專利名稱：：噴氣燃料組合物及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：除了別的以外，本發(fā)明提供了噴氣燃料組合物及其制備和使用方法。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物包含至少一種可至少部分地由微生物容易和有效地生成的燃料組分。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含生物工程燃料組分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含蒈烷、策烷、檜烷或其組合。
背景技術(shù)：
：生物燃料通常指來自于生物質(zhì)(即，最近存活的有機(jī)體或其代謝副產(chǎn)物，例如動(dòng)物的糞肥)的燃料。生物燃料是理想的，因?yàn)槠渑c其它天然來源如石油、煤炭和核燃料不同，它是一種可再生能源。然而，適于用作噴氣燃料的生物燃料尚待開發(fā)。因此，對(duì)用于噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)的生物燃料存在需求。本發(fā)明提供了這樣的生物燃料
發(fā)明內(nèi)容除了別的以外，本發(fā)明提供了包含Qo二環(huán)類異戊二烯的燃料組合物及其制備和使用方法。這些化合物可顯示出用于制備優(yōu)良的噴氣或?qū)椚剂系奈锢韺傩缘牧己闷胶?。在特定的?shí)施方案中，C,o二環(huán)類異戊二烯至少部分地由微生物容易和有效地生成。一方面，本發(fā)明提供了燃料組合物，其包含(a)占燃料組合物總體積的至少2%體積量的C,o二環(huán)類異戊二烯；以及(b)占燃料組合物總體積的至少5%體積量的石油為基礎(chǔ)的燃料。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或大于38r的閃點(diǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度。另一方面，本發(fā)明提供了燃料組合物，其包含(a)占燃料組合物總體積的至少10%體積量的Qo二環(huán)類異戊二烯；以及(b)占燃料組合物總體積的至少40%體積量的煤油。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/n^至約840kg/n^的密度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或大于38。C的閃點(diǎn)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該燃料組合物具有低于-4(TC的凍點(diǎn)。另一方面，本發(fā)明提供了制備燃料組合物的方法，其包括如下步驟(a)將C1()類異戊二烯起始原料與氫在催化劑的存在下相接觸，以形成C1()二環(huán)類異戊二烯；并(b)將該Cn)二環(huán)類異戊二烯與燃料組分相混合，以制備該燃料組合物。在特定的實(shí)施方案中，該C,o類異戊二烯起始原料為蒈烯、a-蒎蜂、(3-蒎烯、檜烯或其組合。另一方面，本發(fā)明提供了從單糖制備燃料組合物的方法，其包括如下步驟(a)在適于制備該do類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成Cu)類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與該單糖相接觸；(b)將該do類異戊二烯起始原料轉(zhuǎn)化9為Qo二環(huán)類異戊二烯；并(c)將該C,o二環(huán)類異戊二烯與燃料組分相混合，以制備該燃料組合物。在特定的實(shí)施方案中，該Qo類異戊二烯起始原料為蒈烯、a-蒗烯、(3-蒗雄、；f會(huì)烯或其組合。另一方面，本發(fā)明提供了車輛，其包括內(nèi)燃機(jī)、與該內(nèi)燃機(jī)連接的燃料箱、以及燃料箱中的本發(fā)明公開的燃料組合物，其中該燃料組合物被用于向該內(nèi)燃機(jī)提供動(dòng)力。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)燃機(jī)為噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)。在另一方面，本發(fā)明提供了向發(fā)動(dòng)機(jī)提供動(dòng)力的方法，其包括燃燒本發(fā)明公開的一種或多種燃料組合物的步驟。在特定的實(shí)施方案中，該發(fā)動(dòng)機(jī)為噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物中的do二環(huán)類異戊二烯為(或包括)蒈烷、菜烷、檜烷或其組合。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物中的石油為基礎(chǔ)的燃料為煤油、JetA、JetA-l、JetB或其組合。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物達(dá)到了針對(duì)JetA、JetA-l或JetB的ASTMD1655規(guī)范。圖1為用于生成異戊烯二磷酸("IPP")的甲羥戊酸("MEV")途徑的示意圖。圖2為生成IPP和二甲基丙烯焦磷酸脂("DMAPP")的DXP途徑的示意圖。Dxs為l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr為l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(也稱為IspC);IspD為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspE為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspF為2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-環(huán)二磷酸合成酶；IspG為l-幾基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG);IspH為異戊烯_87二甲基烯丙基二磷酸合成酶。圖3為將一個(gè)IPP分子和一個(gè)DMAPP分子轉(zhuǎn)化為香葉基二磷酸("GPP")的示意圖。已知催化該步驟的酶是，例如，香葉基二磷酸合成酶。圖4A-B顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM408、pAM409和pAM424的圖譜。圖5A-E顯示了載體pAM489、pAM491、pAM493、pAM495和pAM497的插入片段的圖譜。圖6顯示了表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS的圖譜。圖7顯示了表達(dá)質(zhì)粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d-CS和pRS425-leu2d-SS的圖譜。1655測試數(shù)據(jù)。圖9顯示了JetA以及JetA和AMJ-400的特定混合物的蒸餾曲線。定義由ASTM國際公布的ASTMD1655規(guī)范對(duì)JetA、JetA-1和JetB提出了一些最低驗(yàn)收要求。"生物工程化合物"指由宿主細(xì)胞(包括任意的古細(xì)菌、細(xì)菌或真核細(xì)胞或微生物)生成的化合物。"生物燃料"指來自于生物量(即，最近存活的有機(jī)體或其代謝副產(chǎn)物，例如牛的糞肥)的任意燃料。與其它天然來源如石油、煤炭和核燃料不同，它是一種可再生能源。"蒈烷"指如下化合物li"Cl0二環(huán)類異戊二烯"指包含兩個(gè)環(huán)狀部分的由10個(gè)碳原子組成的全飽和類異戊二烯化合物。在特定的實(shí)施方案中，該Qo二環(huán)類異戊二烯選自蒈烷(即，3，7，7-三甲基-二環(huán)[4丄0]庚烷;CAS號(hào)554-59-6)、蒎烷(即，2,6,6-三甲基-二環(huán)[3.1.1]庚烷；CAS號(hào)473-55-2)、以及檜烷(即，4-甲基-l-(l-甲基乙基)二環(huán)[3.1.0]己烷;CAS號(hào)471-12-5)及其組合。"C,o類異戊二烯起始原料"指香葉基焦磷酸("GPP")或能夠由GPP衍生的化合物。"密度"指在特定溫度下單位體積的質(zhì)量。測定燃料密度的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D4052，其作為參考并入本發(fā)明。"含硫試驗(yàn)"是對(duì)石油為基礎(chǔ)的燃料(例如噴氣燃料和煤油)中疏醇的檢測。該試驗(yàn)還可提供該燃料中可能存在的疏化氫和元素疏的信息。測定燃料凍點(diǎn)的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D4952，其作為參考并入本發(fā)明。"閃點(diǎn)"指在應(yīng)用火源時(shí)使得易燃液體上的蒸汽在空氣中燃燒的最低溫度。通常每種易燃液體具有蒸氣壓，該蒸氣壓是該液體的溫度的函數(shù)。隨著溫度上升，該液體的蒸氣壓也上升。隨著蒸氣壓上升，空氣中蒸發(fā)的液體的濃度也上升。在閃點(diǎn)溫度下，正好有足夠量的液體被蒸發(fā)，將該液體上方的蒸氣-空氣空間帶到易燃性下限之上。例如，汽油的閃點(diǎn)為約43。C，這也是為什么汽油是高度易燃的。出于安全的理由，希望用于噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)的燃料具有更高的閃點(diǎn)。測定燃料閃點(diǎn)的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D56、ASTM標(biāo)準(zhǔn)D93、ASTM標(biāo)準(zhǔn)D3828-98,其均作為參考并入本發(fā)明。"凍點(diǎn)"指已被冷卻至蠟狀晶體形成的燃料，在進(jìn)行加溫時(shí)最后的蠟狀晶體熔解時(shí)的溫度。測定燃料凍點(diǎn)的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D2386，其作為參考并入本發(fā)明。"燃料"指一種或多種烴、一種或多種醇、一種或多種脂肪酸酯或其混合物。優(yōu)選地，可使用液體烴。燃料可用于向內(nèi)燃機(jī)提供動(dòng)力，例如，往復(fù)發(fā)動(dòng)機(jī)(例如，汽油發(fā)動(dòng)機(jī)和柴油發(fā)動(dòng)機(jī))、Wankel發(fā)動(dòng)機(jī)、噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)、一些火箭發(fā)動(dòng)機(jī)、導(dǎo)彈發(fā)動(dòng)機(jī)、以及燃?xì)鉁u輪發(fā)動(dòng)機(jī)。在一些實(shí)施方案中，燃料通常包含烴類，例如烷烴、環(huán)烷烴和芳香經(jīng)的混合物。在其它實(shí)施方案中，該燃料包含Cu)二環(huán)類異戊二烯。在其它實(shí)施方案中，燃料包含單獨(dú)的蒈烷、蒎烷和檜烷或其混合物。"燃料添加劑"指向燃料添加以改變?cè)撊剂系男再|(zhì)(例如，提高發(fā)動(dòng)機(jī)性能、燃料處理、燃料穩(wěn)定性、或污染控制)的化學(xué)組分。添加劑的類型包括，但不限于抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、十六烷值增進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動(dòng)性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、潤滑性能改進(jìn)劑、防冰劑、噴射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、去污劑、破乳劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合。術(shù)語"常規(guī)添加劑"指本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的燃料添加劑，例如上述添加劑，但不包括C10二環(huán)類異戊二烯。"燃料組分"指用于配制燃料組合物的任意化合物或化合物的混合物。存在"主要燃料組分"和"次要燃料組分"。主要的燃料組分在燃料組合物中至少占50%的體積；而次要燃料組分在燃料組合物中的比例小于50%。燃料添加劑為次要燃料組分。C,o二環(huán)類異戊二烯可以是主要燃料組分或次要燃料組分，或與其它燃料組分形成混合物。"燃料組合物"指包含至少兩種燃料組分的燃料。"類異戊二烯"和"類異戊二烯化合物"在本發(fā)明中可互換，并指由異戊烯二磷酸("IPP")書f生的化合物。"噴氣燃料"指適合在噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)中使用的燃料。"煤油"通常指石油(也稱為"原油")在大氣壓下約15(TC至約275。C之間的特定蒸餾組分。原油主要由石^"族、環(huán)烷和芳香族烴組成。"導(dǎo)彈燃料"指適合在導(dǎo)彈發(fā)動(dòng)機(jī)中使用的燃料。"對(duì)傘花烴"指如下化合物蒗烷"指如下化合物"石油為基礎(chǔ)的燃料"指包含了石油的蒸餾組分的燃料。"檜烷"指如下化合物"煙點(diǎn)"指燃料或燃料組合物被加熱直至其分解冒煙的點(diǎn)。測定燃料煙點(diǎn)的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D1322，其作為參考并入本發(fā)明。"粘度"指燃料或燃料組合物在剪切應(yīng)力下抵御變形的量度。測定燃料粘度的常規(guī)可接受的方法是ASTM標(biāo)準(zhǔn)D445，其作為參考并入本發(fā)明。如本發(fā)明所用，為"基本純的"化合物的組合物基本不含一種或多種其它化合物，即，基于該組合物的總體積，該組合物包含大于80體積％、大于90體積％、大于95體積％、大于96體積％、大于97體積％、大于98體積％、大于99體積％、大于99.5體積％、大于99.6體積％、大于99.7體積％、大于99.8體積％、或大于99.9體積％的該化合物；或包含小于20體積％、小于10體積％、小于5體積％、小于3體積。/。、小于1體積％、小于0.5體積％、小于0.1體積％、或小于0.01體積％的一種或多種其它化合物。如本發(fā)明所用，"基本不含"一種化合物的組合物指基于該組合物的總體積，該組合物包含小于20體積％、小于10體積％、小于5體積％、小于4體積％、小于3體積％、小于2體積％、小于1體積％、小于0.5體積％、小于0.1體積％或小于0.01體積％的該化合物。本發(fā)明所用的術(shù)語"立體異構(gòu)純"指包含化合物的一種立體異構(gòu)體，并且基本沒有該化合物的另一立體異構(gòu)體的組合物。例如，具有一個(gè)手性中心的化合物的立體異構(gòu)純的組合物將基本不含該化合物的相對(duì)的對(duì)映體。具有兩個(gè)手性中心的化合物的立體異構(gòu)純組合物將基本不含該化合物的其它非對(duì)映異構(gòu)體。典型的立體異構(gòu)純化合物包含大于約80%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體，和少于約20%重量的該化合物其它立體異構(gòu)體，更優(yōu)選大于約90%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約10%重量的該化合物其它立體異構(gòu)體，更優(yōu)選大于約95%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約5%重量的該化合物其它立體異構(gòu)體，最優(yōu)選大于約97%重量的該化合物的一種立體異構(gòu)體和少于約3%重量的該化合物其它立體異構(gòu)體。本發(fā)明所用的術(shù)語"對(duì)映體純"指具有一個(gè)手性中心的化合物的立體異構(gòu)純組合物。本發(fā)明所用的術(shù)語"外消旋"或"外消旋體"指相對(duì)于該分子中所有的手性中心，約50%的一種對(duì)映體和約50%的相應(yīng)對(duì)映體。本發(fā)明包含了本發(fā)明的化合物的所有對(duì)映體純、對(duì)映體富集、非對(duì)映體純、非對(duì)映體富集，和外消旋混合物。除了上述定義外，本發(fā)明所述的特定化合物具有可以以Z或E異構(gòu)體存在的一個(gè)或多個(gè)雙鍵。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的化合物作為基本不含其它異構(gòu)體的單獨(dú)異構(gòu)體存在，或者可選擇地，作為各種異構(gòu)體的混合物(例如，立體異構(gòu)體的外消旋混合物)存在。在下文的描述中，本發(fā)明公開的所有數(shù)值均為大概的值，不論其是否與"大約，，或"約"等詞共用。它們可具有1%、2%、5%或有時(shí)為10-20%的變化。當(dāng)公開的數(shù)值范圍具有下限RL和上限RU時(shí)，則該范圍內(nèi)的任意數(shù)值均被特別公開了。具體地，在該范圍內(nèi)特別公開了如下數(shù)值R=RL+k*(RU-RL)，其中k為1%至100%范圍內(nèi)具有1%增量的變量，即，k為1%，2%,3%，4%，5%,5%,…，50%,51%,52,…，95%,96%,97%，98%,99或100%。此外，還特別公開了上文所述的由兩個(gè)R值限定的任意數(shù)值范圍。具體實(shí)施方案一方面，本發(fā)明拔j共了燃料組合物，其包含(a)占燃料組合物總體積的至少2Q/o體積的Qo二環(huán)類異戊二烯；以及(b)占燃料組合物總體積的至少5%體積的石油為基礎(chǔ)的燃料，其中該燃料組合物具有等于或大于38'C的閃點(diǎn)，并在15。C下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度。16在一些實(shí)施方案中，該Cu)二環(huán)類異戊二烯為蒈烷。在其它實(shí)施方案中，該do二環(huán)類異戊二烯為蒎烷。在其它實(shí)施方案中，該Cu)二環(huán)類異戊二烯為檜烷。在特定的實(shí)施方案中，該C,o二環(huán)類異戊二烯為包含蒈烷、蒎烷和檜烷中兩種或多種的混合物。在該C,Q二環(huán)類異戊二烯為蒗烷的特定實(shí)施方案中，該燃料組合物包含約0%至約10%的含氛化萘的物質(zhì)。在特定的其它實(shí)施方案中，該燃料組合物不包含含氫化萘的物質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有小于或等于30(TC的終滯點(diǎn)。該燃料組合物中的每一種類異戊二烯化合物均能作為燃料組分，其在與氧氣等氧化劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)釋放能量；或可作為燃料添加劑，改變?cè)撊剂辖M分的性能或?qū)傩?。在一些?shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占燃料組合物的總重或總一f本積至少約2%、至少約3%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約90%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占燃料組合物的總重或總體積最多約5%、最多約10%、最多約15%、最多約20%、最多約25%、最多約30%、最多約35%、最多約40%、最多約45%、最多約50%、最多約60%、最多約70%、最多約80%、或最多約卯％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占燃料組合物的總重或總體積的約2%至約99%、約2.5%至約95%、約5%至約90%、約7.5%至約85%、約10%至約80%、約15%至約80%、約20°/。至約75%、或約25%至約75%。在一些實(shí)施方案中，該C1Q類異戊二烯化合物衍生自生物工程C1G類異戊二烯起始原料。在特定的實(shí)施方案中，該生物工程C,o類異戊二烯起始原料可通過宿主細(xì)胞將碳源轉(zhuǎn)化為Cu)類異戊二烯起始原料制備得到。17在其它實(shí)施方案中，該石炭源為糖，例如單糖(simplesugar)、二糖、或其一種或多種組合。在特定的實(shí)施方案中，該糖為能夠支持本發(fā)明提供的一種或多種細(xì)胞生長的單糖。該單糖為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意單糖。一些合適的單糖的非限制性范例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其組合。合適的二糖的一些非限制性范例包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖及其組合。在其它實(shí)施方案中，該碳源為多糖。合適的多糖的一些非限制性范例包括淀粉、糖原、纖維素、幾丁質(zhì)及其組合。在其它實(shí)施方案中，該碳源為不可發(fā)酵的碳源。不可發(fā)酵碳源的一些非限制性范例包括乙酸鹽和甘油。在其它實(shí)施方案中，在本發(fā)明公開的燃料組合物中，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為燃料組合物總體積的至少約20%，而所述類異戊二烯化合物的量為燃料組合物總體積的約5%至約75%。在特定的實(shí)施方案中，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為燃料組合物總體積的至少約30%,而所述類異戊二烯化合物的量為燃料組合物總-f本積的約5%至約65%。在特定的實(shí)施方案中所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為燃料組合物總體積的至少約40%，而所述類異戊二烯化合物的量為燃料組合物總體積的約5%至約50%。在特定的實(shí)施方案中，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為燃料組合物總體積的至少約50%,而所述類異戊二烯化合物的量為燃料組合物總體積的約5%至約45%。在一些實(shí)施方案中，所述石油為基礎(chǔ)的燃料為煤油。常規(guī)的煤油通常是烴的混合物，具有約285°F至約610°F(即，約140°C至約320°C)的彿點(diǎn)。國防部("MOD")已經(jīng)率先設(shè)置并維持了針對(duì)民用航空渦輪燃料或噴氣燃料的規(guī)范。由這兩個(gè)組織頒布的相應(yīng)規(guī)范非常相似，但不完全一致。眾多其它國家頒布了他們自己的針對(duì)噴氣燃料的國家規(guī)范，與ASTM或MOD規(guī)范非常接近或完全一致。ASTMD1655是針對(duì)航空渦輪燃料的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，并包括針對(duì)JetA、JetA-l以及JetB燃料的規(guī)范。國防部標(biāo)準(zhǔn)91-91是針對(duì)JetA-l的MOD規(guī)范。JetA-l是最常用的噴氣燃料，并按照國際標(biāo)準(zhǔn)化的一套范標(biāo)制備。僅在美國，還采用了稱為JetA的一種JetA-l類型。在民航中常用的另一種噴氣燃料;波稱為JetB。JetB是石油腦-煤油(naptha-kerosene)領(lǐng)域的一種點(diǎn)火器燃油，因其改善的寒冷天氣性能而被使用。在ASTMD1655中對(duì)JetA、JetA-l以及JetB進(jìn)行了規(guī)定。或者，全世界的軍隊(duì)以不同的JP編號(hào)系統(tǒng)對(duì)噴氣燃料進(jìn)行了分類。其中的一些分類幾乎與其民用對(duì)應(yīng)分類一致，僅在少量添加劑的量上有所區(qū)別。例如，JetA-l與JP-8類似，而JetB與JP-4類似。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物進(jìn)一步包含芳香族化合物，例如對(duì)傘花烴、間傘花烴或鄰傘花烴。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該芳香族化合物為對(duì)傘花烴或包含對(duì)傘花烴。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)傘花烴的量為燃料組合物總體積的約0.1%至約50%體積、約0.1%至約45%體積、約0.1%至約40%體積、約0.1%至約35%體積。在其它實(shí)施方案中，該對(duì)傘花烴的量為燃料組合物總體積的約0.5%至約35%體積。在其它實(shí)施方案中，該對(duì)傘花烴的量為燃料組合物總體積的約5%至約25%體積、約5%至約20%體積、或約10%至約20%體積。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物中芳香族化合物的總量為燃料組合物的總重量或總體積的約1%至約50%。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物中芳香族化合物的總量為燃料組合物的總重量或總體積的約15%至約35%。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物中芳香族化合物的總量為燃料組合物的總重量或總體積的約15%至約25%。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物中芳香族化合物的總量為燃料組合物的總重量或總體積的約5%至約10%。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物中芳香族化合物的總量為燃料組合物的總重量或總體積的至少約25%。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物進(jìn)一步包含燃料添加劑。在特定的實(shí)施方案中，所述燃料添加劑為燃料組合物的總重量或總體積的約0.1%至約50%。在其它實(shí)施方案中，所述燃料添加劑選自氧化劑、抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動(dòng)性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、潤滑性能改進(jìn)劑、防冰劑、噴射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、去污劑、破乳劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合。本發(fā)明公開的燃料組合物中的燃料添加劑的量可以是燃料組合物總量的約0.1%至小于約50%、約0.2%至約40%、約0.3%至約30%、約0.4%至約20%、約0.5%至約15%、或約0.5%至約10%。在特定的實(shí)施方案中，基于燃料組合物總量，所述燃料添加劑的量小于約50%、小于約45%、小于約40%、小于約35%、小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、小于約1%或小于約0.5%。在一些實(shí)施方案中，上述量為燃料組合物總重量的重量百分比(wt.。/0)。在其它實(shí)施方案中，上述量為燃料組合物總體積的體積百分比(vo1。/0)。下文更具體描述了燃料添加劑的示范性范例。其中一個(gè)范例是潤滑性能改進(jìn)劑。在特定的添加劑中，燃料中的潤滑性能改進(jìn)劑的濃度在約1ppm至約50000ppm、優(yōu)選約10ppm至約20000ppm、且更優(yōu)選約25ppm至約10000ppm的范圍內(nèi)。潤滑性能改進(jìn)劑的一些非限制性范例包括脂肪酸的酯。穩(wěn)定劑提高該燃料組合物的貯存穩(wěn)定性。穩(wěn)定劑的一些非限制性范例包括叔烷基伯胺。穩(wěn)定劑在該燃料組合物中的濃度可為該燃料組合物總重的約0.001wt/o至約2wt%，在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/o至約1wt%。助燃劑可提高該燃料組合物的質(zhì)量燃燒速率。助燃劑的一些非限制性范例包括二茂鐵(dicyclopentadienyliron)、鐵基助燃劑(例如，TURBOTECTER-18,購于Turbotect(USA)Inc.，Tomball，Texas)、鋇基助燃劑、鈰助燃劑、以及鐵和鎂基助燃劑(例如，TURBOTECT703，購于Turbotect(USA)Inc.，約0.001wt.。/o至約1wt%，在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/。至約1wt%?？寡趸瘎┳柚褂扇剂显谫A存中氧化引起的燃料系統(tǒng)組分的膠質(zhì)沉淀物的形成和/或抑制在本發(fā)明中可使用的特定燃料組合物中的過氧化物化合物的形成?？寡趸瘎┰谠撊剂辖M合物中的濃度可為占燃料組合物總重的約0.001wt.%至約5wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt，/。至約1wt%。防靜電劑可減少燃料通過高流速燃料傳遞系統(tǒng)時(shí)生成的靜電的影響。防靜電劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001wt,/o至約5wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/。至約1wt%。緩蝕劑可防止燃料處理系統(tǒng)(例如管道和燃料儲(chǔ)罐)中的鐵類金屬被腐蝕。在需要附加潤滑性的情況下，可采用能同時(shí)提高該組合物的潤滑性能的21緩蝕劑。緩蝕劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001Wt.%至約5wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/o至約1wt%。燃料系統(tǒng)防冰劑(也稱為抗冰添加劑)可降低由于高海拔下冷卻從噴氣燃料中沉降的水的凍點(diǎn)，并防止能限制燃料向發(fā)動(dòng)機(jī)流動(dòng)的冰晶的形成。某些燃料系統(tǒng)防冰劑還可用作殺蟲劑。燃料系統(tǒng)防冰劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001wt.。/o至約5wt%，在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt，/。至約1wt%。殺蟲劑用于抵御燃料組合物中的微生物生長。殺蟲劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001wt.。