nèi)代謝快、半衰期短等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種GLP-I類似物exendin-4偶聯(lián)的，可靶向 GLP-I受體的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO-exendiM)的制備方法，采用該方法制備的 SPI0-exendin4能用于胰島素瘤的靶向顯像，并可提高SPIO對(duì)beta細(xì)胞的標(biāo)記效率。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種SPIO-exendiM的制備方法，采用高溫水解金屬醇鹽螯合物過程制備出超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)，采用雙羧基聚乙二醇對(duì)所述顆粒進(jìn)行表面修飾，制備出PEG-SPI0，在此基礎(chǔ)上，將GLP-I類似物exendin-4偶聯(lián)于 PEG-SPIO制得本產(chǎn)品。本發(fā)明是采用高溫水解金屬醇鹽螯合物過程制備出SPIO納米顆粒，應(yīng)用APS對(duì) SPIO進(jìn)行硅烷化修飾及PEG對(duì)APS-SPIO顆粒進(jìn)行表面包被，得到PEG-SPI0，進(jìn)一步采用NHS/EDC方法將exendin-4偶聯(lián)于PEG-SPIO上，從而得到具有beta細(xì)胞靶向性的納米材料 SPI0-exendin4o本發(fā)明的具體步驟如下1)、在惰性氣體的保護(hù)下，于室溫中將!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黃褐色溶液；FeCl3*6H20 與 FeCl2*4H20 的摩爾比為 2 1，F(xiàn)eCl3 ·6Η20 在黃褐色溶液中的濃度為0. 01 0. IM ；2)、在惰性氣體的保護(hù)下，將步驟1)所得的黃褐色溶液升溫至120 140°C，然后加入去離子水和 2，2' _(乙烯二氧)雙(乙胺)(2，2-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) EDEA)，在120 140°C保溫30 60分鐘，得黑色懸浮液；去離子水與FeCl3 ·6Η20的摩爾比為30 10 1,2,2' _(乙烯二氧)雙(乙胺)與FeCl3 ·6Η20的摩爾比為200 400 1 ；3)、將步驟2)所得的黑色懸浮液冷卻至室溫，加入甲苯離心，去除上清液，得到棕色的氧化鐵納米顆粒(SPI0，為粉末狀固體)；甲苯與黑色懸浮液的體積比為1 3 1 ；4)、在惰性氣體保護(hù)下，將步驟3)所得的氧化鐵納米顆粒分散于甲苯中，使氧化鐵納米顆粒的濃度為0. 005 0. 05Μ ；然后在攪拌的情況下，加入3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺((3-aminopropyl)trimethoxysilane APS)和鈦酸丁酯，加熱至 70 90°C，回流反應(yīng)10 16小時(shí)；3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APS)與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為5 30 1，鈦酸丁酯與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為1 5 1 ；5)、將步驟4)反應(yīng)結(jié)束所得的溶液冷卻至室溫并離心分離，用甲苯清洗(3 5 次，目的是去除殘余未反應(yīng)的3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APS)或者鈦酸丁酯)，得到 APS-SPIO (APS修飾的SPI0，為棕色粉末)；將APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的濃度為0. 005 0. 05M ；然后于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，加入雙羧基PEG(poly(ethylene glycol)bis (carboxymethyl) ether，MW 600)和二環(huán)己基碳二亞胺(N，N-dicyclohexyl carbodiimide，DCC)，反應(yīng) 3 5小時(shí)后，所述雙羧基PEG與APS-SPIO的摩爾比為1 5 1，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與 APS-SPIO的摩爾比為5 20 1;上述反應(yīng)結(jié)束后，再加入2，2'-(乙烯二氧)雙(乙胺)(EDEA)，于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌的條件下繼續(xù)反應(yīng)3 5小時(shí)；所述2，2'-(乙烯二氧)雙(乙胺)(EDEA)與 APS-SPIO的摩爾比為1 5 1;6)、將步驟5)所得的產(chǎn)物離心，用乙醇和去離子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸鹽緩沖溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS緩沖溶液)，得到PEG-SPI0的PBS溶液；PEG-SPIO的PBS溶液中！