專利名稱：利用dna損傷指標(biāo)的天然與人工化學(xué)物質(zhì)的簡易生物學(xué)的評價法,與用于此目的的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用DNA損傷指標(biāo)的天然與人工化學(xué)物質(zhì)的簡易生物學(xué)的評價法，具體地說，涉及關(guān)于DNA的構(gòu)成成分2′-脫氧鳥苷(dG)變?yōu)檠趸偷?-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)的反應(yīng)，或關(guān)于在來自生物體細胞的產(chǎn)物中含有的8OHdG/dG，通過對被測物質(zhì)投藥組和對照組進行比較，簡單地評價藥品或農(nóng)藥等的天然與人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有效性、或者各種功能性食品等的有害性或有效性的方法。本發(fā)明還涉及生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)的高靈敏度測定裝置。
但是，根據(jù)腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)的堿基對對遺傳信息進行密碼化。這種DNA信息，由于紫外線照射或DNA的復(fù)制錯誤、或是各種致癌物質(zhì)或暴露在活性氧類下等受到一定程度的損傷，最終產(chǎn)生它的基因信息的缺失、改組或變異等，成為它的細胞或固體的滅絕、或相反地產(chǎn)生新生物種的引發(fā)物。上述的天然與合成化學(xué)物質(zhì)，對包括人在內(nèi)的動物帶來毒性的機理的一部分，可以根據(jù)這種DNA的損傷來說明。
從這個觀點看，著眼于DNA的氧化，含有嘌呤核的DNA(單核苷)的2′-脫氧鳥苷(dG)與2′-脫氧腺苷(dA)是與活化氧類的羥基(·OH)結(jié)合，各自氧化為8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)和2-羥基-2′-脫氧腺苷(2OHdA)，使原來GC必要的DNA的堿基對變化為TA、AT變化為GC。這種DNA水平的基因信息的改寫發(fā)生的頻率，在近年的醫(yī)學(xué)界中，作為與各種疾病的病態(tài)相關(guān)的有力的信息被矚目。
以前，化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)上所容許的安全濃度是參考1)對實驗動物投藥時的致死量、2)對實驗動物投藥時，產(chǎn)生致癌或神經(jīng)障礙等明顯的臟器損害量、3)影響生殖能力的量等，它們的最低有效量乘以100～1000倍的安全率的濃度。
但是，成為評價對象的化學(xué)物質(zhì)的種類約有10萬種以上很多的物質(zhì)，對小鼠或者大鼠使用定量化生物毒性時，即使完成一代也要大約兩個月，雖然評價超過一代的影響情況很少，但還是需要其兩倍以上的時間，而且由于為維持評價系統(tǒng)需要很多的費用等理由，用現(xiàn)有的方法評價所有物質(zhì)的生物學(xué)的毒性，由于受時間的與費用的限制，迄今為止，在事實上是不可能的。
另外，現(xiàn)在市售的多數(shù)的健康食品或功能性食品等的食品類是提取天然原材料的物質(zhì)，或者在安全許可量的范圍內(nèi)添加了特定的物質(zhì)等是主要傾向。但是，對于該食品等，關(guān)于有效性(實效性)還沒有確立客觀的評價系統(tǒng)。
一方面，現(xiàn)在，白血球、實質(zhì)器官或浮游細胞溶液等的生物體樣品中，作為測定上述的氧化DNA物質(zhì)的一種8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)的方法，從這些的細胞成分中提取核DNA進行各種酶處理后，通過HPLC(高效液相色譜)的游離液流入電化學(xué)檢測器，一般按單核苷的形式進行測定。這種方法，雖然可以評價測定靈敏度10pg/ml左右的核DNA的氧化性損傷，但是由于經(jīng)過酸或堿處理、酶反應(yīng)等步驟，操作煩雜，很難避免由這些操作引起的二次DNA的氧化，因此在實際上只能用很有限的設(shè)備來實施。
測定大量地含有同樣8OHdG的尿時，經(jīng)過除蛋白處理后，雖然也使用通過HPLC和電化學(xué)檢測器的方法，但是由于尿本身是極易氧化的生物體樣品，因此如何在預(yù)防氧化的條件下除去蛋白是最大的難關(guān)。
近來，作為正在使用的8OHdG的定量法，有使用單克隆抗體的酶抗體法(EIA法)。這種方法和根據(jù)HPLC與電化學(xué)檢測器的方法不同，雖然具有不在單核苷酸的狀態(tài)下也可以檢測的特征，但是存在除8OHdG以外也有交叉反應(yīng)，和檢測靈敏度低到1ng/ml左右的缺點，一般化地未解決的問題很多。
一方面，生物體樣品中的單核苷酸本身，由于其核DNA內(nèi)的絕對量是8OHdG等氧化物的約10,000～100,000倍，比較多量地存在，因此檢測比較容易，從它的化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征考慮，作為一般的檢測方法，可以有效地使用紫外線吸收測定裝置。但是，由于測定分析物的前處理是與使用電化學(xué)檢查器測定8OHdG的情況相同，因此基本上也存在同樣的問題點。
上述的人工化學(xué)物質(zhì)或食品類，人類可能日常地攝取或者投藥或接觸，雖然確認它們的生物學(xué)毒性或有效性、特別是以確認毒性為首要任務(wù)，但是現(xiàn)狀如上所述，有耗時長、費用高等問題。所以，期望開發(fā)出簡便且低消耗地評價人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)毒性或食品類的有害性·有效性的方法。
本發(fā)明的目的在于，為適應(yīng)這個期望，提供一種合理且簡便的評價龐大種類的天然物質(zhì)或人工化學(xué)物質(zhì)與食品類的生物學(xué)的有害性或有益性的方法。
另外，本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種測定裝置，這種裝置應(yīng)對生物學(xué)的評價法中作為指標(biāo)的物質(zhì)，一般是指氧化DNA物質(zhì)，特別是8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)、2-羥基-2′-脫氧腺嘌呤核苷(2OHdA)等的量和生物體樣品中的核DNA的量能用簡便的方法進行正確地定量，其重現(xiàn)性良好。
特別地，本發(fā)明的另一個目的在于，在該測定裝置中，提供一種能夠防止生物體樣品中的DNA受氧化損傷的抗氧化保存液。
即，本發(fā)明涉及一種天然或人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的評價法，該評價法包括，在含有特定的天然或人工化學(xué)物質(zhì)的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
另外，在上述被測溶液的生物學(xué)的評價法中，通過加入dG，對上述溶液進行紫外線照射和/或添加活性氧類發(fā)生劑后，通過定量分析上述溶液中的8OHdG，也能夠評價對于來自上述被測溶液的活性氧的基因核酸的氧化損傷有無相加、協(xié)同或相抵的效果。
因此，本發(fā)明涉及一種天然或人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的評價法，該評價法包括，在含有特定的天然或人工化學(xué)物質(zhì)的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷，對該溶液進行紫外線照射和/或加入活化氧類發(fā)生劑后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量，將來自天然或人工化學(xué)物質(zhì)的活性氧的基因核酸的氧化損傷有無相加、協(xié)同或相抵效果作為指標(biāo)，評價天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
進而，本發(fā)明涉及一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該食品的有害性或有益性；另外，本發(fā)明還涉及一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷，對該溶液進行紫外線照射和/或加入活化氧類發(fā)生劑后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量，將來自該食品的活性氧的基因核酸的氧化損傷有無相加、協(xié)同或相抵效果作為指標(biāo)，評價天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
本發(fā)明還涉及一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品和具有基因核酸的氧化損傷作用物質(zhì)的溶液中，加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該食品成分的基因核酸的氧化損傷預(yù)防作用的有效性。
本發(fā)明還涉及一種被測溶液的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有不特定化學(xué)物質(zhì)的被測溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該被測溶液的抗氧化能力或者氧化能力。
本發(fā)明還涉及一種化學(xué)物質(zhì)或食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在一定期間內(nèi)把特定的化學(xué)物質(zhì)或食品投喂給包括人在內(nèi)的動物、植物、細菌或真菌，按照取自它們的來自生物體細胞產(chǎn)物中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷和2′-脫氧鳥苷的含量比，評價該化學(xué)物質(zhì)或者食品的有害性或有益性。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，將混入抗氧化保存液中的生物體樣品，灌注到具有分子量20～50kD截斷功能的透析膜中，通過所謂的微量透析處理，能夠在抗氧化環(huán)境中進行該生物體樣品的除蛋白操作，及對于灌注后通過高效液相色譜得到的洗脫成分，同時進行用紫外線吸收分析的DNA的定量和用電化學(xué)測定的DNA氧化損傷物的定量，能夠在同一條件下正確地測定兩者的值，正確地檢測出DNA的氧化損傷狀態(tài)。
所以，本發(fā)明涉及一種DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其特征在于，該裝置具有
