專利名稱:用于在生物樣品中進(jìn)行稀有事件分析的高靈敏度多參數(shù)方法
析的高靈敏度多參數(shù)方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請是2008年3月20日提交的U,S.申請Ser. No. 12/067,532的 部分繼續(xù)申請,其中U.S.申請Ser. No. 12/067,532要求于2005年9月 20日提交的美國臨時(shí)申請60/718,676、 2005年10月24日提交的 60/729,536以及2006年3月提交的60/786的優(yōu)先權(quán)。通過參照將前述 申請均完全并入本文。
背景技術(shù):
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及癌癥和診斷測試領(lǐng)域。本發(fā)明可以用于疾病例如癌癥 或心血管紊亂的篩選、分級、治療應(yīng)答、復(fù)發(fā)等。更具體的,本發(fā)明 提供了 一些方法,其輔助對從生物樣品分離的循環(huán)稀有細(xì)胞進(jìn)行分析 和計(jì)數(shù)。
背景
之前已經(jīng)描述了用于從生物樣品中鑒別不僅腫瘤細(xì)胞、還有稀有 細(xì)胞以及其他生物實(shí)體(entity)的方法(US 6,365,362)。這種兩階段方
法需要有效的富集以確保在分析之前獲取目標(biāo)細(xì)胞,同時(shí)消除實(shí)質(zhì)量 的碎片和其他干擾物質(zhì),以允許通過成像枝術(shù)進(jìn)行細(xì)胞檢驗(yàn)。該方法
以獨(dú)特的自動(dòng)化方式將免疫磁性富集的元件與多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)量 術(shù)、顯微鏡術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析組合。這種組合方法用于對血液樣 品中的上皮細(xì)胞進(jìn)行富集和計(jì)數(shù),這樣提供了用于測量癌癥的工具。
這種兩階段方法在癌癥預(yù)后中以及癌癥轉(zhuǎn)移患者的存活中具有應(yīng) 用(WO 04076643)?;谘褐写嬖谛螒B(tài)學(xué)上完整的循環(huán)癌細(xì)胞,該方 法能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移乳癌患者的循環(huán)癌細(xì)胞的存在與疾病進(jìn)展和存活的時(shí)間 進(jìn)行關(guān)聯(lián)。更具體的,每7.5毫升存在五(5)個(gè)或更多個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì) 胞提供了在首次隨訪時(shí)的預(yù)測值,這樣提供了患者存活的早期預(yù)后指 示。上述檢驗(yàn)的特異性隨著所檢測細(xì)胞的數(shù)目而提高,并且如果僅檢
測少量的細(xì)胞(通常低于5個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞),則其特異性不足。該問 題的一個(gè)解決方案是提供關(guān)于可疑癌細(xì)胞的詳細(xì)遺傳信息。因此,一 種將血液樣品的富集與對個(gè)別可疑癌細(xì)胞的多參數(shù)圖像細(xì)胞計(jì)量術(shù)和
多參數(shù)遺傳分析結(jié)合的方法將提供完整的分布圖(profile)和確認(rèn)機(jī)制 以顯著改善目前用于患者篩選、評定疾病復(fù)發(fā)或其他全部存活的程序。 已經(jīng)描述了在稀有循環(huán)細(xì)胞的分析中的確認(rèn)檢驗(yàn),其通過將個(gè)別分離 的目標(biāo)細(xì)胞的表型和基因型多參數(shù)分析進(jìn)行組合(參見審批中的U.S.申 請12/067,532)。確認(rèn)提供了臨床上顯著的靈敏度水平,因此確保醫(yī)生 獲取所有定量信息。使用數(shù)目非常小(l、 2、 3或5個(gè))的循環(huán)腫瘤細(xì) 胞(CTC)評定相關(guān)疾病狀態(tài),并提供對早期疾病^r測的確認(rèn)。
還不存在其他可以利用的技術(shù),其能夠?qū)κ褂孟嗤瑯?biāo)志物對相同
的樣品進(jìn)行多次高靈敏度檢驗(yàn),并對稀有事件進(jìn)行該技術(shù)。通常進(jìn)行 多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù),但其需要數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)目標(biāo)細(xì)胞或事件以 得到精確的信息。然而,如果患者在7.5mL血液中僅具有6個(gè)CTC, 則存在太少的事件而不能可靠地檢測,也不能進(jìn)行多參數(shù)分析。
