專利名稱：以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，涉及以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法。

背景技術(shù)：
隨著全球原油價(jià)格的不斷攀升以及溫室效應(yīng)的加重，近幾年各國紛紛加大對(duì)生物燃料的研發(fā)力度和推廣應(yīng)用。生物柴油作為一種清潔的替代燃料，它可生物降解、無毒、幾乎不含硫和芳香類化合物，并且使用方便，不需要對(duì)發(fā)動(dòng)機(jī)進(jìn)行改造或者只做微小改動(dòng)就可以直接使用生物柴油或者將生物柴油與石化柴油接任意比例調(diào)和后使用(Palligarnai T et al.Bio dieselproduction—current state of the art and challenges.J IndMicrobiol Biotechnol.2008)。
生物柴油是一種生物質(zhì)能，其生產(chǎn)原料十分廣泛，既可用玉米、木薯、高粱等淀粉類作物以及甘蔗、甜菜等糖類作物，還可以用大豆、蓖麻、油菜籽、麻風(fēng)樹等油料作物，不受地理等影響，可以因地制宜種植生物柴油原料植物，形成綠色能源儲(chǔ)備庫，加上生物柴油的生產(chǎn)不受地理環(huán)境的影響，可免去勘探、鉆井、采礦及長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)，利于普及和推廣(M.Canakciand H.Sanli.Biodiesel production from various feedstocks andtheir effects on the fuel properties.J Ind Microbiol Biotechnol.2008，35431-441)。因此，生物柴油的布局更合理，在能源上更加獨(dú)立，使得各國的能源不易受到別國的干涉和控制，減少對(duì)石油市場(chǎng)的依賴。
生物柴油的生產(chǎn)技術(shù)和使用技術(shù)已經(jīng)比較成熟。早期利用高溫裂解生產(chǎn)汽油、柴油，但是轉(zhuǎn)化率低、能耗高、經(jīng)濟(jì)性差，現(xiàn)在生物柴油生產(chǎn)技術(shù)主要可以分為物理法和化學(xué)法。其中酯化/酯交換是生物柴油的主要生產(chǎn)方法，即用含或不含游離脂肪酸的油脂和醇等進(jìn)行酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，生成相應(yīng)的脂肪酸低碳烷基酯，再經(jīng)分離甘油、水洗、干燥等適當(dāng)后處理即得生物柴油。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化得到的脂肪酸低碳烷基酯完全具有石化柴油幾乎相同的流動(dòng)性和粘度范圍，同時(shí)具有與石化柴油的完全互溶性，是一種良好的柴油內(nèi)燃機(jī)動(dòng)力燃料(莊靜，周熙榮，孫超才，王偉榮，李延莉，顧龍弟，錢小芳。利用植物油脂生產(chǎn)生物柴油技術(shù)和方法的研究進(jìn)展。上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)。2006年，04期；王曉東。生物柴油的制備技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀。工業(yè)催化。2008年，08期；黃世豐，陳國，方柏山。酯化及轉(zhuǎn)酯化法制備生物柴油過程中催化劑的研究進(jìn)展。化工進(jìn)展。2008年，27卷4期)。
經(jīng)過國內(nèi)外多年的探索，從眾多能源原料作物中脫穎而出的能源甘蔗備受關(guān)注，20世紀(jì)70年代后期就已經(jīng)利用甘蔗的熱帶種S.officinarum同熱帶斑茅屬植物雜交育并篩選出了高生物量的甘蔗品種，其特點(diǎn)在于生長(zhǎng)快、生物量高、可發(fā)酵糖的含量高以及纖維含量高(Edme SJ，Miller JD，Glaz B，Tai PY-P，Comstock JC.Genetic contribution to yield in the Floridasugarcane industry accross 33 years.Crop Science.2005，4592-97)，并且甘蔗是作物中對(duì)太陽能利用率最高的作物之一，因而能充分轉(zhuǎn)化太陽能為貯藏能。最有說服力的就是巴西經(jīng)驗(yàn)，為應(yīng)對(duì)上世紀(jì)以來的幾次世界石油危機(jī)，減少對(duì)石油進(jìn)口的依賴，巴開充分利用本國的甘蔗種植優(yōu)勢(shì)，制定了以甘蔗為主要原料的燃料乙醇計(jì)劃。目前該國已經(jīng)掌握了生產(chǎn)酒精燃料的成熟技術(shù)，成為世界上最大的酒精出口國之一，也是以酒精為汽車燃料最為成功的國家之一(Gisella M.Zanin et al.Brazilian Bioethanol Program.Applied Biochemistry andBiotechnology.2000，Vol.84-861147-1161)。上述這些事實(shí)證明甘蔗是一種優(yōu)質(zhì)的生物燃料生產(chǎn)原料。
對(duì)于目前的現(xiàn)有技術(shù)而言，將甘蔗作為原料生產(chǎn)生物燃料是指燃料乙醇的生產(chǎn)，該現(xiàn)有技術(shù)主要包括用厭氧微生物，如酵母，對(duì)甘蔗中的可發(fā)酵糖(其中包括蔗糖、還原糖以及其他可被生物所利用的單糖、二糖以及多糖)進(jìn)行厭氧發(fā)酵，然后將發(fā)酵液脫去水分進(jìn)而生產(chǎn)出燃料乙醇(Kevin A Gray et al.Bioethanol.Current Opinion in Chemical Biology.2006，10141-146)。然而，實(shí)現(xiàn)將甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的技術(shù)尚無報(bào)道。和燃料乙醇相比，生物柴油的熱值高于乙醇，完全燃燒可以釋放出更多的熱量；用乙醇作為原料需要對(duì)現(xiàn)有汽車的制動(dòng)裝置和/或設(shè)備進(jìn)行改造，而用生物柴油作為燃料則不需要對(duì)汽車進(jìn)行改造就可以直接使用，從而節(jié)省了汽車制造業(yè)的研發(fā)和改造成本(安曉東，李冠峰，李洲。乙醇與生物柴油應(yīng)用對(duì)比分析和市場(chǎng)化前景。農(nóng)機(jī)化研究。2008年，08期)；在目前的燃料乙醇生產(chǎn)流程中，需要耗費(fèi)大量的電能對(duì)含有乙醇的發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾以便除去過多的水分，而生物柴油的生產(chǎn)過程中不需要該步驟；生物柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物是甘油，這是一種非常有用的化學(xué)產(chǎn)品(何延青，吳永強(qiáng)，聞建平。生物柴油生產(chǎn)及其副產(chǎn)物甘油的有效利用。中國油脂，2007年，第32卷，第05期)。
