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用于生產(chǎn)生物分子的方法和設(shè)備的制作方法

文檔序號:5075695閱讀:323來源:國知局
專利名稱:用于生產(chǎn)生物分子的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物分子,特別是多核苷酸例如質(zhì)粒DNA的領(lǐng)域。特別地,本發(fā)明 涉及溫和的澄清步驟,其利用通過產(chǎn)生氣體氣泡(無氣體/空氣的噴射)來調(diào)節(jié)的先進的 漂浮方法(floatation method)。本發(fā)明特別適合于工業(yè)規(guī)模的方法,其包括以下步驟在 堿條件下的細胞溶胞,之后的中和以及隨后的細胞溶胞產(chǎn)物的澄清,而所有這些步驟以完 全連續(xù)方式運行。
背景技術(shù)
在二十世紀最后二十五年以及二十一世紀初,在分子和細胞生物學(xué)上的發(fā)展導(dǎo)致 用于生產(chǎn)重組生物分子(生物聚合物)的新技術(shù)的產(chǎn)生。這組大分子包括,例如蛋白質(zhì)、核 酸和多糖。它們越來越多地用于人類的衛(wèi)生保健、用于疾病的診斷、預(yù)防和治療領(lǐng)域。近年來,在診斷、基因治療和核酸疫苗領(lǐng)域中用多核苷酸取得了一些最具革命性 的進步。這些應(yīng)用的共同之處在于,將DNA引入到細胞中,特別是將染色體外DNA或RNA引 入到細胞中以輔助診斷、治療或預(yù)防的效果。多核苷酸有代表性的成員為信使RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)和核糖體 RNA (rRNA)、基因組DNA (gDNA)或染色體DNA (cDNA)、以及質(zhì)粒DNA (pDNA)。這些大分子可以 是單鏈或雙鏈的。根據(jù)其大小和形狀,多核苷酸對于酶降解(DNA酶和RNA酶)和剪切力是敏感的。 尤其是染色體DNA,當(dāng)處于其變性形式和糾纏形式(entangled form)時,其對于機械壓力 非常敏感,產(chǎn)生與PDNA具有相似性質(zhì)的片段。對于暴露在剪切力下的期間,這一點變得越 來越重要(Ciccolini LAS,Shamlou PA, Titchener-Hooker N, Ward JM, Dunnill P(1998) Biotechnol Bioeng 60 768 ;Ciccolini LAS, Shamlou PA, Titchener-Hooker N(2002) Biotechnol Bioeng 77 796)。質(zhì)粒(pDNA)是雙鏈的染色體外環(huán)狀多核苷酸。大部分藥物用質(zhì)粒的大小范圍為 3 lOkbp,相當(dāng)于2X IO6 7X IO6的分子量且其具有的旋轉(zhuǎn)半徑為IOOnm或更高(Tyn M, Gusek T (1990) Biotech. Bioeng. 35 :327)。有報道顯示在某些情況下,多順反子/多價質(zhì)粒 大于 20kbp,其編碼幾個不同的蛋白質(zhì)(MUller PP, Oumard A, Wirth D,Kroger A, Hauser H, in :Schleef M(2001)Plasmids for Gene Therapy and Vaccination, ffiley-VCH, Weinheim,pll9)??梢詤^(qū)分pDNA的不同拓撲形式。超螺旋(sc)或共價閉合環(huán)狀(ccc)形 式被認為對于治療用途是最穩(wěn)定的,因此其是所期望的形式。其它的拓撲PDNA形式是從 ccc形式通過單鏈切口(開環(huán)的或oc)或雙鏈切口(線性的)而產(chǎn)生,或者由接合產(chǎn)生。物 理的、化學(xué)的或酶的活性可以引起鏈的斷裂。對于治療用途而言,ccc形式的比例是用于評 價pDNA制品質(zhì)量的主要參數(shù)。在基因治療和遺傳疫苗領(lǐng)域,不斷增加的臨床試驗數(shù)量反映出pDNA的潛在優(yōu)點。 目前,還觀察到根據(jù)cGMP規(guī)則生產(chǎn)藥物級pDNA的需求在持續(xù)不斷的增加。特別是針對基 于pDNA的疫苗(pDNA-based vaccine)的市場供應(yīng),預(yù)計確定每年將需要許多克或甚至幾 千克的經(jīng)純化的pDNA。因此,需要可以在工業(yè)規(guī)模上運行的過程。這些生產(chǎn)過程必須滿足規(guī)章的要求(例如FDA,EMEA),并應(yīng)當(dāng)是經(jīng)濟上可行的和必須是具有生產(chǎn)性和耐用的。以往,已經(jīng)開發(fā)出的大部分生物技術(shù)生產(chǎn)過程是用于生產(chǎn)經(jīng)純化的重組蛋白質(zhì) 的。由于多核苷酸和蛋白質(zhì)在物理-化學(xué)性質(zhì)上存在不同,這些方法難以適用于多核苷酸 的生產(chǎn)。建立了基于傳統(tǒng)實驗室規(guī)模實驗設(shè)計的生產(chǎn)過程的制造業(yè)者,面臨涉及生產(chǎn)性、可 規(guī)?;约爱a(chǎn)品的成本(COGS)方面的越來越多嚴格的限制。因此,需要可以用于多核苷酸 的方法,特別是用于在制造業(yè)規(guī)模生產(chǎn)PDNA的方法。簡言之,用于生產(chǎn)不被宿主分泌的重組生物分子的過程,特別是PDNA和大蛋白 質(zhì),其步驟如下a)發(fā)酵(培養(yǎng)攜帶有目標(biāo)生物分子的細胞以及任選從發(fā)酵液中收獲所述細胞),b)細胞破碎(從細胞中釋放目標(biāo)生物分子),c)分離和純化(從雜質(zhì)中分離出目標(biāo)生物分子)。更為具體地,上述這些步驟的特征在于用于多核苷酸的生產(chǎn),特別是用于生產(chǎn) pDNA,如下所述。通常,大腸桿菌是用于pDNA生產(chǎn)的最為常用的宿主。其它細菌、酵母、哺乳動物和 昆蟲細胞也可以在發(fā)酵步驟中用作宿主細胞。將選擇適合的宿主菌株、良好限定的培養(yǎng)基 用于高細胞密度過程以及保持高質(zhì)??截悢?shù),這對于PDNA的質(zhì)量是非常重要的,對于實現(xiàn) 耐用經(jīng)濟的過程也是非常關(guān)鍵的(Werner RG, Urthaler J, KolImann F, Huber H,Necina R, Konopitzky K(2002)Contract Services Europe, a supplement to Pharm. Techno1. Eur. p. 34)。發(fā)酵之后,通常收獲細胞,大部分是通過離心裝置。將收獲的濕生物質(zhì)重懸在適合 的緩沖液中。在最終從雜質(zhì)(與宿主相關(guān)的例如蛋白質(zhì)、gDNA、RNA和內(nèi)毒素;與產(chǎn)物相關(guān) 的例如不期望的多核苷酸亞型(polynucleotide isoforms);與過程相關(guān)的例如發(fā)酵培 養(yǎng)基的剩余化合物)中分離出多核苷酸之前,需要對細胞進行處理,即可以直接處理也可 以在冷凍和解凍之后處理。任選地,在進一步處理前收獲和重懸細胞,對發(fā)酵液本身可以進 行進一步處理(W0 97/29190)。處理過程從破碎細胞開始(釋放多核苷酸)并以回收含有目標(biāo)多核苷酸的 澄清的溶液為終止。在后續(xù)的分離目標(biāo)多核苷酸的過程中(通過例如柱色譜、超滲濾 (ultradiafiltration)、提取或沉淀)需要將其從雜質(zhì)中分離出來??梢酝ㄟ^物理的、化學(xué)的或酶方法來實現(xiàn)細胞的破碎。通常,破碎和從細菌細胞中 釋放出目標(biāo)多核苷酸是通過Birnboim和Doly(Birnboim HC,Doly J(1979)Nucl Acids Res 7 1513)所描述的堿裂解來進行的。本文中公開的破碎/釋放過程可以分為兩個步驟,第一步是內(nèi)部的細胞破碎或溶 胞步驟,和第二步中和步驟。在堿裂解中,細胞經(jīng)堿溶液(優(yōu)選NaOH)和表面活性劑(優(yōu)選十二烷基硫酸鈉 (SDS))處理。在這種環(huán)境下,細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞從而釋放出目標(biāo)多核苷酸及其它與細胞相 關(guān)的化合物。最后,通過加入酸性鹽來中和該溶液,優(yōu)選加入醋酸鹽,特別優(yōu)選醋酸鉀(KAc) 或醋酸鈉(NaAc)。在中和細胞碎片的過程中,蛋白質(zhì)以及gDNA通過形成絮狀沉淀物與十二 燒基硫酸鹽共沉淀(Levy MS, Collins IJ, Yim SS, et al. (1999)Bioprocess Eng 20:7)。在堿裂解和中和之后的步驟中,需要將沉淀物從含有質(zhì)粒的溶液中分離出來。這個步驟,在本發(fā)明的含義下,被稱為“澄清步驟(clarification step)”。關(guān)于澄清步驟,利用固定角轉(zhuǎn)子的離心是最經(jīng)常使用的、用于實驗室和預(yù)準備規(guī) IlW^fe (Ferreira GNM, Cabral JMS, Prazeres DMF(1999)Biotechnol Prog 15:725)。 當(dāng)溶胞產(chǎn)物的量通常控制在瓶子中時,澄清的液相(clearer liquid phase)從漂浮的絮 凝物,以及一會兒之后一些下降(不漂浮)的沉淀物的較大的相中分離出來。僅吸取和 過濾澄清的液相。另外大量的絮凝物立即被使用的過濾器所阻擋。當(dāng)由于機械壓力導(dǎo)致 絮凝物被破壞時,會導(dǎo)致漂浮的趨勢降低以及差的相分離,在澄清液體中不斷增加的絮凝 物的量甚至?xí)鼮樽璧K過濾過程。通常來說,漂浮的絮凝物層不是非常致密的,因此下 面的澄清相的比例占總體積(澄清相和絮凝物相)的約50-70%。由于在絮凝物相的液 體中含有剩余的質(zhì)粒 DNA(Theodossiou I, Collins IC,Ward JM, Thomas ORT,Dunnhill P (1997)Bioproc Eng 16 :175),必須重視此時損失高達至 40% (Urthaler J, Ascher C, Wohrer H5Necina R(2007) J Biotechnoll28 :132)。進一步,還應(yīng)當(dāng)考慮(多)核苷酸例如 pDNA和不同的過濾器介質(zhì)之間較強的吸附(Theodossiou I, Collins IJ, Ward JM, Thomas ORT, Dunnhill P(1997)Bioprocess Eng 16 175 ;Theodossiou I, Thomas ORT, Dunnhill P(1999)Bioprocess Eng 20 :147)。通常主體過濾器(bulk filter)材料或袋式過濾器用來 使溶胞產(chǎn)物澄清。由于這些材料即不能經(jīng)檢驗有無法規(guī)模化,因此它們不能應(yīng)用于制造業(yè) 規(guī)模上的藥物級質(zhì)粒的生產(chǎn)中。