本發(fā)明擴(kuò)展了在US 6,365,362中所描述的,以及在Celltracks Autoprep 系統(tǒng)和Celltracks Analyzer II系統(tǒng)(Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA)中所使用的富集和分析規(guī)程,其通過提供允許 使用多個(gè)熒光生物標(biāo)志物研究稀有循環(huán)細(xì)胞的手段。
發(fā)明內(nèi)容
本文所描述的發(fā)明包括一種方法,其包括聯(lián)合工作的五個(gè)部分以 達(dá)到最終的結(jié)果。本發(fā)明主要包括(l)對柱體(cartridge)進(jìn)行掃描以 鑒定具有所關(guān)注目標(biāo)細(xì)胞的那些,以及它們在所迷柱體中的位置;(2) 從所迷柱體抽吸流體以千燥或主動(dòng)地將細(xì)胞固定在它們在蓋玻片上的
位置;(3)對熒光信號進(jìn)行光漂白以消除最初用于鑒定目標(biāo)細(xì)胞的熒光;
(4)使用 一種或者多種熒光抗體綴合物或染料對柱體內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行再染 色以在所關(guān)注目標(biāo)上或之內(nèi)標(biāo)記標(biāo)志物、受體、蛋白質(zhì)等;(5)對所述 柱體進(jìn)行再掃描并返回到之前所鑒定所關(guān)注的目標(biāo),并確定細(xì)胞對于 期望的標(biāo)志物或蛋白質(zhì)是陽性還是陰性。
使用熒光標(biāo)志物對含有CTC或其他所關(guān)注細(xì)胞的血液樣品進(jìn)行染
5色以進(jìn)行成像分析,并掃描以鑒定目標(biāo)細(xì)胞或亞細(xì)胞元件在柱體內(nèi)的存在和位置。接著對含有期望目標(biāo)細(xì)胞或亞細(xì)胞元件的樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理, 一部分通過對樣品進(jìn)行光漂白,以便這些相同的目標(biāo)可以被再分析,其使用附加的綴合到相同或不同熒光染料的生物標(biāo)志物,并使用與進(jìn)行起始分析相同的成像標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明具有利用目標(biāo)的應(yīng)用,例如循環(huán)上皮細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群、含有所關(guān)注細(xì)胞器或受體的細(xì)胞、細(xì)應(yīng)碎片、破裂細(xì)胞和它們的碎片,或者其他任何可以被捕獲并成像的所艱成元件。
圖l:畫面A在千燥后確認(rèn)樣品的完整性和目標(biāo)的位置。畫面B在千燥前后在相同的位置顯示細(xì)胞。圖2:在干燥后對柱體再染色。
圖3:使用LED對焚光信號進(jìn)行漂白。畫面A漂白使用Cll-PE染色的SKBR細(xì)胞,接著進(jìn)行CU-FITC再染色。畫面B漂白使用Cll-PE染色的PC3-9細(xì)胞,接著進(jìn)行C1卜FITC再染色。
圖4:圖A顯示使用CU-PE染色的SKBR細(xì)胞的起始掃描。圖B顯示在漂白后和僅使用C11-FITC再染色的樣品。圖C顯示使用C11-FITC和pART-PE在染色的樣品。
發(fā)明詳迷
已經(jīng)使用CellTracks Autoprep 系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)(Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA)對從血液捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)進(jìn)行檢測和分析。在該程序中,熒光生物標(biāo)志物和染料的組合被用于鑒定上皮細(xì)胞來源的細(xì)胞,并將它們與污染的白細(xì)胞區(qū)別開。CellTracks⑧分析平臺受限于4個(gè)通道或顏色以檢測這些熒光標(biāo)志物。UV通道檢測細(xì)胞核染料4,,6,-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),以鑒定有細(xì)胞核的事件或細(xì)胞事件;別藻藍(lán)蛋白(APC)通道,用于檢測CD45-APC,其用于鑒定白細(xì)胞;以及兩個(gè)標(biāo)志物通道藻紅蛋白(PE)和異硫氰酸熒光素(FITC)用于檢測綴合到PE或FITC上的生物標(biāo)志物。使用標(biāo)準(zhǔn)的CellSearch⑧試劑盒(Veridex LLC, Raritan, NJ),將PE綴合到細(xì)胞角蛋白,這用于鑒定上皮細(xì)胞,F(xiàn)ITC是可以利用的其他所關(guān)