小球藻為綠藻門小球藻屬(Chlorella)單細(xì)胞綠藻，生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度快。小球藻細(xì)胞除了可在自養(yǎng)條件下利用光和二氧化碳進(jìn)行正常的生長(zhǎng)外，還可以在異養(yǎng)條件下利用有機(jī)碳源，如葡萄糖，進(jìn)行快速生長(zhǎng)繁殖并且在細(xì)胞內(nèi)積累大量油脂(魏東，劉龍軍。異養(yǎng)小球藻產(chǎn)總脂肪酸的培養(yǎng)基優(yōu)化?；瘜W(xué)與生物工程。2008年，03期；閆海，張賓，王素琴，李雅雯，劉碩，楊帥。小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的研究進(jìn)展?，F(xiàn)代化工。2007年，第4期)，細(xì)胞的生長(zhǎng)主要依賴細(xì)胞對(duì)有機(jī)碳源的吸收，因此可以通過流加策略等工業(yè)手段實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵和脂肪的高效合成。清華大學(xué)吳慶余課題組以一株既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)生長(zhǎng)的綠藻Chlorella protothecoides為材料，率先開展了利用異養(yǎng)微藻來生產(chǎn)生物柴油的研究，目前通過建立合理的補(bǔ)料流加策略，異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)密度可達(dá)100gL-1，油脂含量超過細(xì)胞干重的50％，這種微藻油脂同樣也是一種潛在的生產(chǎn)生物柴油的原料來源(Miao XL，Wu QY.Biodiesel production from heterotrophic microalgal oil.BioresourTechnol.2006.97841-6；Xu H，Miao XL，Wu QY.High qualitybiodiesel production from microalga Chlorella protothecoides byheterotrophic growth in fermenters.J Biotechnol.2006.126499-507；Li XF，Xu H，Wu QY.Large-scale biodieselproduction from microalga Chlorella protothecoids throughheterotrophic cultivation in bioreactors.Biotechnology andBioengineering.2007.98(4)764-71；Xiong W，Li XF，Xiang JY，et al.High Density Fermentation of Microalga ChlorellaProtothecoides in Bioreactor for Microbio-Diesel Production.Applied Microbiology and Biotechnology.2008，7829-36)。
在利用小球藻來生產(chǎn)生物柴油方面，已經(jīng)有相關(guān)專利對(duì)此進(jìn)行了描述。例如中國專利申請(qǐng)公開CN1446882A公開了用淀粉酶解培養(yǎng)異養(yǎng)藻制備生物柴油的方法，其利用酶解淀粉制葡萄糖水溶液配制培養(yǎng)液，通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)技術(shù)獲得高脂肪含量的異養(yǎng)藻細(xì)胞，再用高脂肪含量的異養(yǎng)藻快速熱解制備得到生物柴油。中國專利申請(qǐng)公開CN101230364A公開了一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法，其通過高生長(zhǎng)速率與高脂肪含量藻種的篩選、接種并進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵，得到高密度培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻細(xì)胞，經(jīng)過分離、收集并干燥、抽提藻油，再經(jīng)過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油。但是這些方法需要復(fù)雜的培養(yǎng)基配制過程，需要添加額外的物質(zhì)，步驟繁瑣，成本較高，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)上存在一定缺陷。
考慮到以上所述方面，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種利用甘蔗中的可發(fā)酵碳源生產(chǎn)生物柴油的方案。微藻將甘蔗中的碳源轉(zhuǎn)化為油脂并在細(xì)胞內(nèi)大量積累，積累的油脂提取后經(jīng)過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而生成生物柴油。這不僅降低生產(chǎn)生物柴油的原料成本，也巧妙的填補(bǔ)了利用甘蔗來生產(chǎn)生物柴油的技術(shù)空缺，為甘蔗的全面開發(fā)利用提供了一種新的途徑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，具體的說，本發(fā)明的大體過程為以甘蔗汁為原料，首先將甘蔗汁中的多糖轉(zhuǎn)化成產(chǎn)油微藻能夠直接利用的單糖，得到甘蔗汁降解液，再利用甘蔗汁降解液培養(yǎng)產(chǎn)油微生物獲得油脂，然后從獲得的油脂制備生物柴油。
本發(fā)明的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，包括以下步驟 (1)從甘蔗提取甘蔗汁； (2)將甘蔗汁中多糖轉(zhuǎn)化成單糖，獲得甘蔗汁降解液； (3)利用甘蔗汁降解液培養(yǎng)產(chǎn)油微藻； (4)從產(chǎn)油微藻獲得油脂； (5)從油脂制備生物柴油。
其中所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)化方法可為酸法降解、堿法降解或酶法降解，優(yōu)選酶法降解。酶法降解可以利用蔗糖轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行。
酶法降解中酶的加入量為每100kg底物130-400g酶，優(yōu)選每100kg底物300g酶，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。