^e元素濃度為3 7毫克/毫升(S卩，以SPIO中的!^e元素為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定濃度)；7)、將摩爾比1 2.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (N-ethyl-N-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide，EDC)與 N-羥基琥珀酰亞胺 (N-Hydroxysuccinimide, NHS)混合，得混合物；取步驟6)所得的(部分的)PEG-SPI0的PBS溶液加入exendin-4水溶液和上述混合物，于常溫下攪拌反應(yīng)8 12小時(shí)，從而使exendin-4通過表面的羧基與PEG-SPIO表面的氨基通過縮水反應(yīng)連結(jié)到PEG-SPIO表面；通過超濾，將可能殘存的EDC與NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物去除，最終得到的SPI0-exendin4 ；exendin-4與！^元素的質(zhì)量比為0. 5 1. 5 1，PEG-SPIO與EDC的摩爾比為1 2 4。作為本發(fā)明的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法的改進(jìn)步驟2)在攪拌條件下進(jìn)行。作為本發(fā)明的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法的改進(jìn)惰性氣體為Ar。本發(fā)明還同時(shí)公開了如上述方法制備的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的用途用于胰島beta細(xì)胞的標(biāo)記及胰島素瘤的靶向顯像。綜上所述，本發(fā)明采用3_(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APQ對(duì)制備的SPIO進(jìn)行硅烷化修飾及雙羧基聚乙二醇(PEG)對(duì)APS-SPIO顆粒進(jìn)行表面包被，得到粒徑均勻，分散性好，具有較好磁性的納米顆粒PEG-SPI0。進(jìn)一步采用NHS/EDC方法將GLP-I類似物 exendin-4 偶聯(lián)于 PEG-SPI0 上，得到 SPI0_exendin4。該SPIO-exendiM納米顆粒在體外系列標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中(活細(xì)胞及固定細(xì)胞的標(biāo)記， 胰腺內(nèi)原位胰島的標(biāo)記及胰島細(xì)胞移植物的標(biāo)記等)表現(xiàn)出對(duì)beta細(xì)胞的較高特異性。通過建立胰島素瘤模型，尾靜脈注射SPIO-exendiM，MRI掃描瘤體，可實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素瘤的靶向顯像。采用本發(fā)明制得的SPIO-exendiM的表征(圖1 圖4)。TEM掃描提示顆粒核心直徑約為5 lOnm，尺寸分布集中，在水溶液中分散性良好。納米激光粒度儀分析結(jié)果提示粒徑尺寸，包括SPIO核心和外部的修飾層，其平均尺寸為25nm。顆粒表面裹有約20nm左右厚的PEG修飾層，所產(chǎn)生的空間位阻作用平衡了作用在顆粒表面的磁性和范德華吸引力，這為PVP-SPIO納米顆粒提供了良好的膠體穩(wěn)定性和生物相容性。為了進(jìn)一步證實(shí)修飾劑被成功包覆在納米顆粒的表面，我們利用FIlR對(duì)SPIO納米顆粒的表面修飾基團(tuán)進(jìn)行表征。從圖中可以明顯看到PEG和APS的特征吸收峰。圖4是 PEG-SPIO在室溫(300K)下，外磁場(chǎng)為I時(shí)的磁滯回線。從圖中可以看出PEG-SPIO納米顆粒樣品表現(xiàn)出超順磁性，沒有余磁和矯頑力，在包覆修飾層后仍具有較高的飽和磁化強(qiáng)度， 達(dá)到 27emu/g。通過SPIO-exendiM納米顆粒在體外的系列標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，證明其對(duì)高表達(dá)GLP-I 受體的beta細(xì)胞具有較高的特異性。將100ug/ml鐵濃度的非靶向PEG-SPIO及靶向 SPI0-exendin4對(duì)INS-I細(xì)胞孵育12h后行普魯士藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)SPI0_exendin4比PEG-SPI0 可更多的標(biāo)記beta細(xì)胞。將200ug/ml鐵濃度的SPI0_exendin4及PEG-SPIO同4%多聚甲醛固定后的INS-I細(xì)胞孵育l，2，4h后行普魯士藍(lán)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非靶向的PEG-SPIO不能夠標(biāo)記beta細(xì)胞，而SPIO-exendiM可有效標(biāo)記INS-I細(xì)胞，且標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。