6注的標(biāo)志物。上皮細(xì)胞試劑盒(Immunicon Corporation, HuntingdonValley, PA)使用相同的顏色組合,其中目前僅僅細(xì)胞角蛋白與FITC綴合,而空出了 PE通道。PE通道較強(qiáng)的信號可以允許檢測綴合到PE的較暗的生物標(biāo)志物。
因?yàn)樵贑ellTracks Analyzer II系統(tǒng)中僅僅存在4個(gè)通道或顏色,并且這四個(gè)中有3個(gè)用于檢測上皮細(xì)胞和白細(xì)胞,僅一個(gè)通道可以保留下來用于附加的生物標(biāo)志物分析。然而,特別是在制藥工業(yè)中,需要對所捕獲的目標(biāo)檢測多個(gè)生物標(biāo)志物,并且優(yōu)選檢測發(fā)生在相同的目標(biāo)上。本發(fā)明能夠從附著到所捕獲目標(biāo)上的生物標(biāo)志物和染料除去焚光信號,并使用所關(guān)注的附加標(biāo)志物對相同的目標(biāo)進(jìn)行再染色。在柱體的起始掃描之后的千燥步驟將所關(guān)注的目標(biāo)固定在它們在柱體中的起始位置中,以便在將柱體再染色時(shí),這些相同的目標(biāo)容易被發(fā)現(xiàn),并分析所關(guān)注的附加生物標(biāo)志物的存在。
在程序的第一步中,在Celltracks Autoprep(g)系統(tǒng)和Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對CellTmcks⑧柱體進(jìn)行處理,在此處對所捕獲的目標(biāo)進(jìn)行掃描,并確定所鑒定期望目標(biāo)的存在得到它們在柱體中的定位。通過抽吸從柱體中移出液體,并將該柱體風(fēng)干過夜。進(jìn)行抽吸和風(fēng)干,同時(shí)該柱體保持在起始MagNest⑧中。該步驟將目標(biāo),通常是細(xì)胞例如CTC"固定,,在柱體的適當(dāng)位置處,以便它們基本上成為固定的,并且附著到成像表面,在此位置處它們被初次檢測。固定細(xì)胞的優(yōu)選方法是風(fēng)干柱體,然而也可以使用其他固定方法,事實(shí)上,可以需要暴露到某些類型的抗原,或者達(dá)到某些抗體與它們抗原之間的最佳反應(yīng)性。該干燥步驟或主動(dòng)固定使得柱體可以從MagNest⑧.除去,并使得該柱體被處理,其中幾乎沒有或沒有細(xì)胞移動(dòng)或損失。因此,使得成像設(shè)備例如但不限于Celltracks Analyzer II系統(tǒng)能夠在后續(xù)分析過程能夠再獲取目標(biāo)。該程序的第二步驟將所述柱體暴露到強(qiáng)光(由例如但不限于LED產(chǎn)生的),以便對在其起始處理過程中附著到目標(biāo)的染料和標(biāo)記物的熒光進(jìn)行漂白。在熒光染料以高速激發(fā)時(shí),光漂白是有效的。以高效率激發(fā)染料的波長帶通常是窄的(10-50nm)。 LED有效地高效產(chǎn)生窄波長帶,并可以得到近UV至IR的發(fā)射。通過散熱器(heat sink)進(jìn)一步提高LED的效率??梢詫⑷芜x的均化器(由反射或折射表面構(gòu)成)用于提高樣品上光分布的均一性。使用目前的原型LED漂白器,
7光漂白亮染料可以需要最高達(dá)到20分鐘。然而,對于4交暗的信號,10~15 分鐘足夠了。在最后的步驟中,柱體中的樣品被綴合到焚光染料上的 所關(guān)注的附加生物標(biāo)志物再染色。除去染色溶液,并使用核酸染料溶 液例如含有DAPI的CellFix,并在成像設(shè)備上對柱體進(jìn)行再分析。
圖1A確認(rèn)了在干燥后樣品的完整性。在樣品被干燥后,鐵磁流體 分布和目標(biāo)的位置與在CellTracks Analyzer II系統(tǒng)上起始進(jìn)行掃描時(shí) 保持相同。圖1B顯示在干燥前后,這些細(xì)胞保持完整,并且在相同位 置。 —
圖2證明在干燥后在柱體中再染色的能力。此處,將目標(biāo)細(xì)胞加 入使用CellSave防腐劑(Immunicon Corporation)制備的血液中,并存儲 過夜。接著,使用利用C11-PE標(biāo)記細(xì)胞的CTC試劑盒在CellTracks⑧ Autoprep⑧系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)中處理樣品。在起始掃 描中,F(xiàn)ITC通道保持空白,因?yàn)闆]有綴合到FITC的標(biāo)志物。在柱體 干燥后,對熒光信號進(jìn)行漂白,在柱體中使用C11-FITC對樣品進(jìn)行再 染色,接著在CellTracks Analyzer II系統(tǒng)上進(jìn)行再掃描。目前,樣品 在PE和FITC通道中都是陽性的。盡管一開始使用C11-PE對這些樣 品進(jìn)行染色,但仍保持充分的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)Cll-FITC結(jié)合。