所述的產(chǎn)油微藻優(yōu)選為小球藻，更優(yōu)選為原始小球藻(Cholorella protothecoides)。
在所述步驟(3)中培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法為使用三角搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-40攝氏度，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度；搖床旋轉(zhuǎn)速度為100-300rpm，優(yōu)選150-250rpm，最優(yōu)選220rpm；pH為5.0-7.5，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3，可發(fā)酵碳源濃度為10-30g/L，優(yōu)選30g/L。
在所述步驟(3)中培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法還可為使用發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-40攝氏度，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度；攪拌速度為100-500rpm，優(yōu)選200-400rpm，最優(yōu)選350rpm；pH為5.0-7.5，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3；溶解氧飽和度維持在5-50％，優(yōu)選10-40％，可發(fā)酵碳源濃度為10-30g/L，優(yōu)選30g/L。
在所述步驟(4)中從產(chǎn)油微藻獲得油脂的方法為壓榨法、裂解法、有機(jī)溶劑抽提、破碎細(xì)胞或超臨界流體技術(shù)。
在所述步驟(5)中采用酯化反應(yīng)從油脂制備生物柴油。
采用本發(fā)明方法，在將甘蔗汁中多糖轉(zhuǎn)化成單糖，獲得甘蔗汁降解液后，無需添加其它營養(yǎng)因子即可直接用于培養(yǎng)小球藻，不僅簡(jiǎn)化培養(yǎng)過程，還降低生產(chǎn)成本。這對(duì)于大規(guī)模的生物量生產(chǎn)以及油脂的生產(chǎn)而言，都是極為有利的。



圖1表示在實(shí)施例1搖瓶培養(yǎng)中，小球藻的細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中還原糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化。
其中，實(shí)心圈表示細(xì)胞密度，空心方塊表示還原糖濃度。數(shù)值為平行取樣3次的平均值。
圖2中A圖表示用尼羅紅染色方法對(duì)培養(yǎng)起始階段的細(xì)胞進(jìn)行的染色。B圖表示用尼羅紅染色方法對(duì)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行的染色。
其中，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光信號(hào)強(qiáng)度，其中500nm-650nm區(qū)域?yàn)橹行灾男盘?hào)區(qū)域。
圖3表示在實(shí)施例2的5L發(fā)酵罐中，小球藻的細(xì)胞密度和培養(yǎng)液中還原糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化。
其中，空心方塊表示細(xì)胞密度，實(shí)心圈表示還原糖濃度。
圖4為葡萄糖培養(yǎng)基和甘蔗汁完全培養(yǎng)基用于小球藻培養(yǎng)的比較。
其中，▲和■表示細(xì)胞密度，△和□表示殘留的還原糖濃度，■和□表示葡萄糖對(duì)照，▲和△表示甘蔗汁完全培養(yǎng)基。
圖5為甘蔗汁酶解液(未補(bǔ)加其他營養(yǎng)因子)和甘蔗汁完全培養(yǎng)基用于小球藻培養(yǎng)的比較。
其中，●和▲表示細(xì)胞密度，○和△表示殘留的還原糖濃度，▲和△表示甘蔗汁完全培養(yǎng)基，●和○表示甘蔗汁酶解液(未補(bǔ)加其他營養(yǎng)因子)。
圖6為尼羅紅染色熒光譜。
其中，(實(shí)線)葡萄糖，(虛線)甘蔗汁酶解液。雙箭頭指示570nm位置。
圖7為不同濃度甘蔗汁酶解液(不額外添加其他營養(yǎng)因子)對(duì)小球藻培養(yǎng)的影響。
其中，還原糖濃度分別為■5g L-1，●10g L-1，▲15g L-1，□25g L-1，○30g L-1。

具體實(shí)施例方式 術(shù)語 除非另有指明，否則本說明中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明涉及技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)理解有相同含義。
如此處所用，術(shù)語“生物柴油”根據(jù)美國試驗(yàn)與材料學(xué)會(huì)(ASTM)生物柴油D-6751標(biāo)準(zhǔn)，定義為從可再生脂質(zhì)資源，如植物油或動(dòng)物脂中得到的長(zhǎng)鏈脂肪酸烷基單酯，是由長(zhǎng)鏈脂肪酸的單烷基酯組成的燃料(Specification for Biodiesel(B100)-ASTM D6751)。其中“生物”表示它相對(duì)于石化柴油而言，是一種可再生的生物資源；“柴油”指的是它可用于柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。
如此處所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)酯反應(yīng)”(也作“酯交換反應(yīng)”、“酯交換”)是指酯與醇在酸或堿的催化下生成一個(gè)新酯和一個(gè)新醇的反應(yīng)，即酯的醇解反應(yīng)。
如此處所用，術(shù)語“異養(yǎng)”是指生物不能直接利用無機(jī)物合成有機(jī)物，必須攝取現(xiàn)成的有機(jī)物來維持生活的營養(yǎng)方式。
如此處所用，術(shù)語“還原糖”是指能夠還原斐林(H.vonFehling)試劑或托倫斯(B.Tollens)試劑的糖稱為還原糖，所有的單糖，不論醛糖、酮糖都是還原糖，如果糖、葡萄糖。部分雙糖也是還原糖，但蔗糖不是。例如在本發(fā)明中，甘蔗中的可發(fā)酵糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖以及其他可被生物所利用的單糖、二糖以及多糖，對(duì)甘蔗汁進(jìn)行酶法降解之后，認(rèn)為酶解液中得到的是一種以果糖和葡萄糖等還原糖類為主要成分的混合物，因而在本發(fā)明的上下文中，還原糖也可以理解為酶解液中的這些成分。
如此處所用，術(shù)語“中性脂”、“中性脂肪”、“油脂”或“甘油三酯”在本說明中可以互相替換。甘油三酯是指由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成的脂肪分子。絕大多數(shù)是混合的三酰甘油，即含有兩種或三種不同的脂肪酸的三酰甘油。甘油三酰在常溫下(25℃)呈固態(tài)者稱為脂；在常溫下呈液態(tài)者稱為油。一般情況下，中性脂主要是指甘油三酯。