/。至約5wt%，在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.o/。至約1wt%。金屬減活劑抑制某些金屬(特別是銅)對(duì)燃料氧化的催化作用。金屬減活劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001wt.。/。至約5wt%，在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/。至約1wt%。熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑用于抑制航空器燃料系統(tǒng)的高溫區(qū)域的沉積物形成。熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑在該燃料組合物中的濃度可為燃料組合物總重的約0.001wt.%至約5wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中為約0.01wt.。/。至約1wt%。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有大于約32"C的閃點(diǎn)、大于約33t:的閃點(diǎn)、大于約34'C的閃點(diǎn)、大于約35。C的閃點(diǎn)、大于約36。C的閃點(diǎn)、大于約37°C的閃點(diǎn)、大于約38°C的閃點(diǎn)、大于約39°C的閃點(diǎn)、大于約40°C的閃點(diǎn)、大于約4rC的閃點(diǎn)、大于約42t:的閃點(diǎn)、大于約43。C的閃點(diǎn)、或大于約44。C的閃點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有大于38。C的閃點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的閃點(diǎn)參照ASTM標(biāo)準(zhǔn)D56測定。在測定。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的閃點(diǎn)參照ASTM標(biāo)準(zhǔn)D3828-98測定。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的閃點(diǎn)參照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的用于測定燃料閃點(diǎn)的任意常規(guī)方法來測定。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/n^至約850kg/m3、約750kg/m3至約845kg/m3、約750kg/m3至約840kg/m3、約760kg/m3至約845kg/m3、約770kg/m3至約850kg/m3、約770kg/m3至約845kg/m3、約775kg/m3至約850kg/m3、或約775kg/m3至約845kg/m3的密度。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物在15°C下具有約780kg/m3至約845kg/m3的密度。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物在15'C下具有約775kg/n^至約840kg/m3的密度。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/mS至約805kg/n^的密度。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的密度參照ASTM標(biāo)準(zhǔn)D4052測定。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的密度參照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的用于測定燃料密度的任意常規(guī)方法來測定。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有低于-30。C、低于-40。C、低于-50。C、低于-6(TC、低于-7(TC、或低于-80。C的凍點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約-8(TC至約-30r、約-75°(3至約-35°(3、約-7(TC至約-40。C、或約-65"至約-45。C的凍點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的凍點(diǎn)參照ASTM標(biāo)準(zhǔn)D2386來測定。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的凍點(diǎn)參照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的用于測定燃料凍點(diǎn)的任意常規(guī)方法來測定。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/m"至約850kg/n^的密度，以及等于或大于38。C的閃點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，該燃料組合物在15°C下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度，等于或大于38°C的閃點(diǎn)，以及低于-4(TC的凍點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，該燃料組合物在15。C下具有約750kg/m3至約840kg/m3的密度，等于或大于38°C的閃點(diǎn)，以及低于-40°C的凍點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約14(TC至約17(TC的初沸點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約18(TC至約30(TC的終沸點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約14(TC至約17(TC的初沸點(diǎn)和約18(TC至約300。C的終沐點(diǎn)。在特定的實(shí)施方案中，該燃料組合物達(dá)到了ASTMD86的蒸餾規(guī)范。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或大于245'C的噴氣燃料熱氧化測試(JFTOT)溫度。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或大于25(TC、等于或大于255i:、等于或大于260。C、或等于或大于265°C的JFTOT溫度。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物在-20。C下具有小于6mm2/sec、小于7mm2/sec、小于8mm2/sec、,J、f9mm2/sec、或小于10mm2/sec的粘度。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的燃料組合物的粘度參照ASTM標(biāo)準(zhǔn)D445來測定。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物達(dá)到了ASTMD1655對(duì)JetA-l的規(guī)范。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物達(dá)到了ASTMD1655對(duì)JetA的規(guī)范。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物達(dá)到了ASTMD1655對(duì)JetB的規(guī)范。另一方面，本發(fā)明才是z洪了燃料組合物，其包含24(a)占燃料組合物總體積的至少10%體積的do二環(huán)類異戊二烯；以及(b)占燃料組合物總體積的至少40%體積的煤油，其中該燃料組合物在15°C下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度，等于或大于38°C的閃點(diǎn)，以及低于-40°C的凍點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，該C,o二環(huán)類異戊二烯化合物的量占燃料組合物總重或總^L積的至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、或至少約50%的重量或體積。在特定的實(shí)施方案中，該量為占燃料組合物總重量的重量百分比。在其它實(shí)施方案中，該量為占燃料組合物總體積的體積百分比。在一些實(shí)施方案中，該Cu)二環(huán)類異戊二烯為蒈烷。在其它實(shí)施方案中，該C,o二環(huán)類異戊二烯為蒗烷。在其它實(shí)施方案中，該do二環(huán)類異戊二烯為檜烷。在特定的實(shí)施方案中，該Qo二環(huán)類異戊二烯為包含蒈烷、菜烷和檜烷中兩種或多種的混合物。在特定的實(shí)施方案中，該燃料組合物達(dá)到了ASTMD1655對(duì)JetA的規(guī)范。另一方面，本發(fā)明提供了包括含有本發(fā)明提供的燃料組合物的燃料箱的燃料系統(tǒng)?？蛇x地，該燃料系統(tǒng)進(jìn)一步包括具有再循環(huán)發(fā)動(dòng)機(jī)冷卻液的發(fā)動(dòng)機(jī)冷卻系統(tǒng)，連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管和/或設(shè)置在燃料管上的燃料過濾器。內(nèi)燃機(jī)的一些非限制性范例包括往復(fù)發(fā)動(dòng)機(jī)(例如，汽油發(fā)動(dòng)機(jī)和柴油發(fā)動(dòng)機(jī))、Wankel發(fā)動(dòng)機(jī)、噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)、一些火箭發(fā)動(dòng)機(jī)、以及燃?xì)鉁u輪發(fā)動(dòng)機(jī)。在一些實(shí)施方案中，該燃料箱與所述冷卻系統(tǒng)設(shè)置在一起，從而允許在該再循環(huán)發(fā)動(dòng)機(jī)冷卻液和該燃料箱中的燃料組合物間進(jìn)行熱傳遞。在其它實(shí)2施方案中，該燃料系統(tǒng)進(jìn)一步包括含有用于噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)的第二燃料的第二燃料箱和連接該第二燃料箱和該發(fā)動(dòng)機(jī)的第二燃料管?？蛇x地，該第一和第二燃料管可配備電磁操作閥，該閥可彼此獨(dú)立地或同步地開啟或關(guān)閉。在其它實(shí)施方案中，該第二燃料為JetA。另一方面，本發(fā)明提供了發(fā)動(dòng)機(jī)裝置，其包括內(nèi)燃機(jī)，含有本發(fā)明公開的燃料組合物的燃料箱，連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管。可選地，該發(fā)動(dòng)統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)燃機(jī)為柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。在其它實(shí)施方案中，該內(nèi)燃機(jī)為噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)。當(dāng)使用本發(fā)明公開的燃料組合物時(shí)，需要在將其注入該發(fā)動(dòng)機(jī)前除去該燃料組合物中產(chǎn)生的微粒狀物質(zhì)。因此，需要在本發(fā)明公開的燃料系統(tǒng)中選用適當(dāng)?shù)娜剂线^濾器。在內(nèi)燃機(jī)中使用的燃料中的水，即使數(shù)量極少，也可對(duì)發(fā)動(dòng)機(jī)引起極大的危害。因此，需要在燃料組合物注入發(fā)動(dòng)機(jī)前除去其中的任意水分。在一些實(shí)施方案中，可通過采用渦輪式離心機(jī)的燃料過濾器去除水和微粒狀物質(zhì)，其中水和微粒狀物質(zhì)從該燃料組合物分離的程度使得過用其它類型的燃料過濾器來去除水和/或微粒狀物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供了包括內(nèi)燃機(jī)、含有本發(fā)明公開的燃料組合物的燃料箱、連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管的交通工具。可選地，該交通工具通工具的一些非限制性范例包括汽車、摩托車、火車、輪船、和航空器。制備燃料組合物的方法另一方面，本發(fā)明^是供了制備燃料組合物的方法，其包括如下步驟(a)將Cu)類異戊二烯起始原料與氫在催化劑的存在下相接觸，以形成do二環(huán)類異戊二烯；并(b)將該Cu)二環(huán)類異戊二烯與燃料組分相混合，以制備該燃料組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該C,o類異戊二烯起始原料為蒈烯，該C,o二環(huán)類異戊二烯為蒈烷。在另一實(shí)施方案中，該do類異戊二烯起始原料為a-蒎烯，該do二環(huán)類異戊二烯為策烷。在另一實(shí)施方案中，該C川類異戊二烯起始原料為(3-蒗烯，該C川二環(huán)類異戊二烯為蒎烷。在其它實(shí)施方案中，該C,o類異戊二烯起始原料為a-蒗烯和P-蒗烯的混合物，該C，o二環(huán)類異戊二烯為蒎烷。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該Cu)類異戊二烯起始原料為檜烯，該C,o二環(huán)類異戊二烯為抬，烷。另一方面，本發(fā)明提供了從單糖制備燃料組合物的方法，其包括如下步驟(a)在適于生成Cl()類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成Cl0類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與單糖相接觸；(b)將C,o類異戊二烯起始原料轉(zhuǎn)化為do二環(huán)類異戊二烯；并(c)將C,o二環(huán)類異戊二烯與燃料組分相混合，以制備該燃料組合物。在一些實(shí)施方案中，通過將C1Q類異戊二烯起始原料與氫在催化劑的存在下接觸，將C,o類異戊二烯起始原料轉(zhuǎn)化為C,o二環(huán)類異戊二烯。另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的燃料、生物工程燃料組分、或生物工程燃料添加劑的裝置。在特定的實(shí)施方案中，該裝置能夠以生物方法生產(chǎn)該Cu)起始原料。在特定的實(shí)施方案中，該裝置進(jìn)一步能夠從該起始原料制備類異戊二烯燃料添加劑或燃料組分。該裝置可包括能夠用于采用微生物制備C川起始原料的任意結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，該生物裝置包含本發(fā)明公開的一種或多種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該生物裝置包含細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含占其總重至少約1wt.%、至少約5wt.%、至少約10wt.%、至少約20wt.%、或至少約30wt%的至少一種C,o起始原料。在其它實(shí)施方案中，該生物裝置包括含有本發(fā)明所述的一種或多種細(xì)胞的發(fā)酵罐。本發(fā)明可使用能夠提供適于細(xì)胞或微生物生長或繁殖的穩(wěn)定和適宜環(huán)境的任意發(fā)酵罐。在一些實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包含含有本發(fā)明公開的一種或多種細(xì)胞的培養(yǎng)物。在其它實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包含能夠以生物方式生成香葉基焦磷酸(GPP)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在其它實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包含能夠以生物方式生成異戊烯二磷酸(IPP)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在特定實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包含細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞培養(yǎng)物包含占其總重至少約1wt.%、至少約5wt.%、至少約10wt.%、至少約20wt.%、或至少約30wt.。/。的至少一種Cu)起始原料。該裝置可進(jìn)一步包括能夠由C1Q起始原料生產(chǎn)燃料組分或燃料添加劑的任意結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可包含用于氫化C,o起始原料的氫化器。本發(fā)明可使用能在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的條件下將C=C雙鍵還原為C-C單鍵的任意氫化器。該氫化器可包含本發(fā)明公開的氫化催化劑。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括混合器，容器，以及在該容器中的來自氫化步驟的氫化產(chǎn)物和常規(guī)燃料添加劑的混合物。該單糖為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意單糖。合適的單糖的一些非限制性范例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其組合。合適的二糖的一些非限制性范例包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖及其組合。28在特定的實(shí)施方案中，該生物工程燃料組分可從多糖獲得。合適的多糖的一些非限制性范例包括淀粉、糖原、纖維素、幾丁質(zhì)及其組合。適用于制備生物工程四甲基環(huán)己烷的單糖、二糖和多糖可從多種農(nóng)作物或來源中發(fā)現(xiàn)。合適的農(nóng)作物或來源的一些非限制性范例包括甘蔗、甘蔗渣、芒、甜菜、蜀黍、高粱、柳枝稷、大麥、麻、槿麻、土豆、紅薯、木薯、向日葵、水果、糖漿、乳清或脫脂牛奶、玉米、秸稈、谷物、小麥、木材、紙、稻草、棉花、多種纖維類廢物和其他生物量。在特定的實(shí)施方案中，合適的農(nóng)作物或來源包括甘蔗、甜菜和玉米。制備化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的化合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法制備，包括生物方法，化學(xué)合成(不使用生物來源的原料)，以及同時(shí)采用生物和化學(xué)手段的混合方法。在特定的實(shí)施方案中，該Qo類異戊二烯起始原料各自由宿主細(xì)胞將單糖轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物來進(jìn)行制備。宿主細(xì)胞該C川類異戊二烯起始原料還可通過本領(lǐng)域已知的任意方法制備，該方法包括生物方法、化學(xué)合成和混合方法。當(dāng)C川類異戊二烯起始原料通過生物方法制備時(shí)，可采用經(jīng)改良以生成目標(biāo)產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。與所有的類異戊二蜂類似，C10類異戊二烯起始原料可通過常見的中間體異戊烯二磷酸("IPP")經(jīng)生物化學(xué)方法來制備。該宿主細(xì)胞可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意技術(shù)來進(jìn)行生長。特別地，宿主細(xì)胞可生長于適合宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在有利的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含容易獲得的可再生的組分。因此，本發(fā)明4是^^了容易獲得的可再生的能源，將其用于生成燃料組合物的方法。在特定的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在適于其生長和生成C,Q類異戊二烯的條件下通過與單糖接觸來進(jìn)行生長或培養(yǎng)。在特定的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可通過與葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其組合相接觸進(jìn)行生長或培養(yǎng)。因此，本發(fā)明提供了來自于單糖(例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其組合)的燃料組合物，以及從該單糖生成它們的方法。任意合適的宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明所述的方法和組合物的使用。在一實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為遺傳修飾的宿主微生物，其中核酸分子被插入、缺失或修飾(即，突變的；例如，通過核苷酸的插入、缺失、替換和/或倒位)，從而生成所需的類異戊二烯或類異戊二烯衍生物，或者提高所需的類異戊二烯或類異戊二烯衍生物的產(chǎn)量。在特定的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠在液體生長培養(yǎng)基中生長。合適的宿主細(xì)胞的范例包括古細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和真核細(xì)胞。古細(xì)菌細(xì)胞的范例包括但不限于那些屬于氣火菌屬(Aeropymm)、Archaeglobus、嗜鹽才i1菌屬(Halobacterium)、甲烷^求菌屬(Melhanococcus)、甲烷片f菌屬(Methanobacterium)、熱3求菌屬(Pyrococcus)、碌l化葉菌屬(Sulfolobus)、和嗜熱枝原體屬(Thermoplasma)的古細(xì)菌細(xì)胞。古細(xì)菌菌抹的范例包括但不限于嗜熱7良生古纟田菌(Aeropyrumpernix)、閃爍古生3求菌(Archaeoglobusfulgidus)、詹氏甲烷3求菌(Methanococcusjannaschii)、嗜熱自養(yǎng)甲烷牙f菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、超々予熱菌(Pyrococcusabyssi)、才及端嗜熱3求古菌(Pyrococcushonkoshii)、嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)、和Thermoplasmavolcamum。有用的細(xì)菌種類的范例包括但不限于那些屬于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、月旨環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藻屬(Anabaena)、組囊藍(lán)細(xì)菌屬(Anacystis)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、定氮菌屬(Azobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、產(chǎn)色菌屬(Chromatium)、梭狀芽孑包才干菌屬(Clostridium)、氺奉狀4f菌屬(Corynebacterium)、腸一f菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、大腸+f菌屬(Escherichia)、乳酸+f菌屬(Lactobacillus)、乳J求菌屬(Lactococcus)、慢生沖艮瘤菌屬(Mesorhizobium)、甲基菌屬(Methylobacterium)、孩i:+f菌屬(Microbacterium)、席藍(lán)纟田菌屬(Phormidium)、寸艮單胞菌屬(Pseudomonas)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅4艮單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum)、纟:U求菌屬(Rhodococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、Scenedesmun、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、鏈霉菌屬(Strepromyces)、Synnecoccus和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的種類。有用的細(xì)菌菌抹的范例包括但不限于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、醫(yī)學(xué)J不4大4f"菌(Bacillusamyloliquefacines)、產(chǎn)氨，豆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacteriumimmariophilum、拜季4木-斤基(氏)4炎菌(Clostridiumbeigerinckii)、卩反崎腸菌(Enterobactersakazaku)、大月為碎f菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、中慢生才艮瘤菌(Mesorhizobiumloti)、4同纟錄j艮單孑包菌(Pseudomonasaeruginosa)、Pseudomonasmevalonii、Pseudomonaspudica、芙月莫紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)、5求形紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)、腸炎沙門(氏)菌(Salmonellaenterica)、沙門氏菌傷寒一f菌(Salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門(氏)菌(Salmonellatyphimurium)、志賀氏痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、弗氏31志賀(氏)菌(Shigellaflexneri)、宋內(nèi)志賀菌(Shigellasonnei)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等。一般而言，當(dāng)使用細(xì)菌宿主細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選非病原性菌抹。非病原性菌抹的范例包括但不限于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜酸乳桿菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳(酸)桿菌(Lactobacillushelveticus)、銅綠^f艮單月包菌(Pseudomonasaeruginosa)、Pseudomonasmevalonii、惡臭fli單胞菌(Pseudomonaspudita)、J求形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)、光合菌(Rodobactercapsulatus)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)等。有用的真核細(xì)胞的范例包括但不限于真菌細(xì)胞。真菌細(xì)胞的范例包括但不限于那些屬于以下屬的真菌細(xì)胞曲霉屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、隱球酵母屬(Cryotococcus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、內(nèi)生真菌屬(Neotyphodium)、鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母菌屬(Saccharomyces)、和木霉菌屬(Trichoderma)的真菌細(xì)月包。有用的真核細(xì)胞菌抹的范例包括但不限于構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、白色念珠菌Candidaalbicans)、Chrysosporiumlucknowense、禾谷鐮孢菌(Fusariumgramineamm)、鐮孑包霉Fusariumvenenatum)、IL西l克魯纟偉酵母(Kluyveromyceslactis)、斗且并造l7jc孑包菌(Neurosporacrassa)、安格斯畢赤酵母(Pichiaangusta)、吉利蒙德(氏)畢赤酵母(Pichiafinlandica)、庫德畢赤酵母(Pichiakodamae)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、奧默酵母(Pichiaopuntiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、畢赤酵母pijperi(Pichiapijperi)、畢赤酵母quercuum(Pichiaquercuum)、畢赤酵母salictaria(Pichiasalictaria)、耐熱畢赤酵母(Pichiathermotolerans)、Pichiatrehalophila、樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)、抗菌素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)、金色鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)、鏈金黃色葡萄球菌(Streptomycesaureus)、貝酵母(Saccaromycesbayanus)、布4立氏酉孝母(Saccaromycesboulardi)、酉良酒西孝母(Saccharomycescerevisiae)、殺真菌素鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus)、灰產(chǎn)色《連霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、鉛青《連霉菌(Streptomyceslividans)、產(chǎn)#:欖色鏈霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝鏈霉菌(Streptomycesrameus)、田無《連霉菌(Streptomycestanashiensis)、酒紅鏈霉菌(Streptomycesvinaceus)、和里氏木霉(Trichoderma一般而言，當(dāng)使用真核細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選非病原性種類。