通過將200ug/ml鐵濃度的PEG-SPIO與SPIO-exendiM同移植入腎包膜下的beta細(xì)胞切片孵育池后，普魯士藍(lán)染色結(jié)果提示SPIO-exendiM可有效標(biāo)記beta細(xì)胞移植物。將200ug/ml鐵濃度的PEG-SPIO與SPIO-exendiM同胰腺切片孵育池后，普魯士藍(lán)染色結(jié)果提示SPIO-exendiM可有效標(biāo)記原位胰島，而對(duì)外分泌腺則不能標(biāo)記。通過建立胰島素瘤荷瘤裸鼠模型，尾靜脈PEG-SPIO及SPIO-exendiM CBmg Fe/kg)，注射后Mh， 給予MRI掃描，T2加權(quán)像(T2-weighted image)上，SPI0_exendin4注射組老鼠腫瘤呈現(xiàn)明顯的負(fù)性增強(qiáng)，普魯士藍(lán)染色顯示在SPIO-exendiM注射組腫瘤內(nèi)有狗顆粒的沉積，表明胰島素瘤可被SPI0-exendin4靶向顯像。
目前尚沒有文獻(xiàn)及研究報(bào)道將exendin-4偶聯(lián)于SPIO上合成靶向造影劑。SPIO 為一種新型的MRI造影劑，在其基礎(chǔ)上可以偶聯(lián)不同的物質(zhì)，如抗體、小分子或肽段等，以形成具有不同用途，不同靶向性的造影劑；且MRI成像相比于核素顯像具有較高空間分辨率等優(yōu)勢(shì)。SPIO-exendiM合成的第一步是合成PEG-SPI0，然后在PEG-SPIO的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將exendin-4偶聯(lián)其上，制得具有靶向GLP-1受體的SPI0_exendin4。該SPI0_exendin4用于胰島素瘤靶向顯像的效果在體外實(shí)驗(yàn)中，SPI0_exendin4 相比于非靶向的PEG-SPI0，其對(duì)胰島素瘤細(xì)胞系具有更高的標(biāo)記效率，說明SPIO-exendiM 可通過配受體結(jié)合而更多的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。SPIO-exendiM還可在胰腺切片上區(qū)別顯示胰島細(xì)胞團(tuán)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，SPI0-exendin4可靶向聚集于胰島素瘤內(nèi)，而使胰島素瘤在MRI上得到顯示，而非靶向的PEG-SPIO則不能顯示胰島素瘤。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、合成的SPIO-exendiM具有良好的理化性質(zhì)及磁學(xué)特性；2、對(duì)比于非靶向的PEG-SPI0，靶向的SPI0-exendin4對(duì)活細(xì)胞及固定的beta細(xì)胞均具有較好的標(biāo)記效率；3、制備的SPIO-exendiM可有效標(biāo)記beta細(xì)胞移植物及胰腺內(nèi)原位胰島，且擁有較高的特異性；4、SPI0-exendin4在體內(nèi)對(duì)胰島素瘤具有良好的靶向顯像效果。綜上所述，本發(fā)明的SPIO-exendiM納米顆粒用于MRI上胰島素瘤的靶向顯像，為臨床上GLP-I受體高表達(dá)的胰島素瘤的靶向、特異診斷(包括原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶)提供有效手段。同時(shí)，SPIO-exendiM對(duì)beta細(xì)胞具有較高的細(xì)胞標(biāo)記效率，為更好的實(shí)現(xiàn)胰島beta 細(xì)胞標(biāo)記及MRI示蹤提供了良好的材料。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1PEG-SPI0納米顆粒的透射電鏡照片。圖2PEG-SPI0納米顆粒的納米激光粒度分析圖譜。圖3PEG-SPI0納米顆粒的傅立葉紅外吸收光譜。圖4PEG-SPI0納米顆粒的振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)室溫磁性圖譜。圖5是Exendin-4結(jié)構(gòu)及SPI0_exendin4的合成策略圖；A，Exendin-4分子結(jié)構(gòu)； B, Exendin-4的分子式；C，采用NHS/EDC方法合成SPI0_exendin4的策略。圖6-1是100ug/ml鐵濃度的PEG-SPI0與PEG-SPI0_Exendin4標(biāo)記同等數(shù)量的 iNs-i細(xì)胞Ia1后普魯士藍(lán)染色圖；左圖為100ug/ml鐵濃度的PEG-SPI0標(biāo)記INS-1細(xì)胞12h后普魯士藍(lán)染色圖；中圖為100ug/ml鐵濃度的SPI0_exendin4標(biāo)記INS-1細(xì)胞12h后普魯士藍(lán)染色圖；右圖為中圖的放大，清晰顯示細(xì)胞被SPIO-exendiM標(biāo)記； 結(jié)果提示相對(duì)于普通PEG-SPI0，含靶向的造影劑可更多的標(biāo)記細(xì)胞。