a)用于與液態(tài)生物體樣品混合并進行冷凍保存，其準(zhǔn)備量為該樣品的1～5倍的抗氧化保存液，b)微量透析裝置，該裝置通過向上述液態(tài)生物體樣品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸漬的透析膜管內(nèi)，灌注由甘油水溶液組成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物質(zhì)通過，同時對回收液進行微量透析處理，使回收液中的甘油濃度目標(biāo)值在10～20重量％的范圍內(nèi)，c)具有用于從上述微量透析處理的回收液中分離出低分子DNA關(guān)聯(lián)物質(zhì)的色譜柱的高效液相色譜，d)用于對上述色譜柱的洗脫液進行紫外線吸收分析和用于測定DNA核酸的量的紫外線吸收分析裝置，e)用于對上述色譜柱的洗脫液進行電化學(xué)分析和用于測定DNA氧化損傷物的量的電化學(xué)測定器，f)根據(jù)測得的DNA核酸的量和DNA氧化損傷物的量的比率求出上述液態(tài)生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
本發(fā)明還涉及一種DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其特征在于，該裝置具有a)用于把由含有細胞成分的生物體樣品和相當(dāng)于其1～5倍量的上述抗氧化保存液的混合溶液密封而且冷凍保存的組織細胞粉碎用的管，b)細胞粉碎與固體物質(zhì)分離裝置，該裝置通過把在密封·冷卻后的管內(nèi)生物體樣品中含有的組織粉碎來使細胞內(nèi)外的游離核酸溶出到保存液中，同時使固體物質(zhì)從粉碎樣品中分離出來并沉淀。
c)微量透析裝置，該裝置通過向上述液態(tài)生物體樣品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸漬的透析膜管內(nèi)，灌注由甘油水溶液組成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物質(zhì)通過，同時對回收液進行微量透析處理，使回收液中的甘油濃度目標(biāo)值在10～20重量％的范圍內(nèi)，d)具有用于從上述微量透析處理的回收液中分離出低分子DNA關(guān)聯(lián)物質(zhì)的色譜柱的高效液相色譜，e)用于對上述色譜柱的洗脫液進行紫外線吸收分析和用于測定DNA核酸的量的紫外線吸收分析裝置，f)用于對上述色譜柱的洗脫液進行電化學(xué)分析和用于測定DNA氧化損傷物的量的電化學(xué)測定器，g)根據(jù)測得的DNA核酸的量和DNA氧化損傷物的量的比率求出上述液態(tài)生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
進而，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，作為在上述測定裝置中的生物體樣品用的抗氧化保存液，含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇、與10～40重量％的甘油的水溶液是特別有用的。
所以，本發(fā)明涉及上述DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其中，上述抗氧化保存液是一種含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇與10～40重量％的甘油的水溶液；另外，本發(fā)明還涉及由含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇與10～40重量％的甘油的水溶液組成的生物體樣品的抗氧化保存液本身。
對附圖的簡單說明

圖1是表示本發(fā)明的生物體樣品測定裝置的順序的流程圖。
圖2是表示使用本發(fā)明的生物體樣品測定裝置測得的人尿中的NO3-/dG的濃度比與8OHdG/dG的濃度比的關(guān)系的曲線圖。
圖3是表示根據(jù)HPLC+電化學(xué)檢測器(ECD)法和EIA法得到的8OHdG濃度的關(guān)系的曲線圖。
圖4是表示尿中的8OhdG濃度和硝酸根離子(NO3-)濃度的關(guān)系的曲線圖。
圖5是表示在母乳主體、奶粉主體及混合營養(yǎng)的各組中，8OHdG濃度、dG濃度與8OHdG濃度對dG濃度之比的柱形圖。
用于實施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明所說的「評價有害性或有益性(的有無)」，意味著它可作為判斷被測物質(zhì)是否具有生物學(xué)的有害性(對氧化應(yīng)力的授予、致癌性、促畸形性、對生殖能力的不好的影響等)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，或者有無有害性或有益性(有效性)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以及提示上述有害性或有益性的程度。另外，「評價抗氧化能或者氧化能」是指，它可作為判斷被測溶液有無抗氧化能、換言之，有無還原能力的判斷標(biāo)準(zhǔn)，或者被測物質(zhì)有無氧化能力(氧化力)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以及提示它們的程度。
本發(fā)明中使用的2′-脫氧鳥苷是DNA的構(gòu)成成分脫氧嘌呤核苷的一種。雖然幾乎全部的基因信息能用腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的堿基對進行密碼化，但其基因信息，由于自然突變(紫外線照射或DNA的復(fù)制錯誤等引起)或由人工產(chǎn)物引起的突變(各種致癌物質(zhì)、活性氧等引起)受到一定程度的損傷，最終引起基因信息的缺失、重復(fù)、反轉(zhuǎn)、插入、移位、點突變等，導(dǎo)致細胞或個體的滅亡，反之成為新的生物種誕生的引發(fā)物。
我們知道，活性氧除了可以由進入體內(nèi)的氧生成以外，還可由生物體攝取的天然或人工化學(xué)物質(zhì)作為活性氧的起源或誘導(dǎo)因子來生成，給作為生物體成分的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、基因核酸等帶來氧化損傷。在上述dG的情況下，當(dāng)它一旦和活性氧類的羥基(·OH)等結(jié)合，就會生成氧化型的8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)。該(8OHdG)最終由本來的GC的堿基對變換為TA的堿基對?？傊?，從GC到TA的變換，意味著各個細胞的基因有一定程度的損傷，其程度的多少，必然被認為是作為評價其個體的自己保存能力或物種保存能力的有力的指標(biāo)。實際上，8OHdG作為DNA的代表的氧化損傷指標(biāo)，例如與致癌率或腦的變性疾病的發(fā)病具有有意義的相關(guān)性(「實驗醫(yī)學(xué)」第13卷，第15號，第31～37頁，1995)或和細胞死(apoptosis)有密切的關(guān)系(「最新醫(yī)學(xué)」第51卷，第3號，第42～47頁，1996)等。
本發(fā)明是，進而使用8OhdG作為DNA氧化損傷指標(biāo)，測定被測物質(zhì)是否具有把dG氧化為8OHdG的能力及其程度，據(jù)此評價該被測物質(zhì)的有害性或安全性。換言之，本發(fā)明是用被測物質(zhì)將dG變換為8OHdG的能力作為該物質(zhì)有無有害性等的判斷標(biāo)準(zhǔn)，這與現(xiàn)有技術(shù)將生物體樣品等中已經(jīng)存在的8OHdG作為癌或者神經(jīng)變性疾病的發(fā)病的危險性或老化程度的尺度的技術(shù)思想是基本不同的。本發(fā)明的生物學(xué)評價法中dG到8OHdG的變化，反映了生命現(xiàn)象的設(shè)計圖的DNA的損傷程度，可以說它是用于評價對包括人類在內(nèi)的生物的各個體的自我保存能力或物種保存能力的影響的非常合理的客觀指標(biāo)。
作為按本發(fā)明進行的生物學(xué)評價的被測物質(zhì)，可列舉的有天然與人工化學(xué)物質(zhì)，例如藥品、農(nóng)藥、洗滌劑、食品添加劑、防腐劑、各種致癌物質(zhì)、內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)等，除此之外，還有大氣污染物質(zhì)，水質(zhì)污染物質(zhì)等，及含有天然與人工化學(xué)物質(zhì)的健康食品或功能性食品的食品類等。該食品類中，除一般食品類和健康食品類本身之外，還包含它的成分。另外，本發(fā)明的上述被測物質(zhì)中，含有不特定的物質(zhì)的水溶液(組成不明確的溶液。本說明書中也記作被測溶液。)例如包含生活下水、工業(yè)下水、污水、自來水、凈化水、天然水、河流水、海水、湖水等。
本發(fā)明的方法，雖然通常將被測物質(zhì)的人工化學(xué)物質(zhì)或食品類或者自來水等的被測溶液和dG一起放置一段時間后，根據(jù)測定生成的8OHdG進行評價，但是此外，通過添加活性氧類發(fā)生劑，照射紫外線等，可以使有可能暴露在自然界或生物體內(nèi)的某些氧化誘導(dǎo)因子再負荷，這樣也可用來評價它們和被測物質(zhì)的相互作用。
這樣，本發(fā)明的方法能夠簡便而且合理地、并且低消耗地評價藥物、農(nóng)藥等的人工化學(xué)物質(zhì)與天然物質(zhì)或者食品類的有害性或有益性。另外，用該方法在帶有粗略的容許量或有效量的標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)中，而且對于其重要性高的物質(zhì)，特別的用下述的細胞培養(yǎng)評價法、生物體內(nèi)評價法也可以進行更嚴(yán)密的評價，本發(fā)明也提供這些方法。
細胞培養(yǎng)評價法在添加了被測物質(zhì)的培養(yǎng)液中的動物細胞(例如，小鼠的淋巴球細胞系的B9細胞系)、植物細胞(例如，煙草BY-2細胞)、真菌(例如，酵母菌)中，根據(jù)需要添加氧化劑和/或進行紫外線照射，經(jīng)過一定時間后，測定來自培養(yǎng)細胞的dG與8OHdG濃度，比較處理前后的值。低等的動植物細胞，雖然本身作為一個生命單位有適應(yīng)多種環(huán)境的能力(人工化學(xué)物質(zhì)的解毒或活性氧消去功能等)，但使用生物細胞的有用性，就能評價這種生物具有的恒常性維持機能中被測物質(zhì)能達到多大程度的影響。這就意味著，細胞評價法可以稱作是可最簡單地使用的生物指標(biāo)(biomarker)。培養(yǎng)細胞的世代交替非?？?，能夠高靈敏度地反映細胞分裂時容易產(chǎn)生的DNA損傷的頻率，另外，若對dG與8OHdG的定量分析結(jié)果也有107～109個的細胞數(shù)，由于可能充分地測定，和通常的恒溫槽相比，能夠建立一種可以使用較多分析物的系統(tǒng)。