以下將詳細(xì)地介紹本發(fā)明的具體步驟。
本發(fā)明的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，包括 (1)從甘蔗提取甘蔗汁； 本發(fā)明的最終目的是利用產(chǎn)油微藻將甘蔗中的可發(fā)酵碳源轉(zhuǎn)化為油脂，進(jìn)而制備生物柴油。其中所述可發(fā)酵碳源是指任何可以被微生物以任何方式所利用的碳源。甘蔗中的碳源以多種形式存在，例如甘蔗外皮中，碳源主要是指纖維素和木質(zhì)素等有機(jī)化合物；在甘蔗汁中，碳源主要包括但不限于蔗糖、蔗糖衍生的產(chǎn)物、葡萄糖、果糖以及其他可以利用的碳源。成熟的原料蔗(原料蔗是指蔗莖，不包括蔗葉、蔗梢和蔗根)一般含水分約70％-77％、蔗糖約12％-18％、葡萄糖約0.4％-1.5％、纖維約9.5％-12％、非糖有機(jī)物約0.7％-1.0％、無機(jī)物約0.5％-1.4％。甘蔗汁中水分約占76％-85％、可溶性碳水化合物約占13％-22％、其它成分約占1.2％-2.8％，其中所述可溶性碳水化合物主要成分是蔗糖、葡萄糖和果糖(陳平華。甘蔗主成分分析及作為再生能源的可行性。甘蔗。2004年，02期)。
小球藻可以利用多種有機(jī)和無機(jī)碳源，在小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)中優(yōu)選利用六碳糖作為有機(jī)碳源，更優(yōu)選利用葡萄糖和/或果糖作為有機(jī)碳源(閆海，張賓，王素琴，李雅雯，劉碩，楊帥。小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的研究進(jìn)展?，F(xiàn)代化工。2007年，第4期)。因而，優(yōu)選使用甘蔗汁作為可發(fā)酵碳源的形式，甘蔗汁的獲取步驟包括 ①將甘蔗制備成小塊和/或碾軋甘蔗破壞其堅(jiān)硬外皮結(jié)構(gòu)，以便更有效的提取更多甘蔗汁。可以使用工業(yè)制造領(lǐng)域中任何適合的人工、自動(dòng)化、半自動(dòng)化裝置處理和/或碾軋甘蔗，包括但不限于刀、輥軸、甘蔗削皮機(jī)、甘蔗皮切割裝置、滾筒式切割機(jī)、甘蔗糖廠高強(qiáng)度耐磨切蔗機(jī)、斧型式和/或釘型式甘蔗撕解機(jī)等； ②榨取①中處理過的甘蔗，并收集甘蔗汁。可以使用工業(yè)制造領(lǐng)域中任何適合的人工、自動(dòng)化、半自動(dòng)化裝置榨取甘蔗汁，包括但不限于離心設(shè)備、臺(tái)式、立式、手搖式甘蔗榨汁機(jī)、家用甘蔗榨汁機(jī)、糖廠壓榨機(jī)、壓榨輥軸等。
(2)將甘蔗汁中的多糖進(jìn)行降解，使其中的碳源轉(zhuǎn)化成適于產(chǎn)油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液； 將甘蔗汁中的碳源轉(zhuǎn)變成適于特定微生物物種利用的形式，對(duì)于微藻，尤其是小球藻而言，優(yōu)選將甘蔗汁中的碳源轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁切问剑虼烁收嶂械奶荚崔D(zhuǎn)變方式優(yōu)選是指將蔗糖降解為單糖。為了向小球藻提供甘蔗中的可發(fā)酵碳源，可以利用本領(lǐng)域公知的任何合適的方法將蔗糖降解為單糖，方法包括但不限于酸法降解、堿法降解和酶法降解，從而得到甘蔗汁降解液。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中優(yōu)選使用酶法降解蔗糖，更優(yōu)選使用蔗糖轉(zhuǎn)化酶降解蔗糖。酶加入的量以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，可以輕易的根據(jù)酶制造商提供的說明書或者本領(lǐng)域相關(guān)文獻(xiàn)來做出改進(jìn)或決定。本發(fā)明按照每100kg底物130-400g酶的比例加入酶，優(yōu)選每100kg底物加入300g酶，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選30分鐘。因?yàn)楦收嶂兄饕荚词钦崽?、葡萄糖和果糖，因此，?jīng)過酶解之后獲得的碳源主要是指果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖是還原糖，因而可以用DNS法測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明按照DNS法測(cè)量酶解液。所得酶解液可以稀釋或者濃縮之后使用。
以上獲得的甘蔗汁降解液中，不僅含有可供微藻特別是小球藻利用的可發(fā)酵碳源，還包括供其利用的氮源等。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過降解的甘蔗汁，已經(jīng)包含了微藻生產(chǎn)所需的各種營養(yǎng)元素，無需再添加任何其它物質(zhì)，滅菌后即可直接利用。這避免了目前產(chǎn)油微藻培養(yǎng)技術(shù)中培養(yǎng)基配置繁雜，需要使用純品試劑，成本較高的缺點(diǎn)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，降低了生產(chǎn)成本。對(duì)于大規(guī)模的生物量生產(chǎn)以及油脂的生產(chǎn)而言，都是極為有利的。
將上述甘蔗汁降解液進(jìn)行滅菌處理后，獲得最終的培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液用于小球藻的培養(yǎng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何合適的滅菌方法處理上述生產(chǎn)生物柴油的原料，包括但不限于物理輻射、過濾、高溫高壓滅菌和/或添加化學(xué)添加劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選采用蒸汽滅菌法處理原料。
(3)利用甘蔗汁降解液培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，特別是產(chǎn)油微藻； 產(chǎn)油微生物為任何具有油脂生產(chǎn)能力的微生物，優(yōu)選產(chǎn)油微藻，更優(yōu)選小球藻，最優(yōu)選原始小球藻(Cholorellaprotothecoides)。
小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的過程包括①將小球藻接種至滅菌處理的甘蔗汁降解液中。小球藻在異養(yǎng)狀態(tài)下利用培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源作為唯一碳源用于維持生理活動(dòng)并積累油脂。②小球藻利用甘蔗汁中的可發(fā)酵碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)和繁殖，并在體內(nèi)積累油脂。