圖6-2是INS-I及原代胰島固定后，造影劑的標(biāo)記情況圖；A，INS-I細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定后，200ug/ml鐵濃度下的PEG-SPIO及PEG-SPI0_Exendin4標(biāo)記細(xì)胞lh，2h及4h，棄去造影劑并用PBS清洗三次，行普魯士藍(lán)染色；結(jié)果顯示普通PEG-SPIO為能標(biāo)記上固定的 INS-I細(xì)胞，而偶聯(lián)exendin-4的SPIO則隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。B,原代胰島切片經(jīng)固定后，給予200ug/ml SPI0-Exendin4孵育2h，PBS洗三次后行普魯士藍(lán)染色，提示SPIO-ExendiM同樣可標(biāo)記固定的胰島細(xì)胞。圖7是PEG-SPIO，SPI0_exendin4分別標(biāo)記移植入腎包膜下的beta細(xì)胞切片普魯士藍(lán)染色照片；A，INS-I細(xì)胞移植入腎包膜下的HE染色圖；B，C，200ug/ml鐵濃度的PEG-SPIO標(biāo)記胰島移植物切片池后普魯士藍(lán)染色，結(jié)果顯示PEG-SPIO未能標(biāo)記胰島移植物(C圖為B 圖的放大)；D，同等鐵濃度的SPIO-ExendiM標(biāo)記池后，普魯士藍(lán)染色顯示腎小管未被標(biāo)記，而E，F(xiàn)，胰島細(xì)胞移植物可被SPIO-ExendiM標(biāo)記(F圖為E圖中方框部分的放大)。圖8是PEG-SPIO，SPI0_exendin4分別標(biāo)記胰腺切片中的beta細(xì)胞普魯士藍(lán)染色照片；A，含胰島的胰腺切片HE染色；B，C，D，200ug/ml鐵濃度的SPIO-ExendiM標(biāo)記原位胰島池后，普魯士藍(lán)染色顯示胰島被SPIO-ExendiM標(biāo)記，而周圍外分泌腺則未被標(biāo)記(C，D圖為B圖內(nèi)胰島的逐級(jí)放大顯示)；E，F(xiàn)，G，顯示另一例胰島被SPIO-exendiM 有效標(biāo)記，而周圍外分泌腺則未被標(biāo)記(F，G為E圖內(nèi)胰島的逐級(jí)放大顯示)，證明了 SPI0-Exendin4存在著靶向性。圖9是PEG-SPI0，SPI0_exendin4分別注射入胰島素瘤荷瘤裸鼠體內(nèi)，MRI掃描成像T2WI圖像；左圖、中圖、右圖分別為未注射造影劑組、PEG-SPIO注射后24h及SPIO-exendiM 注射后MhMRI掃描T2WI圖。結(jié)果顯示胰島素瘤荷瘤鼠分別通過尾靜脈注射PEG-SPIO及 SPI0-exendin4 (3mgFe/kg)，24h 后 MRI 掃描成像(T2 map)。結(jié)果顯示 SPI0_exendin4 可聚集于胰島素瘤區(qū)域(表現(xiàn)為負(fù)性增強(qiáng))，而PEG-SPIO則無靶向性。圖10是PEG-SPIO，SPI0-exendin4注射不同組胰島素瘤切片普魯士藍(lán)染色照片， 用于普魯士藍(lán)染色驗(yàn)證SPIO-exendiM對(duì)胰島素瘤的靶向性。A，裸鼠胰島素瘤荷瘤模型建立，可見腫瘤粗大的供應(yīng)血管；B，C，胰島素瘤荷瘤鼠通過尾靜脈注射PEG-SPIO (3mg Fe/kg)，24h后切取腫瘤行普魯士藍(lán)染色，結(jié)果顯示腫瘤區(qū)域無鐵顆粒沉積(C圖為B圖框內(nèi)部分的放大)；D，E，F(xiàn)，胰島素瘤荷瘤鼠通過尾靜脈注射 SPI0-exendin4 (3mg Fe/kg)，24h后切取腫瘤行普魯士藍(lán)染色，結(jié)果顯示SPI0_exendin4可聚集于腫瘤部位(D圖及F圖分別為E圖內(nèi)框內(nèi)部分的放大)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1、一種exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPI0_exendin4納米顆粒)的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、在惰性氣體Ar的保護(hù)下，于室溫中將FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20按照2 1 的摩爾比溶解于聚乙二醇600(PEG600)中，得到黃褐色溶液；FeCl3 · 6H20在該黃褐色溶液中的摩爾濃度為0. 05M。2)、在惰性氣體Ar的保護(hù)下，將上述步驟1)所得的黃褐色溶液升溫至125°C， 加入一定量的去離子水和EDEA，在125°C保溫30分鐘，得黑色懸浮液。其中去離子水與 FeCl3 · 6H20 的摩爾比為 20 1，EDEA 與 FeCl3 · 6H20 的摩爾比為 300 1。