圖3A和3B證明了使用發(fā)光二極管(LED)漂白掉熒光信號的能 力。將細(xì)胞摻入到血液中,其中所迷血液^/f吏用CellSave防腐劑進(jìn)行 過防腐,并儲存過夜。接著,利用C11-PE標(biāo)記細(xì)胞的CTC試劑盒在 CellTracks Autoprep 系統(tǒng)上對樣品進(jìn)行處理。接著,在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對柱體進(jìn)行掃描。在抽吸液體和柱體干燥之后,將 CellFix加回到柱體;從MagNest(g)移出柱體,并接著暴露到LED發(fā)出 的光,最高達(dá)到20分鐘。將柱體放置回到MagNest 內(nèi),并抽吸CellFix, 使用C1卜FITC對細(xì)胞再染色,接著使用DAPI。這種再染色是必要的, 以便摻入的細(xì)胞能夠^皮在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上再獲取,并分 析。在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對樣品進(jìn)行掃描之后,對它們進(jìn) 行評定光強(qiáng)度,其使用確定平均熒光強(qiáng)度(MFI)的軟件。
圖3A顯示使用被C11-PE亮染色的SKBR細(xì)胞的漂白。在漂白20 分鐘后,PE MFI從大約4000降到接近0。圖3B顯示CU-PE較暗染 色的PC3-9細(xì)胞(典型的CTC)的漂白。在漂白10 15分鐘后,PEMFI 從500-2000的范圍內(nèi)降至0。最終目標(biāo)是使用標(biāo)志物進(jìn)行再染色,其中該標(biāo)志物不是之前在起
始處理樣品過程中在CellTracks Autopr印(g)系統(tǒng)上所使用的標(biāo)志物。 圖4中的圖像證明使用DAPI、 CD45 APC和CU-PE的染料組合提取 在CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)上的CTC的能力,漂白掉這些信號,接 著再用DAPI、 C11-FITC和p-AKT PE對細(xì)胞再染色。AKT是在通過 PI3K通路的細(xì)胞傳導(dǎo)中重要的激酶。該酶通過磷酸化而被激活,并且 已知在某些腫瘤中是組成型激活的。
圖4A顯示在CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)上從細(xì)胞捕獲的以及被 C11-PE染色的SKBR細(xì)胞的起始掃描。注意陰性FITC通道。圖4B顯 示在漂白以及使用C11-FITC再染色之后的樣品。注意陰性PE通道信 號。圖4C顯示在漂白以及使用C11-FITC和pAKT-PE再染色之后的樣品。
本發(fā)明能夠使用多個(gè)熒光生物標(biāo)志物研究CTC,而這通常在采用 單處理頭見程的CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系 統(tǒng)中是不可能的。這一點(diǎn)是通過漂白掉在起始批次中使用的染料的熒 光信號,并在柱體中使用附加的熒光生物標(biāo)志物進(jìn)行再染色,其中現(xiàn) 在可以使用相同的焚光通道對附加的熒光生物標(biāo)志物進(jìn)行再掃描。
本發(fā)明考慮使用后續(xù)再染色對相同的樣品進(jìn)行多次再漂白。本發(fā) 明進(jìn) 一 步考慮漂白處理,以及其對相同的細(xì)胞使用多特異性結(jié)合配偶 體檢驗(yàn)的應(yīng)用。因此,可以對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析,而不需要增加熒 光通道;不需要更多的濾波器,不需要更多的光源,也不會提高收集 和分析數(shù)據(jù)的裝置和軟件的復(fù)雜性。隨后,本發(fā)明將現(xiàn)有4色熒光分 析儀的能力擴(kuò)展到進(jìn)行"N,,參數(shù)分析,而不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備改 進(jìn)。本發(fā)明還允許用戶鑒定所關(guān)注的柱體、干燥或固定它們,接著將 它們保存用于以后高價(jià)值的分析。