近期的技術(shù)利用膨脹床吸附(expanded bed adsorption) (EBA),該技術(shù)可以在捕獲所期望的產(chǎn)物的同時除去沉淀物質(zhì)(Chase HA(1994)Trends Biotechnol 12:296)。然而,應(yīng)當(dāng)考慮由于在中和過程中產(chǎn)生的凝聚絮凝物的較大的 直徑,EBA 之前的預(yù)澄清是重要的(Ferreira GNM,Cabral JMS,Prazeres DMF(2000) Bioseparation 9 1 ;Varley DL, Hitchkock AG, Weiss ΑΜΕ, et al. (1998)Bioseparation 8 209)。已經(jīng)有一些嘗試來開發(fā)針對上述每一個步驟的改進技術(shù),這些步驟通常以非連續(xù) 的開放系統(tǒng)來運轉(zhuǎn),這承擔(dān)著可能污染的風(fēng)險。該處理步驟不是自動的,因此其結(jié)果是取決 于使用者的。因此所使用的方法和設(shè)備不適合用于制造業(yè)規(guī)模上的藥物級多核苷酸的生 產(chǎn)。對于這些過程,控制大pDNA量的唯一方式就是增加設(shè)備,例如平行地運行這些設(shè)備??紤]到目標(biāo)多核苷酸的進一步純化,通常需要調(diào)整溶液的參數(shù)(例如鹽的組分、 導(dǎo)電性、PH值)以保證所期望的多核苷酸與樹脂的結(jié)合(該調(diào)整步驟,在本發(fā)明的含義內(nèi), 被稱為“調(diào)節(jié)步驟(conditioning step)”)。隨后,將該溶液經(jīng)過第一色譜步驟(捕獲步 驟)ο可能是最難以克服的限制因素即溶胞產(chǎn)物的澄清。為了獲得澄清的溶胞產(chǎn) 物,經(jīng)沉淀的物質(zhì)必須從含有多核苷酸的溶液中分離出來。傳統(tǒng)地,該澄清步驟以分 批的方式(batchwise mode)來進行,利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù),例如過濾或離心(例 如US 2001/0034435, WO 02/04027)。最為普遍的是,所述過濾器是深度過濾器(cbpth filter) (WO 00/09680)。其它用于粗過濾(macrofiltration)的過濾方式是由壓縮濾網(wǎng) (compressed gauze)或與此相當(dāng)?shù)倪^濾器材料構(gòu)成的大孔隔膜(macroporous diaphragm) (EP 0376080)。根據(jù)一些方案,過濾在存在助濾器(filter aid)的條件下進行(W0 95/21250,W002/057446,US 2002/0012990)。WO 96/21729 公開了如下方法在離心步驟之 后包含使用硅藻土的過濾步驟,從而實現(xiàn)減少RNA含量的額外效果。另外,EP 0814156中描述了以膜過濾器和疏松基質(zhì)(loose matrix)(玻璃、硅膠、陰離子交換樹脂或硅藻土)協(xié) 同地作為 DNA 的載體。根據(jù) WO 96/08500, WO 93/11218,EP 0616638 和 EP 0875271,通過 下述設(shè)備來完成澄清,該設(shè)備的過濾部分可以由不同材料(例如玻璃、硅膠、氧化鋁)以疏 松顆粒、層或過濾器板的形式(特別是具有不均勻的孔徑分布)構(gòu)成。由重力、真空、壓力 或離心來實現(xiàn)通過過濾器的流動。在WO 2004/024283和WO 2004/108260中描述了實現(xiàn)絮 凝物和溶胞產(chǎn)物分離的其它選擇。其中,在中和之前或中和的過程中用于該過程的緩沖液 /溶液中的一種,與通過氣體通道(gas port)導(dǎo)入的可控氣流相混合。氣體的良好分布是 通過鼓泡石(sparge stone)來實現(xiàn)的,該鼓泡石在與溶液/懸浮液相連的流體中且提供一 定大小的小氣泡。小氣泡附著到中和過程中產(chǎn)生的沉淀物上。經(jīng)中和的已溶解的細胞溶液 被收集到槽中并且保持一段時間,需要該過程以使得大量絮凝物漂浮(由吸附的氣泡來調(diào) 節(jié))。然后,通過一組過濾器分批地過濾下面的溶胞產(chǎn)物相。在另一個方案中,收集溶胞產(chǎn) 物絮凝物混合物(在具有或不具有氣體噴射的條件下得到)到槽中,設(shè)計該槽從而使得還 可以在絮凝物/溶胞產(chǎn)物相上施用減壓(真空)(W0 03/070942,WO 2004/108260)。真空 促進絮凝物的漂浮并引導(dǎo)它們到收集槽的頂部。這些方法均以非連續(xù)的模式進行澄清,并 且需要用于澄清的額外的過濾步驟。在WO 99/37750和WO 96/02658中公開了將離心用作 連續(xù)的澄清方法(例如碟式離心(disc stack centrifuge)或沉降式離心)。還公開了為 了澄清的目的,在過濾之后結(jié)合離心的方法(W0 02/26966,W096/02658)。上述澄清方法通常在物質(zhì)與中和緩沖液溫育一定的時間后進行。該步驟無法與在 前的和隨后的步驟連續(xù)連接,其規(guī)模受到限制。除此之外,過濾技術(shù)通常在可能具有污染風(fēng) 險的開放設(shè)備中進行。由于用于cGMP過程的任何材料必須經(jīng)過驗證,盡管另外的助濾器提 高了過濾過程的性能,但通常避免使用。本領(lǐng)域中已知的澄清方法的另一個缺點是絮凝物 和溶胞產(chǎn)物的接觸時間長(在分離之前/分離過程中),應(yīng)當(dāng)避免這樣長時間的接觸從而減 少雜質(zhì)再溶解和酶降解的風(fēng)險。通常來說,傳統(tǒng)的過濾器具有受限的生產(chǎn)量以及會迅速地被大量絮凝物堵塞。此 外,通過沉淀物的持續(xù)流動被物質(zhì)所阻擋可能會導(dǎo)致絮凝物的破壞和雜質(zhì)的再溶解,這會 再次對后續(xù)步驟產(chǎn)生負面影響。對于大量PDNA,已經(jīng)有建議增加一些設(shè)備(例如平行運行 這些設(shè)備),這不是所期望的而且對于制造業(yè)規(guī)模是不利的。一些離心技術(shù)可以(半)連續(xù)地運行,但是由于多核苷酸對于剪切力的敏感性,這 種處理可能會導(dǎo)致質(zhì)粒DNA和基因組DNA的降解,以及由于絮凝物的破裂經(jīng)沉淀的雜質(zhì)也 會發(fā)生脫離。當(dāng)在最終純化之前進行調(diào)節(jié)步驟時,調(diào)節(jié)澄清的溶胞產(chǎn)物的鹽組成和/或?qū)щ娦?和/或PH值到預(yù)定的數(shù)值,從而確保在后續(xù)的捕獲步驟中期望的分子結(jié)合到樹脂上。有時, 添加調(diào)節(jié)步驟是因為預(yù)純化的原因(例如如W000/09680所述的內(nèi)毒素的除去)。在本領(lǐng)域中已知一些用于捕獲目標(biāo)多核苷酸的技術(shù),例如切向流過濾(TO 01/07599)、大小排阻色譜法(W0 96/21729,WO 98/11208)、陰離子交換色譜法(W0 00/09680,US 6, 410, 274, WO 99/16869)和疏水作用色譜法(W0 02/04027)。大多數(shù)上述過程步驟是以非連續(xù)和/或非自動模式運轉(zhuǎn)的。通常來說,程序步驟 不與完全連續(xù)系統(tǒng)相連。在EP 0814156,WO 93/11218,EP 0616638 和 EP 0875271 中公開了如下過程,其中細胞溶胞、中和、澄清、洗滌、任選調(diào)節(jié)和捕獲步驟是在同一設(shè)備中進行的。這些方法是開放 系統(tǒng),其以非自動/非連續(xù)方式運行,包括一些貯藏步驟(holding st印)。所述設(shè)備僅適用 于實驗室規(guī)模,且無法轉(zhuǎn)移為制造業(yè)規(guī)模。這些技術(shù)還缺乏用于cGMP大規(guī)模生產(chǎn)的再現(xiàn)性 和適應(yīng)性。另外,還描述了結(jié)合使用不同的設(shè)備,其中單個步驟以連續(xù)方式直接彼此相連(W0 96/02658, WO 00/09680, WO 02/26966, US 2001/0034435 W097/23601, WO 00/05358, WO 99/37750)。但是這些過程中沒有一個聯(lián)合了多于三個的步驟,所述步驟屬于以重懸步驟為 開始到以捕獲步驟為終止的一系列步驟。在這些方法中使用的設(shè)備即無法保證均勻地進行 混合還可能會對溶解物施加不利的剪切力。另外,之前描述的一些缺點會阻礙所使用的澄 清技術(shù)(過濾,離心)。WO 2004/085643 以及 Urthaler J, Ascher C,W^hrer H和 Necina R (2007) (J Biotechnol 128:132)公開了聯(lián)合多于三個步驟的、能夠?qū)崿F(xiàn)自動連續(xù)模式且適合用于目 標(biāo)多核苷酸工業(yè)生產(chǎn)的方法和設(shè)備。這樣的分離不被宿主細胞分泌的多核苷酸的過程包 括以改進的堿裂解方法作為細胞破碎步驟、中和步驟、澄清步驟、以及任選調(diào)節(jié)步驟和/ 或在純化生物分子之后的濃縮步驟。進行所述澄清,通過使包含中和過程中得到的沉淀物 和溶胞產(chǎn)物的混合物、溫和地分散并且在澄清反應(yīng)器中分離,在所述澄清反應(yīng)器的下部部 分地填充保留材料(retention material)。將沉淀物保持在保留材料層的頂部和內(nèi)部。所 述澄清的溶胞產(chǎn)物經(jīng)由反應(yīng)器底部的出口連續(xù)地聚集。盡管該方法和該設(shè)備可以規(guī)?;?且可以以連續(xù)方式工作,但澄清設(shè)備的容量受到限制。為了增加在上述這個裝備中可以處 理的生物質(zhì)的量,不得不增加澄清槽的體積或者必須使用另外的澄清槽來收集所有量的絮 凝物,從而增加了設(shè)備成本。任選地,為了從澄清反應(yīng)器中除去絮凝物不得不中止生產(chǎn)過 程,由此延遲了生產(chǎn)過程并導(dǎo)致額外的工作努力,以及還會增加污染的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于從細胞培養(yǎng)物中分離目標(biāo)多核苷酸的方法和設(shè)備,從而 克服已知方法的限制。這樣的方法和設(shè)備還應(yīng)當(dāng)適用于治療用途多核苷酸的連續(xù)生產(chǎn)。因 此,這樣的過程應(yīng)當(dāng)即不需要使用酶例如RNA酶和溶菌酶,也不需要使用除SDS之外的表面 活性劑。另外,所述方法和設(shè)備應(yīng)當(dāng)適用于高達至數(shù)千克的大量多核苷酸的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。 工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過程的先決條件是完全連續(xù)地進行細胞溶胞、中和以及后續(xù)的澄清過程(參 考圖1)。為了解決所述問題,下述發(fā)明進行了如下步驟基于WO 2004/085643所公開的方法和設(shè)備,進行了大量的實驗以克服WO 2004/085643中所描述的澄清步驟的限制。盡管在WO 2004/085643中說明的所述方法和設(shè) 備是可以規(guī)?;模⑶铱梢砸赃B續(xù)方式工作,但是所述澄清設(shè)備的容量受到了限制。這些 實驗是針對提高絮凝物的漂浮,以及同時實現(xiàn)完全連續(xù)地分離所述絮凝物和溶胞產(chǎn)物的實 驗。除了向溶胞產(chǎn)物絮凝物混合物通氣之外,還檢測了緩沖液標(biāo)準組成的不同的添加物以 提高漂浮。令人驚奇地是,發(fā)現(xiàn)了在中和步驟之前,之時或之后添加碳酸鹽導(dǎo)致顯著地改善 了在中和步驟中產(chǎn)生的絮凝物的漂浮。因此,由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的小氣泡調(diào)節(jié)改善的漂浮。當(dāng)作為固體鹽或溶解于中性到堿性的水溶液中的碳酸鹽與酸性溶液接觸時,根據(jù)下述反應(yīng)方 程式,從碳酸鹽中釋放出CO2:
CO]- + IH3O+ — COl + 3//20在本發(fā)明的一個實施方式中,所述碳酸鹽溶解于單獨的緩沖液/溶液中。在另一 個實施方式中,所述碳酸鹽溶解于重懸緩沖液或溶胞溶液中。任選地,將所述碳酸鹽溶解到中和步驟之前產(chǎn)生的懸浮液中(例如將所述碳酸鹽 添加到用于重懸的緩沖液或溶胞溶液中)。溶解在所述重懸緩沖液或溶胞溶液中(在中和 之前溶解)的碳酸鹽的使用濃度的范圍為約0. 01 1M,優(yōu)選為0. 02 0. 1M。CO2氣泡的 產(chǎn)生開始于當(dāng)將溶解的細胞溶液與酸性的中和溶液相接觸時,并隨著混合繼續(xù)產(chǎn)生。同時 小氣泡附著在產(chǎn)生的沉淀物(十二烷基硫酸鹽(鉀)與細胞碎片、蛋白質(zhì)和基因組DNA共 沉淀的絮凝物)上,從而促進了后續(xù)的漂浮。該過程實現(xiàn)了絮凝物和溶胞產(chǎn)物的優(yōu)異的相 分離。這是以下過程的先決條件該過程步驟的完全連續(xù)運行,絮凝物和澄清的溶胞產(chǎn)物的 快速分離,以及經(jīng)沉淀的雜質(zhì)和含有PDNA的溶液的接觸時間短。這些結(jié)果令人驚奇地顯示出在特定位置上具有入口的簡單容器可以實現(xiàn)在容器 的底部連續(xù)地排出(收集)(預(yù))澄清的溶胞產(chǎn)物。可以在容器的頂部收集所述絮凝物, 包括少量的剩余溶胞產(chǎn)物。所述容器,其也為本發(fā)明的主題,是一個流體可以通過的容器 (flow-through container),優(yōu)選形成圓柱體或管的中空體,特別是玻璃或不銹鋼管。該管 也可以由塑料或任何其它生物藥物生產(chǎn)可以接受的材料制成。可以進一步處理所述收集的絮凝物,例如通過清洗和/或排液(drain)來回收絮 凝物內(nèi)的剩余溶胞產(chǎn)物。除了傳統(tǒng)方法例如離心和/或過濾之外,在優(yōu)選的實施方式中,可 以將WO 2004/085643中所描述的澄清設(shè)備用于上述這些目的。通過后續(xù)的純化步驟進一 步處理在圓柱體出口收集的所述溶胞產(chǎn)物。可以將從絮凝物清洗和排液步驟中又回收的液體添加到在圓柱體底部收集的溶 胞產(chǎn)物中。在任選的實施方式中,可以再處理在圓柱體頂部收集的所述絮凝物,通過將這些 絮凝物加入到已中和的溶解的細胞溶液中或者直接加入到分離圓柱體中的混合物中。在酸性條件下,從碳酸鹽(在中和之前,之時或之后加入溶解的或固體形式)中連 續(xù)釋放CO2,結(jié)果促進了中和過程中產(chǎn)生的沉淀絮凝物的連續(xù)漂浮,這是新穎的,所述酸性 條件是在連續(xù)工業(yè)規(guī)模的堿裂解過程中由碳酸鹽與已中和的溶解的細胞溶液的化學(xué)反應(yīng) 所形成的。另外,應(yīng)用/結(jié)合上述新穎的技術(shù)與允許在工業(yè)規(guī)模連續(xù)分離絮凝物和溶胞產(chǎn) 物的設(shè)備是新穎的。新型CO2-調(diào)節(jié)漂浮和用于連續(xù)絮凝物分離具有自動的連續(xù)溶胞和中 和的新型設(shè)備(如WO 2004/085643所述)的結(jié)合提供了下述顯著的優(yōu)點,并解決了規(guī)模的 限制,因此其對于大量質(zhì)粒DNA的經(jīng)濟生產(chǎn)是至關(guān)重要的_用于由生物質(zhì)產(chǎn)生澄清的溶胞產(chǎn)物的完全連續(xù)和自動的生產(chǎn)線_完全封閉的可CIP系統(tǒng)-減少了設(shè)備的大小和成本-不需要額外設(shè)備或處理(例如不需要噴射氣體)而改善了漂浮-簡單并且無需進行復(fù)雜的調(diào)節(jié)和維護-耐用并且可重現(xiàn)
-溫和的(減少了絮凝物上的機械壓力從而減少了已沉淀雜質(zhì)(雜質(zhì)附著在沉淀物上)的再溶解_提高了產(chǎn)率,由于更為致密的絮凝物層從而使留在絮凝物-溶胞產(chǎn)物之間的 pDNA更少)-最小化已沉淀雜質(zhì)(絮凝物)和含有pDNA的液體(溶胞產(chǎn)物)的接觸時間
具體實施例方式本發(fā)明利用在酸性條件下由碳酸鹽釋放出的CO2,其具有的促進絮狀沉淀物漂浮 的效果,所述絮狀沉淀物是在PDNA堿裂解步驟的中和過程中產(chǎn)生的,并可以在特別設(shè)計的 設(shè)備中實現(xiàn)上述這些絮凝物的連續(xù)分離。因此,所述碳酸鹽只要在絮凝物分離之前加入到 所述過程中即可,其加入的時間或?qū)⑵浼尤氲骄彌_液、溶液或懸浮液中不重要。碳酸鹽即可 以在中性或堿性條件下在中和之前加入,也可以加入到已經(jīng)被中和的、具有酸性PH含有絮 凝物的溶解的細胞溶液中。在所有的情況中,CO2釋放發(fā)生于含有碳酸鹽的溶液或懸浮液或 者固體碳酸鹽與已中和的溶解的細胞溶液或中和溶液相接觸時。在生物分子(特別是pDNA)的生產(chǎn)過程的單個步驟中應(yīng)用堿裂解如下所述??梢?根據(jù)已知的方法進行步驟a) c)和步驟e)。a)發(fā)酵/培養(yǎng)(以及任選收獲和重懸)在本發(fā)明的方法中,優(yōu)選使用大腸桿菌作為宿主,特別是當(dāng)目標(biāo)生物分子為DNA 時。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法以分批、流加或連續(xù)方式來進行發(fā)酵。收獲也可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法來進行。在本發(fā)明的一個實施方式中,使用 連續(xù)運轉(zhuǎn)設(shè)備,例如管式離心機(tube centrifuge)或分離器從培養(yǎng)培養(yǎng)基中分離出細胞。 如果在進一步處理在先冷凍細胞(生物質(zhì)),則可以在收獲后直接或?qū)⒓毎貞业竭m合的 緩沖液之后進行細胞的冷凍(包括冷凍造粒(cryopelletation)),常用的緩沖液在pH8的 條件下,含有0.05M Tris,0. OlM EDTA。在這種情況下,在堿裂解之前不需要加入另外的重 懸緩沖液或只需加入少量的重懸緩沖液。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中,所述重懸緩沖液任 選含有碳酸鹽。在本發(fā)明任選的實施方式中,可以省略收獲和重懸細胞的步驟。在這種情況下,可 以直接在溶胞步驟b)中進一步處理所述發(fā)酵液,而不需要分離細胞和培養(yǎng)上清液。b)通過堿裂解破碎原則上,步驟b)可以根據(jù)本身已知的方法來進行,優(yōu)選根據(jù)溫和的,并且可以使 用含有表面活性劑的堿裂解溶液,以連續(xù)和自動模式運行的方法來進行。常用的溶胞溶液 由NaOH (0. 2M)和十二烷基硫酸鈉(SDS) (1%)組成(優(yōu)選的),但原則上來說,也可以使用 其它堿溶液、表面活性劑和濃度(參考例如WO 97/29190),在本發(fā)明的方法中,只要在過程 中產(chǎn)生絮狀沉淀物即可。在本發(fā)明的一個實施方式中,所述溶胞溶液還含有碳酸鹽。已收獲的步驟a)的細胞既可以直接處理,也可以進行解凍,如果在先將其冷凍 (例如包括冷凍造粒)。兩個步驟的相同點在于,在內(nèi)部細胞破碎步驟b)之前,將已收獲的 細胞重懸到如a)所述的重懸緩沖液中。任選得,直接進一步處理步驟a)中得到的發(fā)酵液,而不收獲和重懸細胞。在這種 情況下,細胞可以直接進行堿裂解(以及任選后續(xù)的中和)而將其破碎,該過程可以在發(fā)酵罐中進行,或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到溶胞反應(yīng)器中進行。在該實施方式中,無重懸過程,可以將 所述碳酸鹽加入到中性或堿性的發(fā)酵液中,加入到溶胞溶液中,或加入到已中和的溶解的 細胞溶液中,從而獲得CO2釋放帶來的漂浮促進效果(參考步驟C))。優(yōu)選使用WO 2004/085643中所描述的方法和設(shè)備的原理來實行步驟b)。接下來,關(guān)于步驟b)中的細胞破碎,術(shù)語“細胞懸浮液”用于收獲后重懸的細胞和 發(fā)酵液兩者。C)中和/沉淀/CO2釋放通常將具有酸性pH和高鹽濃度的經(jīng)緩沖的溶液用于中和。優(yōu)選這樣的溶液在 PH5. 5的條件下,含有3M醋酸鉀(KAc)。但是也可以使用或加入其它中和鹽(neutralizing salt),例如醋酸鈉、醋酸銨或磷酸鉀。原則上,該步驟還可以根據(jù)本身已知的方法來進行,優(yōu)選根據(jù)溫和的并且能夠以 連續(xù)和自動模式運行的方法來進行。在中和步驟C)的一個實施方式中,以連續(xù)的,優(yōu)選為自動的方式將溶解的細胞溶 液與中和溶液混合。上述這樣的步驟可以通過混合溶解的細胞溶液和中和溶液來完成,例 如通過T連接器(connector)或Y連接器的方式,在流速(flow rate)的恒定比例(=恒 定的混合比例)條件下并確?;旌?,從而在后續(xù)的混合階段徹底地實現(xiàn)溶液的中和/沉淀。在本發(fā)明的一個實施方式中,在中和之前加入碳酸鹽,CO2釋放與中和/沉淀同時 發(fā)生。優(yōu)選,使用WO 2004/085643中所描述的方法和設(shè)備的原理來進行步驟c)。一旦,所述溶解的細胞溶液與中和溶液相接觸,混合物的pH下降到酸性,就開始 形成絮凝物。如果在中和之前已經(jīng)加入了碳酸鹽,則由于酸化,CO2的釋放和絮凝物的形成 在同一時間開始。然后,在混合階段(例如W02004/085643中所描述的管道系統(tǒng))進一步 混合所述溶解的細胞溶液和中和溶液,并同時輸送到澄清設(shè)備中,優(yōu)選通過泵或加壓氣體。在另外的實施方式中,使用了含水的“漂浮溶液(floatation solution) ”。在本 發(fā)明中,術(shù)語“漂浮溶液”表示含水的碳酸鹽溶液。這樣的漂浮溶液與其它處理溶液的不同 之處在于其含有碳酸鹽,以及將其加入到任何其它處理溶液中(術(shù)語“處理溶液(process solution),,是指用于進行堿裂解、中和及任選重懸的任何液體)。這樣的漂浮溶液可以在 中和步驟之前與處理溶液中的一種混合,或者與在過程中產(chǎn)生的懸浮液中的一種混合。任 選地,所述漂浮溶液可以與已中和的溶解的細胞溶液混合。碳酸鹽在所述漂浮溶液中的濃 度范圍為0. OlM 1M,優(yōu)選為0.025 1M。因此,漂浮溶液的混合比例為2 1 1 50。 優(yōu)選使用少量的濃度更高的濃縮碳酸鹽溶液。當(dāng)連續(xù)使用所述漂浮溶液時,通過流速的比 例來調(diào)節(jié)混合比例(漂浮溶液過程懸浮液(processsuspension))。在本發(fā)明的這個實施方式中,在步驟c)中使用“漂浮溶液”,可以以連續(xù)、優(yōu)選為 自動方式將已中和的溶解的細胞溶液與漂浮溶液混合。按照下述方式來完成上述這個過 程在流速的恒定比例(=恒定的混合比例;例如通過T連接器或Y連接器的方式)的條件 下,混合已中和的溶解的細胞溶液(含有絮狀沉淀物)和“漂浮溶液”,并且確保充分地混合 從而在將反應(yīng)混合物運輸?shù)胶罄m(xù)的澄清設(shè)備的過程中釋放出C02。在這個實施方式中,可以 在溶解的細胞溶液和中和溶液以及澄清設(shè)備會合時的任何點上將所述“漂浮溶液”與已中 和的溶解的細胞溶液混合,優(yōu)選在該距離的前半部分中。