可以使用本領(lǐng)域公知的任何合適的容器和/或設(shè)備進(jìn)行培養(yǎng)，包括但不限于發(fā)酵罐、搖瓶、通氣瓶、培養(yǎng)箱、搖床、泵、冷凝設(shè)備、監(jiān)控設(shè)備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在恒溫?fù)u床中使用三角搖瓶培養(yǎng)小球藻。小球藻在10-40攝氏度范圍內(nèi)均可以生存，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度。搖床旋轉(zhuǎn)速度可以是100-300rpm，優(yōu)選150-250rpm，最優(yōu)選220rpm。pH在5.0-7.5之間，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選在28攝氏度，220rpm，pH6.3，常壓下培養(yǎng)小球藻，一次性向小球藻提供培養(yǎng)基。也可以在發(fā)酵罐中對(duì)小球藻進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵。發(fā)酵罐的培養(yǎng)規(guī)?？梢允菑?L至數(shù)十噸，甚至更大規(guī)模。小球藻在10-40攝氏度范圍內(nèi)均可以生存，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度。攪拌速度可以是100-500rpm，優(yōu)選200-400rpm，最優(yōu)選350rpm。pH在5.0-7.5之間，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3。溶解氧飽和度維持在5-50％左右，優(yōu)選10-40％左右，由于溶解氧對(duì)于培養(yǎng)液的條件變化敏感，隨著補(bǔ)料、攪拌速度、細(xì)胞密度、培養(yǎng)基成分、通氣量等的變化而變化，因此，此處所述“左右”是有必要并且有意義的，不應(yīng)理解為表述模糊不清。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選在5L發(fā)酵罐中對(duì)小球藻進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵，在28攝氏度，350rpm，pH6.3，溶解氧飽和度維持在10-40％左右，常壓下對(duì)小球藻進(jìn)行發(fā)酵，采用流加策略向小球藻提供營養(yǎng)物質(zhì)，使得可發(fā)酵碳源濃度維持在10-30g/L。
培養(yǎng)期間，可以定時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度、可發(fā)酵碳源濃度以及細(xì)胞內(nèi)油脂的積累隨時(shí)間的變化，取樣間隔可以是但不限于每48小時(shí)、每36小時(shí)、每24小時(shí)、每12小時(shí)、每6小時(shí)、每3小時(shí)、每1小時(shí)?？紤]到實(shí)驗(yàn)材料自身的生長(zhǎng)特性，本發(fā)明優(yōu)選每24小時(shí)平行取樣3次進(jìn)行測(cè)定，取平均值。培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度通過分光光度計(jì)測(cè)定光密度值(OD540nm)來估算。OD540nm與細(xì)胞干重的線性關(guān)系可以用以下公式表示y＝0.4155x，(R2＝0.9933，P<0.05)，其中y表示細(xì)胞密度(g L-1)，x表示540nm處光吸收密度值。使用DNS法來測(cè)量培養(yǎng)基中還原糖的濃度，因?yàn)楸景l(fā)明中的可發(fā)酵碳源主要是由甘蔗汁酶解液中可被DNS所探測(cè)到的還原性碳源所組成的，因此在本發(fā)明中利用DNS法測(cè)得的還原糖濃度來表示可發(fā)酵碳源濃度。使用尼羅紅染色法來評(píng)價(jià)油脂在藻細(xì)胞中的積累情況。
(4)從產(chǎn)油微藻獲得油脂； 從產(chǎn)油微生物，特別是從小球藻中獲得油脂的方法，包括 ①在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收集異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻。細(xì)胞的收集方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，如離心、過濾、吸附等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用離心的方法收集培養(yǎng)容器中的小球藻細(xì)胞； ②為了便于油脂的獲得，優(yōu)選將細(xì)胞進(jìn)行干燥之后再進(jìn)行油脂的提取?？梢允褂萌魏魏线m的干燥方法，如冷凍干燥、烘干、晾曬等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選使用冷凍干燥的方法對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行干燥。
③從小球藻細(xì)胞中提取并收集油脂。可以使用任何合適的方法獲得油脂，包括但不限于壓榨法、裂解法、有機(jī)溶劑抽提、破碎細(xì)胞、超臨界流體技術(shù)。小球藻細(xì)胞中積累的油脂以中性脂肪為主，根據(jù)有機(jī)化學(xué)中的相似相容原理，選擇適當(dāng)?shù)姆菢O性溶劑來提取油脂，由于非極性溶劑能較易溶解非極性物質(zhì)，所以可以采用任何適合的溶劑和/或溶劑組合按照適當(dāng)?shù)谋壤齺硖崛∥⒃逵椭?，包括但不限于正己烷、汽油、四氯化碳、正己烷和異丙醇的化合物等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易的選擇和優(yōu)化有機(jī)溶劑的類型、添加比例和提取時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選在油脂提取之前用研磨的方法將小球藻細(xì)胞破碎，可以采用任何合適的方法來破碎細(xì)胞，優(yōu)選使用石英砂機(jī)械研磨來破碎細(xì)胞，然后使用正己烷抽提細(xì)胞中積累的中性油脂，抽提時(shí)間5分鐘-1小時(shí)，優(yōu)選10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘左右。含有油脂的正己烷經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀處理，將正己烷除去后收集獲得的油脂。