非病原性種類的范例包括但不限于禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、4廉孢霉(Fusariumvenenatum)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)、布拉氏酵母(Saccaromycesboulardi)、禾口西良酒酵母(Saccaromycescerevisiae)。此外，某些種類經(jīng)食品藥品管理局指定為GRAS或通常認(rèn)為安全。這些菌抹包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜酸乳桿菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳(酸)菌(Lactobacillushelveticus)、和酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。IPP途經(jīng)存在兩種已知的合成IPP及其異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸脂("DMAPP")的生物合成途徑。不同于植物，真核生物使用甲羥戊酸-依賴性("MEV")類異戊二烯途徑專有地將乙酰輔酶A("乙酰-CoA")轉(zhuǎn)化為IPP，IPP隨后被異構(gòu)化為DMAPP。原核生物(存在少數(shù)例外)使用該甲羥戊酸-依賴性或脫氧木酮糖5-磷酸("DXP")途徑通過一個(gè)分支點(diǎn)分別生成IPP和DMAPP。一般而言，植物同時(shí)使用MEV和DXP途徑進(jìn)行IPP合成。MEV途徑圖1顯示了MEV途徑的示意圖。一般而言，該途徑包括六個(gè)步驟。在第一步驟，兩個(gè)乙酰輔酶A分子經(jīng)酶催化合并形成乙酰乙酰輔酶A。已知催化該步驟的酶是，例如，乙酰輔酶A石克解酶。核苷酸序列的范例包括但不限于來源于如下GenBank錄入號(hào)以及從中獲得該序列的有機(jī)物(NC000913REGION:2324131..2325315;大腸桿菌)，(D49362;脫氮微球菌)，和(L20428;釀酒酵母)。在MEV途徑的第二步驟，乙酰乙酰輔酶A與另一乙酰輔酶A分子縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苦酸序列的范例包括但不限于(NC—001145,互補(bǔ)19061..20536;釀酒酵母)，(X96617;釀酒酵母)，(X83882;擬南芥)，(AB037907;Kitasatosporagriseola)，(BT007302;智人)，以及(NC—002758，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽SAV2546，GeneID1122571;金黃色葡萄球菌)。在第三步，HMG輔酶A酶催化轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG-CoA還原酶。核脊酸序列的范例包括但不限于(NM—206548;黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster))、(NC—002758，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽SAV2545，GeneID1122570;金黃色葡萄球菌)、(NM—204485;紅原雞(Gallusgallus))、(AB015627;鏈霉菌屬KO3988)、(AF542543;漸狹葉煙草(Mcotianaattenuata))、(AB037907;Kitasatosporagriseola)、，(AX128213，才是供編碼截34短HMGR的序列；酉良酒酵母)、以及(NC—001145;互補(bǔ)(l15734..118898;酉良酒酵母)。在第四步，甲羥戊酸被酶催化磷酸化形成甲羥戊酸5-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，甲羥戊酸激酶。核普酸序列的范例包括但不限于(L77688;擬南齊)和(X55875;釀酒酵母)。在第五步，向該甲羥戊酸5-磷酸酶催化添加第二個(gè)磷酸基團(tuán)，從而形成甲鞋戊酸5-焦磷酸脂。已知催化該步驟的酶是，例如，磷酸甲羥戊酸激酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(AF429385;巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis))、(NM_006556;智人)、和(NC—001145;互補(bǔ)體712315..713670;釀酒酵母)。在第六步，甲羥戊酸5-焦磷酸脂被酶催化轉(zhuǎn)化為IPP。已知催化該步驟的酶是，例如，甲羥戊酸焦磷酸脂脫羧酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(X97557;釀酒酵母)、(AF290095;屎腸球菌(Enterococcusfaecium))、和(U49260;智人)。如要通過該甲羥戊酸途徑將IPP轉(zhuǎn)化為DMAPP,則需要進(jìn)行第七步。已知催化該步驟的酶是，例如，IPP異構(gòu)酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(NC_000913,3031087..3031635;大腸桿菌)、和(AF082326;雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis))。DXP途徑圖2顯示了DXP途徑的示意圖。一般而言，DXP途徑包括七個(gè)步驟。在第一步，將丙酮酸鹽與D-甘油醛3-磷酸縮合形成l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(AF035440;大腸桿菌)、(NC_002947，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽PP0527;惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonasputida))、(CP000026,基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽SPA2301;腸炎副傷寒沙門氏菌(SalmonellaentericaParatyphi),見ATCC9150)、(NC—007493，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽RSP—0254;球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1)、(NC—005296，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽RPA0952;沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)CGA009)、(NC_004556，基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽PD1293;苛養(yǎng)木桿菌(Xylellafastidiosa)Temeculal)、和(NC—003076,基因座標(biāo)簽基因座標(biāo)簽AT5G11380;擬南芥)。在第二步，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(AB013300;大腸桿菌)、(AF148852;擬南芥)、(NC_002947，基因座標(biāo)簽PP1597;惡臭假單胞菌KT2440)、(AL939124，基因座標(biāo)簽SC05694;天藍(lán)色《連霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2))、(NC—007493，基因座標(biāo)簽RSP—2709;球形紅細(xì)菌2.4.1)、和(NC—007492，基因座標(biāo)簽Pf1_1107;熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)PfO-1)。在第三步，2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸被轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-20甲基-0-赤藻糖醇合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(AF230736;大腸桿菌)、(NC—007493，基因座標(biāo)簽RSP—2835;球形紅細(xì)菌2.4.1)、(NC_003071，基因座標(biāo)簽AT2G02500;擬南芥)、和(NCJ)02947，基因座標(biāo)簽PP1614;惡臭假單胞菌KT2440)。在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇被轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-20甲基-D-赤藻糖醇激酶。核普酸序列的范例包括但不限于(AF216300;大腸桿菌)和(NCJ)07493，基因座標(biāo)簽RSPJ779;球形紅細(xì)菌2.4.1)。在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，2C-甲基-D畫赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶。核普酸序列的范例包括但不限于(AF230738;大腸桿菌)、(NC_007493，基因座標(biāo)簽RSP_6071;球形紅細(xì)菌2.4.1)、以及(NC_002947，基因座標(biāo)簽PP1618;惡臭々i單胞菌KT2440)。在第五步中，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，20甲基-0-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于(AF230738;大腸桿菌)、(NC—007493，基因座標(biāo)簽RSP_6071;球形紅細(xì)菌2.4.1)、以及(NC一002947，基因座標(biāo)簽PP1618;惡臭假單胞菌KT2440)在第六步中，2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸被轉(zhuǎn)化為l-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，1-羥基-2-甲基-2-(￡)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核普酸序列的范例包括但不限于(AY033515;大腸桿菌)、(NC—002947，基因座標(biāo)簽PP0853;惡臭假單胞菌KT2440)、以及(NC—007493，基因座標(biāo)簽RSP—2982;球形紅細(xì)菌2.4.1)。在第七步中，l-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被轉(zhuǎn)化為IPP或其異構(gòu)體DMAPP。已知催化該步驟的酶是，例如，異戊17二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的范例包括但不限于(AY062212;大腸桿菌)和(NC—002947，基因座標(biāo)簽PP0606;惡臭假單胞菌KT2440)。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞自身的代謝過程和本發(fā)明提供的涉及IPP生成的過程之間的"相互干擾(crosstalk)"(或干擾)被最小化或完全消除。例如，當(dāng)該宿主微生物專門依賴DXP途徑合成IPP,而MEV途徑被導(dǎo)入以提供額外的IPP時(shí)，相互干擾被最小化或完全消除。該種宿主微生物不會(huì)被修飾以改變?cè)揗EV途徑酶的表達(dá)或處理與該MEV途徑相關(guān)的中間體。專門或主要依賴DXP途徑的有機(jī)體包括，例如，大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞專門通過MEV途徑或通過MEV途徑與DXP途徑聯(lián)合生成IPP。在其它實(shí)施方案中，宿主DXP途徑的功能缺失，從而使宿主細(xì)胞專門通過外部引入的MEV途徑生成IPP?？赏ㄟ^使一種或多種DXP途徑酶停止基因表達(dá)或功能失活使該DXP途徑缺失功能。類異戊二烯起始原料在一些實(shí)施方案中，GPP可參照?qǐng)D3所示的方法進(jìn)行制備。將一分子的IPP和一分子的DMAPP縮合形成GPP。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)可被已知催化該步驟的酶(例如，香葉基二磷酸合成酶)所催化。各種Qo類異戊二烯起始原料可由GPP制備。編碼香葉基焦磷酸合成酶的多聚核香酸的范例包括但不限于(AF513111;北美冷杉(Abiesgrandis))、(AF513112;北美冷杉)、(AF513113;北美冷杉)、(AY534686;金魚草(Antirrhinummajus))、(AY534687;金魚草)、(Y17376;擬南芥)、(AE016877,基因座API1092;蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus);ATCC14579)、(AJ243739;甜橙(Citrussinensis))、(AY534745;仙女扇(Clarkiabreweri))、(AY953508;Ipspini)、(DQ286930;番庇(Lycopersiconesculentum))、(AF182828;胡椒薄荷(Menthaxpiperita))、(AF182827;Menthaxpiperita)、(MPI249453;Menthaxpiperita)、(PZE431697,基因座CAD24425;Paracoccuszeaxanthinifaciens)、(AY866498;庫洛胡黃連(Picrorhizakurrooa))、38(AY351862;葡萄(Vitisvinifera))、以及(AF203881，基因座AAF12843;酵單胞菌(Zymomonasmobilis))。然后可采用一種或多種薛烯合成酶將GPP轉(zhuǎn)化為各種Cio類異戊二烯起始原料。一些非限制性范例包括如下范例及其立體異構(gòu)體。蒈烯蒈烯，其結(jié)構(gòu)為發(fā)現(xiàn)于多種樹(特別是松樹)的樹脂中。蒈烯可通過蒈烯合成酶由GPP制備。合適的核脊酸序列的范例包括但不限于(AF461460，REGION43..1926;挪威云杉(Piceaabies))和(AF527416,REGION:78..1871;Salviastenophylla)。a-蒗烯a-蒗烯，其結(jié)構(gòu)為發(fā)現(xiàn)于松樹和桉樹中。a-蒎烯可通過a-蒎烯合成酶由GPP制備。合適的核苷酸序列的范例包括但不限于(+)a-策烯合成酶(AF543530，REGION:1..1887;火炬松(Pinustaeda))、(-)a-菜烯合成酶(AF543527，REGION:32..1921;火炬松)、以及(+)/(-)a-蒗烯合成酶(AGU87909，REGION:6111892;北美冷杉)。P-蒎烯P-蒎烯，其結(jié)構(gòu)為發(fā)現(xiàn)于松樹、迷迭香、歐芹、蒔蘿、羅勒、和玫瑰中。(3-蒎烯可通過(3-蒗烯合成酶由GPP制備。合適的核苷酸序列的范例包括但不限于(-)P-菜烯合成酶(AF276072，REGION:l..1749;青蒿素(Artemisiaannua))和(AF514288，REGION:26..1834;檸檬(Cirtuslimon))。發(fā)現(xiàn)于黑胡椒、胡蘿卜種子、鼠尾草和茶樹。檜烯可通過檜烯合成酶由GPP制備。合適的核香酸序列的范例包括但不限于來自于鼠尾草的AF051901,REGION:26..1798。在一些實(shí)施方案中，該類異戊二烯起始原料可從天然存在的萜蜂獲得或制備得到，該萜烯可由多種植物(例如，香脂蘇木(Copaiferalangsdorfii)、針葉樹、和大戟樹)，昆蟲(例如，燕尾蝶、葉甲、白蟻、以及松葉蜂)和海洋生物(例如，海藻、海綿、珊瑚、軟體動(dòng)物、和魚)生成。檜烯檜燁，其結(jié)構(gòu)為香脂蘇木或香脂樹也稱為柴油樹和煤油樹。它在地方語言中具有多個(gè)名稱，包括kupa'y，cabismo，和copai3Tva。香脂樹可在其木材和葉子中生成大量的碎烯烴。一般而言，一顆香脂樹每年可生成約30至約40升的萜烯油。碎烯油還可從針葉屬和大戟屬獲得。針葉屬屬于植物中的松柏i':i(Pinophyta)或松柏科(Conifeme)，且通常為具有維管組織的以松果攜帶種子的植物。針葉樹中大部分是樹，但有些針葉樹可能是灌木。合適的針葉樹的一些非限制性范例包括雪松、柏樹、道格拉斯樅樹、樅樹、杜松、貝殼松、落葉;松、；松樹、紅杉、云杉、以及紫杉。大戟屬，也稱為Euphorbia,是在全世界廣泛分布的植物，屬于大戟科(Euphorbiaceae)。由約2160個(gè)種類組成的大戟屬，是植物王國最大的物種之一。該Qo類異戊二烯起始原料為倍半萜，它是稱為萜烯的更大類別化合物的一部分。作為烴類中較大的類別，薛烯包括半碎烯、單萜烯、倍半萜、二萜烯、二倍半裕、三碎烯、四裕烯和多裕烯。因此，可從萜烯油中分離合適的C10類異戊二烯起始原料用于本發(fā)明。化學(xué)轉(zhuǎn)化在特定的實(shí)施方案中，從天然存在的來源分離一種或多種C川類異戊二烯起始原料，隨后轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的Qo二環(huán)類異戊二烯。不管為何種來源，C,o類異戊二烯起始原料均可通過已知的還原反應(yīng)(例如氫化反應(yīng))化學(xué)轉(zhuǎn)化為C川二環(huán)類異戊二烯。在一些實(shí)施方案中，該C,o類異戊二烯起始原料可采用催化劑(例如，Pd、Pd/C、Pt、Pt02、Ru(PPh3)2Cl2、蘭尼鎳及其組合)被氫化還原。一般而言，在完成后，可洗滌該反應(yīng)混合物，濃縮，并干燥以獲得相應(yīng)的氫化產(chǎn)物。Cu)類異戊二烯起始原料的氫化反應(yīng)的催化劑可以以能夠使該反應(yīng)進(jìn)行的任意量存在。在一些實(shí)施方案中，該氫化催化劑的量為每升反應(yīng)物約lg至約100g、每升反應(yīng)物約2g至約75g、每升反應(yīng)物約3g至約50g、每升反應(yīng)物約4g至約40g、每升反應(yīng)物約5g至約25g、或每升反應(yīng)物約5g至約10g。在一些實(shí)施方案中，該氫化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。在特定的實(shí)施方案中，該反應(yīng)溫度介于約10。C和約75°C、介于約15t:和約60°C、介于約20。C和約50°C、或介于約20。C和約4(TC。在其它實(shí)施方案中，該反應(yīng)溫度介于約75。C和約150。C、介于約90。C和約130°C、或介于約IO(TC和約125°C。氫化反應(yīng)中氫的壓力可以是使該反應(yīng)進(jìn)行的任意壓力。在一些實(shí)施方案中，該氫的壓力介于約10psi和約1000psi、介于約50psi和約800psi、介于約400psi和約600psi、或介于約450psi和約550psi。在其它實(shí)施方案中，該氫的壓力小于100psi。在一些實(shí)施方案中，該催化劑為Pd催化劑。在其它實(shí)施方案中，該催化劑為5。/。Pd/C。在其它實(shí)施方案中，該催化劑為10%Pd/C。在特定的這些實(shí)施方案中，該催化劑載量介于每升反應(yīng)物約lg至約10g。在其它實(shí)施方案中，該催化劑載量介于每升反應(yīng)物約5g至約5g。在一些實(shí)施方案中，該Cw類異戊二烯起始原料中的C=C鍵在室溫下于催化劑和氫的存在下被氫化還原為相應(yīng)的C-C鍵。在特定的實(shí)施方案中，如下文圖解1所示，蒈烯在10Q/()Pd/C催化劑的存在下被氫還原為蒈烷。圖解1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如下文圖解2所示，a-蒗烯或|3-蒎烯在10%Pd/C催化劑的存在下被氫還原為蒎烷。圖解2在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如下文圖解3所示，檜烯在100/oPd/C催化劑的存在下被氫還原為檜烷?？蛇x擇地，也可使用任何能將C二C鍵還原為C-C鍵的還原劑。例如，該do類異戊二烯起始原料可通過在氧氣氛中，在催化劑(例如，5-乙基-3-甲基光黃素高氯酸酯)存在下，以肼處理氫化得到相應(yīng)的氫化產(chǎn)物。該種用肼進(jìn)行的還原反應(yīng)公開于Imada等人.J.Am.Chem.Soc.,127，14544-14545(2005)，其通過參考并入本發(fā)明。該C1()類異戊二烯起始原料的氫化可在不對(duì)稱氫化催化劑(例如銠-手性雙膦復(fù)合物)的存在下進(jìn)行，從而形成基本不含其它立體異構(gòu)體的立體特異性氫化產(chǎn)物。該非對(duì)稱氫化催化劑的非限制性范例包括銠-DIPAMP催化劑。該銠-DIPAMP催化劑和其它非對(duì)稱氬化催化劑公開于Vineyard等人，J.Am.Chem.Soc.1977,99，(18)，5946;RyojiNoyori,"AsymmetricCatalysisInOrganicSynthesis,"JohnWiley&SonsInc.，NewYork,第二章，16-94頁(1994);以圖解3及Blaser等人,"AsymmetricCatalysisonIndustrialScale:Challenges，ApproachesandSolutions,"Wiley-VCH，Weinheim，23-52頁(2004)，其全文均通過參考并入本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，蒈烯可在不對(duì)稱氫化催化劑的存在下被氫化形成下文所示的蒈烷的四種可能的立體異構(gòu)體之一在其它實(shí)施方案中，a-菜烯或(3-蒎烯可在不對(duì)稱氫化催化劑的存在下被氬化形成下文所示的蒗烷的四種可能的立體異構(gòu)體之一在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，檜雄可在不對(duì)稱氫化催化劑的存在下被氫化形成下文所示的檜烷(也稱為側(cè)柏烷或tenacetane)的四種可能的立體異構(gòu)體之商業(yè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及商業(yè)方法，其包括(a)通過糖與重組宿主細(xì)胞的發(fā)酵反應(yīng)獲得包含由C1()類異戊二烯起始原料獲得的C1G二環(huán)類異戊二烯的生44物燃料，其中該重組宿主細(xì)胞生成該C,o類異戊二烯起始原料；和(b)營銷和/或銷售所述生物燃料。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了向燃料的經(jīng)銷商、承辦商和/或使用者經(jīng)銷或分銷本發(fā)明所述的生物燃料的方法，該方法包括對(duì)本發(fā)明公開的生物燃料進(jìn)行廣告和/或許諾銷售。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的生物燃料可相對(duì)于天然燃料或相對(duì)應(yīng)的含乙醇生物燃料具有改良的物理或市場特征。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與確立的石油油料精煉商合伙或合作或許可其將本發(fā)明公開的生物燃料混合進(jìn)入石油為基礎(chǔ)的燃料(例如汽油、噴氣燃料、煤油、柴油燃料或其組合)的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與已成立的石油油料精煉商合伙或合作或許可其加工(例如，氫化、加氫裂化、進(jìn)一步純化)本發(fā)明公開的生物燃料，從而使其經(jīng)修飾具有有益屬性的方法。上述已成立的石油油料精煉商可將本發(fā)明公開的生物燃料作為原料進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)修飾，該終產(chǎn)品可用作燃料或燃料組合物的混合組分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與從可再生來源(例如，谷物、甘蔗、甘蔗渣或木質(zhì)纖維材料)獲得糖的生產(chǎn)商合伙或合作或許可其利用該種可再生糖來源生產(chǎn)本發(fā)明公開的生物燃料的方法。在一些實(shí)施方案中，可使用糖的傳統(tǒng)來源谷物和甘蔗。在其它實(shí)施方案中，可將廉價(jià)的木質(zhì)纖維材料(農(nóng)業(yè)廢物、谷物秸稈或柳枝草和蒲蘋等生物量農(nóng)作物)作為糖的來源。根據(jù)本發(fā)明公開的方法，可將來自于該種廉價(jià)來源的糖進(jìn)行投料，以生產(chǎn)本發(fā)明公開的生物燃料。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與從可再生來源(例如，谷物、甘蔗、甘蔗渣或木質(zhì)纖維材料)生產(chǎn)和/或使用糖的化工生產(chǎn)商合伙或合作或許可其利用該種來自可再生糖來源的糖生產(chǎn)本發(fā)明公開的生物燃料的方法。實(shí)施例如下實(shí)施例僅作闡述之用，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非另行指明，本發(fā)明的實(shí)施可采用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的生物合成等行業(yè)中的常規(guī)技術(shù)。對(duì)于本發(fā)明未完全描述的該種技術(shù)，人們可在科技文獻(xiàn)中找到有關(guān)于此的充分參考。在如下的實(shí)施例中，我們努力確保所用數(shù)字(例如，數(shù)量、溫度等)的精確性，但應(yīng)容許變化和偏差，且當(dāng)本發(fā)明存在該種數(shù)值的書寫錯(cuò)誤時(shí)，本非另行指明，溫度報(bào)道為攝氏度，壓力等于或接近海平面的大氣壓。除非另行指明，所有的試劑均為商購的。如下實(shí)施例僅作闡述之用，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例描述了的編碼排列在操縱子中的酶的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法，所述酶包4舌來自釀酒酵母的MEV途徑的酶。表達(dá)質(zhì)粒pMevT可通過將MevT操縱子插入pBAD33載體后生成。該MevT操縱子編碼MEV途徑的一組可共同將普遍存在的前體乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(R)-甲羥戊酸的酶，即，乙酰乙酰輔酶A石克解酶、HMG輔酶A合成酶、以及HMG輔酶A還原酶。通過PCR擴(kuò)增來源于大腸片干菌基因組DNA的atoBREGION2324131..2325315)(編碼乙酰乙酰輔酶A碌^解酶)、來源于釀酒酵基因組DNA母的ERG13基因的編碼序列(GenBank錄入號(hào)X96617，REGION220..1695)(編碼HMG輔酶A合成酶)、以及來源于釀酒酵母基因組DNA的HMG1基因的編碼區(qū)域的一個(gè)片段(GenBank錄入號(hào)M22002,REGION1660..3165)(編碼截短的HMG輔酶A還原酶(tHMGR))，以生成該MevT操縱子。用于HMG1基因片段擴(kuò)增的上游PCR引物包括人工起始密碼子。通過重疊延伸(SOEing)將擴(kuò)增的片段拼接在一起，在該過程中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被引入到atoB和ERG13編碼序列之后。添加3'A突出末端后，將MevT操縱子連接至TA克隆載體pCR4(Invitrogen，Carlsbad,CA)。隨后，該MevT操縱子被連4妄至載體pBAD33的XmalPstl限制性酶切位點(diǎn)(Guzman等人.(1995)J.Bacteriol.177(14):4121-4130)。為使該操縱子受到PLac啟動(dòng)子的控制，以pBBRlMCS的Nsil-Xmal片段替換pBAD33的araC-PBADNsil-Xmal片段，以得到表達(dá)栽體pMevT(參見美國專利7,192,751)。表達(dá)質(zhì)粒pAM36-MevT66可通過將MevT66操縱子插入pAM36載體來生成。pAM36載體可通過將含有AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI限制性酶切位點(diǎn)的寡聚核苷酸盒插入pACYC184載體(GenBank錄入號(hào)X06403),并除去pACYC184中賦予四霉素耐受性的基因后獲得。該MevT66操縱子可通過以SEQIDNO:l為模板合成得到，該SEQIDNO:l包含了來自大腸桿菌的atoB基因(GenBank錄入號(hào)NC—000913REGION2324131..2325315)、來自釀酒酵母的ERG13基因(GenBank錄入號(hào)X96617,REGION220..1695)、以及來自釀酒酵母的截短型HMG1基因(GenBank錄入號(hào)M22002，REGION1777..3285),所有三種序列均被密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。