本發(fā)明提供了使用相同高靈敏度的熒光團(tuán)用于對相同的細(xì)胞進(jìn)行 兩種或更多種分析,這對于使用本領(lǐng)域中的其他技術(shù)而言是不可能的。 例如,PE具有高吸收和熒光量子產(chǎn)額,這使得其非常適于檢測高靈敏 度標(biāo)志物例如IGF-1R和p-AKT。這些標(biāo)志物在目標(biāo)細(xì)胞中的濃度低, 以至于如果抗體綴合物偶聯(lián)到FITC上而不是PE上,則它們無法:故檢 測到。在陽性細(xì)胞上剛好沒有足夠的IGF-1R以提供可使用FITC檢測 的信號,因?yàn)槠潇`敏度和量子產(chǎn)額較低。這對于P-AKT同樣是正確的,
9但在本發(fā)明中可以使用CK-PE對CTC進(jìn)行鑒定,CK-PE信號被漂白 到0,使用抗-IGF-1R-PE進(jìn)行再染色,和確定相同細(xì)胞的IGF-1R狀態(tài)。 IGF-1R信號可以被進(jìn)一步漂白到0,并使用抗-p-AKT-PE對柱體進(jìn)行 再次再染色。該方法能夠在相同的細(xì)胞上使用可以利用的最靈敏的焚 光染料對全部三種分析物進(jìn)行檢驗(yàn)。
本發(fā)明還能夠得到在樣品上收集到的其他高價(jià)值研究或臨床信 息,而不需要召回患者也不需要收集額外的樣品。發(fā)現(xiàn)了CTC或其他 所關(guān)注的目標(biāo),則可以使用本發(fā)明制備樣品,并檢驗(yàn)這些CTC的性質(zhì) 并進(jìn)行研究,而不需要對患者進(jìn)行額外的侵入性程序。同樣,如果發(fā) 現(xiàn)樣品不含有所關(guān)注的目標(biāo),而不需要考慮其他高價(jià)值測試、程序和 試劑。這一點(diǎn)與其他方法不同,在其他方法中不管是否知道確實(shí)含有 所關(guān)注的目標(biāo)之前都必須要加入測試試劑。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮對相同的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)FISH分析,以尋找與所 觀察到的表達(dá)相關(guān)或者解釋所觀察到的表達(dá)的基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位或者突 變(break )。用于后續(xù)FISH分析的優(yōu)選手段包括使用無重復(fù)的探針(US. 12/067,532)。
一旦發(fā)現(xiàn)了 CTC或其他所關(guān)注的目標(biāo),則本發(fā)明能夠?qū)ζ溥M(jìn)行詳 細(xì)分析。這在藥物開發(fā)過程中可以用于鑒定是否個(gè)體的CTC可能易于 受到目標(biāo)藥物治療的影響。接著,其可以用于進(jìn)一步探索或確認(rèn)藥物 機(jī)理研究,這通過確定是否細(xì)胞內(nèi)或其他標(biāo)志物如同體外研究所預(yù)測 的針對治療被上調(diào)、下調(diào)或磷酸化,因此提供了伴隨治療(companion diagnostics )。本發(fā)明可以用于提供最小侵入性方法以獲得樣品用于確 定患者對目標(biāo)個(gè)性化藥物的適宜性。本領(lǐng)域中的其他已知應(yīng)用例如但 不限于檢測在炎癥損傷中重要的白細(xì)胞亞群的激活狀態(tài),或者白介素 爆發(fā)i例如敗血性休克。本發(fā)明的方法還可用作僅供研究(RUO)服務(wù),
并可能最終作為可以返回到醫(yī)院和相關(guān)實(shí)^^室中的產(chǎn)品。
盡管已經(jīng)描述了并且在上面具體例證了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式, 但不意味著本發(fā)明限于這些實(shí)施方式。可以對其進(jìn)行各種修改而不離 開本發(fā)明的主旨,在后面的權(quán)利要求書中描繪了這些改進(jìn)的全部范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高稀有事件分析中靈敏度的方法,所述方法包括a.通過熒光標(biāo)記制備樣品;b.對所述樣品進(jìn)行掃描以鑒定目標(biāo)事件;c.從所述樣品抽吸流體以在相同的位置留下所述目標(biāo)事件;d.對所述目標(biāo)事件進(jìn)行光漂白;e.使用第二熒光標(biāo)記的標(biāo)志物對所述目標(biāo)事件進(jìn)行再染色;f.對所述目標(biāo)事件進(jìn)行再掃描;以及g.對每個(gè)附加的熒光標(biāo)記的標(biāo)志物重復(fù)步驟c~f。
2. 權(quán)利要求1的方法,其中所述第二標(biāo)記的標(biāo)志物是熒光抗體綴 合物、染料或其組合。