本發(fā)明的目的在于獲得藻細(xì)胞內(nèi)的油脂，因此培養(yǎng)結(jié)束的判斷可以通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)期間的細(xì)胞密度和細(xì)胞內(nèi)油脂的積累隨時(shí)間的變化情況，以及監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中可發(fā)酵碳源的消耗情況來實(shí)現(xiàn)。所述的油脂監(jiān)測(cè)方法可以是本領(lǐng)域中任何合適的方法，例如核磁共振、尼羅紅染色、流式細(xì)胞術(shù)等；所述的碳源消耗在本發(fā)明中主要是指甘蔗汁中可溶性的糖以及蔗糖的衍生產(chǎn)物的消耗，可以使用本領(lǐng)域公知的合適的方法來進(jìn)行測(cè)量，可以使用本領(lǐng)域公知的合適的方法來測(cè)量細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用尼羅紅染色法來評(píng)價(jià)油脂在藻細(xì)胞中的積累情況，并且使用3，5-二硝基水楊酸法(簡(jiǎn)稱DNS法)來測(cè)量培養(yǎng)基中還原性糖類的濃度，從而間接了解碳源的消耗以及碳源對(duì)油脂的轉(zhuǎn)化情況，利用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度。當(dāng)具有以下特征的一項(xiàng)、兩項(xiàng)、所有或其組合時(shí)，就認(rèn)為培養(yǎng)達(dá)到終點(diǎn)①細(xì)胞密度增加生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期；②培養(yǎng)基中碳源耗盡；③藻細(xì)胞中油脂積累達(dá)到平臺(tái)期。
(5)從油脂制備生物柴油 本發(fā)明采用酯化反應(yīng)將微藻油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油。脂肪酸到脂肪酸酯的轉(zhuǎn)化包括但不限于強(qiáng)酸催化(如濃硫酸)、脂肪酶催化等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用酸法催化制備生物柴油，優(yōu)選采用濃硫酸催化。所用的醇優(yōu)選為甲醇，醇油摩爾比優(yōu)選30:1，反應(yīng)最好在55℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速約160rpm，反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，混合反應(yīng)體系分成上下兩層，分離位于上層的生物柴油，并置于30℃的溫水中淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑，得到純凈的生物柴油 實(shí)施例 以下描述只是以實(shí)例方式對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的說明，而不意圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1. (1)種子的制備原始小球藻(Cholorella protothecoides)(購自美國Texas大學(xué)藻種中心)培養(yǎng)于異養(yǎng)培養(yǎng)基中作為種子，所述異養(yǎng)培養(yǎng)基包括30g L-1葡萄糖、3g L-1酵母提取物、0.7g L-1KH2PO4、0.3g L-1K2HPO4、0.3g L-1MgSO4·7H2O、0.3mg L-1FeSO4·7H2O、5g L-1甘氨酸以及0.01mg L-1維生素B1。
(2)甘蔗汁酶解液的獲得使用市售家用甘蔗榨汁機(jī)獲取甘蔗汁(型號(hào)YZ28，品牌恒聯(lián))，該設(shè)備內(nèi)部具有液壓裝置，將碾軋、榨取和收集操作一體化，直接通過強(qiáng)大的壓力將甘蔗汁榨壓出來。
將從市場(chǎng)上購買新鮮甘蔗榨取出甘蔗汁來并且收集于器皿當(dāng)中。溫室下，向甘蔗汁中加入蔗糖轉(zhuǎn)化酶(商品名Validase

Invertase ANL)，酶加入的量為每100kg底物300g酶，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明按照DNS法測(cè)量酶解液，其中還原糖的濃度為188-210g L-1左右(相同條件下重復(fù)3次所得范圍)。
(3).制備培養(yǎng)基將步驟(2)中獲得的酶解液用水稀釋至還原糖濃度約為30g L-1左右，分裝于1L搖瓶中，121℃下蒸汽滅菌30分鐘，作為供小球藻生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
(4).小球藻的搖瓶培養(yǎng)將步驟(1)中制備的種子接種至滅菌的培養(yǎng)基中，接種量?jī)?yōu)選使細(xì)胞初始密度達(dá)到3g L-1左右。在28攝氏度，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)小球藻，搖床旋轉(zhuǎn)速度220rpm，培養(yǎng)時(shí)使培養(yǎng)基的pH保持在6.3±0.5之間。培養(yǎng)期間，每24小時(shí)平行取樣3次進(jìn)行測(cè)定，取平均值以定時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度、可發(fā)酵碳源濃度以及細(xì)胞內(nèi)油脂的積累隨時(shí)間的變化，使用DNS法來測(cè)量培養(yǎng)基中還原糖的濃度。使用尼羅紅染色法來評(píng)價(jià)油脂在藻細(xì)胞中的積累情況。培養(yǎng)基中可發(fā)酵碳源初始濃度約29g L-1可發(fā)酵碳源，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，可發(fā)酵碳源濃度約0.5g L-1，同時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到約14g L-1。由尼羅紅染色分析可見，在中性脂染色區(qū)域出現(xiàn)信號(hào)(圖2B)，表明中性脂在培養(yǎng)過程中得以積累。
(5).油脂的獲得將發(fā)酵液在8000g的速度下離心2min，收集細(xì)胞并進(jìn)行冷凍干燥。使用石英砂機(jī)械研磨對(duì)干燥的細(xì)胞進(jìn)行研磨破碎，以1:10(重量:體積)的比例向細(xì)胞中加入正己烷，振蕩混勻。抽提15分鐘左右。離心獲得含有油脂的正己烷抽提液，優(yōu)選將所述抽提液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法將油脂和正己烷分離開，收集油脂并稱重，以油脂凈重除以細(xì)胞干重，得細(xì)胞干重的油脂含量為細(xì)胞干重的50％左右(w/w)。