該合成生成的MevT66操縱子側(cè)翼連接5'EcoRI限制性酶切位點(diǎn)和3'HindIII限制性酶切位點(diǎn)，因此可被克隆至克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源的載體)的相容限制性酶切位點(diǎn)。該MevT66操縱子從該構(gòu)建體PCR擴(kuò)增，并帶有側(cè)翼的Sfil和AsiSI限制性酶切位點(diǎn)，使用Sfil和AsiSI限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的DNA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，通過凝膠純化試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)凝膠提取約4.2kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pAM36載體的SfilAsiSI限制性酶切位點(diǎn)，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pAM36-MevT66。表達(dá)質(zhì)粒pAM25可通過將MevT66操縱子插入pAM29載體生成。該pAM29載體可通過將來自pZS24-MCSl的pl5A復(fù)制起始區(qū)和賦予卡那霉素耐受性的基因(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)與寡聚核苷酸生成的lacUV5啟動(dòng)子裝配后生成。使用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶將包含MevT66操縱子(參見上述pAM36-MevT66的描述)的DNA合成構(gòu)建體消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.2kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pAM296的EcoRIHindIII限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)4立pAM25。表達(dá)質(zhì)粒pMevB-Cm可通過將MevB操縱子插入pBBRlMCS-1載體后生成。該MevB操縱子編碼一組能共同將(R)-甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為IPP的酶，即，甲羥戊酸激酶、；粦酸甲羥戊酸激酶以及甲幾戊酸焦-粦酸脂l炎化酶。該MevB操縱子可通過從釀酒酵母基因組DNA中PCR擴(kuò)增ERG12基因(GenBank錄入號(hào)X55875，REGION:580..1911)(編碼甲鞋戊酸激酶)、ERG8基因(GenBank錄入號(hào)Z49939，REGION:3363..4718)(編碼磷酸甲羥戊酸激酶)、以及MVD1基因(GenBank錄入號(hào)X97557，REGION:544..1734)(編碼甲羥戊酸焦磷酸脂羧化酶)的編碼序列，并通過重疊延伸(SOEing)將PCT片段拼接在一起后獲得。通過選擇適當(dāng)?shù)囊镄蛄校跀U(kuò)增過程中將ERG12和ERG8的終止密碼子由TAA變?yōu)門AG,以引入核糖體結(jié)合位點(diǎn)。添加3'A懸掛序列后，將MevB操縱子連接至TA克隆載體pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)。通過采用Pstl限制性內(nèi)切酶完全消化該克隆構(gòu)建體以切除該MevB操縱子，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.2kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pBBRlMCS-l載體的Pstl限制性酶切位點(diǎn)(Kovach等人，Gene166(1):175-176(1995))，獲得表達(dá)質(zhì)粒pMevB-Cm。表達(dá)質(zhì)粒pMBI可通過將MBI操縱子插入pBBRlMCS-3載體生成。除了MevB操縱子的酶外，該MBI操縱子還編碼異戊烯基焦磷酸酶異構(gòu)酶，其將IPP催化轉(zhuǎn)化為DMAPP。該MBI操縱子可通過如下方式獲得以包含5'端的Xmal限制性酶切位點(diǎn)的引物從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增idi基因(GenBank錄入號(hào)AF119715)的編碼序列，使用Xmal限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的DNA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約0.5kb片段，并將分離的DNA片段連接至pMevB-Cm表達(dá)質(zhì)粒的Xmal限制性酶切位點(diǎn)，從而將idi置于MevB操縱子的3'端。將該MBI操縱子亞克隆進(jìn)入載體pBBRlMCS-3的SailSacl限制性酶切位點(diǎn)(Kovach等人，Gene166(1):175-176(1995))，獲得表達(dá)載體pMBI(參見美國專利7,192,751)。通過將ispA基因插入pMBI生成表達(dá)質(zhì)粒pMBIS。該ispA基因編碼法呢基二磷酸合成酶，其將兩分子IPP與一分子DMAPP催化縮合生成法呢基焦磷酸(FPP)。采用具有SacII限制性酶切位點(diǎn)的正向引物和具有Sacl限制性酶切位點(diǎn)的反向引物從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增該ispA基因(GenBank錄入號(hào)D00694，REGION:484..1383)的編碼序列。使用SacII和Sacl限制性49內(nèi)切酶將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約0.9kb片段，并將分離的DNA片段連接至pMBI表達(dá)質(zhì)粒的SacIISacl限制性酶切位點(diǎn)，從而將該ispA基因置于idi和MevB操縱子的3'端，并獲得表達(dá)質(zhì)粒pMBIS(參見美國專利7,192,751)?？赏ㄟ^將表達(dá)質(zhì)粒pMBIS的ispA編碼序列替換為編碼香葉基二磷酸合成酶("gpps")的核苷酸序列來獲得表達(dá)質(zhì)粒pMBIS-gpps。包含編碼香葉基二磷酸合成酶的核普酸序列的DNA片段可采用經(jīng)過針對(duì)大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的擬南芥gpps基因(GenBank錄入號(hào)Yl7376，REGION:52..1320)編碼序列作為模板(SEQIDNO:2)合成得到。該核苷酸序列側(cè)翼連接前導(dǎo)SacII限制性酶切位點(diǎn)和末端Sacl限制性酶切位點(diǎn)，因此可被克隆進(jìn)入克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源載體)的相容限制性酶切位點(diǎn)。合成生成的香葉基二磷酸合成酶序列可通過如下方式分離使用SacII和Sacl限制性內(nèi)切酶將該DNA合成構(gòu)建體消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約1.3kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pMBIS表達(dá)質(zhì)粒的SacIISacl限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pMBIS-gpps。實(shí)施例2本實(shí)施例描述了編碼排列在操縱子中的酶的表達(dá)載體的制備方法，所述酶包括來自金黃色葡萄球菌的MEV途徑的酶?？赏ㄟ^將表達(dá)質(zhì)粒pAM25的HMG1基因(編碼釀酒酵母HMG輔酶A還原酶)的編碼序列替換為mvaA基因(編碼金黃色葡萄球菌HMG輔酶A還原酶(GenBank錄入號(hào)BA000017,REGION:2688925..2687648))的編碼序列獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM41。采用引物4-49mvaASpel(SEQIDNO:1l)和4-49mvaARXbal(SEQIDNO:12)從金黃色葡萄球菌(ATCC70069)基因組DNA中PCR擴(kuò)增mvaA基因的編碼序列，使用Spel限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的DNA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約1.3kbDNA片段。通過使用HindIII限制性內(nèi)切酶將pAM25消化完全，從該質(zhì)粒中去除HMGl編碼序列。采用T4DNA聚合酶平端化所得線性DNA片段的末端懸掛。然后采用Spel限制性內(nèi)切酶部分消化該DNA片段，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取4.8kbDNA片段。分離的DNA片段與SpeI-消化的mvaAPCR產(chǎn)物連接，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM41?？赏ㄟ^將表達(dá)質(zhì)粒pAM41的ERG13基因(編碼釀酒酵母HMG輔酶A合成酶)的編碼序列替換為mvaS基因(編碼金黃色葡萄球菌HMG輔酶A合成酶(GenBank錄入號(hào)BA000017，REGION:2689180..2690346))的編碼序列獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM52。通過引物HMGS5'SamvaS-S(SEQIDNO:13)和HMGS3'SamvaS-AS(SEQIDNO:14)從金黃色葡萄球菌(ATCC70069)基因組DNA中PCR擴(kuò)增mvaS基因的編碼序列，該擴(kuò)增的DNA片段可用作PCR引物，并按照Geiser等人(BioTechniques31:88-92(2001))的方法替換pAM41中的HMG1基因的編碼序列，以獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM52。實(shí)施例3本實(shí)施例描述了編碼排列在操縱子中的酶的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法，所述酶包括來自大腸桿菌的DXP途徑的酶。表達(dá)質(zhì)粒pAM408可通過將編碼"頂端"DXP途徑的酶的基因插入pAM29載體后生成。"頂端"DXP途徑的酶包括l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大腸桿菌的dxs基因編碼)、l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(由大腸桿菌的dxr基因編碼)、4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大腸桿菌的基因編碼)、以及4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大腸桿菌的基因編碼)，這些酶共同將丙酮酸鹽和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。包含編碼"頂端"DXP途徑的酶的核普酸序列的DNA片段可通過采用SEQIDNO:15至22所示的PCR引物，從具有加入了最佳ShineDalgarno序列以及5'和3'限制性酶切位點(diǎn)的大腸桿菌菌抹DH1(ATCC#33849)中PCR擴(kuò)增血s(GenBank錄入號(hào)U00096REGION:437539..439401)、血KGenBank序列號(hào)U00096REGION:193521..194717)、/^Z)(GenBank錄入號(hào)U00096REGION:2869803..2870512)、以及&/￡(GenBank錄入號(hào)U00096REGION1261249..1262100)基因的編碼序列后生成。通過凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠提取，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(J^o/和A^w/可用于包含血s基因的PCR產(chǎn)物；和j/a/可用于包含血r基因的PCR產(chǎn)物；J/a/和AWe/可用于包含^;D基因的PCR產(chǎn)物；AWe/和M/w/可用于包含基因的PCR產(chǎn)物)消化至完全，并采用PCR純化試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)進(jìn)行純化。然后將大約等摩爾量的各PCR產(chǎn)物添加至連接反應(yīng)，以將單個(gè)基因組裝進(jìn)入操縱子。1^的該連接反應(yīng)的反應(yīng)混合物被用于PCR擴(kuò)增兩個(gè)單獨(dú)的基因盒，即和&/￡>-/5/￡基因盒。使用引物67-1A-C(SEQIDNO:15)和67-1D-C(SEQIDNO:18)PCR擴(kuò)增該基因盒，并使用67-1E-C(SEQIDNO:19)和67-lH-C(SEQIDNO:22)引物PCR擴(kuò)增該/s/D-^/必基因盒。通過凝膠電泳分離兩種PCR產(chǎn)物，并凝膠提取。使用A7zo/和j/a/限制性內(nèi)切酶將包含該基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全，使用々w/和似/w/限制性內(nèi)切酶將包含該基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全。純化該兩種PCR產(chǎn)物，并將純化的DNA片段連接至pAM29載體的&〃M/w/限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM408(參見圖4的質(zhì)粒圖譜)。表達(dá)質(zhì)粒pAM409可通過將編碼"底部"DXP途徑的酶的基因插入pAM369載體后生成。"底部"DXP途徑的酶包括2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶(由大腸桿菌的^尸F(xiàn)基因編碼)、1-羥基-2-甲基-2-(￡)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(由大腸桿菌的^;G基因編碼)、以及異戊烯^/二甲基烯丙基二磷酸合成酶(由大腸桿菌的&///基因編碼)，這些酶共同將4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP。IPP還可通過異戊基二磷酸異構(gòu)酶(由大腸桿菌的W基因編碼)的活性轉(zhuǎn)化為DMAPP。DMAPP還可通過法呢基二磷酸合成酶(例如由大腸桿菌的/^v4基因編碼)的活性進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為FPP。編碼"底部"DXP途徑的酶以及異戊基二磷酸異構(gòu)酶和法呢基二磷酸合成酶的操縱子可通過采用SEQIDNO:23至32所示的PCR引物從具有加入了最佳ShineDalgarno序列以及5'和3'限制性酶切位點(diǎn)的大腸桿菌菌抹DH1(ATCC#33849)中PCR擴(kuò)增/s;F(GenBank錄入號(hào)U00096REGION:2869323..2869802)、^pG(GenBank錄入號(hào)U00096REGION:2638708..2639826)、^;if(GenBank錄入號(hào)U00096REGION:26277,27227)、W(GenBank錄入號(hào)AF119715)，以及/s;^4(GenBank錄入號(hào)D00694REGION:484..1383)基因后生成。通過凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠提取，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(5aw///和j/a/可用于包含/s;F基因的PCR產(chǎn)物；和^a/可用于包含基因的PCR產(chǎn)物；5"a//和X/w/可用于包含^;7/基因的PCR產(chǎn)物；Sa〃和州'wc////可用于包含基因的PCR產(chǎn)物；和Wco/可用于包含/5pJ基因的PCR產(chǎn)物)消化，并純化。然后將大約等摩爾量的各PCR產(chǎn)物添加至連接反應(yīng)，以將單個(gè)基因組裝進(jìn)入操縱子。lpl的該連接反應(yīng)的反53應(yīng)混合物被用于PCR擴(kuò)增兩個(gè)單獨(dú)的基因盒，即和基因盒。使用引物67-2A-C(SEQIDNO:23)和67-2D-C(SEQIDNO:26)PCR擴(kuò)增該/^F-i^G基因盒，并使用引物67-2E-C(SEQIDNO:27)和67-2J-C(SEQIDNO:32)PCR擴(kuò)增該/^iZ-W-^/W基因盒。通過凝膠電泳分離兩種PCR產(chǎn)物，并凝膠提取。使用5awi//和Xp"/限制性內(nèi)切酶將包含該/^尸-紅/G基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全，使用和Wco/限制性內(nèi)切酶將包含該基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全。純化兩種PCR產(chǎn)物。可通過將來自pAM29的pl5A復(fù)制起始區(qū)，來自pZE12-luc的用于氨比西林耐受的(3內(nèi)酰胺酶基因(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)與寡聚核苷酸生成的/acf/K5啟動(dòng)子裝配后生成載體pAM369。將包含"底部"DXP途徑操縱子的兩種分離PCR產(chǎn)物連接至pAM369載體的Saw///Wco/限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM409(參見圖4B的質(zhì)粒圖譜)。包含廣泛宿主范圍RK2復(fù)制起始區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒pAM409的衍生物-表達(dá)質(zhì)粒pAM424可通過將pAM409的/"cUV5啟動(dòng)子和/^FG/Z-W-Z^j操縱子轉(zhuǎn)移至pAM257載體后生成。載體pAM257可按如下方式生成采用引物9-156A(SEQIDNO:33)和9-156B(SEQIDNO:34)從RK2質(zhì)粒DNAPCR擴(kuò)增RK2基因座(Meyer等人.(1975)Science190:1226-1228)，采用A7"/和^/zo/限制性內(nèi)切酶將該2.6kbPCR產(chǎn)物消化至完全，并將該DNA片段連接至含有來自載體pZA31-luc的p15復(fù)制起始區(qū)和賦予氯霉素耐受性的基因的質(zhì)粒(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210)，獲得質(zhì)粒pAM37卞w;采用和限制性內(nèi)切酶將pAM37-pw消化至完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取含有RK2戶ar基因座和氯霉素耐受性基因的DNA片段，并將分離的DNA片段連接至mini-RK2復(fù)制子pRR10的州"W//位點(diǎn)(Roberts等人.(1990)JBacteriol.172:6204-6216)，獲得載體pAM133;采用Sg///和歷W///限制性內(nèi)切酶將pAM133消化至完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取缺失氨比西林耐受性基因和on丁結(jié)合起始區(qū)的約6.4kbDNA片段，并將該分離的DNA片段與合成生成的包含多個(gè)克隆位點(diǎn)(包含尸cZ/和^770/限制性酶切位點(diǎn))DNA片段相連接，獲得載體pAM257。使用io/和尸d/限制性內(nèi)切酶完全消化所得的表達(dá)質(zhì)粒pAM409，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.4kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至pAM257載體的尸c//限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM424(參見圖4C的質(zhì)粒圖譜)。實(shí)施例4本實(shí)施例描述了制備載體以將編碼酶(包括MEV途徑的酶)的核酸定向整合至釀酒酵母的特定染色體位置的方法?；蚪MDNA分離自釀酒酵母菌抹Y002(CEN.PK2背景；MATA;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)、Y007(S288C背景MATAtrplA63)、Y051(S288C背景；MATahis3Alleu2A0lys2A0ura3A0PGAL1-HMG1"863323PGAL1-upc2-lerg9::PMET3-ERG9::HIS3PGAL1-ERG20Pgal,畫HMG11586-3323)、和EG123(MATAura3;trpl;leu2;his4canl)。該菌抹在含有1%酵母提取物、2%細(xì)菌蛋白胨、和2%右旋糖的液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)中生長過夜。通過3，100rpm離心，以10mL超純水洗滌細(xì)胞團(tuán)，再次離心從10mL液體培養(yǎng)物中分離細(xì)胞。使用Y-DER酵母DNA抽提試劑盒(PierceBiotechnologies，Rockford，IL)才艮據(jù)生產(chǎn)商的建議方案抽提基因組DNA。將抽提的基因組DNA重懸浮于100(xL10mMTris-Cl(pH8.5)中，在ND-1000分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies,Wilmington，0￡)上讀取00260/280讀數(shù)，以確定基因組DNA濃度和純度。在AppliedBiosystems2720Thermocycler(AppliedBiosystemsInc,FosterCity，CA)中，采用Phusion高保真DNA聚合酶系統(tǒng)(FinnzymesOY，Espoo,Finland),并參照生產(chǎn)商的建議方案，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA。在完成待插入TOPOTApCR2.1克隆載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DNA片段的PCR擴(kuò)增后，通過向該反應(yīng)混合物添加1的QiagenTaq聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)，額外運(yùn)行10分鐘，72°CPCR伸展步驟，然后冷卻至4。C，以生成核苷酸懸掛序列。在PCR擴(kuò)增完成后，將8pL的50。/。甘油溶液添加至反應(yīng)混合物，并將完整的混合物加載至含有0.5ug/mL溴化乙啡啶的l%TBE(0.89MTris，0.89M硼酸，0.02MEDTA鈉鹽)瓊脂糖凝膠上。在120V,400mA下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，并采用紫外線顯示DNA條帶。使用無菌刀片從凝膠中切除DNA條帶，并采用Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒(ZymoResearch,Orange,CA)參照生產(chǎn)商的建議方案對(duì)切除的DNA進(jìn)行凝膠純化。將純化的DNA洗脫至10超純水中，在ND-1000分光光度計(jì)上讀取OD26()/28()讀數(shù)，以確定DNA濃度和純度。使用100-500ug的純化PCR產(chǎn)物和高濃度的T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，Ipswich,MA)，參照生產(chǎn)商的建議方案進(jìn)行連接。為進(jìn)行質(zhì)粒增殖，將連接的構(gòu)建體參照生產(chǎn)商的建議方案轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad,CA)。在含有1.5%Bacto瓊脂、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl、以及50ug/mL適當(dāng)抗生素的固體培養(yǎng)基上選擇陽性轉(zhuǎn)化體。使分離的轉(zhuǎn)化體在含有50ug/mL羧千青霉素或卡那霉素抗生素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C下生長16小時(shí)，使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)參照生產(chǎn)商的建議方案分離和純化質(zhì)粒。通過診斷性限制性內(nèi)切酶消化來驗(yàn)證構(gòu)建體，在瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，并采用紫外光顯示該條帶。還可通過DNA測序來驗(yàn)證選擇的構(gòu)建體，該工作由ElimBiopharmaceuticalsInc.(Hayward，CA)完成。通過將載體pAM471的ERG20-PGAL-tHMGR插入片段插入載體pAM466生成質(zhì)粒pAM489。通過將DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR插入TOPOZeroBluntII克隆載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)生成載體pAM471，該DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR包含ERG20的開放閱讀框架(ORF)(ERG20核苷酸位置1至1208;ATG起始密碼子的A為核苷酸1)(ERG20),該基因組基因座包含趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL),以及//MG7的截短ORF(/W/G7核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通過將DNA片段TRPl-856至+548插入TOPOTApCR2.1克隆載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)生成載體pAM466,該DNA片段TRPl-856至+548包含從核苷酸位置-856延伸至位置548的釀酒酵母野生型TRP1基因座的片段，并在堿基-226和-225之間帶有非天然內(nèi)部Xma/限制性酶切位點(diǎn)。參照表1的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR和TRPr856至+548。為構(gòu)建pAM489，使用Z附a/限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA)將400ng的pAM471和100ng的pAM466消化完全，將對(duì)應(yīng)于ERG20-PGAL-tHMGR插入片段和線性化的pAM466載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入片段和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM489(參見圖5A的圖譜，以及ERG20-PGAL-tHMGR插入片段的核苷酸序列SEQIDNO:3)。XT-，n'^^^"^T^1Fif'■■;PCR循環(huán)模板引物1引物2PCR產(chǎn)物100ng的Y051基因組DNA,!DNO均(SEO腦O:3$>微，w66W-CP酬-G卿JU船闊6，'6'C,'G(SK)翻O'夠-225i十548測100ng藥EG123基閨'組DNA《s,r》歐s外鵬,o,,磨100ng的Y002基因組DNA61-67CP,-G麵頓:100ngS莓'lt1TRPr536至-226和TRPl—22"+548純化PCR產(chǎn)物,[DKO-3"、""'"■"里"''"fc'"'"《SE々位NO,3靠〗--856至+548T國PCR產(chǎn)物.《.(T,S*Gl鄉(xiāng)！DNO:59》3l加一1i""""吝f"苺""矛中'■麗2靜下-tHMGR純化PCR產(chǎn)物鵬1D船卿IDNO60)通過將載體pAM472的ERG13-PGAL-tHMGR插入片段插入載體pAM467生成質(zhì)粒pAM491。通過將DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR插入TOPOZeroBluntII克隆載體的Ima/限制性酶切位點(diǎn)生成載體pAM472，該DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR包含ERG13的ORF(ERG13核苷酸位置1至1626)(ERG13),該基因組基因座包含趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PgaO,以及/ZMG/的截短ORF(/fMG/核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通過將DNA片段URA3-723至701插入TOPOTApCR2.1克隆載體生成載體pAM467，該DNA片段URA3-"至701包含從核苷酸位置-723延伸至位置-224的釀酒酵母野生型URA3基因座片段，并在石威基-224和-223之間帶有非天然內(nèi)部Iwa/限制性酶切位點(diǎn)。參照表2的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG13-PGAL-tHMGR和URA3723至701。