3)、將上述步驟2)所得的黑色懸浮液冷卻至室溫，加入甲苯5000rpm離心，甲苯與黑色懸浮液的體積比為1 1;去除上清液，得到棕色的氧化鐵納米顆粒(SPIO)(為粉末狀固體)。4)、在惰性氣體Ar保護(hù)下，將上述步驟3)得到的氧化鐵納米顆粒分散于甲苯中， 從而使氧化鐵納米顆粒的摩爾濃度為0. OlM ；然后在攪拌的條件下，加入一定量的APS和鈦酸丁酯，加熱至80°C，回流反應(yīng)10小時(shí)。APS與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為20 1，鈦酸丁酯與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為5 1。5)、將上述步驟4)反應(yīng)結(jié)束所得的溶液冷卻至室溫5000rpm離心分離，用甲苯清洗3 5次去除殘余未反應(yīng)的APS或者鈦酸丁酯，得到APS修飾的SPIO (APS-SPIO)的棕色粉末。每次清洗時(shí)甲苯的用量與反應(yīng)溶液體積相同。將得到的APS-SPIO分散于甲苯中，從而使APS-SPIO的濃度為0. OlM0在室溫中于30KHz的超聲清洗機(jī)中超聲，并機(jī)械攪拌，加入雙羧基PEG和DCC，反應(yīng)3小時(shí)后，再加入 EDEA，在室溫中于超聲及機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)。其中雙羧基PEG與APS-SPIO的摩爾比為3 1，DCC與APS-SPIO的摩爾比為10 1 ;EDEA與APS-SPI0的摩爾比為3 1。6)、將步驟5)所得的產(chǎn)物5000rpm離心，依次用乙醇和去離子水清洗，得到 PEG-SPIO。將PEG-SPIO分散于磷酸鹽緩沖溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS緩沖溶液)，得PEG-SPIO的PBS溶液，其濃度約為6毫克PEG-SPIO每毫升，即！^e元素濃度約為6 毫克每毫升(其準(zhǔn)確狗元素的濃度一般用原子吸收光譜測(cè)得，以下濃度均用元素濃度表不)O7)、將摩爾比1 2. 5的EDC與NHS混合，得混合物。取1毫升!^e元素濃度為6毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量 exendin-4水溶液與上述混合物(即摩爾比1 2. 5的EDC與NHS混合而得)，常溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)，exendin-4 /K溶液中exendin-4的濃度為1毫克每毫升，exendin-4與Fe元素的質(zhì)量比為1 1，PEG-SPIO與EDC的摩爾比為1 2。exendin-4通過表面的羧基與 PEG-SPIO表面的氨基通過縮水反應(yīng)連結(jié)到PEG-SPIO表面，通過3kDa的超濾管超濾，將可能殘存的EDC與NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物去除，得到最終的SPI0-exendin4。實(shí)施例2、一種exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPI0_exendin4納米顆粒)的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、在惰性氣體的保護(hù)下，于室溫中將!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黃褐色溶液；FeCl3*6H20 與 FeCl2*4H20 的摩爾比為 2 1，F(xiàn)eCl3 ·6Η20 在黃褐色溶液中的濃度為0. 05Μ。2)、在惰性氣體的保護(hù)下，將步驟1)所得的黃褐色溶液升溫至125°C，加入一定量的去離子水和EDEA，在125°C保溫30分鐘，得黑色懸浮液。其中去離子水與FeCl3 ·6Η20的摩爾比為20 1，EDEA與FeCl3 ·6Η20的摩爾比為300 1。3)、將步驟2)所得的黑色懸浮液冷卻至室溫，加入甲苯5000rpm離心，去除上清液，得到棕色氧化鐵納米顆粒(SPIO)粉末狀固體。其中甲苯與反應(yīng)溶液的體積比為1 1。4)、在惰性氣體保護(hù)下，將步驟3)得到的氧化鐵納米顆粒分散于甲苯中，使氧化鐵納米顆粒的濃度為0.01M，然后在攪拌的情況下，加入一定量的APS和鈦酸丁酯，加熱至80°C，回流反應(yīng)12小時(shí)。APS與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為20 1，鈦酸丁酯與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為1 1;5)、將上述反應(yīng)結(jié)束的溶液冷卻至室溫并5000rpm離心分離，用甲苯清洗3 5次去除殘余未反應(yīng)的APS或者鈦酸丁酯，每次清洗時(shí)甲苯的用量與反應(yīng)溶液體積相同。得到 APS修飾的SPIO(APS-SPIO)棕色粉末。將得到的APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的濃度為0. 01M，于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，加入雙羧基PEG和DCC，反應(yīng)4小時(shí)后，加入EDEA，于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。其中雙羧基PEG與APS-SPIO的摩爾比為3 1，EDEA與APS-SPIO 的摩爾比為3 1，DCC與APS-SPIO的摩爾比為10 1。 6)、將步驟5)得到的產(chǎn)物5000rpm離心，用乙醇和去離子水依次清洗，得到 PEG-SPI0，并分散于磷酸鹽緩沖溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS緩沖溶液)，得到 PEG-SPIO的PBS溶液；其濃度約為6毫克PEG-SPIO每毫升，即，PEG-SPIO的PBS溶液中！^e