(6).生物柴油的制備:酯化反應(yīng)由濃硫酸催化完成。將藻油置于燒瓶中，加入等摩爾量的濃硫酸作為催化劑，加入甲醇溶劑，使醇油摩爾比達(dá)到30:1，反應(yīng)在55℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行，轉(zhuǎn)速約160rpm，反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，混合反應(yīng)體系分成上下兩層，分離位于上層的生物柴油，并置于30℃的溫水中淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑，得到純凈的生物柴油。
實(shí)施例2 以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了將小球藻的搖瓶培養(yǎng)用以下發(fā)酵實(shí)驗(yàn)代替之外 小球藻的5L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備5L發(fā)酵罐(MINIFORS，瑞士)，組裝好溫度、pH、溶氧電極和消泡電極，加入步驟3中所述的3L異養(yǎng)培養(yǎng)基，蒸汽滅菌后冷卻備用。異養(yǎng)發(fā)酵條件設(shè)定如下溫度28±1℃，通氣速率180L/h左右，pH值6.3±0.5，攪拌速度為350±50rpm；在線監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐中的溶氧變化，使其保持在10-40％飽和度范圍內(nèi)；當(dāng)碳源消耗時(shí)，將實(shí)施例2中所述濃縮酶解液(為了便于操作，優(yōu)選經(jīng)冷凍干燥法將酶解液濃縮到還原糖濃度為500g/L左右)流加至發(fā)酵罐中，使還原糖濃度控制在10-30g/L范圍內(nèi)。監(jiān)控發(fā)酵罐中溶氧、葡萄糖、細(xì)胞濃度的變化，并同時(shí)采用尼羅紅熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)藻細(xì)胞中的中性脂肪含量(具體檢測(cè)步驟參見參考文獻(xiàn)“Danielle E，David J，BarryR，et al.Fluorescent measurement of microalgal neutrallipids.Journal of Microbiological Methods.2007.68(3):639-642)。發(fā)酵過程中細(xì)胞密度通過定時(shí)測(cè)定光密度值(OD540nm)來估算。OD540nm與細(xì)胞干重的線性關(guān)系可以用以下公式表示y＝0.4155x，(R2＝0.9933，P<0.05)，其中y表示細(xì)胞密度(g.L-1)，x表示540nm處光吸收密度值。發(fā)酵完成后，從發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，并真空干燥稱重，3L發(fā)酵液中共得到280g干藻粉(圖3)。
實(shí)施例3-7 以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了將搖瓶中起始還原糖濃度分別配置成5g L-1，10g L-1，15g L-1，25g L-1，30g L-1之外。從圖7可見，在75小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，小球藻在不同碳源濃度范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，表現(xiàn)出一定的承受能力。
實(shí)施例8 以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了酶解時(shí)酶的加入量為每100kg底物130g酶，培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)溫度控制在10-20攝氏度，搖床轉(zhuǎn)速控制在100-150rpm，pH控制在5.0-6.0之外。
實(shí)施例9 以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了酶解時(shí)酶的加入量為每100kg底物400g酶，培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)溫度控制在30-40攝氏度，搖床轉(zhuǎn)速控制在250-300rpm，pH控制在7.0-7.5之外。
實(shí)施例10 以與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)溫度控制在10-20攝氏度，攪拌速度控制在100-200rpm，pH控制在5.0-6.0，溶解氧濃度維持在5-20％之外。
實(shí)施例11 以與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)溫度控制在30-40攝氏度，攪拌速度控制在400-500rpm，pH控制在7.0-7.5，溶解氧濃度維持在30-50％之外。
比較例 除了分別用按照表1配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻之外，以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，表1中的甘蔗汁酶解液(未補(bǔ)加其他營養(yǎng)因子)為實(shí)施例1所用的甘蔗汁酶解液。
表1
A5微量元素母液H3BO32.86g L-1，NaMo O4·2H2O 0.039g L-1，ZnSO4·7H2O 0.222g L-1，MnCl2·4H2O 1.81g L-1，CuSO4·5H2O0.074g L-1。
從表1中可見，葡萄糖對(duì)照培養(yǎng)基(現(xiàn)有技術(shù))的配制繁雜，均需使用純品試劑，成本較高，而本發(fā)明甘蔗汁酶解液不需添加任何其他物質(zhì)，酶解后滅菌直接就可以利用。
在各培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)量利用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果示于表2。
表2.不同碳源用于培養(yǎng)小球藻的各項(xiàng)指標(biāo)比較
此外，從圖4可見在兩種不同培養(yǎng)環(huán)境下小球藻的生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)一致，對(duì)于可利用的碳源消耗動(dòng)力學(xué)也是相當(dāng)?shù)模瑹o顯著差別。因此甘蔗汁酶解液中的還原性碳源完全可以取代葡萄糖作為碳源。
從圖5可見在培養(yǎng)的前兩天之內(nèi)小球藻在甘蔗汁酶解液(未補(bǔ)加其他營養(yǎng)因子)中生長(zhǎng)更快，對(duì)碳源的利用更多。雖然最高細(xì)胞密度低于在甘蔗汁完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度，但是從每日的碳源-油脂轉(zhuǎn)化速度來看是相當(dāng)?shù)?表2)。