為構(gòu)建pAM491，使用Xwa/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM472和100ng的pAM467消化完全，將對(duì)應(yīng)于ERG13-PGAL-tHMGR插入片段和線性化的pAM467載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入片段和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM491(參見圖5B的圖譜，以及ERG13-PcAL-tHMGR插入片段的核苷酸序列SEQIDNO:4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>灘通過將載體pAM473的IDIl-PGAL-tHMGR插入片段插入載體pAM468生成質(zhì)粒pAM493。通過將DNA片段IDIl-PGAL-tHMGR插入TOPOZeroBluntII克隆載體生成載體pAM473，該DNA片段IDIl-PGAL-tHMGR包含IDI1的ORF(IDIl核普酸位置1至1017)(IDI1)，該基因組基因座包含趨異進(jìn)化GALl和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及//MG/的截短ORF(//7WG/核普酸位置1586至3323)(tHMGR)。通過將DNA片段ADEl—825至653插入TOPOTApCR2,1克隆載體生成載體pAM468，該DNA片段ADEl-825至653包含從核苷酸位置-225延伸至位置653的釀酒酵母野生型ADE1基因座的片段，并在堿基-226和-225之間帶有非天然內(nèi)部Xma/限制性酶切位點(diǎn)。參照表3的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段IDIl-PcAL-tHMGR和ADEl—825￡653。為構(gòu)建pAM493，使用Zwa/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM473和100ng的pAM468消化完全，將對(duì)應(yīng)于IDIl-PGAL-tHMGR插入片段和線性化的pAM468載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入片段和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM493(參見圖5C的圖譜，以及IDI1-PGAL-tHMGR插入片段的核苦酸序列SEQIDNO:5)。表3:二:"生'成"PSM將3'…的'"rcF擴(kuò)增""一'<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>通過將載體pAM474的ERG10-PGAL-ERG12插入片段插入載體pAM469生成質(zhì)粒pAM495。通過將DNA片段ERG10-PGAL-ERG12插入TOPOZeroBluntII克隆載體生成載體pAM474，該DNA片段ERG8-PGAL-ERG12包含ERG10的ORF(ERG10核苷酸位置1至1347)(ERG10)，該基因組基因座包含趨異進(jìn)化GALl和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及ERG12的ORF(ERG12核芬酸位置1至1482)(ERG12)。通過將DNA片段HIS3-32至-咖0-HISMX-HIS3504至-no3插入TOPOTApCR2.1克隆載體生成載體pAM469，該DNA片段HIS3-32t|000-HISMX-fflS3504至-1103包含從核苷酸位置-32延伸至位置-1000的釀酒酵母野生型HIS基因座，HISMX標(biāo)記，并在HIS3504至-1103序列和該HISMX標(biāo)記之間帶有非天然Zma/限制性酶切位點(diǎn)。參照表4的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG10-PGAL-ERG12和HIS3-32至-1W)()-HISMX-HIS35()4t11()3。為構(gòu)建pAM495,使用I附a/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM474和100ng的pAM469消化完全，將對(duì)應(yīng)于ERG10-PGAL-ERG12插入片段和線性化的pAM469載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入片段和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM495(參見圖5D的圖譜，以及ERG10-Pgal-ERG12插入片段的核苷酸序列SEQIDNO:6)。100ng的每種HIS350"1和HISMXPCR純化產(chǎn)物P(5AL純化PCR產(chǎn)物HISMX-HIS35(I4L|m3純化D廣D立仏100ng的每種ERG10-PGAL和ERG12純化PCR產(chǎn)物.....................................................''卿翻o:竭'〖SEQ腦徹夠《s閨ijno:《歸504至-no多HISj504至-1103^WlAM330'""中wms簡X"稱記'來.窗T"pra6Fms'wxCT^m'ETr—-;wfrppgfr#>^^erfiTEymg"Mkmh-IkduiaL26(SUfl^JIQfelM)所tf.■........................................................■■■■■■■■■■■■■:一"w二^^_通過將載體pAM475的ERG8-PGAL-ERG19插入片段插入載體pAM470生成質(zhì)粒pAM497。通過將DNA片段ERG8-PGAL-ERG19插入TOPOZeroBluntII克隆載體生成載體pAM475，該DNA片段ERG8-PGAL-ERG19包含ERG8的ORF(ERG8核香酸位置1至1512)(ERG8),該基因組基因座包含趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PGAL)，以及ERG19的ORF(ERG19核苦酸位置1至1341)(ERG19)。通過將DNA片段LEU2-咖至450-HISMX-LEU21096至1770插入TOPOTApCR2.1克隆載體生成載體pAM470，該DNA片段LEU2-歸至450-HISMX-LEU2川96至1770包含從核苷酸位置-100延伸至位置450和從核苷酸位置1096延伸至位置1770的釀酒酵母野生型LEU2基因座的兩個(gè)片段，HISMX標(biāo)記，以及在LEU2,",序列和該fflSMX標(biāo)記之間帶有非天然Ima/限制性酶切位點(diǎn)。參照表5的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG8畫Pgal-ERG19和LEU2"00"50-HISMX-LEU21096至1770。為構(gòu)建pAM497,使用限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM475和100ng的pAM470消化完全，純化對(duì)應(yīng)于ERG8-PGAL-ERG19插入片段和線性化的pAM470載體的DNA片段，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入片段和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM497(參見圖5E的圖譜，以及ERG8-PGAL-ERG19插入片段的核苷酸序列SEQIDNO:7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實(shí)施例5本實(shí)施例描述了編碼轉(zhuǎn)化GPP的酶的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法。通過將編碼a-蒎烯合成酶("APS")的核苷酸序列插入pTrc99A載體生成表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-APS。該核苷酸序列插入片段可采用針對(duì)大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的火炬松a-蒎烯合成酶基因(GenBank錄入號(hào)AF543530REGION:1..1887)的編碼序列作為模板合成生成(SEQIDNo:8)。該核苷酸序列側(cè)翼連接前導(dǎo)Xwa/限制性酶切位點(diǎn)和末端^YZ)a/限制性酶切位點(diǎn)。該合成的核酸被克隆進(jìn)入克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源載體)的相容限制性酶切位點(diǎn)，使用^>a/和ZmG/限制性內(nèi)切酶將該DNA合成構(gòu)建體消化完全以再次從該位點(diǎn)釋放該核酸序列，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約1.9kb萜烯合成酶編碼DNA片段。將分離的DNA片段連接至載體pTrc99A的Zma/la/限制性酶切位點(diǎn)(Amman等人，Gene40:183-190(1985))，以獲得表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-APS(參見圖6的質(zhì)粒圖譜)。分別通過將編碼(3-蒎烯合成酶("BPS")、蒈烯合成酶("CS")或檜寧(sabinine)合成酶("SS")的核苷酸序列插入pTrc99A載體來生成表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-BPS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS。該核普酸序列插入片段可采用，例如，青蒿素卩-蒗烯合成酶的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF276072REGION:1..1749)、Salviastenophylla的蒈烯合成酶基因的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF527416REGION:78..1871)、或是鼠尾草的檜寧合成酶的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF051901REGION:26..1798)作為模板合成生成。編碼P-蒗烯和檜寧合成酶的核普酸序列側(cè)翼連4妾前導(dǎo)^m/限制性酶切^:點(diǎn)和末端16"/限制性酶切卩立點(diǎn)，而編碼蒈烯合成酶的核苷酸序列側(cè)翼連接前導(dǎo)7Vco/限制性酶切位點(diǎn)和末端Zwa/限制性酶切位點(diǎn)。采用JT附fl/和力a/限制性內(nèi)切酶將該(3-蒗烯和檜寧合成酶DNA合成構(gòu)建體消化完全，并采用Wco/和Xma/限制性內(nèi)切酶將該蒈烯合成酶DNA合成構(gòu)建體消化完全。通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約1.7至1.8kbDNA片段，然后將分離的DNA片段連接至pTrc99A載體的Zwa/力a/限制性酶切位點(diǎn)(針對(duì)(3-蒗烯和檜寧合成酶插入片段)或2Vco/Zma/限制性酶切位點(diǎn)(針對(duì)蒈烯合成酶插入片段)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-BPS、pTrc99A-CS或pTrc99A-SS(參見圖6的質(zhì)粒圖譜)。可通過將連接趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(pgal)的編碼a-蒗烯合成酶("APS")、(3-蒗烯合成酶("BPS")、蒈烯合成酶("CS")、或檜寧合成酶("SS")的核苷酸序列分別插入載體pRS425-leu2d以得到表達(dá)質(zhì)粒pRS425-leu2d-APS、pRS425匿leu2d陽BPS、pRS425-leu2d-CS以及pRS425-leu2d-SS。載體pRS425-leu2d可通過如下方式生成采用引物PW-91-079畫CPK373誦G(SEQIDNO:87)和PW-79-079-CPK374-G(SEQIDNO:88)PCR擴(kuò)增pAM178的leu2基因(SEQIDNO:10)，采用PW-91-079-CPK376-G(SEQIDNO:89)和PW陽79-079畫CPK375-G(SEQIDNO:90)PCR擴(kuò)增pRS425載體的骨架(GenBank錄入號(hào)U03452),通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約1.6kbleu2基因片段和約4.6kbpRS425載體骨架，以T4激酶處理該DNA片段，以加入末端磷酸基團(tuán)，并連接這兩個(gè)DNA片段。該核苷酸序列插入片段可采用，例如火炬松的a-蒗烯合成酶的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF543530REGION:1..1887)、青蒿素的(3-蒗烯合成酶基因的編碼序歹寸(GenBank錄入號(hào)AF276072REGION:1..1749)、Salviastenophylla的蒈烯合成酶基因的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF527416REGION:78..1871)或是鼠尾草的4會(huì)寧合成酶的編碼序列(GenBank錄入號(hào)AF051901REGION:26..1798)作為模板合成生成，上述每一個(gè)編碼序列均連接了趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動(dòng)子(GAL1核苷酸位置-1至-668)(PgaO，該核苷酸序列均有平頭末端，因此可被克隆進(jìn)入克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源載體)的相容限制性酶切位點(diǎn)。合成生成的pgal-薛烯合成酶序列可通過如下方式分離，使用Sma/限制性內(nèi)切酶將該DNA合成構(gòu)建體消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約2.5kb至2.6kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至載體pRS425-leu2d的Sma/限制性酶切位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pRS425畫leu2d隱APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d畫CS或pRS425-leu2d-SS(見圖7的質(zhì)粒圖譜)。實(shí)施例6本實(shí)施例描述了可用于本發(fā)明的大腸桿菌宿主菌林的生成。如表6所述，通過實(shí)施例1至3和實(shí)施例5的一種或多種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌親代細(xì)胞以生成宿主菌抹。表6大腸桿菌宿主菌林<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>在含有抗生素的LuriaBertoni(LB)瓊脂上選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單克隆從LB瓊脂轉(zhuǎn)移至含有5mL的LB液體培養(yǎng)基和抗生素的培養(yǎng)管中。在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于37。C下孵育培養(yǎng)物，直至生長至指數(shù)期。通過將細(xì)胞在含有0.8%葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培養(yǎng)基(M9-MOPS培養(yǎng)基的組分可參見表7)中連續(xù)傳代4至5代，使細(xì)胞適應(yīng)最小培養(yǎng)基。將細(xì)胞以由400(iL無菌50%甘油和600jxL液體培養(yǎng)基組成的1mL儲(chǔ)存液儲(chǔ)存在-80。C下的冷凍小瓶中。表7M9-IV10PS培養(yǎng)基的組成成分?jǐn)?shù)量海升)幽!國47瞎fMb'....js...—-N錢CI0，g1s--..M晶2m":'.0.1n隱'!硫胺素,彥oTOm州203.7LyH》BO*25%、一7,〗y(tǒng)CuSO,2,4ug旨UJ2.9ugFC—"實(shí)施例7本實(shí)施例描述了可用于本發(fā)明的釀酒酵母菌抹的生成?？赏ㄟ^以釀酒酵母7kffiTJ啟動(dòng)子替換五iG9啟動(dòng)子，并以光滑念珠菌基因(CgLEU2)替換JZ^/ORF來制備釀酒酵母菌抹CEN.PK2-1C(Y002)(MATA;ura3陽52;trpl-289;leu2-3,112;his3八l;MAL2-8C;SUC2)和CEN.PK2-1D(Y003)(MATa;um3畫52;trp1-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2畫8C;SUC2)(vanDijken等人.(2000)EnzymeMicrob.Technol.26(9-10):706-714)以導(dǎo)入可誘導(dǎo)MEV途徑基因。這可通過以引物50-56-pwlOO-G(SEQIDNO:85)和50-56-pwlOl-G(SEQIDNO:86)PCR擴(kuò)增載體pAM328的KanMX-PMET3區(qū)(SEQIDNO:9)(其包含與天然ERG9啟動(dòng)子同源的45個(gè)堿基對(duì))，使用40%w/w聚乙二醇3350(Sigma畫Aldrich，St.Louis，MO)、100mM醋酸鋰(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)、以及10ug鮭魚精子DNA(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)來將10ug所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入對(duì)數(shù)生長的Y002和Y003細(xì)胞中，將該細(xì)胞在30°C下孵育30分鐘后在42°C下熱沖擊30分鐘后(Schiestl和Gietz.(1989)Curr.Genet.16，339-346)來實(shí)現(xiàn)。陽性重組體可通過其在含有0.5ug/mL遺傳霉素(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)的豐富培養(yǎng)基上生長的能力來進(jìn)行鑒定，并可通過診斷性PCR對(duì)所選的克隆進(jìn)行確認(rèn)。所得克隆命名為Y93(MATA)和Y94(MATa)。然后使用引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO:83)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO:84)從光滑念珠菌基因組DNA(ATCC，Manassas,VA)擴(kuò)增該3.5kbCgLEU2基因組基因座(其包含與ORF同源的50個(gè)堿基對(duì))，并將10ug所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入對(duì)數(shù)生長的Y93和Y94細(xì)胞，通過在沒有亮氨酸添加下生長來選擇陽性重組體，并通過診斷PCR確認(rèn)所選的克隆。所得克隆命名為Y176(MATA)和Y177(MATa)。然后通過4吏用戶me/限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化2ug的pAM491和pAM495質(zhì)粒DNA，并將該純化的DNA插入片段導(dǎo)入對(duì)數(shù)生長的Y176細(xì)胞以得到菌抹Y188。通過在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養(yǎng)基上生長來選擇陽性重組體，并通過診斷性PCR確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。然后通過使用戶me/限制性內(nèi)切酶消化2ug的pAM489和pAM497質(zhì)粒DNA，并將該純化的DNA插入片段導(dǎo)入對(duì)數(shù)生長的Y177細(xì)胞來得到菌抹Y189。通過在缺乏色氨酸和組氨酸的培養(yǎng)基上生長來選擇陽性重組體，并通過診斷性PCR確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。將來自菌抹Y188和Y189的約1X107細(xì)胞在YPD培養(yǎng)板上室溫下混合6小時(shí)以允許交配。將混合的細(xì)胞培養(yǎng)物涂覆在缺乏組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基上以選擇二倍體細(xì)胞的生長。以被尸we/限制性內(nèi)切酶完全消化的2ug的pAM493質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化該二倍體細(xì)胞，并將純化的DNA插入片段導(dǎo)入對(duì)數(shù)生長的二倍體細(xì)胞，從而形成菌抹Y238。通過在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長來選4奪陽性重組體，并通過診斷性PCR確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。單倍體菌抹Y21l(MATa)可通過如下方式生成在2%醋酸鉀和0.02%棉子糖液體培養(yǎng)基中使菌抹Y238形成孢子，采用SingerInstrumentsMSM300系列顯微操作儀(SingerInstrumentLTD,Somerset,UK)分離約200個(gè)遺傳四分體，通過在缺乏腺噪呤、組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基中生長的能力來鑒定包含誘導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的適當(dāng)補(bǔ)體的獨(dú)立遺傳分離物，并通過診斷性PCR確認(rèn)所有誘導(dǎo)的DNA的整合。最后，以表達(dá)質(zhì)粒pRS425-leu2d-APS、pRS425-leu2d-BPS、pRS425-leu2d畫CS或pRS425-leu2d-SS轉(zhuǎn)化菌抹Y211生成宿主菌株9至12。在含有2%葡萄糖和除亮氨酸外的所有氨基酸的合成的確定組分培養(yǎng)基(SM-glu)上選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至含有5mL缺乏亮氨酸的液體SM-glu的培養(yǎng)瓶中，并在30。C下振蕩孵育該培養(yǎng)物直至達(dá)到靜止期。將細(xì)胞以由400[iL無菌50%甘油和600(iL液體培養(yǎng)基組成的1mL儲(chǔ)存液儲(chǔ)存在-80t下的冷凍小瓶中。實(shí)施例8本實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中通過MEV途徑來生成a-蒎烯、(3-菜烯、蒈烯以及檜寧。將宿主菌抹l至4的等分儲(chǔ)液添加至含有25mLM9-MOPS、2。/()葡萄糖、0.5%酵母提取物、以及表6中所述的抗生素的單獨(dú)的125mL燒瓶中，并生長過夜，以形成宿主菌抹1至4的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始OD6oo接種含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物以及抗生素的單獨(dú)的250mL燒瓶。在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于30°C下孵育培養(yǎng)物直至其達(dá)到約0.2的OD6M，此時(shí)通過向培養(yǎng)基添加40uL的1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的目標(biāo)化合物的生成。該目標(biāo)化合物可通過溶劑-溶劑萃取從培養(yǎng)基中分離，或者當(dāng)該目標(biāo)化合物的滴定濃度大到足以在培養(yǎng)基中飽和并形成第二相時(shí)，可通過沉降和傾析進(jìn)行分離。實(shí)施例9本實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中通過DXP途徑來生成a-蒎烯、p-蒎烯、蒈烯以及纟會(huì)寧。將宿主菌抹5至8的等分儲(chǔ)液添加至含有25mLM9-MOPS、0.8%葡萄糖、0.5%酵母提取物、以及表6中所述的抗生素的單獨(dú)的125mL燒瓶中，并生長過夜，以形成宿主菌林5至8的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始OD6Qo接種含有40mLM9-MOPS、45ug/mL疏胺素、微量營養(yǎng)素、1.00E-5mol/LFeS04、0.1MMOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物以及抗生素的單獨(dú)的250mL燒瓶。在250rpm的加濕培養(yǎng)振蕩器上于30°C下孵育培養(yǎng)物直至其達(dá)到約0,2至0.3的OD,,此時(shí)通過向培養(yǎng)基添加40uL的1MIPTG69誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的目標(biāo)化合物的生成。該目標(biāo)化合物可通過溶劑-溶劑萃取從該培養(yǎng)基中分離，或者當(dāng)該目標(biāo)化合物的滴定濃度大到足以在培養(yǎng)基中飽和并形成第二相時(shí)，可通過沉降和傾析進(jìn)行分離。實(shí)施例10本實(shí)施例描述了在釀酒酵母宿主菌抹中a-蒗烯、P-蒎烯、蒈烯以及^f會(huì)寧的生成。將宿主菌抹9至12的等分儲(chǔ)液添加至含有缺乏亮氨酸的25mLSM-glu的單獨(dú)的125mL燒瓶中，并分別生長過夜，以形成宿主菌抹9至12的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始OD畫接種含有0.2%葡萄糖和1.8%半乳糖，缺乏亮氨酸的40mL合成的組分明確培養(yǎng)基的250mL帶擋板燒瓶。在200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于30°C下孵育培養(yǎng)物。該目標(biāo)化合物可通過溶劑-溶劑萃取從培養(yǎng)基中分離，或者當(dāng)該目標(biāo)化合物的滴定濃度大到足以在培養(yǎng)基中飽和并形成第二相時(shí)，可通過沉降和傾析進(jìn)行分離。實(shí)施例11本實(shí)施例描述將a-蒎烯氫化為蒎烷。以6g/L的量向反應(yīng)容器添加a-蒎烯和10%Pd/C[鈀，在活性炭上含10wt.%，Aldrich#205699]。將容器密封，以氮?dú)馇逑?，然后通過真空系統(tǒng)抽真空。為啟動(dòng)反應(yīng)，在攪拌該容器的同時(shí)在80psig下添加壓縮氫氣。在室溫下進(jìn)行該溫和的放熱反應(yīng)。最終的轉(zhuǎn)化為100%，這可以氬耗盡為標(biāo)志，并通過結(jié)合火焰離子化檢測的氣相色譜來進(jìn)行驗(yàn)證。該產(chǎn)物-催化劑混合物可經(jīng)60A硅膠通過重力過濾進(jìn)行分離，并以AgilentDB-XLB柱和火焰離子化檢測器來進(jìn)行分析。實(shí)施例12將包含98.7%蒎烷的燃料組合物(稱為AMJ-400)與各種量的JetA混合。AMJ-400的組分可通過氣相色譜/火焰離子化檢測器(GC/FID)進(jìn)行鑒定。各種混合物的效果符合ASTMD1655的結(jié)果顯示于表8:JetA，100%AMJ-400,50%AMJ-400和50%JetA,以及20%AMJ-400和80%JetA。圖9顯示了JetA和JetA與AMJ-400的特定混合物的蒸餾曲線本發(fā)明描述的該燃料組合物可通過具有成本效益的和環(huán)境良好的方式制備。有利的是，用于本發(fā)明的燃料組合物的該C,o二環(huán)類異戊二烯化合物可通過一種或多種微生物生成。這些Cu)二環(huán)類異戊二烯化合物從而可提供可用于柴油或噴氣燃料、特別是本發(fā)明提供的燃料組合物的可再生能源。此外，這些C1()二環(huán)類異戊二烯化合物可降低對(duì)不可再生的燃料、燃料組分和/或燃料添加劑的來源的依賴性。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含生物工程蒈烷、蒎烷和檜烷。盡管本發(fā)明已通過有限量的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，一個(gè)實(shí)施方案的具體特征不應(yīng)歸于本發(fā)明的其它實(shí)施方案。沒有一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案可代表所主張的主題的所有方面。在一些實(shí)施方案中，該組合物或方法可包括多種本發(fā)明未提及的化合物或步驟。在其它實(shí)施方案中，該組合物或方法不包括，或基本不包括，本發(fā)明未列舉的任何化合物或步驟。存在對(duì)本發(fā)明所述的實(shí)施方案的變化和改動(dòng)。應(yīng)注意，本發(fā)明公開的該噴氣燃料組合物的應(yīng)用不限于噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)；它可用于任何需要噴氣燃料的裝備。盡管對(duì)于多數(shù)噴氣燃料存在規(guī)范，并非本發(fā)明公開的所有噴氣燃料組合物均需要滿足這些規(guī)范的所有要求。應(yīng)注意，本發(fā)明公開的制備和使用該噴氣燃料的方法涉及多個(gè)步驟。這些步驟可以任何順序?qū)嵤??？墒÷曰蚝喜⒁粋€(gè)或多個(gè)步驟，但依然實(shí)現(xiàn)基本相同的結(jié)果。所附的權(quán)利要求書意在覆蓋所有落入本發(fā)明范圍的該種變化和改動(dòng)o本說明書中所涉及的所有出版物和專利申請(qǐng)均作為參考引入本文，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物和專利申請(qǐng)均為特定的單獨(dú)的作為參考引入本文一樣。