同時獨立的(與中和/沉淀同時)或隨后的(使用“漂浮溶液”)CO2釋放所產(chǎn)生 的小氣泡附著到絮凝物_沉淀物上,從而促進在后續(xù)澄清過程中的溶胞產(chǎn)物和絮凝物的相 分離。在得到的溶胞產(chǎn)物-絮凝物混合物(附著有CO2氣泡)中的計算出的理論碳酸鹽濃 度范圍應(yīng)當(dāng)為約0. 003 0. 35M,優(yōu)選為約0. 005 0. 05M。濃度較低可能會導(dǎo)致CO2釋放 可忽略不計,而濃度過高則會導(dǎo)致不利的起泡現(xiàn)象。通過一個優(yōu)選的實施方式來實現(xiàn)CO2的釋放,優(yōu)選使用在W02004/085643中所描 述的中和設(shè)備。該設(shè)備為管道,其內(nèi)徑為約3 200mm(取決于所述過程的規(guī)模),為了避免 在管道壁上的對絮凝物的剪切,優(yōu)選大于8mm。流動的方向可以是以任何方向,優(yōu)選為向上 方向(形成螺旋形)。30cm 數(shù)米的混合距離可以使得溶液溫和且充分地混合,從而沉淀 來源于細胞的雜質(zhì)和釋放C02?;旌暇嚯x、管的內(nèi)徑以及混合設(shè)備中的停留時間影響混合的 質(zhì)量,以及從而影響沉淀物的形成和CO2的釋放。另一個實施方式中包括步驟d),用非連續(xù)的方式,將所述碳酸鹽以“漂浮溶液”的 形式或以固體鹽的形式加入到收集在澄清設(shè)備中的已中和的溶解的細胞溶液中。優(yōu)選按 照WO 2004/085643所述來設(shè)計澄清設(shè)備。在這個實施方式中,優(yōu)選從底部出口加入“漂浮 溶液”,通過位于澄清設(shè)備底部的保留材料,以維持在澄清設(shè)備的整個直徑范圍內(nèi)的均勻分 布。對于加入固體碳酸鹽的實施方式,從頂部的額外入口處加入固體鹽,可以通過另外安裝 在澄清設(shè)備下部的攪拌器來實現(xiàn)均勻地混合。在已中和的溶解的細胞溶液中提供充分均勻 的CO2釋放的、用于添加“漂浮溶液”或固體碳酸鹽的任何其它位置或混合方法,均可以用來 進行本發(fā)明方法的改進的溫和沉淀物漂浮。在所有實施方式中,在使用“漂浮溶液”時(在加入中和溶液之后加入),優(yōu)選根 據(jù)下面兩個方面來選擇混合比例(加入的“漂浮溶液”的量比已中和的溶解的細胞溶液的 量),所述兩個方面為,一方面所提供的CO2釋放對于完全和致密的沉淀物的漂浮是充分的, 一方面避免溶胞產(chǎn)物的過分稀釋。d)分離/澄清(以及任選清洗)在用于澄清(絮狀沉淀物的分離)的工業(yè)規(guī)模過程的方法和設(shè)備中應(yīng)用如下方法 是非常關(guān)鍵的,所述方法利用由碳酸鹽釋放出的CO2,以促進堿裂解過程中的中和過程所產(chǎn) 生的沉淀物的漂浮。對于有利的應(yīng)用本發(fā)明方法,三種澄清方式是可行的I.連續(xù)II.半連續(xù)III.非連續(xù)(分批)根據(jù)使用其本身是新穎的以及是本發(fā)明重要部分的設(shè)備,來進行第一種澄清方 式,而第二種和第三種澄清方式部分基于已經(jīng)在WO 2004/085643中公開的澄清設(shè)備和方法。在連續(xù)系統(tǒng)(I)中,CO2的釋放通常在已中和的溶解的細胞溶液進入澄清設(shè)備之前 發(fā)生。然而如下所述,通過在澄清設(shè)備出口的上方加入漂浮溶液,使CO2在澄清設(shè)備中釋放 (如步驟C)所述)也是可行的。在完全連續(xù)系統(tǒng)中,在澄清設(shè)備中連續(xù)地分離絮凝物和溶 胞產(chǎn)物??梢栽诘撞砍隹谔幨占馨a(chǎn)物,而通過澄清設(shè)備的頂部的出口收集絮凝物。本 發(fā)明方法的優(yōu)點在于由于連續(xù)因此快速的分離絮凝物和溶胞產(chǎn)物,接觸時間被最小化,從而將降解和引入雜質(zhì)的風(fēng)險最小化,并由此在收集的溶胞產(chǎn)物中得到高質(zhì)量的PDNA。新型澄清設(shè)備可以由玻璃、不銹鋼、塑料或藥物生產(chǎn)可以接受的任何其它材料制 成。所述澄清設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)如圖13a所示。還可以擴展澄清設(shè)備,如圖13b所述。澄清 設(shè)備的主要部分的形狀可以是圓柱形的,但是原則上來說,所有其它中空體均可以使用。本 發(fā)明方法中的步驟d)是獨立于反應(yīng)器形狀的。澄清設(shè)備在底部(6)具有出口,以及在頂部(9)具有另一個出口,有利地設(shè)計該 設(shè)備以實現(xiàn)在底部連續(xù)地回收預(yù)澄清的溶胞產(chǎn)物,以及在頂部連續(xù)地除去漂浮的沉淀絮凝 物。出口優(yōu)選位于部分地穿過澄清設(shè)備頂部和底部的中心的位置處,盡管底部和頂部的任 何其它位置也是可以行的。另外,所述澄清設(shè)備包含在底部和頂部出口之間的開口(port) (15),優(yōu)選位于這個距離的中間。優(yōu)選在出口和入口(1)處安裝閥(2,5,8),其可以分別打 開和關(guān)閉。在本發(fā)明的含義內(nèi),所述閥可以是任何適合于打開和關(guān)閉導(dǎo)管(conduit)的設(shè) 備(優(yōu)選為薄膜閥(membrane valves))。由于所述新型的澄清設(shè)備可以以完全連續(xù)方式運轉(zhuǎn),所以與半連續(xù)或分批澄清設(shè) 備相比,可以減少其大小。以基于占主流的圓柱形狀為例,用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的常用維度, 在處理10 1500kg生物質(zhì),優(yōu)選50 750kg時,直徑為20 IOOcm以及長度為50 300cm,優(yōu)選直徑為30 80cm以及長度為100 250cm。直徑和長度的比例應(yīng)當(dāng)在1 1 1 10的范圍,優(yōu)選為1 2 1 5。增加設(shè)備的長度可能會獲得甚至更好的分離以及 更好地漂浮的絮凝物的排液。澄清設(shè)備安裝了與管道相連的開口(15),在管中進行中和/沉淀以及優(yōu)選釋放 CO20上述該開口本身也可以是澄清設(shè)備的入口,并直接與中和/沉淀管道相連。任選所述 開口與分配管道(distributing tubing) (3)相連,所述分配管道本身與中和/沉淀管道相 連。在該實施方式中,其中開口為入口,該入口是在所述澄清設(shè)備的外殼的側(cè)面的簡單的 孔,沒有在澄清設(shè)備中設(shè)置任何更多的部分。在其它實施方式中,優(yōu)選可拆卸的分配管道 (任選由適用于藥物生產(chǎn)的剛性材料制成;例如不銹鋼)延伸到澄清設(shè)備中。任選所述管 道的末端在澄清設(shè)備的中部。該末端為開放的。在兩個實施方式中,所述開口(第一個實施方式中的連接開口或延伸管道的末 端)所在的高度位于如上所述的底部和頂部出口之間,優(yōu)選在這個距離的中間。與中和管 道(16)相比,開口 /入口可以具有相同或更大的直徑。在第二個實施方式中,所述開口可 以位于澄清設(shè)備的任何位置。優(yōu)選定向所述分配管道使得已中和的溶解的細胞溶液向上流 動,并且所述分配管道的末端優(yōu)選在澄清設(shè)備的中部。經(jīng)由開口(15)或分配管道(3),已經(jīng)含有附著氣泡的絮凝物的、已中和的溶解的 細胞溶液進入(1)澄清設(shè)備,立即發(fā)生相分離。由于附著有氣泡,與無CO2釋放的過程相比, 絮凝物的密度(每單位體積的質(zhì)量)顯著降低。因此,所述絮凝物(7)開始漂浮到或多或 少澄清的液體(溶胞產(chǎn)物)在澄清設(shè)備中的界面之上。當(dāng)在澄清設(shè)備中液體水平面高于所 述入口時,迫使氣泡-沉淀物-復(fù)合物(7)向上到達頂部出口。在澄清步驟開始時,所述澄清設(shè)備是空的。關(guān)閉底部出口 /閥(5/6)直到所述澄 清設(shè)備中充滿已中和的溶解的細胞溶液。由于附著有氣泡,與無CO2釋放的過程相比,絮凝 物的密度(每單位體積的質(zhì)量)顯著降低。因此所述絮凝物(7)在設(shè)備的上部分聚集,以 及或多或少澄清的液體溶胞產(chǎn)物位于設(shè)備的下部分。
任選的,所述澄清設(shè)備已經(jīng)填充有液體,通常是含有與溶胞產(chǎn)物相似成分的緩沖 液。啟動所述過程,打開底部出口 /閥(5/6)及調(diào)節(jié)流出量使得在整個過程中在澄清設(shè)備 中維持溶胞產(chǎn)物_絮凝物界面的水平面恒定。溶胞產(chǎn)物_絮凝物界面的恒定水平面是通 過底部閥的打開程度來控制的,任選其是自動的。在底部單位時間上的體積流出量低于每 單位時間的體積進料量(入口)。因此,額外的量必須經(jīng)由頂部出口(8/9)離開澄清設(shè)備。 由于溶胞產(chǎn)物_絮凝物界面低于頂部出口,在該過程中迫使大部分絮凝物(其中具有最少 量的剩余液體)通過頂部出口。為了結(jié)束所述過程,通過關(guān)閉入口閥來停止進料,并通過底 部出口(5/6)回收剩余的溶胞產(chǎn)物,直到漂浮在溶胞產(chǎn)物頂部的剩余絮凝物到達底部出口 (5/6)。另一種終止所述過程的選擇是,首先關(guān)閉底部出口(5/6)并持續(xù)向澄清設(shè)備進 料,任選含有與溶胞產(chǎn)物相似成分的緩沖液,直到迫使所有的剩余絮凝物經(jīng)由頂部出口 (8/9)離開該設(shè)備。然后,經(jīng)由底部出口(5/6)簡單地回收所述設(shè)備中存有的澄清的溶胞產(chǎn) 物,如上所述(關(guān)閉頂部出口(8/9)和入口(1/2);打開位于頂部的單獨的通氣閥(venting valve)(10))。用于終止所述過程的兩種選擇也可以按照下述方式結(jié)合首先根據(jù)選擇1回收溶 胞產(chǎn)物,隨后根據(jù)選擇2迫使絮凝物經(jīng)由頂部出口離開澄清設(shè)備。