生物體內(nèi)評價法向?qū)嶒瀯游?例如小鼠)中定期投予被測物質(zhì)，測定尿中與生殖器官(卵巢或精巢)中的dG與8OHdG的濃度?，F(xiàn)在，雖然開始對人工化學(xué)物質(zhì)等的生物毒性從多個側(cè)面(例如，壽命、體重變化、血液生物化學(xué)數(shù)據(jù)、疾病的發(fā)病頻率等)進行評價，但是全部網(wǎng)羅各個指標(biāo)進行綜合的判斷幾乎是不可能的。但是，DNA損傷指標(biāo)表示生命活動的設(shè)計圖的質(zhì)量，認為它的生成量應(yīng)該是全部的病態(tài)所共有的。從此意義來看，本發(fā)明中對8OHdG的生成量的測定，可以說是能夠推定生命體的健康程度的最簡單、而且合理的綜合指標(biāo)。因為生命活動的本質(zhì)是匯總自身保存和物種的保存，評價生殖毒性的意義重大，根據(jù)本發(fā)明的方法，將目標(biāo)縮小到只限于作為雄性和雌性生殖器官的精巢和卵巢，根據(jù)下一代的生命的設(shè)計圖(DNA)有何種程度的損傷，也能夠評價被測物質(zhì)的基本的危險性。另外，生物體內(nèi)評價法是一系列評價法中，最需要勞力和時間的方法，對于暴露濃度高的物質(zhì)或者即使低濃度但有害性也高的物質(zhì)，最終在與人近似的動物(哺乳類動物)上進行驗證是必要的。但是，本發(fā)明把DNA損傷能這一點當(dāng)作焦點的評價法，和現(xiàn)有的方法相比能格外地減少時間或者經(jīng)費。
本發(fā)明的方法中，例如可以用高效液相色譜(HPLC)分離樣品溶液中含有的dG和8OHdG，以及利用和該色譜儀相連的紫外線吸收分析裝置和電化學(xué)檢測器，能夠進行8OHdG濃度的測定。而且，用此方法可能同時檢測出dG和8OHdG的濃度。另外，8OHdG濃度，使用和8OHdG有特異反應(yīng)的抗體、優(yōu)選單克隆抗體等也能夠測定。
另外，在使用生物體樣品時，優(yōu)選使用微量透析法(透析膜灌注法)較高效率地回收低分子DNA組成成分(dG、8OHdG等)后，進行8OHdG等的測定。具體地說使用能截止20kD～50kD的高分子成分的透析膜進行灌注。但生物體樣品是液態(tài)樣品(血漿、尿、骨髓等)時，使用上述的膜進行透析，在8OHdG等的測定中提供透析后的混合液。含有細胞成分的樣品(全血、細胞浮游液、組織液等)時，用細胞粉碎裝置粉碎組織或細胞，以便使存在于細胞質(zhì)或核內(nèi)的核酸成分溶出。然后，通過離心分離法將固體成分分離，然后用上述的透析膜透析其上清液，測定回收的透析液中的dG與8OHdG。
然后，在使用生物體樣品作為被測物質(zhì)時，像從dG到8OhdG那樣利用活性氧的氧化是從樣品取樣之后立即開始，這樣，在評價結(jié)果中有時不能正確地反映剛?cè)雍蟮臓顟B(tài)。像這種場合，優(yōu)選通過在陽離子螯合劑、抗氧化劑與甘油作為主成分的抗氧化保存液中浸漬生物體樣品來防止樣品取樣后的氧化。陽離子螯合劑具有高效率地停止各種生物體反應(yīng)或者酶反應(yīng)的作用，例如使用乙二胺四乙酸鈉等。由于抗氧化劑是預(yù)防羥基產(chǎn)生·游離的物質(zhì)，因此可以使用例如甲醇等。另外，甘油除了具有由羥基引起的防止氧化的效果以外，還具有可使生物體樣品在-20℃～4℃的條件(通常到生物體樣品使用時為止的保存條件)下穩(wěn)定的保存作用，例如使用20～50％的水溶液。進而，在添加完dG并放置一定時間之后，再將該抗氧化保存液不但加入到生體樣品中，同時也加入到被檢出物質(zhì)中，這樣就能在測定80HdG之前的時間內(nèi)抑制氧化，并能夠測定經(jīng)過一定時間后的正確的(抗)氧化能力。
作為上述抗氧化保存液，優(yōu)選是由一種含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇、與10～40重量％的甘油的水溶液組成的抗氧化保存液。該抗氧化保存液，可以特異地防止dG(脫氧鳥苷)被誘導(dǎo)為8OHdG。第一，作為陽離子螯合劑的EDTA，能使鈣變成螯合物，從而能高效率地防止生物體反應(yīng)或者酶反應(yīng)，第二，作為抗氧化劑甲醇，能預(yù)防羥基的產(chǎn)生·游離，另外，作為第三的主要原因，甘油溶液不僅具有由羥基(OH基)引起的防止氧化的效果，同時還具有作為不凍液在-20℃～4℃下穩(wěn)定地保存分析物的作用。甘油另外還有防止蛋白分解，除此之外，還具有抑制酶反應(yīng)效果。
為了確認上述抗氧化保存液的有效性，本發(fā)明者們，(1)在準(zhǔn)備的各170μg/l的各種保存液成分(候補)中，添加·混合進氧化劑(KBrO3，50mg/ml溶液)各20ml，(2)在這種混合液中，各加入市售的dG標(biāo)準(zhǔn)溶液(2’-脫氧鳥苷，400μg/l)各加10μl，配制被測溶液，(3)經(jīng)過30分鐘后混合各分析物50μl和等量(50μl)的20％甘油水溶液，(4)通過利用這種混合液作為抗氧化保存液對8OHdG和dG進行定量分析來調(diào)節(jié)各分析物的氧化狀態(tài)(8OHdG的增加)。
結(jié)果如下表所示。另外，作為氧化劑使用KBrO3是因為一般將這種物質(zhì)作為面包的漂白劑或防腐劑之類的食品添加劑來使用。
表中的第一行中列舉使用純水代替在上述(1)中得到的混合液作為「純水分析物」時的數(shù)據(jù)，在第二行中列舉使用純水代替保存液成分，和使用含有規(guī)定量氧化劑(KBrO3)的混合液作為「純水/氧化劑分析物」時的數(shù)據(jù)。從表中可以看出，純水分析物的dG濃度是1.0300VS(以紫外線吸光分析裝置的輸出表示的值。此時溶解的標(biāo)準(zhǔn)dG濃度是10μg/ml。)，其配制·測定階段中已經(jīng)存在的8OHdG濃度是0.2710mVs(以電化學(xué)檢測器的輸出表示的值。濃度為5ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)8OHdG的輸出相當(dāng)于7.0mVs。)，所以8OHdG/dG之比是0.263×10-3。然后在純水/氧化劑分析物中經(jīng)過30分后，8OHdG的濃度變?yōu)?.779mVs，8OHdG/dG之比是3.542×10-3，這相當(dāng)于純水分析物時的13.47倍。以下，為了討論各種保存液成分的效果，使用8OHdG/dG之比，其理由是，在各測定時，預(yù)料8OHdG和dG測定值兩者會出現(xiàn)同一個傾向的誤差，例如關(guān)于被測溶液的濃度與容量的誤差，使用80HdG/dG之比就是為了減輕數(shù)據(jù)所受到的影響。
使用屬于陽離子螯合劑的EDTA/4Na(測定時濃度1mM/l)作為保存液成分時，在相同氧化條件下，其8OHdG/dG是1.101×10-3，這相當(dāng)于被抑制為超純水分析物時的4.19倍，使用甘油(測定時濃度10重量％)時，在相同的氧化條件下，其80HdG/dG值是1.506×10-3，這相當(dāng)于被控制為純水分析物時的5.73倍。另外，在使用抗氧化劑甲醇(測定時濃度1重量％與5重量％)時，在各自相同的氧化條件下同值變?yōu)?.771×10-3與2.238×10-3，這相當(dāng)于被控制為各個超純水分析物時的10.54倍與8.51倍。
除了上述保存液成分(EDTA/4Na，甘油與甲醇)以外，上述的表中也表示出了使用棉子糖與葡萄糖各兩個的場合。棉子糖是由甜菜得到的三糖類中的一種，由于其物理·化學(xué)的穩(wěn)定性，可以作為在精子保存液或臟器保存液中添加的組織穩(wěn)定化劑使用。一方面，我們知道葡萄糖是最一般的單糖，同時也是生物體內(nèi)最大量地存在的強有力的抗氧化物質(zhì)(二木他編、「抗氧化物質(zhì)」、學(xué)會出版中心、1994年)。但是上述表中也表明，8OHdG/dG之比與超純水時比較約有10～12倍，該數(shù)值比較大，不適合作抗氧化保存成分。
此外，對于生物體樣品作為用于發(fā)揮抗氧化性的代表物質(zhì)，有VC(抗壞血酸)或NaN3(迭氮化鈉)。但是，雖然VC本身有極強有力的抗氧化性(還原性)，但是在陽金屬離子存在下相反地成為強有力的氧化劑，實際上，添加在dG溶液中和空氣接觸下長期保存，可以確認它能大量地誘變成8OHdG。另外迭氮化鈉雖然是作為核酸的成分或各種酶的保存液(穩(wěn)定化劑)被大量使用的物質(zhì)，但它的化學(xué)反應(yīng)性也很強，可以確認，由于它與空氣中和樣品中的氧反應(yīng)而誘變成大量的氮氧化物。
與此相反，甘油、甲醇與EDTA是非常穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，它們也不誘導(dǎo)微生物的繁殖，如與上述的表有關(guān)的說明，顯示超過葡萄糖、棉子糖等的抗氧化能數(shù)據(jù)。
所以，期望得到優(yōu)選結(jié)果的上述三要素的協(xié)同效果，配制抗氧化保存液(No.10分析物、測定時濃度甘油10重量％、甲醇2.5重量％、與EDTA/4Na 1mM/l組成的混合物)。使用該抗氧化保存液的物質(zhì)，顯示0.924的8OHdG/dG之比、與3.51的對初期值的倍率，可以看出dG的氧化受到大幅度地抑制。所以只有No.10分析物的成分(上述三要素)是作為抗氧化保存液相適應(yīng)的物質(zhì)，上述的配合比是為了供給到由液相色譜開始的測定系統(tǒng)中，它們均處于各優(yōu)選成分濃度范圍內(nèi)。
結(jié)果，該氧化保存液的成分配合比是，由于使用微量透析除蛋白處理的灌注液，典型地為20重量％甘油的水溶液，導(dǎo)致各成分在測定時的濃度發(fā)生變化，為了使其數(shù)值接近于上述No.10分析物的值(但是，測定時的甘油濃度，雖然可能高達該分析物的10重量％～40重量％左右，但是它與將要測定之前的除蛋白處理的精度有關(guān)，因此將其上限它為20重量％左右。)，確定EDTA是0.5～2mM/l、甲醇是2～5重量％、而甘油是10～40重量％。
另外，在上述表中的No.11～17分析物示出了在用純水代替添加了dG標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液中的保存液成分以便使氧化劑(KBrO3)的濃度按三階段變化時，隨著時間經(jīng)過的dG的氧化狀態(tài)。No.11與No.12是在測定時具有與純水/氧化劑分析物相同的氧化劑濃度(KBrO310mg/ml)的物質(zhì)，經(jīng)過15分鐘后的8OHdG濃度3.991與經(jīng)過60分鐘后的8OHdG濃度3.667是一個接近于純水/氧化劑分析物(30分)的8OHdG濃度3.779的值。這些值，與KBrO3濃度是1mg/ml與0.1mg/ml的No.13～17分析物的場合下的0.7～0.8左右與0.2左右相比，是很高的數(shù)值，在不含抗氧化保存液的dG中添加氧化劑(KBrO3)時，明確顯示了氧化的進行與該添加量有關(guān)。
從此結(jié)果可以看出，從dG誘導(dǎo)變成80HdG取決于KBrO3的濃度，并且在15分鐘后至60分鐘后之間看不出8OHdG的誘導(dǎo)量有實質(zhì)性的差異，因此可以推測，由KBrO3引起的氧化反應(yīng)在快速產(chǎn)生后穩(wěn)定化。因此，利用本發(fā)明的測定裝置，可以明確地把握以KBrO3為代表的日?？诜z取的各種食品添加物的DNA氧化功能，對其容許濃度的再研究是有益的。