從圖6可見和原有技術(shù)中利用葡萄糖的方案進(jìn)行比較，小球藻可以利用甘蔗汁中的可利用碳源，并在細(xì)胞內(nèi)積累油脂。
<最終產(chǎn)品的評(píng)價(jià)> 生物柴油的成分測(cè)定方法如下利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析制備得到的生物柴油中成分的含量。采用DSQ GC(Thermo，USA，VARIAN VF-5ms毛細(xì)管柱30M×0.25MM)氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀進(jìn)行分析，儀器采集的數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)庫搜索可以得到生物柴油中各成分的具體名稱和相對(duì)含量，氣相色譜-質(zhì)譜分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。表3中列出了實(shí)施例1-2和比較例中以甘蔗汁酶解液和葡萄糖為原料制備得到的生物柴油中各種脂肪酸甲酯的相對(duì)含量。
表3.生物柴油中各種脂肪酸甲酯的相對(duì)含量
從表3可見，甘蔗汁酶解液和葡萄糖作為原料而生產(chǎn)的油脂可供用于制備生物柴油，而且在相同的制備條件下，十六碳烯酸甲酯(C17H34O2)、9，12-棕櫚酸甲酯(C19H34O2)和9-十八碳烯酸甲酯(C19H36O2)是制備所得生物柴油的主要成分，這三種物質(zhì)構(gòu)成了生物柴油90％以上的組成，因此認(rèn)為由甘蔗作為原料所得的脂肪酸甲酯的主要成分和葡萄糖作為原料所得的結(jié)果是一致的；此外由于柴油理化性質(zhì)主要取決于其主要成分，因此這還表明柴油理化性質(zhì)的相同或相近似。
綜上所述，以上結(jié)果表明甘蔗汁酶解液可以無需添加其他營養(yǎng)因子即直接用于培養(yǎng)小球藻，不僅簡(jiǎn)化了培養(yǎng)過程，還降低了生產(chǎn)成本。這對(duì)于大規(guī)模的生物量生產(chǎn)以及油脂的生產(chǎn)而言，都是極為有利的。
應(yīng)當(dāng)知曉，此處描述的具體實(shí)施方案僅僅是說明目的的，本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)其提出的各種改進(jìn)或變化也應(yīng)該落入本申請(qǐng)的精神和權(quán)限內(nèi)。還應(yīng)理解所述數(shù)值是大約值，是為了說明而提供的。
所有此處涉及或參考的專利、專利申請(qǐng)以及公開通過參考全部并入此處，包括所有的圖和表。
權(quán)利要求
1.以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)從甘蔗提取甘蔗汁；
(2)將甘蔗汁中的多糖進(jìn)行降解，使其中的碳源轉(zhuǎn)化成適于產(chǎn)油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液；
(3)利用甘蔗汁降解液培養(yǎng)產(chǎn)油微藻；
(4)從產(chǎn)油微藻獲得油脂；
(5)從油脂制備生物柴油。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)化方法為酸法降解、堿法降解或酶法降解，優(yōu)選酶法降解。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述的酶法降解為利用蔗糖轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述酶的加入量為每100kg底物130-400g酶，優(yōu)選每100kg底物300g酶，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述的產(chǎn)油微藻為小球藻。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述的小球藻為原始小球藻(Cholorellaprotothecoides)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法為使用三角搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-40攝氏度，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度；搖床旋轉(zhuǎn)速度為100-300rpm，優(yōu)選150-250rpm，最優(yōu)選220rpm；pH為5.0-7.5，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3，可發(fā)酵碳源濃度為10-30g/L，優(yōu)選30g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的方法為使用發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為10-40攝氏度，優(yōu)選20-30攝氏度，最優(yōu)選28攝氏度；攪拌速度為100-500rpm，優(yōu)選200-400rpm，最優(yōu)選350rpm；pH為5.0-7.5，優(yōu)選6.0-7.0，更優(yōu)選6.3；溶解氧飽和度維持在5-50％，優(yōu)選10-40％，可發(fā)酵碳源濃度為10-30g/L，優(yōu)選30g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，所述步驟(4)從產(chǎn)油微藻獲得油脂的方法為壓榨法、裂解法、有機(jī)溶劑抽提、破碎細(xì)胞或超臨界流體技術(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，在所述步驟(5)中采用酯化反應(yīng)從油脂制備生物柴油。
全文摘要
以甘蔗作為原料生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)從甘蔗提取甘蔗汁；(2)將甘蔗汁中的多糖進(jìn)行降解，使其中的碳源轉(zhuǎn)化成適于產(chǎn)油微藻利用的形式，得到甘蔗汁降解液；(3)利用甘蔗汁降解液培養(yǎng)產(chǎn)油微藻；(4)從產(chǎn)油微藻獲得油脂；(5)從油脂制備生物柴油。采用本發(fā)明方法，在將甘蔗汁中多糖轉(zhuǎn)化成單糖，獲得甘蔗汁降解液后，無需添加其它營養(yǎng)因子即可直接用于培養(yǎng)小球藻，不僅簡(jiǎn)化培養(yǎng)過程，還降低生產(chǎn)成本。這對(duì)于大規(guī)模的生物量生產(chǎn)以及油脂的生產(chǎn)而言，都是極為有利的。
文檔編號(hào)C10G3/00GK101475823SQ20091000046
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者吳慶余, 云 程 申請(qǐng)人:清華大學(xué)