元素濃度為6毫克/毫升。7)、取1毫升!^e元素濃度為6毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量 exendin-4水溶液與摩爾比1 2. 5的EDC與NHS的混合物，exendin-4水溶液中exendin_4 的濃度為1毫克每毫升，常溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)，exendin-4通過表面的羧基與PEG-SPIO 表面的氨基通過縮水反應(yīng)連結(jié)到PEG-SPIO表面，通過3kDa的超濾管超濾，將可能殘存的 EDC與NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物去除，得到最終的SPI0-exendin4。其中，exendin-4與!^e元素的質(zhì)量比為1 1，PEG-SPIO與EDC的摩爾比為1 2。實(shí)施例3、一種exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPI0_exendin4納米顆粒)的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、在惰性氣體的保護(hù)下，于室溫中將!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黃褐色溶液；FeCl3*6H20 與 FeCl2*4H20 的摩爾比為 2 1，F(xiàn)eCl3 ·6Η20 在黃褐色溶液中的濃度為0. 1Μ。2)、在惰性氣體的保護(hù)下，將上述黃褐色溶液升溫至135°C，加入一定量的去離子水和EDEA，在135°C保溫40分鐘，得黑色懸浮液；去離子水與FeCl3 · 6H20的摩爾比為 15 1，EDEA 與 FeCl3 · 6H20 的摩爾比為 200 1。3)、將反應(yīng)得到的黑色懸浮液冷卻至室溫，加入甲苯5000rpm離心，去除上清液， 得到棕色氧化鐵納米顆粒(SPIO)粉末狀固體。甲苯與黑色懸浮液的體積比為3 1。4)、在惰性氣體保護(hù)下，將得到的氧化鐵納米顆粒分散于甲苯中，使氧化鐵納米顆粒的濃度為0. OlM ；然后在攪拌的情況下，加入一定量的APS和鈦酸丁酯，加熱至80°C，回流反應(yīng)12小時(shí)。APS與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為10 1，鈦酸丁酯與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為3 1。5)、將上述步驟4)反應(yīng)結(jié)束的溶液冷卻至室溫并5000rpm離心分離，用甲苯清洗 3 5次去除殘余未反應(yīng)的APS或者鈦酸丁酯，得到APS修飾的SPIO (APS-SPIO)棕色粉末， 每次清洗時(shí)甲苯的用量與反應(yīng)溶液體積相同。將得到的APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的濃度為0. 02M ；然后于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，加入雙羧基PEG和DCC，反應(yīng)5小時(shí)后，再加入EDEA，于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。其中雙羧基PEG與APS-SPIO的摩爾比為4 1，EDEA與
9APS-SPIO的摩爾比為4 1，DCC與APS-SPIO的摩爾比為10 1。6)、將得到的產(chǎn)物5000rpm離心，依次用乙醇和去離子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸鹽緩沖溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS緩沖溶液)，得到PEG-SPI0的 PBS溶液；其濃度約為4毫克PEG-SPIO每毫升，即!^e元素濃度約為4毫克每毫升。7)、取2毫升的上述!^e元素濃度為4毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量exendin-4水溶液與摩爾比1 2. 5的EDC與NHS的混合物，exendin-4水溶液中 exendin-4的濃度為1毫克每毫升，常溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)，exendin-4通過表面的羧基與 PEG-SPIO表面的氨基通過縮水反應(yīng)連結(jié)到PEG-SPIO表面，通過3kDa的超濾管超濾，將可能殘存的EDC與NHS及反應(yīng)副產(chǎn)物去除，得到最終的SPI0-exendin4。其中，exendin-4與!^e 元素的質(zhì)量比為0.5 1，PEG-SPIO與EDC的摩爾比為1 3。實(shí)施例4、SPI0-exendin4納米顆粒體外標(biāo)記大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-I細(xì)胞 (一)(1)將大鼠INS-I細(xì)胞以8X IO4個(gè)種入M孔板中，生長(zhǎng)Mh。(2)將制備的PEG-SPIO及SPI0_exendin4納米顆粒用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，F(xiàn)e 濃度為100ug/ml。