在任選的實施方式中,其中CO2釋放在澄清設(shè)備中(如步驟C)所述),連續(xù)地將 “漂浮溶液”經(jīng)由額外的開口 /入口,加入到澄清設(shè)備中的溶胞產(chǎn)物_絮凝物混合物中,所述 開口 /入口設(shè)計成與上述用于已中和的溶解的細胞溶液的開口 /入口相似。任選,可以在 該開口/入口的與澄清設(shè)備相連或延伸到澄清設(shè)備中的末端處安裝用于使流動分布更好 的裝置(例如穿孔板(perforated plate)或玻璃料(frit))。該入口必須設(shè)置于用于已中 和的溶解的細胞溶液的底部出口和入口之間。新型澄清設(shè)備的底部部分任選稍成圓錐形,從而保證在終止所述過程之后完全回 收溶胞產(chǎn)物(完全卸出)以及完全去除清洗溶液。這個底部部分上可以安裝有適合于使剩 余的不漂浮絮凝物保留在底部出口之上的固定設(shè)備(fixture) (4)。為了可以拆卸固定設(shè) 備,澄清設(shè)備的底部部分可以從剩余設(shè)備上拆卸。固定設(shè)備可以是穿孔板、篩、網(wǎng)、玻璃料或 任何其它設(shè)備(installation)或可透過溶胞產(chǎn)物的材料。這些固定設(shè)備的材料以至于整 個澄清系統(tǒng)的材料可以是不銹鋼、玻璃、聚丙烯或適合藥物生產(chǎn)的任何其它材料。在特殊的 實施方式中,所述固定設(shè)備為滯留層,與WO 2004/085643中所描的澄清反應(yīng)器的滯留層具 有相似或相同的部分。任選地,可以將深層過濾器安裝在所述澄清設(shè)備的底部出口路線上,以確保安全 其關(guān)系到不期望溢出最少量的不漂浮絮凝物。任選地,可以將回收的溶胞產(chǎn)物輸送到WO 2004/085643所述的用于精細澄清(fine clarification)的澄清反應(yīng)器中。任選所述新型澄清設(shè)備頂部部分為逐漸變細的,優(yōu)選為錐形漸細,直到其內(nèi)徑與 頂部出口閥(8)的內(nèi)徑相似,以及與在閥的后面相鄰的、由適合藥物生產(chǎn)的任何材料構(gòu)成 的出口管道的內(nèi)徑相似。澄清設(shè)備頂部部分的上部錐形末端(所以也是頂部閥和隨后的管 道)的內(nèi)徑范圍為約3 200mm(取決于所述過程的規(guī)模),優(yōu)選大于8mm,從而避免在管道 壁上的對絮凝物的剪切。澄清設(shè)備的頂部部分的錐角(tapering-angle)的范圍為10° 80°,優(yōu)選為25° 65°。所述逐漸變細的結(jié)構(gòu)在頂部部分制造了瓶頸,其能夠促進漂浮的絮凝物(7)的排液以及減少通過輸出絮凝物而導(dǎo)致的溶胞產(chǎn)物的損失。上述這個澄清設(shè) 備的逐漸變細的頂部部分任選為可以拆卸的(例如對于單獨清洗)。在另一個實施方式中,用于分離絮凝物和溶胞產(chǎn)物的額外單元(圖13b)與澄清設(shè) 備的頂部出口 /閥(8/9)相連接,優(yōu)選直線連接。這個額外單元的特征在于其形狀與澄清 設(shè)備的上部部分相似(主要部分為圓柱形)。這個額外單元的長度可以短于主澄清設(shè)備,例 如是主設(shè)備長度的約1/3。上述額外單元的入口(11)與主澄清設(shè)備的頂部出口(9)以相 同的內(nèi)徑相連接??拷撊肟?11)的額外單元的直徑增大(例如與主澄清設(shè)備的內(nèi)徑相 似)。在一個優(yōu)選的實施方式中,所述額外單元的入口(11)不是該單元的最低點。在這個 任選的實施方式中,上述額外單元的底部既可以是從入口到外殼整個底部區(qū)域逐漸降低, 也可以是在一個確定位置。具有閥(12)的出口(13)可以位于底部最低的部位處。當(dāng)預(yù)排 液絮凝物進入到這個額外單元的擴大部分并直到靠近其入口(11)時,發(fā)生進一步的相分 離過程。當(dāng)絮凝物再次漂浮(7)到額外設(shè)備的頂部,之前陷在絮凝物之間的剩余的溶胞產(chǎn) 物聚集在較低的區(qū)域,并可以通過閥(12)從出口(13)回收,任選自動地、定期地或連續(xù)地 啟動上述過程,從而使攜帶溶胞產(chǎn)物輸出的絮凝物最少化。設(shè)計該額外單元的頂部使得其 與主澄清設(shè)備的頂部相似,具有出口(14)、閥(8)和單獨的通氣閥(10),以及任選包含第二 出口。在具有單一頂部出口(14)的實施方式中,按照與所述主澄清設(shè)備相同的方式輸出所 述絮凝物。在以下實施方式中,所述實施方式具有兩個頂部出口,其中一個出口配備有可拆 卸的玻璃料或連接的過濾器,是回收溶胞產(chǎn)物的另一個位點。當(dāng)在過程中關(guān)閉第二頂部出 口時(假設(shè)這個額外單元的底部出口是關(guān)閉的),溶胞產(chǎn)物通過其它頂部出口輸出,而絮凝 物被玻璃料或過濾器保留??梢詫⒃谶@個單元中被額外回收的溶胞產(chǎn)物加入到在主澄清設(shè)備出口(6)回收 的澄清的溶胞產(chǎn)物中,或者通過合適的管道加入到主澄清設(shè)備中處于較低位置的溶胞產(chǎn)物 相中。所述主澄清設(shè)備可以擴展(類似級聯(lián))多于一個的上述所述額外單元。在又一個實施方式中,另一種額外的澄清單元可以與主澄清設(shè)備的頂部出口相連 接。這個額外單元包括放入另一個管中的管(管套管(tube-in-a-tube))。該內(nèi)管與主澄 清設(shè)備的頂部出口相連接并且具有與上述出口相似或更小的內(nèi)徑,但最小為8mm。在其整個 長度范圍上外部管道包圍內(nèi)部管道,并且外部管道具有靠近內(nèi)部管道與主澄清設(shè)備連接部 分的出口(任選配備有閥)。通過例如合適的墊片將外部管道固定在內(nèi)部管道的兩個末端 上。該管套管組合的方向從主澄清設(shè)備的出口處(微)向上傾斜。長度范圍為30cm 3m, 優(yōu)選范圍為0. 5 2m。上述這個內(nèi)部管道在其整個長度上均有穿孔,其內(nèi)徑小于外殼的一 半,優(yōu)選具有(圓)孔且其大小(直徑0. 5 3_)阻止絮凝物通過。迫使通過主澄清設(shè)備 的出口輸出的絮凝物通過內(nèi)部管道。由于附著有氣泡,大部分絮凝物在管道的徑向上的上 部進行輸送,而剩余的溶胞產(chǎn)物可以可以通過穿孔離開所述內(nèi)部管道,在外部管道中被收 集并在外部管道的出口處被回收。由此,可以進一步對絮凝物進行排液和增加對溶胞產(chǎn)物 的回收??梢詫⒃谶@個單元中被額外回收的溶胞產(chǎn)物加入到在主澄清設(shè)備出口回收的澄清 的溶胞產(chǎn)物中,或者通過合適的管道加入到主澄清設(shè)備中處于較低位置的溶胞產(chǎn)物相中。在又一個實施方式中,所述新型澄清設(shè)備的頂部部分可以安裝機械撇沫器 (mechanical skimmer),其可以連續(xù)地將絮凝物撇去從澄清設(shè)備的頂部出口排出。在這個實施方式中,頂部出口安裝有可以收集被撇去的用于進一步處理的絮凝物的撇去頂部 (skimming top)。在又一個實施方式中,所述絮凝物可以簡單地在頂部出口處溢流,并收集于在徑 向上附著在頂部出口的收集環(huán)(collection ring)中。在掉入到收集環(huán)之前,通過頂部出 口溢流,可以使絮凝物排液并且通過流過多孔板篩(perforated screen)(具有收集下述已 排液的溶胞產(chǎn)物的環(huán))進行清洗。收集環(huán)的底部優(yōu)選傾斜放置從而使收集的絮凝物自動地 指向收集已排液的(“干燥的”)沉淀物的槽。在又一個實施方式中,可以通過泵的方式在主澄清設(shè)備的頂部出口吸出漂浮的絮 凝物。每一個上述額外的澄清單元可以與其它單元結(jié)合。任選進一步處理經(jīng)分離的絮凝物(例如剩余排液、清洗)。剩余排液可以根據(jù) 本領(lǐng)域已知的方法例如過濾(優(yōu)選深層過濾)來完成,使用壓濾機、離心或等同物。WO 2004/085643描述了有利的溫和的排液方法,其可以與絮凝物清洗步驟組合,其使用特別設(shè) 計的包括在底部具有保留材料的溫和分布器(gentle distributor)的澄清反應(yīng)器??梢詫?其中所述方法和設(shè)備簡單地與本發(fā)明結(jié)合,通過將已輸出的絮凝物應(yīng)用到WO 2004/085643 的澄清反應(yīng)器以及進行WO 2004/085643所述的排液和清洗步驟。選擇不會再溶解絮凝物的組合物用作清洗溶液/緩沖液。清洗還可以按照 下述方式進行通過結(jié)合排出絮凝物的物流和清洗溶液/緩沖液并在與中和管道(W0 2004/085643)相似的設(shè)備中進行混合/接觸。任選地,還可以在單獨的槽中清洗絮凝物(分 批或流加培養(yǎng)方式)。在本發(fā)明的另一個實施方式中,可以在新型澄清設(shè)備中回收所述絮凝物。因此,部 分在澄清設(shè)備頂部出口輸出的漂浮的絮凝物,經(jīng)由適合的管道和靠近進料溶液入口的單獨 的入口,被輸送(例如通過泵)回澄清設(shè)備。對于這個實施方式,在新型澄清設(shè)備中提供額 外的漂浮溶液是有利的。在所述實施方式中,所有的閥均優(yōu)選是薄膜閥,但是也可以是例如球閥、閘閥或任 何其它適合打開/關(guān)閉的線/管和/或容器。在不會影響本發(fā)明的基本/原則特征的情況 下還可以省略在該實施方式中所述的一些閥(例如頂部出口閥)。在半連續(xù)系統(tǒng)(II)中,CO2的釋放通常在已中和的溶解的細胞溶液進入澄清設(shè)備 之前發(fā)生。然而,通過在所述澄清設(shè)備出口上方加入漂浮溶液,在澄清設(shè)備中釋放CO2 (如 步驟C)所述)也是可行的。為了以半連續(xù)方式應(yīng)用本發(fā)明的方法,優(yōu)選將WO 2004/085643中所述的澄清反 應(yīng)器用作澄清設(shè)備??梢越?jīng)由頂部入口和新穎或適應(yīng)經(jīng)特殊設(shè)計的如WO 2004/085643所 述的分布器,來引入已中和的溶解的細胞溶液(含有沉淀物)。在另一個實施方式中,入口可以位于高于保留材料的澄清反應(yīng)器的任何位置。由 于通過本發(fā)明的方法改進的漂浮是基于利用酸化由碳酸鹽釋放出CO2來實現(xiàn)的,因此在該 過程中堵塞保留材料的風(fēng)險被顯著降低。從而,滯留層的厚度和組成可以與例如減少層的 數(shù)量或改變保留材料的細度(fineness)/孔隙率相適應(yīng)。僅通過舉出底部玻璃料上可以使 用玻璃珠的實例。在本發(fā)明方法的半連續(xù)方式的另一個實施方式中,在WO 2004/085643的澄清反應(yīng)器中,僅使用最小限度的(例如單獨使用玻璃料)或不使用保留材料。任選,可以將深層 過濾器安裝在澄清反應(yīng)器的底部出口路線上,以確保安全其關(guān)系到不期望溢出最少量的不 漂浮絮凝物。當(dāng)澄清反應(yīng)器完全充滿(漂浮)絮凝物時所述半連續(xù)過程結(jié)束??梢愿鶕?jù)WO 2004/085643中所述的方法對澄清反應(yīng)器中的絮凝物進行清洗或排液。雖然WO 2004/085643中所述的澄清反應(yīng)器是有益的,對于以半連續(xù)方式進行本 發(fā)明的方法是優(yōu)選的,但是任何其它具有入口和底部出口的用于(半)連續(xù)回收溶胞產(chǎn)物 的中空體對于上述這個目的均是適合的。