本發(fā)明的生物學(xué)的評價法例如像下面這樣進行。首先，在多階段稀釋被測物質(zhì)的溶液或被測溶液中，加入已知濃度的2′-脫氧鳥苷(dG)，在水溫為50℃、優(yōu)選為室溫下放置一定時間后，測定8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8OHdG)的生成量(此值作為A)。除此以外，對dG的超純水溶液在上述同樣條件下測定其在放置一定時間后的8OHdG的量(此值作為B)。如果A大于B，則可評價為被測物質(zhì)具有氧化誘導(dǎo)能力，反之，如果A小于B，則可評價為被測物質(zhì)具有抗氧化能力。另外，任何場合下，它的差值越大，可以判定其氧化誘導(dǎo)能力或抗氧化能力的程度越大。
活性氧的產(chǎn)生是在進行生命活動的基礎(chǔ)上不可避免的現(xiàn)象。但是，在消去其生理活性的系統(tǒng)功能不充分時，可以認為，這將會導(dǎo)致DNA的氧化損傷的增加，致癌或細胞活性降低(老化)，并進一步誘導(dǎo)細胞死亡(apoptosis)。根據(jù)本發(fā)明，可以簡單地評價被測物質(zhì)以DNA水平、單一細胞水平、單個體水平下、能否消除哪一個(有無有效性)，或能否增加哪一個活性氧的毒性(有無毒)。
另外，各種健康食品或功能性食品等食品類的有效性，換言之，這取決于可以在多大程度上能有效地消去生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧的毒性。但是，根據(jù)本發(fā)明，各種食品類的抗氧化能，可以客觀化地作為DNA氧化損傷的指標(biāo)。
紫外線由于直接作用于核DNA，是引起DNA氧化損傷的有力的因子，在地球上棲息的生物不能避開它的影響。另外，自然環(huán)境中排出的合成物質(zhì)或自然中存在的天然物質(zhì)也可能受紫外線照射而活化(自由基化)，因此不能忽視由于攝取這些活化的合成物質(zhì)、或和該合成物質(zhì)接觸而產(chǎn)生的生物學(xué)的毒性。根據(jù)本發(fā)明，也可以簡便地評價這種合成物質(zhì)等的被測物質(zhì)與紫外線的相加、協(xié)同或相抵效果。另外，本發(fā)明還提供了對活性氧物質(zhì)產(chǎn)生劑和被測物質(zhì)的相加、協(xié)同或相抵效果的簡便的評價方法。進而，根據(jù)本發(fā)明，通過在含有可以確認具有基因氧化損傷作用的物質(zhì)和被測物質(zhì)的溶液中，加入已知量的dG來定量分析上述溶液中的8OHdG，根據(jù)其含量也可評價對上述被測物質(zhì)的基因氧化損傷作用是否存在有效性。這里，作為可以確認具有基因氧化損傷作用的物質(zhì)，根據(jù)選擇在日常生活中暴露可能性高的物質(zhì)，可以按照更接近于現(xiàn)實的狀態(tài)來評價被測物質(zhì)的作用。特別是，由于被測物質(zhì)是食品類，本發(fā)明可以評價由于該食品類和基因氧化損傷性物質(zhì)的混雜帶來的影響。
在本發(fā)明的生物學(xué)的評價法中，從投喂化學(xué)物質(zhì)或食品，或攝取或接觸這些化學(xué)物質(zhì)或食品的包括人在內(nèi)的動物、植物、細菌或真菌等中采取的來自生物體細胞的產(chǎn)物，例如血液、尿、其它的體液、組織粉碎液或細胞粉碎液等作為被測對象，算出該被測對象中的8OHdG與dG的含量比(8OHdG/dG)，根據(jù)該含量比的大小，可以評價上述化學(xué)物質(zhì)或食品的有害性或有益性(對于上述化學(xué)物質(zhì)或食品，上述含量比越高，有害性越高，含量比越低，有益性越高)。
另外，在本發(fā)明的生物學(xué)的評價法中，有優(yōu)異的抗氧化能力，即，可以有效率地消除由于某些原因產(chǎn)生的活性氧的物質(zhì)，例如含有各種各樣的天然或人工化學(xué)物質(zhì)的功能性食品，或其組成不明確的物質(zhì)，特別是水，通過持續(xù)地攝取，可以治療、改善與減輕包括人在內(nèi)的動物的各種各樣的疾病與障礙。在使用超純水時，這種物質(zhì)所應(yīng)具有的抗氧化能力大體上與被測對象中的8OHdG與dG的含量比相等，這一點可以作為一個基準(zhǔn)。
對于溶解生物體的液體樣品，即全血、血漿、血清、尿、腦脊髓液、組織液等的被測物質(zhì)的水溶液，在使用本發(fā)明的測定裝置時，可以按以下步驟進行。首先，作為樣品的前處理，將液態(tài)樣品和等容量的抗氧化保存液混合，然后，保存至測定為止，直到將要從微量透析處理開始的測定操作之前再將保存分析物的溫度恢復(fù)至室溫。通過微量透析處理將灌注·回收的被測溶液供應(yīng)給高效液相色譜，將含有dG峰與8OHdG峰的洗脫液供給到8OhdG/dG同時測定系統(tǒng)中并進行測定。根據(jù)該測定值，算出最終的生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
對于含有細胞成分的生物體樣品，即，全血、細胞浮游液、組織等必須粉碎的物質(zhì)，在使用本發(fā)明的測定裝置時，可以按以下所述進行。首先，在組織粉碎用管中先注入0.5～0.1ml抗氧化保存液。作為該組織粉碎用管，可以使用適用于物理的細胞粉碎和在生物化學(xué)上的DNA酶非敏感性，或RNA酶非敏感性的滅菌管，例如美國的生物101公司制造出售的“FastDNA管”。然后，在該管中放入100～200mg生物體細胞樣品，然后直接用冰冷凍。細胞粉碎與相關(guān)操作的準(zhǔn)備完成后，使用專用的粉碎裝置，例如美國的生物101公司制造出售的“FastPrep FP120”型裝置將組織粉碎，以便使細胞內(nèi)外的游離核酸溶出到保存液中。將固體物從含有游離核酸的保存液中離心分離除去，將所獲上清液作為保存分析物。將測定分析物在將要測定之前恢復(fù)至室溫，供微量透析處理。通過微量透析處理將灌注·回收的被測溶液供應(yīng)給高效液相色譜，將含有dG峰與8OHdG峰的洗脫液供給到8OHdG/dG同時測定系統(tǒng)中并進行測定。根據(jù)該測定值，算出最終的生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
上述抗氧化保存液基本上是由陽離子螯合劑和抗氧化劑溶解在10～40％甘油水溶液中得到的溶液，在混入生物體樣品之前保存在冰冷條件以下的溫度與避光條件。優(yōu)選的組成配合比如下所示。
甘油 10～40重量％甲醇 2～5重量％EDTA/4Na 0.5～2mM/l上述的組成配合比中，甲醇與EDTA/4Na也可以進行適宜的追加。配制的保存液本身，或生物體樣品混入后的保存都可以在避光·密封狀態(tài)下，按如下所示方式進行。
2～3天的短期保存 于冷藏庫(4℃)半年左右的中期保存于冷凍庫(-10℃～-20℃)半年以上的長期保存將樣品管內(nèi)的空氣用氮氣置換后，于冷凍庫(-80℃以下)
上述的微量透析(微細透析)中，將具有阻止20～50KD的高分子量成分的截斷功能的透析膜管在分析物中浸漬，利用含有管內(nèi)通灌注液的灌注系統(tǒng)的裝置，高效地從分析物回收低分子量的DNA成分?；厥粘煞质莇G、C10H13N5O4、MW267、8OHdG、C10H13N5O5、MW283等。灌注條件以下面的值為基礎(chǔ)。
灌注液 20％甘油溶液灌注溫度 室溫灌注速度 0.5～2μl/分但是，為了提高回收率、改善目的成分的S/N比，可以適當(dāng)?shù)馗淖冞@些條件。
把用微量透析回收的低分子DNA成分送進高效液相色譜的色譜柱中，將8OHdG、dG等全部成分的峰值部分從色譜柱中洗脫。將色譜柱洗脫液首先進入紫外線吸收分析裝置的樣品池中，測定dG的量后，送進電化學(xué)檢測器并測定8OHdG的量。
以上所述的本發(fā)明的測定裝置的順序，根據(jù)圖1的流程圖整理，如下所示。
步驟1生物體樣品的選取。
步驟2將生物體樣品和保存液混合冷凍保存。
步驟3將管內(nèi)保存液中混有的細胞分析用樣品的粉碎與固體物的分離。
步驟4把保存的液態(tài)樣品，或者粉碎與分離后的細胞分析用的樣品進行微量透析處理。
步驟5把通過透析得到的灌注·提取的樣品成分提供給高效液相色譜(HPLC)。
步驟6將液相色譜柱的洗脫液加入到紫外線(UV)吸收分析裝置的樣品池中，測定dG的量。
步驟7把通過上述樣品池的色譜柱洗脫液，利用電化學(xué)檢測器測定其中的8OHdG的量。
步驟8使用步驟6與7的測定值處理8OHdG/dG之比與其它的數(shù)據(jù)。
然后，根據(jù)以下的實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但是本發(fā)明并不限于以下的實施例。實施例1做成五氯苯酚(PCP、除草劑)、雙酚A(BPA、樹脂原料)與白藜蘆醇(RVT、多酚的一種)的各種濃度溶液(0.0005ppm、0.005ppm、0.05ppm、0.5ppm與5ppm)，在兩塊99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，將另一塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，用HPLC[使用的柱CA-5ODS(AICOM公司制)、流動相溶液0.1M磷酸緩沖液、3～10％甲醇、SOS90～100mg]將dG與8OhdG分離，然后，利用與該HPLC連接的紫外線吸收分析裝置與電化學(xué)檢測器定量分析兩者的核苷。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表1所示。此測定是相對兩者的核苷進行的，下表僅示出8OHdG的濃度(ng/ml)(以下的實施例與之相同)。[表1]被測物質(zhì) 濃度(ppm) 放置90分鐘UV照射90分鐘超純水 0.2670.529PCP 5 0.3405.7300.5 0.2820.3960.050.2850.4310.005 0.2360.4510.0005 0.2600.585BPA 5 0.1927.1420.5 0.2311.7360.05nd 0.614
0.005 0.315 0.7940.0005nd 0.689RVT 5 nd 5.5820.5 nd 1.3780.05 nd 0.5710.005 nd 0.6900.0005nd 1.026(表中，各測定值是兩次測定值的平均值，「nd」表示沒有測定。)PCP是農(nóng)藥或皮的軟化劑，有報告指出，其安全濃度為5mg/kg。但是，從上述結(jié)果可以看出，5mg/kg相當(dāng)于5ppm，在此濃度下由于紫外線引起的氧化損傷作用極端地上升，并且有害性提高。
BPA是有代表性的內(nèi)分泌紊亂物質(zhì)(環(huán)境激素)，在0.5ppm以上由于紫外線引起的氧化損傷作用明顯地上升，并使有害性提高。作為參考，實際有暴露可能性的BPA濃度如下所示。
河流或湖泊中 多數(shù)情況下是0.001ppm左右一般產(chǎn)業(yè)廢棄物處理廠的浸出水 最大20ppm左右PC制餐具(95℃下30分) 0.005～0.1ppm從飲水罐的涂層劑溶出 0.1ppm左右齒科用膠合劑溶出 治療齲齒后的唾液中1ppm左右魚0.02～0.3ppm左右另外，對于BPA，在日本的標(biāo)準(zhǔn)是，作為溶出部分是2.5ppm以下，作為材質(zhì)部分是500ppm以下，容許攝取量在各國共通的是0.05mg/kg/天。本發(fā)明有助于重新估量這些標(biāo)準(zhǔn)。
RVT是代表性的多酚，近年的報告表明，在紅葡萄酒中溶解有2～10ppm左右，有抗動脈硬化作用等。但是根據(jù)上述的結(jié)果，當(dāng)其存在0.5ppm以上時，由于紫外線引起的氧化損傷作用明顯地升高，有害性提高。由此，本發(fā)明也可以簡單合理地驗證以往被認為有效的物質(zhì)的有效性(或有害性)。