(3)在含INS-I細(xì)胞的M孔板中加入上述各組含納米顆粒的培養(yǎng)基500ul，孵育 Ia1行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果為普魯士藍(lán)染色顯示PEG-SPIO孵育12h，INS-I細(xì)胞被標(biāo)記效率較低；而 SPI0-exendin4在100ug/ml Fe濃度下則可有效標(biāo)記INS-I細(xì)胞。具體如圖6_1所示。從上述結(jié)果證實(shí)靶向性SPIO-exendiM比PEG-SPI0具有更高的beta細(xì)胞標(biāo)記效率。實(shí)施例5、SPI0-exendin4納米顆粒體外標(biāo)記大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-I細(xì)胞 (二)(1)將大鼠INS-I細(xì)胞以8X IO4個(gè)種入M孔板中，生長(zhǎng)24h后，用4%多聚甲醛室溫固定20min ；(2)將制備的PEG-SPIO與SPI0_exendin4納米顆粒用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，鐵濃度為200ug/ml。(3)在含固定的INS-I細(xì)胞的M孔板中分別加入上述各組含納米顆粒的培養(yǎng)基 500ul，孵育1，2，4h后行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果為不論孵育時(shí)間長(zhǎng)短，PEG-SPIO均不能標(biāo)記上固定的beta細(xì)胞，而 SPI0-exendin4可有效標(biāo)記固定的beta細(xì)胞，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。具體如6-2所示。從上述結(jié)果可以得知SPI0-exendin4不僅對(duì)活的beta細(xì)胞具有較高標(biāo)記效率， 對(duì)固定的beta細(xì)胞仍可通過配受體結(jié)合而較好的實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。實(shí)施例6、SPI0-exendin4標(biāo)記beta細(xì)胞移植物及胰腺內(nèi)原位胰島(1)收集2 X IO6個(gè)INS-I細(xì)胞，并將其移植入C57BL/6小鼠腎包膜下，一周后取出beta細(xì)胞移植物及胰腺，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋、切片(層厚 4um) ο(2)將制備的PEG-SPIO與SPI0_exendin4納米顆粒用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，鐵濃度為200ug/ml。(3)將上述混合液同胰腺切片及beta細(xì)胞移植物孵育池后，行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果為=PEG-SPIO不能夠標(biāo)記切片上的beta細(xì)胞移植物及胰腺內(nèi)胰島；而 SPI0-exendin4則可標(biāo)記beta細(xì)胞移植物及胰腺內(nèi)胰島，而不標(biāo)記腎小管等beta細(xì)胞移植物周邊組織及胰腺外分泌腺。具體如圖7，圖8所示。從上述結(jié)果可以得知制備的SPIO-exendiM對(duì)beta細(xì)胞移植物及胰腺內(nèi)胰島可實(shí)現(xiàn)良好的標(biāo)記，且表現(xiàn)出對(duì)beta細(xì)胞的特異性。實(shí)施例7、SPI0-exendin4對(duì)胰島素瘤的體內(nèi)靶向MRI顯像(1)收集2X IO7個(gè)INS-I細(xì)胞，注射入4周齡裸鼠腋下，建立胰島素瘤裸鼠荷瘤模型。(2)將建瘤成功的裸鼠稱重，腹腔注射50mg/kg的戊巴比妥鈉以麻醉小鼠。在 3. OTesla 的臨床MRI 上，用小鼠線圈進(jìn)行掃描。TR/TE = 200/8ms,Number of averages = 32, FOV = 3. 2X3. 2cm2, matrix size = 256X 256, resolution = 0. 125X0. 125mm2, slice thickness = 0. 5mm。(3)不同組荷瘤鼠通過尾靜脈注射入PEG-SPIO或SPI0_exendin4 C3mgFe/kg)，Mh 后進(jìn)行MRI掃描，參數(shù)基本同(2)。將不同組荷瘤裸鼠的腫瘤進(jìn)行石蠟切片，H&E染色及普魯士藍(lán)染色。結(jié)果為胰島素瘤在MRI T2加權(quán)上表現(xiàn)為高信號(hào)，PEG-SPIO注射后Mh，胰島素瘤信號(hào)無明顯改變，而在SPIO-exendiM注射后，胰島素瘤產(chǎn)生明顯信號(hào)改變，呈現(xiàn)負(fù)性增強(qiáng)(即顏色變黑)。普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，PEG-SPIO注射組胰島素瘤內(nèi)未見明顯鐵顆粒沉積，而在SPIO-exendiM注射組，腫瘤內(nèi)可見較多鐵顆粒聚集。具體如圖9，圖10所示。