專利名稱：Il-18抑制劑在治療和/或預(yù)防心臟病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心血管疾病領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及IL-8抑制劑在治療和/或預(yù)防心臟病特別是缺血性心臟病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子白介素18(IL-18)最初被稱為干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)因子(Nakamura等人，1989)。它是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞輔助細(xì)胞1型(TH1)應(yīng)答反應(yīng)的早期信號。IL-18與IL-12、IL-2、抗原、有絲分裂原、以及可能還有其它一些因子一起作用誘導(dǎo)了IFN-γ的產(chǎn)生。IL-18也可提高GM-CSF和IL-2的產(chǎn)生，增強抗CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖以及增加自然殺傷細(xì)胞的Fas介導(dǎo)的殺傷力。
成熟的IL-18由其前體經(jīng)IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE，caspase-1)作用而產(chǎn)生。
IL-18受體由在配體結(jié)合中協(xié)同起作用的至少兩種成分組成。在經(jīng)小鼠IL-12刺激的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了IL-18的高和低親和力結(jié)合位點(Yoshimoto等人，1998)，提示有一種多鏈?zhǔn)荏w復(fù)合物。迄今為止，已鑒定到兩種受體亞基，均屬于IL-1受體家族(Parnet等人，1996；Kim等人，2001)。IL-18的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括NF-κB的激活(DiDonato等人，1997)。IL-18受體復(fù)合物由兩條受體鏈組成一條為配體結(jié)合鏈，稱之IL-18Rα鏈，另一條為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈，稱之IL-18Rβ鏈。IL-18R鏈最初是作為與放射性標(biāo)記IL-18結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)而分離的；純化了該蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它的氨基酸序列與先前報導(dǎo)被稱為IL-1R相關(guān)蛋白(IL-1Rrp)的孤獨受體相同(Torigoe等人，1997)。
最近，從人尿液分離出對IL-18有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)，并且克隆了人和小鼠cDNA以及人基因(Novick等人，1999；WO99/09063)。該蛋白被命名為IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)。
IL-18BP不是已知的IL-18受體之一的胞外結(jié)構(gòu)域，而是一種分泌性天然循環(huán)蛋白。它屬于分泌性蛋白的一個新家族，該家族還包括幾種痘病毒編碼的蛋白質(zhì)(Novick等人，1999)。尿和重組IL-18能以高親和力特異性結(jié)合IL-18，并調(diào)節(jié)IL-18的生物親和力。
IL-18BP基因位于人染色體11q13上，在8.3Kb的基因組序列中沒發(fā)現(xiàn)編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子。迄今為止，已在人類中發(fā)現(xiàn)由于交替mRNA剪接產(chǎn)生的IL-18BP的四種剪接變體或同種型。它們被命名為IL-18BPa、b、c和d，它們均有相同的N末端，但C末端不同(Novick等人，1999)。這些同種型與IL-18的結(jié)合能力不同。在四種同種型中，已知人IL-18同種型a和c對IL-18具有中和能力。人IL-18同種型a與小鼠IL-18起交叉反應(yīng)。
心臟病定義為影響心肌或心臟血管的疾病(The Merck Manual Home Edition，www.merck.com)。血管障礙是一種血管問題，如阻塞而致的循環(huán)不良。心臟病也稱心血管疾病。