上述的實驗中一次測定中必要的樣品量只需10～100μl這樣少，在樣品注入后5～10分鐘以內(nèi)就能檢測出測定的峰，在15分/樣品的速度下可以連續(xù)測定。所以，采用本發(fā)明，只需1臺的HPLC在每周120小時的速度下運轉(zhuǎn)時，就可以測定480分析物/周，也就是約2000分析物/月。此事意味著，按照本發(fā)明，能夠評價迄今為止尚未報導(dǎo)過的在高速度下的被測物質(zhì)的毒性等。
另外，在實施例1中雖然可以用紫外線吸收分析裝置與電化學(xué)檢測器同時測定dG與8OhdG二者，但最好單獨測定8OHdG。這種場合，通過使用一種利用單克隆抗體的測定裝備[例如商品名8-OHdG Check(日本控制老化研究所制)]，可以在短時間內(nèi)高靈敏度地進行大量的樣品測定。實施例2制成維生素C(VC)、維生素E(VE)、兒茶素(Cate)與鞣酸(Tan)的規(guī)定濃度的溶液，在兩塊99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，將另一塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用蒸餾水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表2所示。[表2]被測物質(zhì) 濃度 放置90分鐘 UV照射90分鐘蒸餾水 0.151.23維生素C 0.001％ 6.0438.360.0001％ 0.631.510.00001％ 0.440.46維生素E 0.05％0.440.420.005％ 0.450.18
0.0005％ 0.49 0.30兒茶素 100μg/ml Nd nd10μg/ml 133.71 nd1μg/ml9.07 nd鞣酸 100μg/ml 54.00 97.0710μg/ml 5.64 19.291μg/ml0.84 1.04(表中，各測定值是兩次測定值的平均值，「nd」表示沒有測定。)從上述的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·VC雖然是強有力的抗氧化物質(zhì)，但對于水溶性的dG來說卻是作為非常強的氧化誘導(dǎo)物質(zhì)起作用。
·VE是非常穩(wěn)定的抗氧化物質(zhì)。
·兒茶素與有無紫外線的照射無關(guān)，非常強有力地誘導(dǎo)8OHdG。可以認為它的氧化能力與兒茶素的殺菌作用或者抗病毒作用有關(guān)。如兒茶素的場合，物質(zhì)所顯示的8OHdG誘導(dǎo)能力，能夠作為殺菌·滅菌效果或者抗病毒效果等指標(biāo)(有效濃度指標(biāo))的可能性高。
·鞣酸顯示高的基因損傷誘導(dǎo)作用。實施例3制成甘油(Gly)與甲醇(Meth)的規(guī)定濃度的溶液，在5塊99穴的塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，另一塊分析板同樣地在室溫下放置24小時，然后將剩下的三塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)分別照射60分鐘、90分鐘或120分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表3所示。UV照被測放 置濃度 射 120分物質(zhì) 90分鐘 24小時 60分鐘90分鐘超純水 0.3230.3820.231 0.382 0.645甘油5％0.2280.3060.344 0.399 0.54420％ 0.2130.3421.317 1.417 1.374甲醇5％0.1460.3360.181 0.209 0.33220％ 0.1860.2740.324 0.395 0.518(表中，各測定值是兩次測定值的平均值)雖然在報告中指出，甘油與甲醇都對由羥基引起的DNA損傷具有預(yù)防效果，但從本實施例的結(jié)果也可以確認它們具有抗氧化能力。特別是，能確認甘油僅在室溫放置時具有抗氧化能力，而Meth能在室溫放置時與紫外線照射時的這兩種情況下皆具有強有力的抗氧化能力。實施例4制成葡萄糖(Glu)、棉子糖(Raffi)與蔗糖(Suc)的規(guī)定濃度的溶液，在4塊99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，然后將剩下的三塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)分別照射60分鐘、90分鐘或120分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表4所示。[表4]放置90UV照射被測物質(zhì)濃度分鐘 60分鐘 90分鐘120分鐘超純水0.1950.3920.901 1.183葡萄糖 1mg/ml0.2200.0940.099 0.237
00μg/ml 0.2000.1320.2740.41410μg/ml 0.2400.2910.4580.2771μg/ml 0.2600.3840.5950.385.1μg/ml 0.2950.3990.7020.410棉子糖 1mg/ml 0.3400.1150.1760.24000μg/ml 0.4550.1580.3700.50310μg/ml 0.4050.2810.6261.3141μg/ml 0.1850.3040.8541.049.1μg/ml 0.2050.3750.6891.127蔗糖1mg/ml 0.3000.1270.3090.36400μg/ml 0.280nd 0.3790.64810μg/ml 0.2350.3330.6901.2791μg/ml 0.1850.3580.7081.143.1μg/ml 0.2350.2990.7561.073(表中，各測定值是兩次測定值的平均值，「nd」表示沒有測定。)從上述的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·抗氧化能力的強度在室溫下放置與紫外線照射的任一場合下，皆可以評價為葡萄糖＞棉子糖≈蔗糖。
·但正常的血糖值在約50～100mg/dl(0.5～1mg/ml)時，可以說血液中存在的葡萄糖相對于紫外線照射是非常有效的抗氧化物質(zhì)。
·棉子糖作為天然低聚糖的一種，添加在清涼飲料、健康飲料、健康食品等多數(shù)的食品中，雖然其抗氧化能力不如葡萄糖，但是在10μg/ml以上的濃度還是有效的。
·蔗糖顯示與棉子糖相同程度的抗氧化能力。實施例5制成全部都與精蛋白有關(guān)的物質(zhì)1精氨酸(Arg)、1-瓜氨酸(Cit)與精胺(Spe)的規(guī)定濃度的溶液，在2塊99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，將另一塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與80HdG。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與80HdG。結(jié)果如表5所示。[表5]被測物質(zhì)濃度放置90分鐘 UV照射90分鐘超純水0.2190.4221-精氨酸1mg/ml0.1730.299100μg/ml 0.1500.30510μg/ml 0.1530.2531μg/ml 0.1860.3231-瓜氨酸1mg/ml0.1560.125100μg/ml 0.1200.22510μg/ml 0.1790.3051μg/ml 0.1840.332精胺1mg/ml0.1790.112100μg/ml 0.1540.35110μg/ml 0.1500.3281μg/ml 0.1400.297(表中，各測定值是兩次測定值的平均值)精蛋白是支持基因的立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，代表的堿性氨基酸精氨酸的含量特別高(20～70％)。
1-精氨酸、1-瓜氨酸與精胺的任意一個皆可確認具有抗氧化能力，Cit與Spe在高濃度時(1mg/ml)，其抗氧化能特別高。
雖然在數(shù)據(jù)中沒有顯示，但一般地，根據(jù)本發(fā)明可以確認，酸性氨基酸具有能夠預(yù)防氧化誘導(dǎo)和堿性氨基酸氧化的傾向。實施例6
制成尿酸的各種濃度的溶液(溶液蒸餾水+0.025％FBS)，在2枚99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，另一塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用上述溶解液施加了同樣處理的物質(zhì)，測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表6所示。[表6]被測物質(zhì) 濃度 放置90分鐘UV照射90分鐘溶液 0.218 1.007尿酸 10μg/ml 0.147 15.6191μg/ml 0.175 2.3690.1μg/ml0.193 0.9660.01μg/ml 0.176 1.064(表中，各測定值是兩次測定值的平均值)尿酸被稱作生物體內(nèi)代表的抗氧化物質(zhì)。但是，從上述的結(jié)果可以明確，在生物體內(nèi)的實際血漿濃度(40～80μg/ml)下，雖然如果不是在強的氧化環(huán)境中可以抑制8OHdG的誘導(dǎo)，但是在紫外線共存的場合DNA氧化損傷的程度高，其毒性增強。實施例7制成溴酸鉀(KBrO3)的各種濃度的溶液，在2塊99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超純水中)20μl，將一塊分析板直接在室溫下放置15分鐘，另一塊分析板放置60分鐘。放置結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表7所示。[表7]被測物質(zhì)濃度放置15分鐘 放置60分鐘超純水0.155 0.289KBrO310mg/ml2.851 2.6261mg/ml 0.511 0.5630.1mg/ml 0.159 0.131(表中，各測定值是兩次測定值的平均值)雖然溴酸鉀是作為面包的漂白劑或防腐劑而廣泛使用的食品添加劑，但是從上述結(jié)果，可以看出與濃度有關(guān)的對8OHdG的誘導(dǎo)。由于放置15分鐘與放置60分鐘沒有大的差別，因此可以認為由溴酸鉀引起的氧化反應(yīng)在快速地發(fā)生后是穩(wěn)定的物質(zhì)。按現(xiàn)在的評價試驗認為安全的溴酸鉀，用本發(fā)明的方法也顯示有毒性。這樣，根據(jù)本發(fā)明可以重新研究日常經(jīng)口攝取的各種食品添加劑的容許濃度。實施例8將1mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)溶液、10％甘油(Gly)溶液、1％或2.5％甲醇(Meth)溶液、10％甘油與2.5％甲醇的混合溶液在99穴塑料分析板的各穴平均注入170μl。然后向各穴添加400μg/ml的dG(溶解于超純水中)10μl與50mg/ml的溴酸鉀(KBrO3)溶液20μl，將其直接在室溫下放置30分鐘。然后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，為了進行比較，對于只用超純水施加了同樣處理的物質(zhì)測定其dG與8OHdG。結(jié)果如表8所示。[表8]被測物質(zhì)放置30分鐘超純水2.6991mM EDTA 0.78410％甘油 1.1231％甲醇 2.0592.5％甲醇 1.685