盡管為了清楚理解的目的，前述發(fā)明已通過圖示和范例進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)能夠容易地理解可在不背離所加權(quán)利要求的主旨和范圍的情況下對(duì)其進(jìn)行一定的更改和調(diào)整。本發(fā)明描述的該燃料組合物可通過具有成本效益的和環(huán)境良好的方式制備。有利的是，用于本發(fā)明的燃料組合物的該Qo二環(huán)類異戊二烯化合物可通過一種或多種徵生物生成。這些Cn)二環(huán)類異戊二烯化合物從而可以々是供了可用于柴油或噴氣燃料、特別是本發(fā)明4是供的燃料組合物的可再生能源。此外，這些C,o二環(huán)類異戊二烯化合物可降低對(duì)不可再生的燃料、燃料組分和/或燃料添加劑的來源的依賴性。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含生物工程蒈烷、蒎烷和檜烷。盡管本發(fā)明已通過有限數(shù)量的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，一個(gè)實(shí)施方案的具體特征不應(yīng)歸于本發(fā)明的其它實(shí)施方案。沒有一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案可代表所主張的主題的所有方面。在一些實(shí)施方案中，該組合物或方法可包括多種本發(fā)明未提及的化合物或步驟。在其它實(shí)施方案中，該組合物或方法不包括，或基本不包括，本發(fā)明未列舉的任何化合物或步驟。存在對(duì)本發(fā)明所述的實(shí)施方案的變化和改動(dòng)。應(yīng)注意，本發(fā)明公開的該噴氣燃料組合物的應(yīng)用不限于噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)；它可用于任何需要噴氣燃料的裝備。盡管對(duì)于多數(shù)噴氣燃料存在規(guī)范，并非本發(fā)明公開的所有噴氣燃料組合物均需要滿足這些規(guī)范的所有要求。應(yīng)注意，本發(fā)明公開的制備和使用該噴氣燃料的方法涉及多個(gè)步驟。這些步驟可以任何順序?qū)嵤??？墒÷曰蚝喜⒁粋€(gè)或多個(gè)步驟，但依然實(shí)現(xiàn)基本相同的結(jié)果。所附的權(quán)利要求書意在覆蓋所有落入本發(fā)明范圍的該種變化和改動(dòng)。本說明書中所涉及的所有出版物和專利申請(qǐng)均作為參考引入本文，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物和專利申請(qǐng)均為特定的單獨(dú)的作為參考引入本文中一樣。盡管為了清楚理解的目的，前述發(fā)明已通過圖示和范例進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)能夠容易理解可在不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍的情況下對(duì)其進(jìn)行一定的更改和調(diào)整。序列表SEQIDNO:lMevT66啟動(dòng)子(5，至3')GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGATCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGCCAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTCAAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAAGAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGCGCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCCAGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTGACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGCAGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGATGGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTGCAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGGCGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTGAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCTGGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAACACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAAGACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACGCAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTAAGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGAGGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACAACATCGACACGAATAAGATCGGTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGATTGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACGCACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGATGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGTCCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAATTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACCTGCTATGTGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGATTTCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCTGAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCAAATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTCCCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCGACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGAGCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACCGCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGACCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCCAGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGCTGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTACGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAGCCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACATTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGGAAAACATCATGGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGCAAGGTGAAGTCTCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAGCGAGGAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGATCCGCCCGCTGGAGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACACCAAGCAGCTGAAGAACAAGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGGTAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGAAAAGAAACTGGGCGATACGACGCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGCAAAGCCTTAAGCATCTTAGCGGAGGCCCCGGTGTTAGCCAGCGACCGCCTGCCGTACAAGAACTACGACTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTACATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCACGAGCTATCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGCCAGCGCCATGCGTGGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGCGACGACCGTGTTAACCAAGGATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGGCGCGTGTAAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAAGCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCTGGCCGGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCGATGGGCATGAACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAACAAATGGTGGAAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCTGTGAGCGGCAACTATTGCACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAACTGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGCGTCGTGGCAGAAGCGACCATCCCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGAGCGACGTCAGCGCCCTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAGCGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTT76ACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAGCAGCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCTGCGCATCAGCGTTTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTGGGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGCCCCAGGCACCAATGCCCGCCAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGGCGGGTGAGCTGAGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCTCACATGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACCTGGACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGTGCATTAAAAGCTGAGCATGCTACTAAGCTTSE(JIDNO:2擬南芥的香葉基二磷酸合成酶，針對(duì)大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，且其側(cè)翼連接Notl和Sacl酶切位點(diǎn)(5，至3，)GCGGCCGCGGAAAAGGAGGCCGGCCGGCATGCTGCTGTCTAATAAACTGCGTGAAATGGTTCTGGCTGAAGTACCTAAACTGGCCTCCGCAGCAGAATATTTCTTCAAGCGTGGCGTTCAGGGCAAACAGTTCCGTAGCACCATCCTGCTGCTGATGGCTACCGCCCTGGACGTGCGTGTCCCGGAAGCCCTGATCGGCGAATCCACCGACATCGTGACCTCTGAACTGCGTGTTCGTCAGCGTGGTATCGCGGAAATCACCGAAATGATCCACGTTGCGTCTCTGCTGCACGACGATGTGCTGGACGATGCAGACACCCGTCGTGGTGTTGGTTCCCTGAACGTGGTGATGGGTAACAAAATGAGCGTGCTGGCAGGCGACTTTCTGCTGTCTCGCGCCTGTGGTGCTCTGGCTGCGCTGAAGAACACCGAGGTAGTGGCACTGCTGGCGACTGCCGTAGAGCACCTGGTTACCGGCGAAACGATGGAAATTACTTCTTCCACCGAACAGCGTTACTCCATGGACTACTACATGCAGAAGACTTACTATAAAACCGCGTCCCTGATTAGCAACTCTTGTAAAGCAGTAGCAGTACTGACTGGCCAAACTGCAGAAGTAGCGGTGCTGGCTTTCGAGTACGGTCGTAACCTGGGTCTGGCTTTCCAGCTGATCGATGACATCCTGGACTTTACTGGTACCAGCGCAAGCCTGGGTAAAGGTTCCCTGTCTGACATTCGTCACGGCGTTATCACCGCTCCGATTCTGTTCGCGATGGAAGAATTCCCGCAGCTGCGTGAAGTTGTTGACCAGGTTGAAAAAGACCCGCGTAACGTCGATATCGCACTGGAATACCTGGGCAAATCCAAAGGTATCCAACGCGCGCGTGAACTGGCTATGGAGCACGCCAACCTGGCAGCAGCAGCAATTGGCTCTCTGCCGGAAACCGACAACGAAGATGTTAAACGCAGCCGTCGTGCACTGATCGACCTGACTCATCGTGTAATCACCCGCAACAAATAAGATTGAGTGATGTTCCTGAGCATCCACCAGAACATTCCGCACTTTATCTGTCGTATTCTGCTGGTGCAATTCGTAAGCCGCTGATAATAGGAGCTCSEQIDNO:3pAM489的ERG20-PGAL-tHMGR插入物(5，至3，)GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAGTGCTTGCATTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAGCAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTATATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTTTTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTTGAAGGAACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCTTTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGGATTGCTGGCCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCTGAAAACGGAAGAGGAGTAGGGAATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATGAACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTATAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGATATTCCTTATGGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCAC78GAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAGAGAGATTCTTGAACGTTTTCCCTAAATTAGTAGAGGAATTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTATGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGTCCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGGCAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGCAGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGG80ACAAGTCCATTACCAGAAGAGGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATGACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGAAACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCAAACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTCGACTTGAGTAAGTTCTCCCTAAAGAAGCACTCCTTCATAGTTACTTTCAAGACTGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTATCACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGTGAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACAGATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATCAACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAAATTACGGTAAGAAGGACTCAGTCGCAGAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAATGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAGGATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGATGTCTTAACTGCGTTCTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAGAACTAACGCTAATCGATAAAACATTAGATTTCAAACTAGATAAGGACCATGTATAAGAACTATATACTTCCAATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGATCTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAAAAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCCGATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCATTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCTTGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCTGACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGGTTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGGC81ACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTTTGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAGTCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGTATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATTCGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGATTGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTACATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGACGCCGTTTAAACSEQIDNO:4pAM491的ERG13國PcAL畫tHMGR插入物(5，至3，)GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCATTTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGGGAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTGTAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACAATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAGATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTAATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAAAGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATAAATGCTTTATTTTTTTGGCAGCCTGCTTTTTTTAGCTCTCATTTAATAGAGTAGTTTTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTTATTTAATAACAATGATATATATATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCCGGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAA8TATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAACSEQIDNO:5pAM493的IDIl-PGAL-tHMGR插入物(5，至3，)GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGAATTGAAGGGCGAACTCTTATTCGAAGTCGGAGTCACCACAACACTTCCGCCCATACTCTCCGAATCCTCGTTTCCTAAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTATTAATGATATCTGAATAATCCTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTAGCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGCCCGACGTCGACGTGATTAGCGAAGGCGCGTAACCATTGTCATGTCTAGCAGCTATAGAACTAACCTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTTCCTTATTACTCATTCTCTTACCAAGCAGAGAATGTTATCTAAAAACTACGTGTATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTACTACCACAGCCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAGCAGAAAACACAACCAGCGTACCCCTGTAGAAGCTTCTTTGTTTACAGCACTTGATCCATGTAGCCATACTCGAAATTTCAACTCATCTGAAA86CTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTTACGCCAAATTAGTGCAAAACCAAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCCTGAAATTATTCCATTACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCAAATGACGAAAGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTAAGT88TAATGAATGAAAATTGTATTGTTTTGGATTGGGACGATAATGCTATTGGTGCCGGTACCAAGAAAGTTTGTCATTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTACTACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATTTTCAATGAACAAGGTGAATTACTTTTACAACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTCCCTGATCTTTGGACTAACACATGCTGCTCTCATCCACTATGTATTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGAATTAGGTATTCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTAAACAGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATGAAATTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTGACTGTCAACCCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTCAAATGGGTTTCACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGATTATTTGCGAGAATTACTTATTCAACTGGTGGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGTGGAAAATGACAGGCAAATTCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATAGGCTACATAAAAATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAAACGTTTCATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGTAATATGTAAACTTTATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGAGAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATCTAATACATATAGACATACATATATATATATATACATTCTATATATTCTTACCCAGATTCTTTGAGGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCGAATCATAAGCATTGCTTACAAAGAATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCAATTACGAAGACTGAACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAGTTAGAGACATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGATCGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGATCCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCTGTCCAACGATGTTCGTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAGACTATTTTCGATTATCTACCTGCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACAAAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTATTGGTTCACAAACATAAACTAATTCCATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATCACCGGATCTGCTTGGAAAGAGTACGTAAAAACAGGTACTGTGCATGGTTTGAAACAACCTCAAGGACTTAAAGAATCTCAAGAGTTCCCAGAACCAATCTTCACCCCATCGACCAAGGCTGAACAAGGTGAACATGACGAAAACATCTCTCCTGCCCAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCACGTAGAGTGGCAGAACTGGCTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATGCTAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAACSE(JIDNO:6pAM495的ERG10-PGAL-ERG12插入物(5，至3，)GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCATCCAGATATAACCCGAGAGGAAACTTCTTAGCGTCTGTTTTCGTACCATAAGGCAGTTCATGAGGTATATTTTCGTTATTGAAGCCCAGCTCGTGAATGCTTAATGCTGCTGAACTGGTGTCCATGTCGCCTAGGTACGCAATCTCCACAGGCTGCAAAGGTTTTGTCTCAAGAGCAATGTTATTGTGCACCCCGTAATTGGTCAACAAGTTTAATCTGTGCTTGTCCACCAGCTCTGTCGTAACCTTCAGTTCATCGACTATCTGAAGAAATTTACTAGGAATAGTGCCATGGTACAGCAACCGAGAATGGCAATTTCTACTCGGGTTCAGCAACGCTGCATAAACGCTGTTGGTGCCGTAGACATATTCGAAGATAGGATTATCATTCATAAGTTTCAGAGCAATGTCCTTATTCTGGAACTTGGATTTATGGCTCTTTTGGTTTAATTTCGCCTGATTCTTGATCTCCTTTAGCTTCTCGACGTGGGCCTTTTTCTTGCCATATGGATCCGCTGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTTCCTTTTAAACCACGACGCTTTGTCTTCATTCAACGTTTCCCATTGTTTTTTTCTACTATTGCTTTGCTGTGGGAAAAACTTATCGAAAGATGACGACTTTTTCTTAATTCTCGTTTTAAGAGCTTGGTGAGCGCTAGGAGTCACTGCCAGGTATCGTTTGAACACGGCATTAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCCTTTCCCGCAATTTTCTTTTTCTATTACTCTTGGCCTCCTCTAGTACACTCTATATTTTTTTATGCCTCGGTAATGATTTTCATTTTTTTTTTTTCCACCTAGCGGATGACTCTTTTTTTTTCTTAGCGATTGGCATTATCACATAATGAATTATACATTATATAAAGTAATGTGATTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTT91CGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATTCTGTCTTCGAAAGCTGAATTGATACTACGAAAAATTTTTTTTTGTTTCTCTTTCTATCTTTATTACATAAAACTTCATACACAGTTAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGTCAATTTGTTGCTTTGTGGTAGTTTTATTTTCAAATAATTGGAATACTAGGGATTTGATTTTAAGATCTTTATTCAAATTTTTTGCGCTTAACAAACAGCAGCCAGTCCCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAAAATCATCTTGCAATTTCTTTTTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTAATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGAGCAACCGCCGCCACCAGCACCGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCATCGCTCAGATTTTTAATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGACAAGCAGTCCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATTATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACTTAGTCATGATCTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTCACCCATGGCATCTAGAATTGGCTTCATAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACACGAACGCGAGCAACAAGATCTTTTGTAGACCTTGGAATTCTAGTATAGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGAAATCATCTAAGAACTTAAAATTGTTTGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAGTCTTTTTCAAATAGCAGGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAAGGGGTACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATATGCTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAACCCCCCCAAGTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGAGGCGCTTGAGCCCAACCCAGCACCGATGGGTAAAGTAGACTTTAAAGAAAACTTAATATTCTTGGCATGGGGGCATAGGCAAACAAACATATACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGTGGAAGGATTCGGATAGTTGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTCCTGAGACAAGCCATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGGCCAATTTTTGGGAGTTTACTTGATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTAAAGCTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATGACTCGCTTATTAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGCGACGGCAGGCTTGTTGTACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCCCAATTGGTTCATTCCAGGGTTCTCTATCCTCCAAGACAGCAGTGGAATTGGGTGCTGTTGCTTTAAAAGGCGCCTTGGCTAAGGTTCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATTATTTTTGGTAACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGTTGCTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAACAAGGTCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAATCCATCAAATGTGGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTGAATCTATGACTAACGCACCATACTACATGCCAGCAGCCCGTGCGGGTGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTGTTGATGGTGTCGAAAGAGATGGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCATGGGTGTACACGCAGAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAACAAGACAATTTTGCCATCGAATCCTACCAAAAATCTCAAAAATCTCAAAAGGAAGGTAAATTCGACAATGAAATTGTACCTGTTACCATTAAGGGATTTAGAGGTAAGCCTGATACTCAAGTCACGAAGGACGAGGAACCTGCTAGATTACACGTTGAAAAATTGAGATCTGCAAGGACTGTTTTCCAAAAAGAAAACGGTACTGTTACTGCCGCTAACGCTTCTCCAATCAACGATGGTGCTGCAGCCGTCATCTTGGTTTCCGAAAAAGTTTTGAAGGAAAAGAATTTGAAGCCTTTGGCTATTATCAAAGGTTGGGGTGAGGCCGCTCATCAACCAGCTGATTTTACATGGGCTCCATCTCTTGCAGTTCCAAAGGCTTTGAAACATGCTGGCATCGAAGACATCAATTCTGTTGATTACTTTGAATTCAATGAAGCCTTTTCGGTTGTCGGTTTGGTGAACACTAAGATTTTGAAGCTAGACCCATCTAAGGTTAATGTATATGGTGGTGCTGTTGCTCTAGGTCACCCATTGGGTTGTTCTGGTGCTAGAGTGGTTGTTACACTGCTATCCATCTTACAGCAAGAAGGAGGTAAGATCGGTGTTGCCGCCATTTGTAATGGTGGTGGTGGTGCTTCCTCTATTGTCATTGAAAAGATATGATTACGTTCTGCGATTTTCTCATGATCTTTTTCATAAAATACATAAATATATAAATGGCTTTATGTATAACAGGCATAATTTAAAGTTTTATTTGCGATTCATCGTTTTTCAGGTACTCAAACGCTGAGGTGTGCCTTTTGACTTACTTTTCCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCACGTTGATTGTCTGCGAGGCAAGAATGATCATCACCGTAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTCTTGCGGTTGCCATAAGAGAAGCCACCTCGCCCAATGGTACCAACGATGTTCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGTGACACCGATTATTTAAAGCTGCAGCATACGATATATATACATGTGTATATATGTATACCTATGAATGTCAGTAAGTATGTATACGAACAGTATGATACTGAAGATGACAAGGTAATGCATCATTCTATACGTGTCATTCTGAACGAGGCGCGCTTTCCTTTTTTCTTTTTGCTTTTTCTTTTTTTTTCTCTTGAACTCGAGAAAAAAAATATAAAAGAGATGG94AGGAACGGGAAAAAGTTAGTTGTGGTGATAGGTGGCAAGTGGTATTCCGTAAGAACAACAAGAAAAGCATTTCATATTATGGCTGAACTGAGCGAACAAGTGCAAAATTTAAGCATCAACGACAACAACGAGAATGGTTATGTTCCTCCTCACTTAAGAGGAAAACCAAGAAGTGCCAGAAATAACAGTAGCAACTACAATAACAACAACGGCGGCGTTTAAACSEQIDNO:7pAM497的ERG8-PGAL-ERG19插入物(5，至3，)GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTTACCTTTTACATTTCAGCAATATATATATATATATTTCAAGGATATACCATTCTAATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCCAGGTGACCACGTTGGTCAAGAAATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTTCTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCAATGTCAAGTTCGATTTCGAAAATCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCTACAGGTGTTCCACTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGGCTGATGCCGTTTTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTAGACCTGAACAAGGTTTACTAAAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTACGCCAACTTAAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGACTTATCTCCAATCAAGCCACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTGTTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGTATTTACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAACTGCTGTTAAAATTAAGATATTTATAAATTGAAGCTTGGTCGTTCCGACCAATACCGTAGGGAAACGTAAATTAGCTATTGTAAAAAAAGGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAATGTTACATATCGAATTGATCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCGTCAATCAAAGATTCGTTTGTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTGGCAACATCCTTTTGCAACTCAAGATCCAATTCACGTGCAGTAAAGTTAGATGATTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAATTTCTTGTCCCATCCAGGAACAGAGCCAAACAATTTATAGATAAATGCAAAGAGTTTCGACTCATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATT96TGATTAATGGTGTGGCACCAACTGATGATACGCTTGGAAGTGTCATTCATGTAGAATATTGGAGGGAAAGAGTCCAAACATGTGGCATGGAAAGAGTTGGAATCCATCATTGTTTCCTTTGCAAAGGTGGCGAAATCTTTTTCAACAATGGCTTTACGCATGACTTCAAATCTCTTTGGTACGACATGTTCAATTCTTTCTTTAAATAGTTCGGAGGTTGCCACGGTCAATTGCATACCCTGAGTGGAACTCACATCCTTTTTAATATCGCTGACAACTAGGACACAAGCTTTCATCTGAGGCCAGTCAGAGCTGTCTGCGATTTGTACTGCCATGGAATCATGACCATCTTCAGCTTTTCCCATTTCCCAGGCCACGTATCCGCCAAACAACGATCTACAAGCTGAACCAGACCCCTTTCTTGCTATTCTAGATATTTCTGAAGTTGACTGTGGTAATTGGTATAACTTAGCAATTGCAGAGACCAATGCAGCAAAGCCAGCAGCGGAGGAAGCTAAACCAGCTGCTGTAGGAAAGTTATTTTCGGAGACAATGTGGAGTTTCCATTGAGATAATGTGGGCAATGAGGCGTCCTTCGATTCCATTTCCTTTCTTAATTGGCGTAGGTCGCGCAGACAATTTTGAGTTCTTTCATTGTCGATGCTGTGTGGTTCTCCATTTAACCACAAAGTGTCGCGTTCAAACTCAGGTGCAGTAGCCGCAGAGGTCAACGTTCTGAGGTCATCTTGCGATAAAGTCACTGATATGGACGAATTGGTGGGCAGATTCAACTTCGTGTCCCTTTTCCCCCAATACTTAAGGGTTGCGATGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCCCCAGGGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATCCGAAATATGAAGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACGGTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTTAAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAACTGGCTTCATTCCTGTTTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTATTTAGCTACTTTAAGCCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTTATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGAACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTTCCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGCTTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAGAAGTTATTCATAATTTATCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATTGGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAAGATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTACGGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTAAAAGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTAAGAATGGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGCATATGCCGGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAGATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATTACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAAGTATCCTGAGATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCTTTAGAAAAA98TAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAACTAGCTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTAATACCTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTGCTAAGCAAGATGTTGATCTTAGGGCTCAAACCGCTGATGACAAAAGATTTTCTAAGGTTCAATGGCTGGATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAGGAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTATCTTGATAAATAACTTAAGGTAGATAATAGTGGTCCATGTGACATCTTTATAAATGTGAAGTTTGAAGTGACCGCGCTTAACATCTAACCATTCATCTTCCGATAGTACTTGAAATTGTTCCTTTCGGCGGCATGATAAAATTCTTTTAATGGGTACAAGCTACCCGGGCCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACATAAACTTTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATGGAATATGTTCATAGGGTAGACGAAACTATATACGCAATCTACATACATTTATCAAGAAGGAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACAGGTAAGCAAATTGATACTAATGGCTCAACGTGATAAGGAAAAAGAATTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGAGGAGGGCACCACACAAAAAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAAACTATGATTCCTAATTTATATATTGGAGGATTTTCTCTAAAAAAAAAAAAATACAACAAATAAAAAACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTTCTTGAACCATTTCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAAACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTCAGTACTAAATCTACCAATACCAAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATCATCCTTACCCAGCGCATGTAAAACATAAGAAGGTTCTAGGGAAGCAGATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATGCGATATCCCTTAGTGCCATCAATAAAGATTCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAAACGTTAACACGTTTAAACSE(JIDNO:8火炬松a-蒎烯合成酶，針對(duì)大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，且其側(cè)翼連接Xmal和Xbal酶切位點(diǎn)(5，至3，)GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGATGATGATTCTATTGCATCTCTGAGCACGTCCTATGAAGCTCCTAGCTACCGCAAGCGTGCGGATAAACTGATTGGCGAAGTGAAAAATATCTTTGATCTGATGTCTGTGGAGGATGGTGTTTTCACTAGCCCGCTGAGCGACCTGCACCATCGCCTGTGGATGGTTGACTCTGTTGAACGCCTGGGCATCGACCGTCACTTTAAGGACGAGATCAACAGCGCTCTGGATCATGTGTACTCTTACTGGACCGAAAAGGGTATCGGCCGTGGCCGTGAATCTGGTGTAACCGATCTGAACAGCACCGCACTGGGCCTGCGTACCCTGCGCCTGCACGGTTATACCGTATCTAGCCATGTCCTGGATCACTTCAAGAACGAAAAAGGTCAGTTCACTTGTTCCGCGATCCAGACCGAAGGCGAAATTCGTGACGTTCTGAACCTGTTCCGTGCGTCCCTGATCGCGTTTCCGGGTGAAAAGATCATGGAAGCGGCCGAAATCTTCTCCACCATGTACCTGAAAGACGCTCTGCAGAAAATTCCGCCGTCCGGTCTGAGCCAGGAAATTGAATATCTGCTGGAGTTCGGCTGGCACACCAACCTGCCGCGTATGGAAACCCGCATGTATATCGACGTCTTTGGCGAAGACACCACCTTCGAAACCCCGTACCTGATCCGTGAAAAACTGCTGGAACTGGCGAAACTGGAATTTAACATCTTTCATTCCCTGGTGAAACGTGAACTGCAGTCCCTGTCCCGCTGGTGGAAGGACTACGGTTTCCCTGAAATCACCTTCTCTCGTCACCGTCACGTAGAATACTACACCCTGGCTGCCTGTATCGCTAATGACCCGAAACACAGCGCTTTTCGTCTGGGCTTCGGTAAAATCTCTCACATGATTACCATCCTGGATGACATTTATGACACCTTCGGCACCATGGAAGAGCTGAAACTGCTGACCGCAGCTTTCAAACGTTGGGACCCGAGCTCCATTGAGTGTCTGCCAGACTATATGAAGGGTGTTTATATGGCAGTTTACGATAACATTAACGAGATGGCGCGTGAAGCGCAGAAGATCCAGGGTTGGGACACGGTTTCCTATGCGCGCAAGTCTTGGGAAGCTTTTATCGGCGCGTACATTCAGGAGGCTAAATGGATTTCTTCCGGCTACCTGCCGACCTTCGACGAATACCTGGAGAACGGTAAAGTCTCCTTCGGCTCCCGTATCA1CTACCCTGGAACCGATGCTGACTCTGGGTTTTCCGCTGCCGCCTCGTATTCTGCAGGAAATCGACTTCCCGTCTAAATTCAACGACCTGATCTGTGCAATCCTGCGTCTGAAAGGCGATACTCAGTGCTATAAAGCGGACCGTGCACGCGGTGAAGAAGCCTCTGCGGTTTCCTGTTATATGAAAGACCATCCGGGTATTACCGAAGAAGATGCCGTAAACCAGGTGAACGCGATGGTGGATAATCTGACCAAAGAACTGAACTGGGAACTGCTGCGTCCGGATTCCGGCGTCCCGATCAGCTATAAAAAGGTGGCGTTCGATATTTGCCGCGTTTTCCACTACGGTTACAAATATCGCGATGGTTTCTCCGTGGCATCTATCGAAATCAAAAACCTGGTGACTCGTACCGTCGTGGAAACGGTGCCGCTGTGATAGTAATCTAGAGGAATTTSEQIDNO:9pAM328的KanMX-PMET3區(qū)(5，至3，)GAATTCGCCCTTNTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTCTGCGCACTTAACTTCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAAAAATATAAATCACGCTAACATTTGATTAAAATAGAACAACTACAATATAAAAAAACTATACAAATGACAAGTTCTTGAAAACAAGAATCTTTTTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT101ACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTTAAAAGGAAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAGCGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCCGTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGGGCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAGACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCAGAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAGCATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAAATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTTAGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTACAGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAAAAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCATTCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACCTCCAAAGGAAATCACCGTATAACAAAGCCACAGTTTTACAACTTAGTCTCTTATGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATATGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTAAACTTGGTTCTTTTTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATCGNAAGGGCGAATTCSEQIDNO:10pAM178(5,至3，)TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGACTACGTCGTAAGGCCGTTTCTGACAGAGTAAAATTCTTGAGGGAACTTTCACCATTATGGGAAATGCTTCAAGAAGGTATTGACTTAAACTCCATCAAATGGTCAGGTCATTGAGTGTTTTTTATTTGTTGTATTTTTTTTTTTTTAGAGAAAATCCTCCAATATCAAATTAGGAATCGTAGTTTCATGATTTTCTGTTACACCTAACTTTTTGTGTGGTGCCCTCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAGTGCAATTCTTTTTCCTTATCACGTTGAGCCATTAGTATCAATTTGCTTACCTGTATTCCTTTACTATCCTCCTTTTTCTCCTTCTTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTTCATTTATAAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGCGACAGCATCACCGACTTCGGTGGTACTGTTGGAACCACCTAAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCCAAAACCTTTTTAACTGCATCTTCAATGGCCTTACCTTCTTCAGGCAAGTTCAATGACAATTTCAACATCATTGCAGCAGACAAGATAGTGGCGATAGGGTCAACCTTATTCTTTGGCAAATCTGGAGCAGAACCGTGGCATGGTTCGTACAAACCAAATGCGGTGTTCTTGTCTGGCAAAGAGGCCAAGGACGCAGATGGCAACAAACCCAAGGAACCTGGGATAACGGAGGCTTCATCGGAGATGATATCACCAAACATGTTGCTGGTGATTATAATACCATTTAGGTGGGTTGGGTTCTTAACTAGGATCATGGCGGCAGAATCAATCAATTGATGTTGAACCTTCAATGTAGGGAATTCGTTCTTGATGGTTTCCTCCACAGTTTTTCTCCATAATCTTGAAGAGGCCAAAAGATTAGCTTTATCCAAGGACCAAATAGGCAATGGTGGCTCATGTTGTAGGGCCATGAAAGCGGCCATTCTTGTGATTCTTTGCACTTCTGGAACGGTGTATTGTTCACTATCCCAAGCGACACCATCACCATCGTCTTCCTTTCTCTTACCAAAGTAAATACCTCCCACTAATTCTCTGACAACAACGAAGTCAGTACCTTTAGCAAATTGTGGCTTGATTGGAGATAAGTCTAAAAGAGAGTCGGATGCAAAGTTACATGGTCTTAAGTTGGCGTACAATTGAAGTTCTTTACGGATTTTTAGTAAACCTTGTTCAGGTCTAACACTACCGGTACCCCATTTAGGACCAGCCACAGCACCTAACAAAACGGCATCAACCTTCTTGGAGGCTTCCAGCGCCTCATCTGGAAGTGGAACACCTGTAGCATCGATAGCAGCACCACCAATTAAATGATTTTCGAAATCGAACTTGACATTGGAACGAACATCAGAAATAGCTTTAAGAACCTTAATGGCTTCGGCTGTGATTTCTTGACCAACGTGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGGCAGACATTACAATGGTATATCCTTGAAATATATATAAAAAAAGGCGCCTTAGACCGCTCGGCCAAACAACCAATTACTTGTTGAGAAATAGAGTATAATTATCCTATAAATATAACGTTTTTGAACACACATGAACAAGGAAGTACAGGACAATTGATTTTGAAGAGAATGTGGATTTTGATGTAATTGTTGGGATTCCATTTTTAATAAGGCAATAATATTAGGTATGTGGATATACTAGAAGTTCTCCTCGACCGTCGATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCG104CTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGAATTGGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAGCAACCTGACCTACAGGAAAGAGTTACTCAAGAATAAGAATTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATACACTTATTTTTTTTATAACTTATTTAATAATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAGACAAGCCGACAACCTTGATTGGAGACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAATTGTTAATTAAGAGCTCAGATCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCATCGATACTAGTGCGGCCGCCCTTTAGTGAGGGTTGAATTCGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCATTACCACCATATACATATCCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCGTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGGAACAGAAGTTGATTTCCGAAGAAGACCTCGAGTAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCTAAGATCCGCTCTAACCGAAAAGG105AAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGATCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAATCTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTATTTTTCTAACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGCGCTCTATAATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTAAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGTAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGTCTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTGCGCACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCCTGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGTACCTCCTGTGATATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCCACTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGATATTGGATCATACTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCSEQIDNO:11引物4-49mvaASpel(5，至3，)GCTACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCGSEQIDNO:12引物4-49mvaARXbal(5，至3，)GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG1SEQIDNO:13引物HMGS5，SamvaS國S(5，至3，)GAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATAAACTSE()IDNO:14引物HMGS3，SamvaS-AS(5，至3，)TTGCATGATGTTTTCCTCCTACTAGTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAACSEQIDNO:15引物67-lA-C(5，至3，)ACACTCGAGGAGGAATAAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGSEQIDNO:16引物67-1B-C(5，至3，)TGATGGTACCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGCSE(JIDNO:17引物67-lC-C(5，至3，)ACTAGGTACCAGGAGGAATAAATGAAGCAACTCACCATTCTGGGCSEQIDNO:18引物67-lD畫C(5，至3，)AATTGATGGGCCCTCAGCTTGCGAGACGCATCACCTCSEQIDNO:19引物67-lE畫C(5，至3，)109CATAAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGCAACCACTCATTTGGATGSEQIDNO:20引物67-lF-C(5，至3，)TATTGTTCATATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCGSEQIDNO:20引物67國1G-C(5，至3，)AACTAACACATATGAGGAGGAATAAATGCGGACACAGTGGCCCTCSEQIDNO:22引物67-lH-C(5，至3，)TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGCAATGGSEQIDNO:23引物67-2A-C(5，至3，)ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACGSEQIDNO:24引物67畫2B-C(5，至3，)TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCCSEQIDNO:25引物67-2C-C(5，至3，)TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACGSEQIDNO:26引物67-2D-C(5，至3，)TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCAATTCGSEQIDNO:27引物67隱2E-C(5，至3，)AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACCSEQIDNO:28引物67國2F-C(5，至3，)TGGATGAAGTCGACTTAATCGACTTCACGAATATCGACACGCAGCSEQIDNO:29引物67-2G-C(5，至3，)CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGSEQIDNO:30引物67-2H畫C(5，至3，)TAATGCAAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCGSEQIDNO:31引物67-2I-C(5，至3，)CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCGSEQIDNO:32引物67畫2J陽C(5，至3，)TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGCSEQIDNO:33引物9-156A(5，至3，)ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGGSEQIDNO:34引物9-156B(5，至3，)TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAGSEQIDNO:35引物61-67國CPK001-G(5，至3，)GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTSEQIDNO:36引物61國67醫(yī)CPK002-G(5，至3，)ACTGCAAAGTACACATATATCCCGGGTGTCAGCTCTTTTAGATCGGSEQIDNO:37引物61-67醫(yī)CPK003國G(5，至3，)CCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGTSEQIDNO:38引物61-67-CPK004-G(5，至3，)GTTTAAACGGCGTCAGTCCACCAGCTAACASEQIDNO:39引物61畫67-CPK005畫G(5，至3，)GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACAC112SE(JIDNO:40引物61-67-CPK006-G(5，至3，)AAAGATGAATTGAAAAGCTTCCCGGGTATGGACCCTGAAACCACAGSEQIDNO:41引物61-67-CPK007-G(5，至3，)CTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTSEQIDNO:42引物61-67-CPK008-G(5，至3，)GTTTAAACCCAACAATAATAATGTCAGATCSEQIDNO:43引物61-67-CPK009-G(5，至3，)GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGASECIDNO:44引物61-67-CPKOlO-G(5，至3，)ATCTCTCGCAAGAGTCAGACTGACTCCCGGGCGTGAATAAGCTTCGGGTGACCCTTATGGCATTCTTTTTSEQIDNO:45引物61-67-CPK011-G(5，至3，)AAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGAGAGATSEQIDNO:46引物61-67-CPK012-G(5，至3，)113GTTTAAACAATTTAGTGTCTGCGATGATGASEQIDNO:47引物61國67誦CPK013國G(5，至3，)GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCSE()IDNO:48引物61國67-CPK014alt國G(5，至3，)GCGGGGACGAGGCAAGCTAAACTTTAGTATATTCTTCGAAGAAASEQIDNO:49引物61-67-CPK015altG(5，至3，)TTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCSEQIDNO:50引物61-67畫CPK016-G(5，至3，)CAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCGSEQIDNO:51引物61-67-CPK017-G(5，至3，)CGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCACGTTGATTGSEQIDNO:52引物61畫67-CPK018畫G(5，至3，)GTTTAAACGCCGCCGTTGTTGTTATTGTAGSE(JIDNO:53引物61畫67畫CPK019畫G(5，至3，)GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAASEQIDNO:54引物61誦67畫CPK020畫G(5，至3，)GGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACGTCTTCCTTTCTCTTACCAAAGTSEQIDNO:55引物61-67國CPK021國G(5，至3，)ACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCSEQIDNO:56引物61-67-CPK022-G(5，至3，)AATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCSEQIDNO:57引物61醫(yī)67-CPK023國G(5，至3，)GCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTSEQIDNO:58引物61畫67國CPK024國G(5，至3，)GTTTAAACGTGTTAACGTTTCTTTCGCCTACGTGGAAGGAGAATCSEQIDNO:59引物61-67國CPK025國G(5，至3，)TCCCCCCGGGTTAAAAAAAATCCTTGGACTAGTCASEQIDNO:60引物61國67誦CPK031-G(5，至3，)TCCCCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAASE(JIDNO:61引物61國67國CPK032-G(5，至3，)TCCCCCCGGGTATATATATATCATTGTTATSEQIDNO:62引物61國67-CPK035-G(5，至3，)TCCCCCCGGGAAAAGTAAGTCAAAAGGCACSEQIDNO:63引物61誦67國CPK040國G(5，至3，)TCCCCCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATSE(JIDNO:64引物61-67-CPK041-G(5，至3，)TCCCCCCGGGTAGCTTGTACCCATTAAAAGAATTTTATCATGCCGSEQIDNO:65引物61畫67國CPK046國G(5，至3，)TCCCCCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAACSEC)IDNO:66引物61國67-CPK047畫G(5，至3，)TCCCCCCGGGTAAATAAAGAAAATAAAGTTSEQIDNO:67引物61-67-CPK050國G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGASE()IDNO:68引物61陽67國CPK051-G(5，至3，)TCCTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSEQIDNO:69引物61-67畫CPK052國G(5，至3，)AGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTASEQIDNO:70引物61-67-CPK053-G(5，至3，)TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACTSEQIDNO:71引物61-67-CPK054-G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTSEQIDNO:72引物61誦67畫CPK055畫G(5，至3，)AACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSEQIDNO:73引物61國67畫CPK056國G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTATSEQIDNO:74引物61-67曙CPK057曙G(5，至3，)ATACAATGTAAACGTTCTGAGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSECIDNO:75引物61-67-CPK058-G(5，至3，)TGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTASEQIDNO:76引物61-67-CPK059畫G(5，至3，)TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCASEQIDNO:77引物61-67-CPK060-G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGSECIDNO:78引物61-67-CPK061-G(5，至3，)118CACTGAAGGCTCTCAACTCTGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSECIDNO:79引物61-67-CPK062-G(5，至3，)GGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTASE(JIDNO:80引物61-67-CPK063畫G(5，至3，)TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACCSEOIDNO:81引物61-67-CPK064-G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCSECJIDNO:82引物61國67-CPK065國G(5，至3，)GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSEQIDNO:83引物61-67-CPK066-G(5，至3，)GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACCSE(JIDNO:84引物61-67-CPK067-G(5，至3，)TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTTGTAAAACGACGGCCAGTSEQIDNO:85引物50-56-pwl00曙G(5，至3，)GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGGCGGCGTTAGTATCSEQIDNO:86引物50-56-pwlOl-G(5，至3，)CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGASEQIDNO:87引物PW-91-079-CPK373-G(5，至3，)TCGACTACGTCGTAAGGCCGTSE()IDNO:88引物PW畫91誦079-CPK374-G(5，至3，)GCATCTGTGCGGTATTTCACTATATATATTTCAAGGATATACSE()IDNO:89引物PW-91畫079-CPK376畫G(5，至3，)TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGSEQIDNO:90引物PW誦91-079-CPK375誦G(5，至3，)GTATATCCTTGAAATATATATAGTGAAATACCGCACAGATGC權(quán)利要求1.包含混合物或可從混合物中獲取的燃料組合物，所述混合物包含(a)C10二環(huán)類異戊二烯；(b)石油為基礎(chǔ)的燃料；以及(c)燃料添加劑，其中所述C10二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積％，這兩個(gè)量均基于所述燃料組合物的總體積，且其中所述燃料組合物具有等于或大于38℃的閃點(diǎn)，并在15℃下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度。2.包含混合物或可從混合物中獲取的燃料組合物，所述混合物包含(a)do二環(huán)類異戊二烯；(b)石油為基礎(chǔ)的燃料；(c)燃料添加劑；以及(d)芳香族化合物，其中所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％,所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積％,所述芳香族化合物的量為約5體積％至約35體積％，所有的量均為占燃料組合物總體積，且其中所述燃料組合物具有等于或大于38。C的閃點(diǎn)，并在15"C下具有約750kg/m3至約850kg/m3的密度。3.噴氣燃料組合物，其包含(a)C,o二環(huán)類異戊二烯；(b)石油為基礎(chǔ)的燃料；以及(c)噴氣燃料添加劑；且其中所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積％,這兩個(gè)量均基于所述燃料組合物的總體積，且其中所述燃料組合物在15"C下具有約750kg/n^至約850kg/m3的密度，并具有等于或大于38°C的閃點(diǎn)。4.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，其中所述C,o二環(huán)類異戊二烯為蒈烷、蒎烷、檜烷或其組合。5.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，其中所述Ch)二環(huán)類異戊二烯的量占該燃料組合物總體積的至少約2體積％。6.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，其中所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量占該燃料組合物總體積的至少約10體積％。7.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量占該燃料組合物總體積的至少約15體積％。8.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量占該燃料組合物總體積的至少約30體積％。9.如權(quán)利要求2所述的燃料組合物，其中所述組合物包含對(duì)傘花烴。10.如權(quán)利要求2所述的燃料組合物，其中所述芳香族化合物的量占該燃料組合物總體積的至少約25體積％。11.如權(quán)利要求1或2所述的燃料組合物，其中所述石油為基礎(chǔ)的燃料為煤油。12.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，其中所述石油為基礎(chǔ)的燃料為JetA、JetA-1或JetB。13.如權(quán)利要求12所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物符合對(duì)JetA的ASTMD1655規(guī)范。14.如權(quán)利要求12所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物符合對(duì)JetA-l的ASTMD1655規(guī)范。15.如權(quán)利要求12所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物符合對(duì)JetB的ASTMD1655規(guī)范。16.權(quán)利要求3所述的噴氣燃料組合物，其中所述燃料添加劑為選自氧化劑、抗氧化劑、熱穩(wěn)定改良劑、穩(wěn)定劑、低溫流動(dòng)性改進(jìn)劑、燃燒改良劑、消泡劑、消光霧添加劑、腐蝕抑制劑、潤滑性能改良劑、防冰劑、噴射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、去污劑、破乳劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合的至少一種添加劑。17.制備燃料組合物的方法，其包括(a)將C1G類異戊二烯起始原料與氫在催化劑的存在下相接觸，以形成C,o二環(huán)類異戊二烯；并(b)將所述do二環(huán)類異戊二烯與石油為基礎(chǔ)的燃料相混合，以制備所述燃料組合物；其中所述C,o二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積°/。，這兩個(gè)量均基于所述燃料組合物的總體積，且其中所述燃料組合物具有等于或大于38。C的閃點(diǎn)。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述C,o類異戊二烯起始原料為蒈烯、a-蒎烯、(3-蒎烯、檜烯或其組合。19.從單糖制備燃料組合物的方法，其包括(a)在適于生成C1Q類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成該CK)類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與所述單糖相接觸；(b)將所述C1Q類異戊二烯起始原料轉(zhuǎn)化為C1Q二環(huán)類異戊二烯；以及(c)將所述C1()二環(huán)類異戊二烯與石油為基礎(chǔ)的燃料相混合，以制備所述燃料組合物，其中所述C化二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％，所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積％,這兩個(gè)量均基于燃料組合物的總體積，且其中所述燃料組合物具有等于或大于38°(3的閃點(diǎn)。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述C,o類異戊二烯起始原料為蒈烯、a-泉烯、(3-蒎烯、檜烯或其組合。21.通過權(quán)利要求17-20任意一項(xiàng)所述的方法制備的燃料組合物。22.包括內(nèi)燃機(jī)、與該內(nèi)燃機(jī)連接的燃料箱、以及該燃料箱中的燃料組合物的交通工具，其中所述燃料組合物為權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物，其中所述Cio二環(huán)類異戊二烯的量為至少約2體積％,所述石油為基礎(chǔ)的燃料的量為至少約5體積％，這兩個(gè)量均基于所述燃料組合物的總體積，且其中所述燃料組合物具有等于或大于38"C的閃點(diǎn)，且其中所述燃料組合物被用于向所述內(nèi)燃機(jī)^是供動(dòng)力。23.向發(fā)動(dòng)機(jī)^是供動(dòng)力的方法，其包括在所述發(fā)動(dòng)機(jī)中燃燒權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的燃料組合物的步驟。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述發(fā)動(dòng)機(jī)為噴氣發(fā)動(dòng)機(jī)。全文摘要除了其它的以外，本發(fā)明提供了噴氣燃料組合物及其制備和使用方法。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物包含至少一種可至少部分從微生物中容易地和有效地生成的燃料組分。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含高濃度的至少一種生物工程燃料組分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的燃料組合物包含C₁₀二環(huán)類異戊二烯，如蒈烷、蒎烷、檜烷或其組合。文檔編號(hào)C10L1/18GK101636474SQ200780050238公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日發(fā)明者卡爾·J·費(fèi)希爾,尼爾·斯蒂芬·倫寧格,詹森·A·萊德申請(qǐng)人:阿邁瑞斯生物技術(shù)公司