3. 權(quán)利要求1的方法,其中所述掃描和所述再掃描是使用 CellTracks Autoprep 系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)完成的。
4. 權(quán)利要求1的方法,其中所述目標(biāo)事件來自循環(huán)上皮細(xì)胞、循 環(huán)胂瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、'淋巴細(xì)胞亞群、含有所關(guān)注細(xì) 胞器或受體的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、破裂細(xì)胞和它們的碎片或其組合。
5. 權(quán)利要求1的方法,其中所述目標(biāo)事件是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
6. 權(quán)利要求1的方法,其中附加的步驟是所述目標(biāo)事件的多參數(shù) 基因型分布圖分析。
7. 權(quán)利要求6的方法,其中所述基因型分布圖分析是FISH。
8. —種對混合細(xì)胞群中可疑目標(biāo)細(xì)胞的檢測和計(jì)數(shù)進(jìn)行確認(rèn)的 方法,所述方法包4舌a. 從測試對象獲得生物樣本,所述樣本包含懷疑含有目標(biāo) 細(xì)胞的混合細(xì)胞群;b. 通過免疫磁力富集分離所述可疑目標(biāo)細(xì)胞的亞群;c. 通過多參數(shù)表型分布圖鑒定可疑目標(biāo)細(xì)胞;d. 制備可疑目標(biāo)細(xì)胞用于多參數(shù)基因型分布圖;以及e. 通過所述基因型分布圖對可疑目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn),其中 所迷個(gè)別可疑目標(biāo)細(xì)胞含有所述目標(biāo)細(xì)胞的表型和基因 型分布圖。
9. 權(quán)利要求8的方法,其中所述表型分布圖包括a. 對可疑細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記;b. 對所述可疑細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行掃描;c. 從所述樣品抽吸流體;d. 對所述樣品進(jìn)行光漂白;以及e. 對所述可疑細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行再掃描。
10. 權(quán)利要求8的方法,其中所述目標(biāo)細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì) 胞、胎兒細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞及其組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在生物樣品中進(jìn)行稀有事件分析的高靈敏度多參數(shù)方法。使用熒光標(biāo)志物對含有CTC或其他所關(guān)注細(xì)胞的血液樣品進(jìn)行染色用于圖像分析,并進(jìn)行掃描以鑒定目標(biāo)細(xì)胞或亞細(xì)胞元件在柱體(cartridge)中的存在和位置。接著,將含有期望目標(biāo)細(xì)胞或亞細(xì)胞元件的樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理,部分通過光漂白,以便這些相同的目標(biāo)可以被再分析,其使用附加的綴合到相同或不同熒光染料的生物標(biāo)志物,并使用與進(jìn)行起始分析相同的成像標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明具有利用目標(biāo)的應(yīng)用,例如循環(huán)上皮細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、含有所關(guān)注細(xì)胞器或受體的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、破裂細(xì)胞和它們的碎片,或者其他任何可以被捕獲并成像的所形成元件。本發(fā)明提供了用于進(jìn)一步研究所關(guān)注的個(gè)別目標(biāo)的手段,特別是在與遺傳分析例如FISH結(jié)合時(shí)。
文檔編號B03C1/00GK101672779SQ20091016467
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者F·庫曼斯, M·C·康奈利, M·凱莉, S·格羅斯 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司