從上述結(jié)果可以得知SPI0-exendin4可靶向胰島素瘤，實(shí)現(xiàn)胰島素瘤在MRI上的靶向成像。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征是依次進(jìn)行以下步驟1)、在惰性氣體的保護(hù)下，于室溫中將FeCl3· 6H20和FeCl2 · 4H20溶解于聚乙二醇600 中，得到黃褐色溶液；所述FeCl3 · 6H20與FeCl2 · 4H20的摩爾比為2:1，F(xiàn)eCl3 · 6H20在黃褐色溶液中的濃度為0. 01 0. IM ；2)、在惰性氣體的保護(hù)下，將步驟1)所得的黃褐色溶液升溫至120 140°C，然后加入去離子水和2，2’ -(乙烯二氧)雙(乙胺)，在120 140°C保溫30 60分鐘，得黑色懸浮液；所述去離子水與 ^α3·6Η20的摩爾比為30 10 :1，2，2’-(乙烯二氧)雙(乙胺)與 FeCl3 · 6Η20 的摩爾比為 200 400 :1 ；3)、將步驟2)所得的黑色懸浮液冷卻至室溫，加入甲苯離心，去除上清液，得到棕色的氧化鐵納米顆粒；所述甲苯與黑色懸浮液的體積比為1 3 :1 ；4)、在惰性氣體保護(hù)下，將步驟3)所得的氧化鐵納米顆粒分散于甲苯中，使氧化鐵納米顆粒的濃度為0. 005 0. 05Μ ；然后在攪拌的情況下，加入3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺和鈦酸丁酯，加熱至70 90°C，回流反應(yīng)10 16小時(shí)；3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為5 30 :1，鈦酸丁酯與氧化鐵納米顆粒的摩爾比為1 5 :1 ；5)、將步驟4)反應(yīng)結(jié)束所得的溶液冷卻至室溫并離心分離，用甲苯清洗，得到 APS-SPIO ；將所述APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的濃度為0. 005 0. 05M ；然后于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌下，加入雙羧基PEG和二環(huán)己基碳二亞胺，反應(yīng)3 5小時(shí)后，所述雙羧基PEG與APS-SPIO的摩爾比為1 5 :1，二環(huán)己基碳二亞胺與APS-SPIO的摩爾比為5 20 1 ；上述反應(yīng)結(jié)束后，再加入2，2’ -(乙烯二氧)雙(乙胺)，于室溫中在超聲及機(jī)械攪拌的條件下繼續(xù)反應(yīng)3 5小時(shí)；所述2，2’ -(乙烯二氧)雙(乙胺)與APS-SPIO的摩爾比為 1 5 :1 ；6)、將步驟5)所得的產(chǎn)物離心，用乙醇和去離子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸鹽緩沖溶液中，得到PEG-SPIO的PBS溶液；所述PEG-SPIO的PBS溶液中！^元素濃度為3 7毫克/毫升；7)、將摩爾比1 2. 5的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺混合，得混合物；取步驟6)所得的部分的PEG-SPIO的PBS溶液加入exendin-4水溶液和上述混合物，于常溫下攪拌反應(yīng)8 12小時(shí)，從而使exendin-4通過表面的羧基與PEG-SPIO表面的氨基通過縮水反應(yīng)連結(jié)到PEG-SPIO表面；再通過超濾，最終得到的SPIO-exendiM ；所述 exendin-4與Fe元素的質(zhì)量比為0. 5 1. 5 :1，PEG-SPIO與EDC的摩爾比為1 :2 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征是所述步驟2)在攪拌條件下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法，其特征是所述惰性氣體為Ar。
4.如權(quán)利要求1 3中任意一種方法制備的Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的用途，其特征是用于胰島beta細(xì)胞的標(biāo)記及胰島素瘤的靶向顯像。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Exendin-4偶聯(lián)的超順磁性氧化鐵納米顆粒的制備方法，其采用高溫水解金屬醇鹽螯合物過程制備出SPIO納米顆粒，應(yīng)用APS對(duì)SPIO進(jìn)行硅烷化修飾及PEG對(duì)APS-SPIO顆粒進(jìn)行表面包被，得到PEG-SPIO，進(jìn)一步采用NHS/EDC方法將exendin-4偶聯(lián)于PEG-SPIO上，從而得到具有beta細(xì)胞靶向性的納米材料SPIO-exendin4。采用本發(fā)明方法制備而得的SPIO-exendin4能用于胰島素瘤的靶向顯像，并可提高SPIO對(duì)beta細(xì)胞的標(biāo)記效率。
文檔編號(hào)B82Y30/00GK102249345SQ20111008393
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者吳育連, 張波, 翟傳鑫 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)