與本領(lǐng)域已知的其它半連續(xù)澄清方法相比,半連續(xù)澄清方式的優(yōu)點在于其增大的 容量。由于通過附著在沉淀絮凝物上的CO2氣泡改善了漂浮,因此漂浮的絮凝物層更為致 密,陷在絮凝物之間的溶胞產(chǎn)物更少。因此,在澄清設(shè)備中用于聚集絮凝物的特定體積內(nèi), 可以處理更多的生物質(zhì)。與回收陷在絮凝物之間的溶胞產(chǎn)物相比,回收已分離的溶胞產(chǎn)物 更為容易。也可以在上述用于半連續(xù)澄清的系統(tǒng)/方法中應(yīng)用/進行非連續(xù)(分批)方式。在非連續(xù)(分批)系統(tǒng)(III)中,在全部已中和的溶解的細胞溶液充滿所述設(shè)備, 留下一些空間用于添加漂浮溶液之后,在澄清設(shè)備中發(fā)生CO2釋放。通過在澄清設(shè)備的出口 上方加入漂浮溶液,在澄清設(shè)備中直接進行CO2的釋放(如步驟C)所述)。這個非連續(xù)系 統(tǒng)被澄清設(shè)備的體積容量所限制。一旦當(dāng)澄清設(shè)備幾乎被已中和的溶解的細胞溶液(含有 絮凝物沉淀物)完全充滿,就開始進行CO2-調(diào)節(jié)的漂浮。關(guān)閉底部出口直到漂浮結(jié)束。然 后以用于半連續(xù)系統(tǒng)的所述的相似方法來回收溶胞產(chǎn)物??梢栽O(shè)計所述澄清設(shè)備使得其與 特定用于半連續(xù)系統(tǒng)的實例相似,優(yōu)選根據(jù)WO 2004/085643中所述的澄清反應(yīng)器(對于半 連續(xù)系統(tǒng)的上述相似的改進/變化是可能的)來進行設(shè)計。任選,按照半連續(xù)系統(tǒng)所述進 行絮凝物排液和清洗。通過上述系統(tǒng)中的任何一個回收的收獲的溶胞產(chǎn)物,其既在視覺上是澄清的,并 可以直接進行進一步處理例如捕獲(通常利用色譜技術(shù)),也可以通過額外簡單的精細澄 清例如過濾來進一步純化。e)純化:在本發(fā)明步驟a) d)之后的過程促進在后續(xù)步驟(例如連續(xù)或非連續(xù)的濃縮、 調(diào)節(jié)、過濾、色譜法)中分離(捕獲)和純化標(biāo)生物分子。本發(fā)明的使用上述澄清系統(tǒng)中的一種來改善漂浮的過程適合用于,但不限于對剪 切力敏感的生物分子,優(yōu)選多核苷酸,特別優(yōu)選質(zhì)粒DNA,以及大蛋白質(zhì),例如抗體。本發(fā)明的過程可以用于任何目標(biāo)生物分子。對于生產(chǎn)蛋白質(zhì),可以對其進行設(shè)計 從而滿足目標(biāo)蛋白質(zhì)的具體要求。所述本發(fā)明方法不受發(fā)酵過程和蛋白質(zhì)來源(例如細 菌、酵母)的限制。對適合用于細胞破碎和后續(xù)處理步驟的具體方法的選擇受到發(fā)酵之后細胞中蛋 白質(zhì)狀態(tài)的顯著影響如果蛋白質(zhì)被過表達,其可能以被稱為“包涵體”的形式存在。在這種情況下,在 溶胞過程中利用例如強堿和還原試劑(例如二硫蘇糖醇,DTT)處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的再溶解 (resolubilization),在這個階段蛋白質(zhì)是處于其變性形式的。為了重構(gòu)蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu),可以通過中和(例如通過添加磷酸)來實現(xiàn)重折疊,并同時釋放CO2,上述過程在所述中 和反應(yīng)器或與溶胞反應(yīng)器相似的第二反應(yīng)器中進行。在澄清設(shè)備中,從含有蛋白質(zhì)的溶液 分離出不可溶組分。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)在細胞中是可溶時,在溶胞反應(yīng)器中以與上述相似的方式進行細胞 的破碎。在所述溶胞反應(yīng)器中,可以選擇條件(接觸時間、溶胞溶液的濃度)從而使得蛋白 質(zhì)保持可溶或,任選地,設(shè)定參數(shù)具體地變性和沉淀蛋白質(zhì)。在第一種情況下,進一步處理 所述溶液,在中和反應(yīng)器(其結(jié)構(gòu)與用于多核苷酸的溶胞反應(yīng)器或中和反應(yīng)器相似)和澄 清設(shè)備(如上所述用于已溶解的包涵體)中。如果所述蛋白質(zhì)是處于其變性的狀態(tài),則既 可以是在溶胞反應(yīng)器中已經(jīng)進行沉淀,也可以之后在中和反應(yīng)器中進行沉淀(通過加入中 和和/或沉淀試劑并同時釋放CO2)。在這兩種情況下,優(yōu)選選擇沉淀條件以具體地沉淀目 標(biāo)蛋白質(zhì)(而不期望的雜質(zhì),例如RNA、內(nèi)毒素和DNA保持可溶)。隨后,在澄清設(shè)備中從溶 液中分離出所述沉淀物。然后,既可以將沉淀從澄清設(shè)備中移出(連續(xù)地如本發(fā)明連續(xù)系 統(tǒng)(I)所述,或者通過例如吸出,或利用合適的緩沖液沖洗),也可以在上述這個設(shè)備中直 接進一步處理。在將其從所述設(shè)備中移出后,利用合適的緩沖液在單獨的容器中再溶解沉 淀物(目標(biāo)蛋白質(zhì)),該過程基于每個實例不同的情況,按經(jīng)驗來確定。當(dāng)沉淀物保留在澄 清設(shè)備中時,在此進行再溶解(通過加入適當(dāng)?shù)木彌_液以及任選混合)。一旦沉淀物(特別 是目標(biāo)蛋白質(zhì))被再溶解,就可以通過在底部的出口簡單地將其移出澄清設(shè)備。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)方面,本發(fā)明方法所有變形的共同之處在于對得到的蛋白質(zhì)溶液進 一步處理的選擇。除了額外的重折疊步驟之外,還可以進行所述用于處理多核苷酸溶液的 相同步驟(連續(xù)或非連續(xù)的濃縮、調(diào)節(jié)、過濾、捕獲)。本發(fā)明的過程滿足針對生產(chǎn)治療生物分子的所有規(guī)章要求。當(dāng)其用于多核苷酸 時,本發(fā)明的方法產(chǎn)出(如果已經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵步驟以提供高質(zhì)量的粗原料)高比例的處于CCC 形式的質(zhì)粒DNA以及低比例的雜質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、RNA、染色體DNA、內(nèi)毒素)。所述過程既 不需要使用酶,例如RNA酶和溶菌酶,也不需要使用表面活性劑,除在溶胞步驟b)中。澄清 之前溶胞產(chǎn)物和絮狀沉淀物的接觸時間被顯著降低。另外,在不提供氣體(通過外部來源) 的情況下進行了所述過程。本發(fā)明的過程可以規(guī)?;蕴幚泶罅亢卸嗪塑账岬募毎淇梢栽凇肮I(yè)規(guī)?!?運轉(zhuǎn),通常可以處理多于1千克的濕細胞,并產(chǎn)出從一克到幾百克以及高達至千克量的目 標(biāo)多核苷酸,所述多核苷酸滿足臨床實驗以及市場供應(yīng)的要求。所述過程的適用范圍不受目標(biāo)生物分子的大小、序列或功能的局限或限制。目標(biāo) 多核苷酸可以是大小范圍從0. 1 約IOOkb或更大的DNA或RNA分子。優(yōu)選,所述目標(biāo)多 核苷酸為環(huán)狀DNA,即質(zhì)粒DNA,優(yōu)選大小為1 20kbp (無限制)。本發(fā)明的過程和設(shè)備不受獲得目標(biāo)生物分子的細胞的來源的限制。可以簡單地實施所述過程,并且在自動化和所期望的規(guī)模方面所述過程是靈活 的;可以利用可市購的泵和壓力系統(tǒng)來調(diào)節(jié)流動和反應(yīng)時間,從而確保穩(wěn)定的流動和較小 的機械壓力影響。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于,所述設(shè)備是可清潔的(sanitizeable),抗高溫分解 的(cbpyrogenizeable)以及能夠允許原位清洗(cleaning in place) (CIP)和在線滅菌(steaming in place)(SIP)。在此使用的方法和設(shè)備在不開放的系統(tǒng)中提供了可控的、穩(wěn)定的性能,允許直接 進一步處理連續(xù)生產(chǎn)的、在澄清之后得到的細胞產(chǎn)物,例如將其上樣到色譜柱上或能夠在 線調(diào)節(jié)和/或在柱子上樣之前過濾溶胞產(chǎn)物(圖2-4)。澄清之后,還可以在調(diào)節(jié)或上樣到 色譜柱之前進行中間濃縮步驟(圖5)。在本發(fā)明的過程中,無論步驟a)是否是以分批還是以連續(xù)方式進行,后續(xù)每一步 均可以以連續(xù)和自動模式運行。優(yōu)選,選自步驟b) e)中的至少兩個步驟的結(jié)合是單個 步驟相連接的連續(xù)運行。在溶胞步驟b)為自動的/連續(xù)步驟的情況下,其與如何獲得細胞懸浮液(分批或 連續(xù)操作,任選在冷凍之后,直接利用發(fā)酵液或收獲以及重懸)無關(guān)。其與用來得到溶胞產(chǎn) 物的宿主也無關(guān)。在中和步驟C)為自動的/連續(xù)步驟的情況下,應(yīng)用與如何制備經(jīng)處理的堿溶解的 細胞溶液(例如分批或連續(xù))無關(guān)。在一個優(yōu)選的實施方式中,按照與WO 2004/085643所 述的澄清反應(yīng)器(在分批或半連續(xù)進行澄清的情況下)的相同方式,設(shè)計中和步驟后的收
集器槽。在澄清步驟d)為自動的/連續(xù)步驟的情況下,應(yīng)用與如何制備經(jīng)處理的、含有絮 凝物的已中和的溶解的細胞溶液(例如分批或連續(xù))無關(guān)。還與何時和何處(在澄清設(shè)備 之前或在澄清設(shè)備中)發(fā)生本發(fā)明方法的CO2釋放無關(guān),只要其在澄清過程之前(或之時) 即可。另外,與如何進一步處理獲得的澄清的溶胞產(chǎn)物也無關(guān)。在一個優(yōu)選的實施方式中,將澄清設(shè)備的流出物與對以后的處理步驟(例如調(diào)節(jié) 溶液)是必須的溶液流混合在一起,通過連接器的方式混合,例如T或Y連接器,或直接在 混合設(shè)備中混合??梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的泵,以特定的流速抽吸兩種溶液。在另一個實施方式中,僅調(diào)節(jié)第二溶液的流速以適應(yīng)離開澄清設(shè)備的溶胞產(chǎn)物的 流速。為了上述這個目的,混合設(shè)備可以是充滿小球的設(shè)備,類似于所述用于自動溶胞步驟 的設(shè)備,或管道系統(tǒng)類似于所述用于中和步驟的設(shè)備(W0 2004/085643)??梢允褂眠@樣的 設(shè)置,如果對于第一色譜步驟溶胞產(chǎn)物的調(diào)節(jié)是必須的。例如,可以以這種方式加入硫酸銨 (或簡單地水)溶液。在另外的實施方式中,所述過程還包括中間濃縮步驟(圖5)—旦出現(xiàn)溶胞產(chǎn)物 的足夠量離開澄清設(shè)備,在調(diào)節(jié)和/或上樣到色譜柱上之前,就濃縮該溶胞產(chǎn)物,例如通過 超濾方式。可以進行一個或多個段(passage)的濃縮,其本身可以以連續(xù)或分批方式進 行。如果僅進行一段,隨后可以對截留物質(zhì)(retentate)(例如含有pDNA)直接進行調(diào)節(jié) 或?qū)⑵渖蠘拥缴V柱上。在有幾段的情況下,回收所述截留物質(zhì)直到所期望的終體積/濃 度,并隨后進一步對其進行處理。對于上述這個濃縮步驟,可以使用傳統(tǒng)的設(shè)備,例如盒式 (cassette)或中空纖維形式的膜。適合膜的截留(cut-off)取決于被處理的生物分子的大 小。對于PDNA通常使用具有截留在10 300kDa之間的膜。在一個優(yōu)選的實施方式中,聯(lián)合所述溶胞反應(yīng)器和中和反應(yīng)器以形成兩步驟自動 的/連續(xù)系統(tǒng)。在這種情況下,溶胞反應(yīng)器的流出物與中和溶液流相連接及混合,以所述用 于自動的/連續(xù)中和步驟的方式(W02004/085643)。這時,調(diào)節(jié)經(jīng)抽吸的中和溶液的流速使 得其適應(yīng)溶胞反應(yīng)器流出物的流速。