10％甘油+2.5％甲醇 0.95410％甘油+2.5％甲醇+1mM 0.699EDTA(表中，各測定值是兩次測定值的平均值)在作為活性氧產(chǎn)生劑作用的溴酸鉀的存在下，10％甘油與2.5％甲醇與1mM EDTA的混合溶液顯示了最高的抗氧化能力。從此來看，可以知道由這三種成分組成的溶液作為各種被測溶液或被測樣品的抗氧化保存液是有效的。實施例9作為被測物質(zhì)，將超純水與規(guī)定濃度的維生素C(VC)、維生素E(VE)與葡萄糖(Glu)170μl添加至2塊99穴塑料分析板的各穴，作為添加液在各穴注入超純水或規(guī)定濃度的雙酚(BPA)20μl。然后向各穴添加400μg/ml的dG(溶解于超純水中)10μl，將一塊分析板直接在室溫下放置90分鐘，將另一塊分析板在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各穴的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。結(jié)果如表9所示。[表9]被測物質(zhì) 添加液(濃度) 放置90分鐘UV照射90分鐘超純水 超純水 0.21 0.64BPA0.22 11.58(50ppm)BPA(5ppm) 0.31 6.19BPA0.19 2.09(0.5ppm)VC(0.001％)超純水 16.3 5.75BPAVC(0.001％) 1.51 12.53(50ppm)
VCBPAnd 15.95(0.0001％)(50ppm)VCBPAnd 14.96(0.00001％) (50ppm)VE(0.001％) 超純水 0.18 0.28BPAVE(0.001％)0.29 3.79(50ppm)VEBPAnd 8.27(0.0001％)(50ppm)VEBPAnd 15.43(0.00001％) (50ppm)葡萄糖超純水 0.16 0.40(1mg/ml)葡萄糖BPA0.24 4.46(1mg/ml) (50ppm)葡萄糖BPAnd 7.52(0.1mg/ml)(50ppm)葡萄糖BPAnd 14.93(0.01mg/ml) (50ppm)(表中，各測定值是兩次測定值的平均值，「nd」表示沒有測定。)從上述的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·由于添加BPA，紫外線照射時的8OhdG隨濃度而增加。
·VE與葡萄糖，能夠有意義地抑制由于添加BPA和紫外線照射所引起的8OHdG的增加。
·0.001％的VC雖然單獨可以強力誘導(dǎo)8OHdG，但與BPA共存則能消除此作用。但是在紫外線照射時，VC不能消除由于BPA引起的8OHdG的誘導(dǎo)。
如上所述，BPA的基因氧化能力由于共存的物質(zhì)而受到各種各樣影響。
因此，通過利用本測定法，不僅可以測定誘導(dǎo)基因的氧化損傷的物質(zhì)，還能測定對能消除其氧化毒性的在該物質(zhì)中的特異的抗氧化物質(zhì)，特別地能定量地評價它們的抗氧化能力。實施例10將各種飲用水作為被測物質(zhì)(被測溶液)。測定其抗氧化能力或者氧化能力。
為使?jié)舛茸優(yōu)?0μg/ml，把在各種飲用水中溶解dG而獲得的溶液200μl注入到兩個試驗容器(溶液的表面積為36mm2)中。將一個容器在室溫下放置90分鐘，另一個容器在紫外線照射箱中用紫外線(254nm、860μW/cm2)照射90分鐘。放置或照射結(jié)束后，將各容器的溶液與等量的20％甘油溶液混合，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。
實驗的飲用水是以下的物質(zhì)。
超純水比電阻18兆歐的水(微孔系統(tǒng)制)，氧化還原電位是360mV。
自來水福岡縣春日市的一般自來水(1999年7月采集)，氧化還原電位是727mV。
處理水將上述的自來水利用市售的凈水器(水由于通過活性炭、強磁石與陶瓷制品等得到凈化)凈化而得到的水，氧化還原電位是518mV。
天然水從大分縣日田市采集的地下水(與酸雨或肥料等的地表污染隔絕的水，溶解的氮氧化物濃度在0.01ppm以下)，氧化還原電位在280mV。結(jié)果如表10所示。[表10]生成被測溶液紫外線1)相對于超純水的比率3)8OHdG2)超純水 (-) 0.131 1.00(+) 1.049 1.00自來水 (-) 0.342 2.61(+) 12.56111.97處理水 (-) 0.157 1.20(+) 0.584 0.56天然水 (-) 0.091 0.69(+) 0.516 0.491)(+)表示進行外線照射，(-)表示不進行紫外線照射，在室溫下放置90分鐘。
2)各測定值是兩次測定值的平均值。
3)表示將在超純水中生成的8OHdG的值作為1時的各數(shù)值的比率。
從上述的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·從殺菌、抗菌的觀點來看可以非常合理地判斷自來水所具有的氧化能力。
·用凈水器處理的水(處理水)顯著地抑制8OHdG，紫外線照射時的8OHdG的誘導(dǎo)比在室溫放置時的值低。
·天然水，在室溫放置與紫外線照射下都可以有意義地抑制8OHdG的誘導(dǎo)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可能將水的還原性(抗氧化能力)或者氧化能力定量化。利用此點，能夠探討飲用水與各種疾病的相關(guān)性(重傷程度、疾病的過程、治療效果、預(yù)防效果等)，特別是也能夠綜合評價含有未知物質(zhì)水溶液的基因損傷誘導(dǎo)作用。實施例11將從健康人采集的隨時的尿與實施例8中顯示的10％甘油與2.5％甲醇與1mM EDTA的混合溶液組成的抗氧化保存液在容量比1∶1下混合，迅速地冷凍(約-20℃)保存。在將要試驗前將該混合液解凍，通過使用有截止分子量50KD功能的透析膜的微量透析處理進行灌注(1μl/分)。關(guān)于如此提取的低分子的DNA有關(guān)成分(回收率約30～40％)，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，與該定量分析合并，用高靈敏度的氧化物檢測器(ENO-10，Eicom公司制)定量分析在同一被測樣品中含有的硝酸根離子(NO3-)。
結(jié)果如圖2的圖表所示。該圖中X軸是檢測出的NO3-濃度(μmol/l)與dG濃度(ng/ml)之比(NO3-/dG)，Y軸是檢測出的8OHdG濃度(pg/ml)與dG濃度(ng/ml)之比(8OHdG/dG)的對數(shù)值。另外，尿中的dG濃度與尿的濃縮率有關(guān)，通過將NO3-與8OHdG的各濃度值除以dG濃度的值，可以排除由尿的濃縮率的差異所引起的數(shù)據(jù)的誤差。特別是，根據(jù)基因的氧化損傷的危險率(Y軸)用氧化型(8OHdG)/還原型(dG)表示，可以得到更合理的指標(biāo)。作為參考，表11中顯示了使用與上述同樣的測定裝置測出的生物體樣品中的大概的8OHdG濃度與dG濃度。[表11]生物體樣品 8OHdG濃度 dG濃度人尿10-5000pg/ml 50-2000ng/ml人血漿 1-50pg/ml 5-25ng/ml人腦脊髓液 2-15pg/ml 50-200ng/ml小鼠腦組織 20-50pg/g 200-1000ng/g小鼠精巢組織50-100pg/g 2000-5000ng/g從圖2顯示的結(jié)果來看，可以明確顯示出8OHdG/dG的對數(shù)值與NO3-/dG之比是正比關(guān)系(p＜0.05)。這里意味著8OHdG/dG的對數(shù)值是與在生物體產(chǎn)生的代表的氧化物硝酸根離子濃度成正關(guān)系，顯示8OHdG/dG的對數(shù)值成為生物體的氧化應(yīng)力指標(biāo)。
另外，雖然數(shù)據(jù)沒有顯示，但從以上的研究可以判明以下的事情。
·惡化癌病患者或先天性的基因異常的患者中，8OHdG/dG的值轉(zhuǎn)位為按健康平常人繪制的近似線的上方(相對于NO3-/dG之比表示的個體全體的氧化指標(biāo)，更強地反映基因的氧化損傷和推測的8OHdG/dG之比顯示比較高的值。)·在吸煙者中，8OHdG/dG比、NO3-/dG比都有顯示較高數(shù)值的傾向。
·即使是同一人，在非正常的狀態(tài)(例如宿醉、感冒、過量運動后等)時，8OHdG/dG比、NO3-/dG比的值向右上方偏。
從以上的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·8OHdG/dG值成為有力的生物體氧化的指標(biāo)。
·根據(jù)被測者的日常生活(吃飯、運動、休養(yǎng)等)等，8OHdG/dG的值變化，成為包含心理社會的因子的廣泛意義下的壓力指標(biāo)。
·生物體定期地攝取的天然與人工化學(xué)物質(zhì)或食品類，根據(jù)定量它們的指標(biāo)帶來的影響，可以合理地評價由該天然與人工化學(xué)物質(zhì)或食品類的有害性(致癌性、促畸形性、生殖毒性等)或有益性(生物體氧化或基因核酸氧化損傷為原因?qū)е碌母鞣N疾病的治療或預(yù)防作用、恢復(fù)疲勞作用、防止老化作用等)。
·8OHdG的測定界限是0.5pg/ml(樣品量50μl)，大大地超過用現(xiàn)在的EIA法的測定界限1ng/ml。另外dG的測定界限是0.2ng/ml(樣品量50μl)。實施例12對于自來水、堿性離子水與深海鹽礦物水，進行以下的三個實驗，對它們的有益性進行評價。實驗1氮氧化物的定量為了測定硝酸性氮與亞硝酸性氮的含量的目的，定量分析上述三種樣品中的氮氧化物。氮氧化物的高含量，由于流出的肥料成分、屎尿、污水等引起的污染在過去顯示很大的問題，在水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中，定為必須在10ppm以下。另外還已知，如果嬰兒(未滿6個月)攝取了含有高濃度氮氧化物的水，則會引起正鐵血紅蛋白血癥，呼吸作用被阻礙。
測定時，使用能在微量的樣品量下同時測出NO3與NO2的高靈敏度氮氧化物分析器(Eicom公司制、ENO-1O)，用還原柱分離NO3與NO2后，根據(jù)重氮化反應(yīng)測出在吸光度540nm下所呈現(xiàn)的顏色。
結(jié)果如下所示。
實驗結(jié)果，任何的樣品都在作為自來水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。實驗2氧化還原電位的測定對上述的三種樣品進行氧化還原電位的測定。另外，作為對照，也對超純水進行了實驗。
結(jié)果如下所示。
抗氧化能力的順序是，堿性離子水＞深海鹽礦物水＞自來水。
實驗3基因氧化損傷誘導(dǎo)試驗對于上述的三種樣品，測定誘導(dǎo)基因氧化損傷的能力。在該測定中，在加入已知濃度dG溶液的玻璃管中分別加入各樣品，用紫外線照射一定時間(0(＝立即)、0.5、1與2小時)，氧化dG。然后，用反應(yīng)停止液停止反應(yīng)，用高效液相色譜將dG與其氧化物8OhdG分離，與實施例1同樣地定量分析dG與8OHdG。另外，作為對照，也進行關(guān)于超純水的實驗。
結(jié)果如下所示。超純水
自來水
堿性離子水
深海鹽礦物水