在另一個優(yōu)選的實施方式中,聯(lián)合所述中和反應(yīng)器和澄清設(shè)備以形成兩步驟自動 的/連續(xù)系統(tǒng)。在這種情況下,將中和反應(yīng)器的流出物與本發(fā)明的自動的/連續(xù)澄清設(shè)備 相連接。在這種情況下,必須調(diào)節(jié)澄清設(shè)備的底部出口閥的打開程度(以及任選頂部出口 閥),使得漂浮的絮凝物和澄清的溶胞產(chǎn)物的界面的水平面(澄清設(shè)備中界面的高度)保持 恒定。上述過程能夠以通過組合浮標(biāo)(integrated floater)的裝置測定界面的水平面來實 現(xiàn),所述浮標(biāo)漂浮在液體上但不漂浮在絮凝物上。另一個選擇是,測量澄清設(shè)備底部出口處 的流量,該流量可以用于計算界面的理論水平面,根據(jù)基于由經(jīng)驗確定的參數(shù)(分配系數(shù)) 的具體算法。底部流出物不能低于進料流量的50%。其它系統(tǒng)如擋光板(light barrier) 也是可適用的。原則上,可以使用每一個適合于識別所述界面的系統(tǒng)。通過與出口閥電連 接的方式,根據(jù)絮凝物-溶胞產(chǎn)物界面的水平面或出口流量,可以逐步地或連續(xù)地調(diào)節(jié)流 出物。在另一個實施方式中,通過直接連接兩個設(shè)備而無中間不同的中和步驟的方式, 連接所述溶胞步驟和所述澄清步驟。在這種情況下,可以在非/半連續(xù)系統(tǒng)(系統(tǒng)II和 III)的澄清設(shè)備中進行中和。因此在這個實施方式中,中和及澄清以非連續(xù)方式進行。首 選關(guān)閉非連續(xù)澄清設(shè)備的出口,以及將所述溶解的細胞溶液與一定體積的中和溶液混合。 該中和溶液可以在澄清設(shè)備中。如果在全部溶解的細胞溶液被收集于澄清設(shè)備之后,加入 中和溶液,則這個步驟優(yōu)選經(jīng)由非/半連續(xù)澄清設(shè)備的底部入口來進行。在這兩種情況下, 通過攪拌器(緩慢的)攪拌,或者通過位于設(shè)備底部的入口、或位于液面以下的額外的入口 引入氣體,可以促進與溶解的細胞溶液的混合。在這個實施方式中,通過直接連接溶胞步驟 與澄清設(shè)備,CO2釋放發(fā)生在所述澄清設(shè)備中。因此,優(yōu)選所述碳酸鹽是溶解的細胞溶液的 成分,或在中和之前或之后額外地加入所述碳酸鹽(以固體鹽或以“漂浮溶液”的形式,其 優(yōu)選通過非/半連續(xù)澄清設(shè)備(系統(tǒng)II和III)的底部出口加入)。在中和/漂浮的末尾, 非連續(xù)-澄清按照與WO 2004/085643中所述的相同方式來進行。在更為優(yōu)選的實施方式中,通過在連續(xù)系統(tǒng)中使用至少步驟b) d)的全部,以及 任選另外步驟a)和/或e),使整個系統(tǒng)完全自動化。在這個實施方式中,溶胞反應(yīng)器的流 出物直接連接中和設(shè)備,且中和設(shè)備的流出物直接連接澄清設(shè)備。在這個實施方式中,為了 通過CO2的釋放來改善澄清,可以使用完全連續(xù)系統(tǒng)(I)或半連續(xù)系統(tǒng)(II)。用于個體連 接和設(shè)備的設(shè)計與上述相同。在最為優(yōu)選的實施方式中,完全自動的系統(tǒng)與任選自動的(及連續(xù)的)調(diào)節(jié)步驟 (和設(shè)備)相連接。這個實施方式可以實現(xiàn)澄清的溶胞產(chǎn)物的連續(xù)混合,所述澄清的溶胞 產(chǎn)物與調(diào)節(jié)溶液(例如硫酸銨溶液)一起離開澄清設(shè)備。如上所述,對于制備用于后續(xù)的 (色譜的)純化步驟(例如疏水作用色譜)的含有多核苷酸的溶胞產(chǎn)物,這樣的調(diào)節(jié)步驟可 能是必要的。加入這樣的調(diào)節(jié)步驟的結(jié)果是將自動和連續(xù)的三步驟系統(tǒng)延伸成為連續(xù)的四步 驟系統(tǒng)。在這個實施方式中,使用設(shè)備可以連續(xù)地混合調(diào)節(jié)溶液和澄清的溶胞產(chǎn)物,所述設(shè) 備優(yōu)選與溶胞反應(yīng)器是相同的類型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),這個設(shè)備是用于連續(xù)混合含有多核苷酸的 溶液的最為溫和的設(shè)備,所述多核苷酸對于剪切力敏感。為了上述這個目的,還可以另外使 用其它設(shè)備(例如所述用于中和步驟的設(shè)備),例如傳統(tǒng)的靜態(tài)混合器。通過安裝流量測量 單元,可以調(diào)節(jié)抽吸調(diào)節(jié)溶液的泵的流速,以適應(yīng)澄清設(shè)備的流出物流速??梢詫⒈门c上述這個單元相連接,從而可以控制該泵,以保持兩種混合溶液的流速比恒定。在調(diào)節(jié)和捕獲步驟之間,可以插入在線的過濾步驟。在本發(fā)明的又一個實施方式中,加入超濾步驟。通過自動的三步驟系統(tǒng)這樣的延 伸,所述過程即代表了連續(xù)的四步驟系統(tǒng)。在這個實施方式中,通過超濾濃縮之前步驟獲得 的溶胞產(chǎn)物。但省略滲透,截留物質(zhì)既可以通過調(diào)節(jié)步驟被直接進一步處理,和/或通過上 樣步驟(其表示通過一個或兩個額外的步驟來延伸連續(xù)系統(tǒng))或循環(huán)直到達到所期望的終 濃度/體積。在后一種情況中,在濃縮結(jié)束之后進一步處理獲得的濃縮物(調(diào)節(jié)和/或上 樣)。在另外的實施方式中,可以直接將流出澄清設(shè)備的溶胞產(chǎn)物上樣到色譜柱中,或 可以在濃縮和/或調(diào)節(jié)之后,上樣到色譜柱上(具有或不具有后續(xù)的在線過濾)。在所有所述的實施方式中,利用自動的經(jīng)改善(CO2釋放)的澄清步驟,得到的澄 清的溶胞產(chǎn)物即可以被收集在適合的槽內(nèi),也可以直接對其進行進一步處理(例如通過將 澄清設(shè)備的流出物與另一個設(shè)備(例如色譜柱)連接)。如果將濃縮和/或調(diào)節(jié)步驟應(yīng)用 到這個自動的過程中,則經(jīng)濃縮的和/或調(diào)節(jié)的溶胞產(chǎn)物既可以被收集在適合的槽內(nèi),也 可以直接對其進行進一步處理。本發(fā)明的方法和設(shè)備與用于抽吸溶液的泵無關(guān)。在特殊的實施方式中,一些懸浮 物和溶液的流動是通過加壓容器中的空氣壓力來代替泵而完成的。本發(fā)明的過程和設(shè)備適合用于cGMP(動態(tài)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(Current Good Manufacturing Practice))藥物級pDNA的生產(chǎn)??梢允乖撨^程適用于任何pDNA的來源, 例如對于任何細菌細胞來源。特別是,由于所述系統(tǒng)的性質(zhì),本發(fā)明的過程可以實現(xiàn)大容量 快速處理,這對于處理細胞溶胞產(chǎn)物具有重要價值。由于溶胞產(chǎn)物含有不同的降解PDNA的 物質(zhì),例如DNA酶,因此過程時間是高產(chǎn)品質(zhì)量和高產(chǎn)率的關(guān)鍵因素。特別是在本文中,澄 清之前,絮狀沉淀物和溶胞產(chǎn)物的短接觸時間,是可以通過本發(fā)明獲得的主要優(yōu)點。本發(fā)明的過程和設(shè)備適合用來生產(chǎn)用于人類和動物的pDNA,例如針對疫苗和基因 治療用途。由于其的高生產(chǎn)能力,所述過程可以用于臨床前和臨床材料的生產(chǎn),以及用于已 注冊產(chǎn)品的市場供應(yīng)。由于本發(fā)明的方法和設(shè)備可以實現(xiàn)完全連續(xù)地進行如上所述的堿裂解、中和及澄 清,和相應(yīng)的和連接步驟,本發(fā)明的方法和設(shè)備是完全可規(guī)?;?可以處理通過發(fā)酵獲 得的高達至4000L或更多的生物質(zhì))。


圖1 流程圖,包含堿裂解、中和(包括同時的/后續(xù)的CO2釋放)和澄清的連續(xù)三 步驟組合過程。圖2 流程圖,圖1的連續(xù)三步驟組合過程外加連續(xù)調(diào)節(jié)步驟(例如濃縮和/或高鹽沉淀)。圖3 流程圖,圖2的連續(xù)組合過程加額外的捕獲步驟。圖4 流程圖,圖3的連續(xù)組合過程在調(diào)節(jié)步驟和捕獲步驟之間包括在線過濾步
驟ο圖5 流程圖,圖4的連續(xù)組合過程在調(diào)節(jié)步驟之前再加濃縮步驟。