根據(jù)結(jié)果能導(dǎo)出以下的結(jié)論。而且，8OHdG/dG之比的值越大，基因的氧化損傷作用越強。
·自來水的基因氧化損傷作用在0.5小時內(nèi)最強，然后有減少的傾向。
·和超純水相比較，堿性離子水與深海鹽礦物水的基因氧化損傷作用都低。
·比較抑制氧化損傷的能力(抗氧化力)，順序是深海鹽礦物水＞堿性離子水。
如上所述，在本發(fā)明的生物學(xué)評價法中，對于不能明確地確定組成的自來水、堿性離子水、深海鹽礦物水等，能夠評價其有益性。實施例13對于以下的樣品，進行與實施例12相同的三種實驗，據(jù)此評價它們的毒性。
樣品A白酒廢液的原液樣品B樣品A的電氣分解處理水實驗1氮氧化物的定量同實施例12一樣，定量分析樣品A與B中的氮氧化物。
結(jié)果如下所示。
樣品A NO2-0.008ppm+NO3-9.8ppm＝NOx9.808ppm樣品B NO2-0.319ppm+NO3-216.0ppm＝NOx216.319ppm根據(jù)結(jié)果可知。
·作為自來水法的基準(zhǔn)，氮氧化物濃度的上限定義為10ppm，樣品A含有接近上限的氮氧化物(9.8ppm)。
·樣品B含有自來水法上限的20倍以上的氮氧化物(216.3ppm)。實驗2氧化還原電位的測定對于樣品A使用原液，而對于樣品B使用NO3-濃度稀釋為10ppm的物質(zhì)，測定氧化還原電位(銀·氯化銀電極)。
測定的結(jié)果，樣品A的氧化還原電位是184.8mv，另一方面，樣品B的氧化還原電位是715.4mv。實驗3基因氧化損傷試驗在dG溶液(200μg/ml)10μl中加入各樣品90μl，攪拌5分鐘。然后，加入反應(yīng)停止液100μl，與實施例1相同地同時測定dG與8OHdG。
結(jié)果如下所示。
從此結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·證明了樣品A的基因氧化損傷誘導(dǎo)性不高，在樣品A中能繁殖微生物。
·樣品B具有能夠?qū)G本身分解的強毒性，即使是稀釋1000倍時，也不能中和其毒性。
如上所述，按照本發(fā)明的生物學(xué)評價法，能夠評價白酒廢液與電解處理完的白酒廢液的毒性。實施例14對于實施例13的樣品B，加入以下所示的催化劑，進行處理，調(diào)查氮氧化物的含量與基因氧化損傷誘導(dǎo)性的變化。
處理條件①樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)②樣品B+磁鐵礦(2g)+C(0.5mg)③樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)④樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)+磁鐵⑤樣品B+磁鐵礦(2g)+C(0.5mg)+磁鐵⑥樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+磁鐵⑦樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)+磁鐵+US(42KHz，300W)⑧樣品B+磁鐵礦(2g)+C(0.5mg)+磁鐵+US(42KHz，300W)⑨樣品B+磁鐵礦(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+磁鐵+US(42KHz，300W)*TiO2二氧化鈦、C活性炭、US超聲波在放入了上述各催化劑的褐色瓶中，加入樣品B30ml，常溫下放置15分鐘。然后，在應(yīng)用超聲波的情況下暴露在超聲波中30分鐘。實驗1氮氧化物的定量分析將如上述處理的液體稀釋20倍，與實施例12同樣地進行氮氧化物的定量分析。
結(jié)果如下所示。
從結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·NO3的濃度在處理條件①～⑨的任意一項中都比樣品B的電解處理液減少。
·通過不單獨使用TiO2與活性炭而是將它們混合起來使用，可以改進NO3的減少效率。
·通過加入磁鐵，可使NO3的減少效果進一步上升。
·由于應(yīng)用了超聲波，NO3反而顯示了增加的傾向。這可以推測出是因為應(yīng)用了超聲波，發(fā)生了也包含氧化反應(yīng)在內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)。
·條件⑥是NO3的減少效率最高，與樣品B相比減少了約16％的NO3(189ppm→159ppm)。
·可以認為，通過對催化劑量等條件的研究，有可能進一步地提高NO3的減少效率。實驗2基因氧化損傷試驗對于樣品B與對樣品B進行了處理⑨的溶液，進行基因氧化損傷試驗，觀察基因氧化損傷誘導(dǎo)性的變化。
在該試驗中，在90μl樣品中加入dG(200μg/ml)10μl，攪拌5分鐘。然后，加入反應(yīng)停止液100μl，與實施例1同樣地同時測定dG與8OHdG。
對于催化劑處理兩天時與催化劑處理1個月時的各自的結(jié)果如下所示。[催化劑處理2天]
結(jié)果如下所示。
·樣品B能夠分解dG本身，為了中和其毒性至少需要稀釋10000倍以上。
·按照處理⑨對樣品B進行處理后得到的溶液，由于稀釋10倍以上而使其毒性驟減。所以，處理⑨的處理，能夠解除電解處理水的生物毒性的可能性高。
·由于按照處理⑨持續(xù)處理1個月，溶液的毒性驟減。
因此可以理解，處理⑨的處理，可以隨時間共同進行。
如上所述，本發(fā)明的生物學(xué)評價法是通過對利用各種各樣的方法處理的溶液毒性進行評價，這樣有助于決定最適宜的處理方法。實施例15對于進行以下的處理的各種工業(yè)廢液，進行氮氧化物的定量分析與基因氧化損傷試驗兩方面，對廢液處理結(jié)果進行調(diào)查。
樣品C使用鉑電極對工業(yè)廢液進行電解處理處理完畢時的COD350ppm處理完畢時的次氯酸濃度3,013ppm樣品D使用鉑·銥電極對工業(yè)廢液進行電解處理處理完畢時的COD2,600ppm處理完畢時的次氯酸濃度1,560ppm實驗1氮氧化物的定量樣品C與樣品D各稀釋100倍后，與實施例12相同，定量分析樣品A與B中的氮氧化物。
結(jié)果如下所示。
實驗2基因氧化損傷試驗對于樣品C與D，進行基因氧化損傷試驗，觀察基因氧化損傷誘導(dǎo)性的變化。
在該試驗中，分別向各樣品90μl中加入dG(200μg/ml)10μl，攪拌5分鐘。然后，加入反應(yīng)停止液100μl，與實施例1相同地同時測定dG與8OHdG。
結(jié)果如下所示。
從以上的結(jié)果可以導(dǎo)出以下的結(jié)論。
·樣品C的原液具有非常強的毒性。為中和其毒性必須稀釋10000倍以上。
·樣品D的毒性大部分消失了。處理條件的改變被認為是與樣品C產(chǎn)生顯著差異的原因。
如上所述，按照本發(fā)明的生物學(xué)評價法，通過對處理后的溶液進行試驗，可以對使用的處理法的有用性進行評價。實施例16關(guān)于嬰幼兒的牛奶營養(yǎng)與尿中的8OHdG排泄量的相關(guān)性按以下的順序進行試驗。
首先，把出生后1～3個月的嬰幼兒作為對象，分為母乳主體(n＝6)、奶粉主體(n＝8)、混合營養(yǎng)(n＝6)。冷凍保存從這些嬰幼兒中隨時地采集的尿，使用用單克隆抗體的8OHdG酶免疫抗體(EIA)測定裝置(日本油脂公司制、測定靈敏度＞1ng/ml)測定8OHdG的濃度。進一步，解凍同一冷凍樣品100μl后，加入到含有由40％甘油、10％甲醇與2mMEDTA組成的抗氧化保存液200μl的保存管中，配制被測尿與保存液的混合溶液。然后，在該混合溶液中，使用微量透析系統(tǒng)(50KD截斷纖維素膜、膜長10mm、Eicom公司制)，按1μl/分(37℃)的速度使回流液(20％甘油溶液)回流，將回收的回流液用冰冷卻。但是，同條件下的8OHdG與dG的標(biāo)準(zhǔn)液的回收率(30～40％)每次都用微量透析的探頭在事前確認。使用自動進樣裝置(4℃)將該回流液10μl自動注入與實施例1相同的8OHdG/dG同時測定系統(tǒng)中并進行測定。另外，將該混合溶液用100％甲醇液稀釋10倍，用離心分離沉淀蛋白成分，用高靈敏度氮氧化物測定器(ENO-10，Eicom公司制)測定其上清液中的硝酸根離子濃度。
得到的結(jié)果如圖3～5所示。
由圖3可得到以下結(jié)論。
·從ECD法與EIA法之間，可以看出其相關(guān)系數(shù)是R2＝0.767的正相關(guān)。
·此結(jié)果中，按ECD的測定值比EIA的測定值顯示相對較高的值。這是由于從采集分析物到加入保存液為止有幾個月的時間差，因此誘導(dǎo)分析物自然氧化的可能性高。
另外，由圖4可得到以下結(jié)論。
·從8OHdG與NO3-濃度之間，可以看出其相關(guān)系數(shù)是R2＝0.627的正相關(guān)。
·一般地尿中的NO3-濃度，認為是生物體的氧化壓力指標(biāo)。所以，從8OHdG與NO3-濃度顯示正的相關(guān)性，暗示出8OHdG濃度即使是作為一般的生物體氧化壓力指標(biāo)也是有用的。
進一步，由圖5可得到以下結(jié)論。
·尿中的8OHdG的排泄量，在奶粉組中比母乳營養(yǎng)組顯示有意義的高值。但是，dG的排泄量同時也顯示高值，按照8OHdG/dG之比，不存在組間的差別。
·最近發(fā)現(xiàn)，在評價被測者的健康狀態(tài)時，只關(guān)注排入到尿中的8OHdG排泄量的報導(dǎo)，從此次結(jié)果看，尿中排泄的總核酸量與攝取的營養(yǎng)組成相比有很大的差異，認為如果不同時考慮尿中的8OHdG排泄量與dG排泄量(一般約為8OHdG的10倍)，就得不到合理的基因的氧化損傷指標(biāo)。
·利用本申請的測定裝置，能經(jīng)常同時測定同一樣品種的8OHdG與dG，與其它的測定法(EIA法或LC-MAS法)相比存在著很大的優(yōu)點。
工業(yè)實用性如以上詳細地說明的那樣，利用本發(fā)明的DNA損傷指標(biāo)對天然與人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的評價法，可以在試管內(nèi)非常簡便且低成本地評價天然或人工化學(xué)物質(zhì)或食品類等的被測物質(zhì)的生物學(xué)毒性、有益性或安全性等。而且此后，根據(jù)被測物質(zhì)的重要程度，可以對培養(yǎng)細胞或?qū)嶒瀯游锏鹊纳矬w內(nèi)進行評價。
人工化學(xué)物質(zhì)即使是主要的也有10萬種以上，要對其中的每一種，實施現(xiàn)在的正式的動物實驗或臨床實驗在事實上是不可能的。所以，對于每個化學(xué)物質(zhì)能夠簡便地提示具體的DNA損傷指標(biāo)的本發(fā)明的方法，制定了粗略的安全標(biāo)準(zhǔn)濃度，另外，在討論正式的動物實驗或臨床實驗的必要性的基礎(chǔ)上能夠提供非常有用的信息。從此來看，本發(fā)明的生物學(xué)的評價法是，提供簡便地篩選各種天然或人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的毒性、食品類的有害性、有益性等的手段。
另外，本發(fā)明的方法能夠客觀地定量化市售或者開發(fā)中的健康食品或功能性食品的有益性或有害性。即，按照本發(fā)明，不僅能可靠且簡便地進行對開發(fā)中的食品類所必須的有益性、安全性等的評價，也可能重新確定現(xiàn)在市場中上市的食品類的有益性或安全性。
進而，對某種物質(zhì)(被測物質(zhì))受紫外線照射的影響，或由于活性酶類產(chǎn)生劑或基因氧化損傷性物質(zhì)的共存對該物質(zhì)的影響，也能按照本發(fā)明簡便地進行評價，可能更正確地評價自然界中的被測物質(zhì)的毒性等。
另外，在本發(fā)明的方法中，通過將含有未知物質(zhì)的水溶液作為被測溶液，能夠綜合評價該水溶液的基因損傷誘導(dǎo)作用。所以，對于組成不能明確的自來水、天然水等可以正確且簡易地得到生物毒性指標(biāo)。
根據(jù)本發(fā)明，從投喂了化學(xué)物質(zhì)或食品的包括人在內(nèi)的動物等中采集的尿或者血液等的生物體細胞獲得的產(chǎn)物中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷與2-脫氧鳥苷的含量比，能夠正確且簡易地評價該化學(xué)物質(zhì)或者食品的有害性或有益性。
根據(jù)本發(fā)明的測定裝置的高測定靈敏度，與其測定結(jié)果的可靠性是生物體樣品(特別是核酸成分)的抗氧化保存液、和抗氧化環(huán)境下的除蛋白處理(微量透析法的應(yīng)用)和本發(fā)明的8OHdG/dG同時測定系統(tǒng)的全部搭配時能最好地發(fā)揮，對大約全部的生物體樣品可以提供劃時代的DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置。即，用電化學(xué)檢測器可能測出的核酸氧化物，例如，與8OHdG同樣地通過AT到GC轉(zhuǎn)換生成的2OHdA或其還原型dA的同時測定，也可能在和8OHdG/dG大致相同的測定條件下測出。
在本發(fā)明的測定裝置中使用的微量透析處理，能夠適用于液態(tài)樣品或細胞含有樣品中的任一種樣品。另外，在除蛋白處理中，不使用酸、堿和酶反應(yīng)，因為全部的操作在低溫下進行，因此分析物的劣化少，以及DNA關(guān)聯(lián)物的提取效率只與從透析膜的回收率有關(guān)，因此，通過使灌注條件恒定化而可以減少誤差，這是其優(yōu)點。進而，若灌注液和保存液相同時，灌注后的分析物的長期保存也是可能的。
在本發(fā)明的8OHdG/dG同時測定方法中，同一樣品下，能同時地定量分析非氧化型和氧化型的單核苷，而且根據(jù)兩者比值的數(shù)據(jù)處理，能夠排除或者減輕分析物注入量等的誤差原因。而且，在一次注入樣品量在10～100μl的極小量下也可能測定，由于注入到色譜柱的主要注入液是透析膜的灌注液，因此測定噪聲小，與現(xiàn)有技術(shù)相比，能得到高的靈敏度，因此，色譜柱的使用年數(shù)延長、及測定樣品在低溫下穩(wěn)定、由于和增加了恒溫冷卻裝置的自動進樣裝置相連、系統(tǒng)的省力化成為可能，在各段提高了運用的經(jīng)濟性。
本發(fā)明的抗氧化保存液中，對于在取樣之后很快就有氧化傾向的生物體樣品，氧化物濃度可能進一步提高，與現(xiàn)有的簡單的冷凍或冷藏保存不同，實際上能抑制保存中的氧化。特別是，對來自核酸的核苷與其氧化物的濃度變化調(diào)整到最小，因此最適合于在DNA氧化損傷指標(biāo)的測定用分析物的保存。而且，該氧化保存液因為組成比較簡單且便宜，內(nèi)容成分也可能穩(wěn)定地長期保存。
權(quán)利要求
1.一種天然或人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的評價法，該評價法包括，在含有特定的天然或人工化學(xué)物質(zhì)的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
2.一種天然或人工化學(xué)物質(zhì)的生物學(xué)的評價法，該評價法包括，在含有特定的天然或人工化學(xué)物質(zhì)的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷，對該溶液進行紫外線照射和/或加入活化氧類發(fā)生劑后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量，對將來自天然或人工化學(xué)物質(zhì)的活性氧的基因核酸的氧化損傷有無相加、協(xié)同或相抵效果作為指標(biāo)，評價天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
3.一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該食品的有害性或有益性。
4.一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷，對該溶液進行紫外線照射和/或加入活化氧類發(fā)生劑后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量，對將來自該食品的活性氧的基因核酸的氧化損傷有無相加、協(xié)同或相抵效果作為指標(biāo)，評價天然或人工化學(xué)物質(zhì)的有害性或有益性。
5.一種由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有由天然或人工化學(xué)物質(zhì)組成的食品和有基因核酸的氧化損傷作用物質(zhì)的溶液中，加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該食品成分的基因核酸的氧化損傷預(yù)防作用的有效性。
6.一種被測溶液的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在含有不特定化學(xué)物質(zhì)的被測溶液中加入已知量的2′-脫氧鳥苷后，定量分析該溶液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，按照該8-羥基-2′-脫氧鳥苷的量來評價該被測溶液的抗氧化能力或者氧化能力。
7.一種化學(xué)物質(zhì)或食品的生物學(xué)評價法，該評價法包括，在一定期間內(nèi)把特定的化學(xué)物質(zhì)或食品投喂給包括人在內(nèi)的動物、植物、細菌或真菌，按照取自它們的來自生物體細胞產(chǎn)物中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷和2′-脫氧鳥苷的含量比，評價該化學(xué)物質(zhì)或者食品的有害性或有益性。
8.一種DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其特征在于，該裝置具有a)用于與液態(tài)生物體樣品混合并進行冷凍保存，其準(zhǔn)備量為該樣品的1～5倍的抗氧化保存液，b)微量透析裝置，該裝置通過向上述液態(tài)生物體樣品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸漬的透析膜管內(nèi)，灌注由甘油水溶液組成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物質(zhì)通過，同時對回收液進行微量透析處理，使回收液中的甘油濃度目標(biāo)值在10～20重量％的范圍內(nèi)，c)具有用于從上述微量透析處理的回收液中分離出低分子DNA關(guān)聯(lián)物質(zhì)的色譜柱的高效液相色譜，d)用于對上述色譜柱的洗脫液進行紫外線吸收分析和用于測定DNA核酸的量的紫外線吸收分析裝置，e)用于對上述色譜柱的洗脫液進行電化學(xué)分析和用于測定DNA氧化損傷物的量的電化學(xué)測定器，f)根據(jù)測得的DNA核酸的量和DNA氧化損傷物的量的比率求出上述液態(tài)生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
9.一種DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其特征在于，該裝置具有a)用于把由含有細胞成分的生物體樣品和相當(dāng)于其1～5倍量的上述抗氧化保存液的混合溶液密封而且冷凍保存的組織細胞粉碎用的管，b)細胞粉碎與固體物質(zhì)分離裝置，該裝置通過把在密封·冷卻后的管內(nèi)生物體樣品中含有的組織粉碎來使細胞內(nèi)外的游離核酸溶出到保存液中，同時使固體物質(zhì)從粉碎樣品中分離出來并沉淀，c)微量透析裝置，該裝置通過向上述液態(tài)生物體樣品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸漬的透析膜管內(nèi)，灌注由甘油水溶液組成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物質(zhì)通過，同時對回收液進行微量透析處理，使回收液中的甘油濃度目標(biāo)值在10～20重量％的范圍內(nèi)，d)具有用于從上述微量透析處理的回收液中分離出低分子DNA關(guān)聯(lián)物質(zhì)的色譜柱的高效液相色譜，e)用于對上述色譜柱的洗出液進行紫外線吸收分析和用于測定DNA核酸的量的紫外線吸收分析裝置，f)用于對上述色譜柱的洗出液進行電化學(xué)分析和用于測定DNA氧化損傷物的量的電化學(xué)測定器，g)根據(jù)測得的DNA核酸的量和DNA氧化損傷物的量的比率求出上述液態(tài)生物體樣品中的DNA氧化損傷指標(biāo)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的DNA氧化損傷指標(biāo)的測定裝置，其中，上述抗氧化保存液是一種含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇、與10～40重量％的甘油的水溶液。
11.一種生物體樣品的抗氧化保存液，該保存液由含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇與10～40重量％的甘油的水溶液組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對龐大種類的天然或人工化學(xué)物質(zhì)或食品等的生物學(xué)的有害性或有效性進行合理而且簡易評價的生物學(xué)評價方法。該生物學(xué)的評價方法包括，在含有被檢物質(zhì)(藥品、農(nóng)藥、功能性食品等)的溶液中加入已知量的2′－脫氧鳥苷(dG)，根據(jù)需要對其進行紫外線照射和/或添加活性氧發(fā)生劑，然后定量分析上述溶液中的8－羥基－2′－脫氧鳥苷(80HdG)，根據(jù)該80HdG的量評價上述被檢物質(zhì)是否有毒性或有效性(80HdG越多，被檢物質(zhì)的有害性就越高，80HdG越少，有害性就越低)。另外，本發(fā)明還提供用于實施該生物學(xué)評價方法所需的測定裝置是以及在該測定裝置中使用的抗氧化保存液。
文檔編號G01N33/52GK1420984SQ01806587
公開日2003年5月28日 申請日期2001年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月16日
發(fā)明者高木厚司 申請人:有限會社環(huán)境技術(shù)研究所, 株式會社產(chǎn)學(xué)連攜機構(gòu)九州