圖6 堿裂解反應(yīng)器、中和反應(yīng)器和(經(jīng)適應(yīng)的)W0 2004/085643的半連續(xù)澄清設(shè) 備連續(xù)組合的方案圖,可應(yīng)用于澄清方式“系統(tǒng)II”和“系統(tǒng)III”。圖7:澄清方式“系統(tǒng)II”比較改進了的漂浮的新方法(a),和標(biāo)準方法(b)(無 CO2釋放)獲得的漂浮的絮凝物(在WO 2004/085643的經(jīng)適應(yīng)的小試規(guī)模的澄清設(shè)備中)。 上面的圖示出整個絮凝物層,而下面的圖示出絮凝物層的放大部分。圖8 通過傳統(tǒng)手工方法,在實驗室規(guī)模(無CO2釋放)得到的對照溶胞產(chǎn)物的分 析性HPLC色譜圖。圖9 澄清方式“系統(tǒng)II” 利用包括溶胞步驟、中和步驟(包括CO2釋放)和半連 續(xù)澄清步驟的本發(fā)明連續(xù)方法,在經(jīng)適應(yīng)的規(guī)模放大的W02004/085643的設(shè)備中得到的溶 胞產(chǎn)物的分析性HPLC色譜圖。圖10 =SEC池(SEC Pool)的分析性HPLC色譜圖,所述SEQ池是利用包括溶胞步 驟、中和步驟(包括CO2釋放)和半連續(xù)澄清步驟的本發(fā)明的連續(xù)方法,在經(jīng)適應(yīng)的規(guī)模放 大的WO 2004/085643的設(shè)備-澄清方式“系統(tǒng)II”中獲得的含有pDNA的溶胞產(chǎn)物的最后 純化步驟所得。圖11 澄清方式“系統(tǒng)II”:通過本發(fā)明新的集成式漂浮方法得到的、在經(jīng)適應(yīng)的 規(guī)模放大的WO 2004/085643的澄清設(shè)備中的漂浮絮凝物。圖12 澄清方式“系統(tǒng)II”:利用在經(jīng)適應(yīng)的規(guī)模放大的WO 2004/085643的澄清 設(shè)備頂部的CIP噴球(CIP ball),在回收過程的結(jié)尾清洗絮凝物的程序(絮凝物是利用本 發(fā)明的新方法分離的)。圖13 澄清方式“系統(tǒng)I”:本發(fā)明的新型連續(xù)澄清設(shè)備的方案圖基本設(shè)置,b) 用于基本設(shè)置的優(yōu)選的任選擴展部分的實例。圖14 澄清方式“系統(tǒng)I” 實驗室規(guī)模研發(fā)設(shè)置。圖15 通過傳統(tǒng)手工方法,在實驗室規(guī)模(無CO2釋放)得到的對照溶胞產(chǎn)物的分 析性HPLC色譜圖。圖16 澄清方式“系統(tǒng)I” 利用包括溶胞步驟、中和步驟(包括CO2釋放)和連續(xù) 澄清步驟的本發(fā)明的連續(xù)方法,在實驗室規(guī)模研發(fā)設(shè)置上得到的溶胞產(chǎn)物的分析性HPLC 色譜圖。圖17 :SEC池的分析性HPLC色譜圖,所述SEC池是利用包括溶胞步驟、中和步驟 (包括CO2釋放)和連續(xù)澄清步驟(“系統(tǒng)I”)的本發(fā)明的連續(xù)方法,在實驗室規(guī)模研發(fā)設(shè) 置中獲得的含有PDNA的溶胞產(chǎn)物經(jīng)最后純化步驟所得。圖18 澄清方式“系統(tǒng)I” 實驗室設(shè)置的樣機(prototype)。實施例1含有pDNA的大腸桿菌細胞的生產(chǎn) 根據(jù)WO 2004/085643或根據(jù)W02005/097990制備含有pDNA的大腸桿菌生物質(zhì)。實施例2在堿裂解過程中在中和時,從碳酸鹽釋放出的CO2促進漂浮的原理的適用性驗證第一個實驗在僅有緩沖液,無生物質(zhì)的條件下進行。將不同的碳酸鹽(例如K2CO3 和NaHCO3,因為作為C032_的反荷離子的K+和Na+已經(jīng)存在于用于溶胞或中和的緩沖液/溶 液中,所以其是有利的)加入到重懸緩沖液或溶胞溶液中,濃度為0. 5M。一方面測定在緩沖液中的溶解度,另一方面測定在中和和從而引起的絮凝物(在中和過程中產(chǎn)生)漂浮的過 程中的CO2釋放強度。已經(jīng)觀測到0. 5M的NaHCO3可以較好的溶解于通常用于重懸生物質(zhì)的緩沖液(含 有0. 05M Tris和0. OlM EDTA, pH為8)中,并且當(dāng)通過混合中和溶液進行酸化時導(dǎo)致大量 的CO2釋放,產(chǎn)生沉淀的SDS的漂浮泡沫。在具有5g生物質(zhì)的條件下重復(fù)上述這個實驗,所述生物質(zhì)重懸于50mL重懸緩沖 液中。將加入重懸緩沖液的NaHCO3的濃度降低到0. IM從而避免過多地發(fā)泡(如第一個實 驗中所觀察到的)。溫和地混合重懸的生物質(zhì)與50mL溶胞溶液(0. 2M NaOH, 1% SDS),并保 持接觸2min,隨后通過中和溶液(3M KAc)進行中和。這個體系運行地非常順利,這是由于 適度的(不是過于大量的)CO2釋放,以及同時由于附著有CO2氣泡加強了沉淀物_絮凝物 的漂浮。對漂浮的絮凝物下面的溶胞產(chǎn)物進行分析(HPLC),并與利用無CO2釋放的標(biāo)準程 序得到的溶胞產(chǎn)物進行比較。通過具有CO2釋放的方法得到的溶胞產(chǎn)物中的pDNA-濃度(產(chǎn)率)為對照溶胞產(chǎn) 物的約70%。在兩種情況下,pDNA的均勻度(homogeneity)均高于80%。在具有CO2釋放 的實驗中,漂浮的絮凝物層明顯更為致密(與無CO2釋放的實驗相比),這一點對工業(yè)規(guī)模 的澄清提供了主要好處。這個初步實驗示出了碳酸鹽的原則適用性,基于用于促進沉淀絮凝物漂浮的CO2 釋放,所述沉淀絮凝物是在用于PDNA生產(chǎn)的堿裂解程序的中和步驟中產(chǎn)生的。實施例3優(yōu)化碳酸鹽濃度(在重懸緩沖液中)如實施例2所述地進行這些實驗,分別使用重懸緩沖液(Pl)中的不同的NaHCO3 濃度(0M =對照,0. 05Μ,0· 07Μ,0· IM和0. 2Μ)和1. Ig生物質(zhì)。在中和含有絮凝物的溶胞 產(chǎn)物并保持3min之后,通過離心來進行澄清(實驗室離心機,7500rpm)。分析所述溶胞產(chǎn) 物(離心之后作為上清液回收)的濃度(產(chǎn)率)和PDNA的均勻度(HPLC)。清洗粒狀沉淀 (pellet)并用同樣的方式還對洗脫-級分(wash-fraction)進行分析。另外,研究了加入 NaHCOjf于得到的具有溶胞產(chǎn)物溶液(P2)的混合物的pH的影響。所述實驗重復(fù)4次,結(jié) 果總結(jié)于表1中。表1 實施例3的結(jié)果(4次重復(fù)的平均值)
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)并非被宿主細胞分泌的目標(biāo)生物分子的方法,其包括如下步驟a)培養(yǎng)宿主細胞從而生產(chǎn)目標(biāo)生物分子以及任選收獲和重懸細胞,b)通過堿裂解破碎細胞,c)中和步驟b)中得到的溶胞產(chǎn)物,由此形成沉淀物,d)將澄清的溶胞產(chǎn)物與步驟c)得到的沉淀物分離,e)純化目標(biāo)生物分子,其中,在步驟a c)中的至少一步中加入碳酸鹽,從而由于步驟c)中的中和,CO2被釋 放出,以及在步驟d)中可以通過澄清設(shè)備來分離沉淀物和溶胞產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其中,在步驟d)中獲得的所述澄清的溶胞產(chǎn)物通過位于底 部的出口離開澄清反應(yīng)器/設(shè)備。
3.權(quán)利要求1所述的方法,其中,在步驟a)中加入所述碳酸鹽。
4.權(quán)利要求1所述的方法,其中,在步驟b)中加入所述碳酸鹽。
5.權(quán)利要求1所述的方法,其中,在步驟c)中加入所述碳酸鹽。
6.權(quán)利要求1 5所述的方法,其中,在得到的溶胞產(chǎn)物-絮凝物混合物(附著有CO2 氣泡)中計算出的理論碳酸鹽濃度的范圍為約0. 003 約0. 35M。
7.權(quán)利要求6所述的方法,其中,在得到的溶胞產(chǎn)物-絮凝物混合物(附著有CO2氣 泡)中計算出的理論碳酸鹽濃度的范圍為約0. 005 約0. 05M。
8.權(quán)利要求1 7所述的方法,其中,所述碳酸鹽為NaHC03。
9.權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟d)以半連續(xù)或連續(xù)方式運轉(zhuǎn)。
10.設(shè)備,其用于以半連續(xù)方式進行權(quán)利要求1所述方法的步驟d),其包括裝備有下述 部分的容器a)在其下部的滯留層,b)位于滯留層上的入口,c)在滯留層下的出口,以及d)一個或多個可以到達至滯留層表面的分散裝置,且均勻和溫和地分散在該容器中經(jīng) 由堿裂解以及中和獲得的沉淀物和溶胞產(chǎn)物的混合物。
11.權(quán)利要求10所述的設(shè)備,其還包括用于提供壓縮氣體的裝置。
12.設(shè)備,其用于以連續(xù)方式進行權(quán)利要求1所述方法的步驟d),其包括容器,所述容 器裝備有a)兩個出口,其中一個位于柱體的頂部,另一個位于容器的底部,以及b)在兩個出口之間的入口。
13.權(quán)利要求12所述的設(shè)備,其中,所述容器上連接有附加的排液和/或清洗單元。
14.權(quán)利要求1所述的方法,其中,選自步驟b) e)中的至少一個步驟以連續(xù)方式運轉(zhuǎn)。
15.權(quán)利要求1所述的方法,其中,使選自步驟b) e)中的至少兩個步驟的組合通過 連接該兩個或多個單獨步驟以連續(xù)方式運轉(zhuǎn)。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法,其中,通過連接至步驟b),步驟a)也以連續(xù)方式運轉(zhuǎn)。
17.權(quán)利要求14 16所述的方法,其中,至少一個步驟以自動模式運轉(zhuǎn)。
18.權(quán)利要求1所述的方法,其中,將沉淀物的清洗步驟插入步驟d)和步驟e)之間。
19.權(quán)利要求18所述的方法,其中,所述清洗步驟由權(quán)利要求13的附加的排液/清洗 單元來進行。
20.權(quán)利要求1所述的方法,其中,將濃縮和/或調(diào)節(jié)步驟(還包括過濾)插入到步驟 d)和步驟e)之間。
21.權(quán)利要求18所述的方法,其中,所述濃縮步驟在所述調(diào)節(jié)步驟之前進行。
22.權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述步驟d)的溶胞產(chǎn)物含有目標(biāo)生物分子。
23.權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述目標(biāo)生物分子是多核苷酸。
24.權(quán)利要求22所述的方法,其中,所述多核苷酸是DNA。
25.權(quán)利要求23所述的方法,其中,所述DNA為質(zhì)粒DNA。
26.權(quán)利要求1所述的方法,其中,在步驟a)中得到的細胞質(zhì)(cellmass)經(jīng)冷凍為粒 狀沉淀(cryo-pelleted)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)生物分子,特別是藥物級質(zhì)粒DNA的可以規(guī)?;倪^程和設(shè)備。所述過程包括堿裂解步驟、中和步驟以及可以進一步擴展到澄清步驟。本發(fā)明公開了用于分離溶胞產(chǎn)物和沉淀物的改進的漂浮方法。該方法基于CO2氣泡在沉淀絮凝物上的附著。該CO2由碳酸鹽釋放,在中和(酸化)過程中或之后。優(yōu)選本發(fā)明的方法使用用于溶胞和中和的設(shè)備以及用于完全連續(xù)澄清(分離絮凝物和澄清的溶胞產(chǎn)物)的新型設(shè)備,以自動的連續(xù)方式來進行。
文檔編號B03D1/18GK101998991SQ200980112325
公開日2011年3月30日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月8日
發(fā)明者丹尼爾·布切利, 喬切恩·厄薩勒, 克里斯廷·阿舍 申請人:貝林格爾.英格海姆Rcv兩合公司
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