缺血性心臟病是心力衰竭的一種常見病因，它是西方社會中最常見的死因。通常由于冠狀動脈粥樣硬化而引起。心肌損傷包括缺血性纖維化和急性心肌梗塞。正常情況下，冠狀動脈內(nèi)的血流與心肌代謝的需求緊密配合。供血不足時會引發(fā)缺血性心臟病，這是因為供血本身受損或心肌肥大對供血的需求增大。正常情況下冠狀動脈的血流不取決于主動脈壓。有一種有效的自動調(diào)節(jié)機制控制血液流過冠狀動脈血管床。
通常，由于動脈粥樣硬化或動脈硬化而發(fā)生主冠狀動脈閉塞時，最初會保持冠狀動脈內(nèi)的血流，這是因為閉塞遠(yuǎn)處的外周阻力減少了。當(dāng)超過75％的管腔閉塞，尤其是如果冠狀動脈側(cè)支循環(huán)不良時，就會發(fā)生缺血。
心肌代謝極其活躍，線粒體占了每根心肌纖維體積的30％以上。因為高能磷酸儲存很少，有氧代謝是必然的。當(dāng)組織的三磷酸腺苷(ATP)水平極低，和厭氧糖酵解實際上停止時，心肌發(fā)生死亡。與其它組織一樣，死亡的準(zhǔn)確原因還不清楚，但心肌的致命損傷與細(xì)胞膜破壞和鈣突然進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有關(guān)。短暫缺血后，可重建(再灌注)心臟的血流。然而，經(jīng)過一段臨界時間后，再灌注即不可能，這可能是毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹的結(jié)果。
絕大多數(shù)冠狀動脈疾病是動脈粥樣硬化。缺血性心臟病也可能由冠狀動脈低灌注引起。特別是出血所引起的休克是其常見原因。
如上指出，缺血性心臟病是由心肌血流與心肌的代謝需求之間的不平衡所引起。血管痙攣、血栓或?qū)е鹿嘧⒉蛔愕难h(huán)變化等疊加事件可使血流進(jìn)一步減少。
冠狀動脈灌注取決于心門(主動脈舒張壓)與冠狀動脈竇(右房壓)之間的壓力差。冠狀動脈的血流由于冠狀動脈口的文丘里效應(yīng)以及心室收縮期間肌內(nèi)動脈壓縮在心臟收縮期間減少。使冠狀動脈的血流減少的因素包括主動脈舒張壓下降、心室內(nèi)壓增大和心肌收縮、冠狀動脈狹窄、主動脈瓣狹窄、倒流以及右心房壓增大。
通常，采用諸如鏈激酶或組織纖溶酶原激活因子(TPA)等藥劑進(jìn)行溶栓治療，以溶解新近形成的血栓。大多數(shù)情況下這些溶栓治療可重建血流。這有助預(yù)防心肌嚴(yán)重受損，若在栓塞早期(少于1小時左右)進(jìn)行，至少可有助減少進(jìn)一步的損傷。
心絞痛是一種缺血性心臟病的癥狀性綜合癥，特點是胸痛突然發(fā)性發(fā)作，通常是胸骨以下或心前區(qū)。它是由不足以誘發(fā)梗塞的心肌缺血所引起。心肌可能發(fā)生突然死亡，這是心臟病引起的意外死亡，通常發(fā)生在心肌栓塞1小時內(nèi)或無癥狀發(fā)作。每年有300,000-400,000人發(fā)病。
心臟病的其它形式包括酒精性心肌病、主動脈瓣脫垂、主動脈瓣狹窄、心律不齊、心源性休克、先天性心臟病、擴張型心肌病、心臟病發(fā)作、心力衰竭、心臟腫瘤、心瓣膜肺動脈狹窄、肥厚型心肌病、特發(fā)性心肌病、缺血性心臟病、缺血性心肌病、二尖瓣反流、二尖瓣脫垂、圍生期心肌病、穩(wěn)定型心絞痛。
心肌梗塞是缺血性心臟病的另一種形式。致病機理可能包括閉塞性冠狀動脈內(nèi)血栓，即血栓位于潰瘍性或裂縫式狹窄斑上。閉塞性冠狀動脈內(nèi)血栓造成90％急性穿壁性心肌梗塞。血管痙攣可能伴有或沒有冠狀動脈粥樣硬化，并可能與血小板聚集有關(guān)。心肌梗塞也可能有栓子。
心肌梗塞的整體形態(tài)外觀可能不同。穿壁性梗塞涉及左心室壁從心內(nèi)膜到心外膜的全部厚度。心內(nèi)膜下梗塞涉及限于左心室壁內(nèi)部1/3-1/2的多灶性壞死區(qū)域。心肌梗塞的并發(fā)癥可包括可能會“突然死亡”的心律不齊和傳導(dǎo)缺陷、梗塞延伸、或再次梗塞、充血性心力衰竭(肺水腫)、心源性休克、心包炎、可能有栓塞現(xiàn)象的附壁血栓、可能有心壓塞的心肌壁破裂、乳頭肌斷裂，還可能有瓣膜關(guān)閉不全、心室動脈瘤形成。
心肌梗塞定義為通常由于某一區(qū)段心肌的冠狀動脈血流突然減少而致的缺血性心肌壞死。
在90％以上患有急性心肌梗塞的病人中，急性血栓常伴有斑破裂使供血給受損部位的動脈(因動脈粥樣硬化斑先前已有部分阻塞)閉塞。動脈粥樣硬化斑內(nèi)的內(nèi)皮改變誘導(dǎo)血小板功能改變，估計有利血栓形成。約三分之二病人發(fā)生自發(fā)性溶栓，所以24小時后只在約30％的病人中發(fā)現(xiàn)血栓閉塞。
心肌梗塞有時是由動脈栓塞(例如二尖瓣或主動脈狹窄、感染性心內(nèi)膜炎及消耗性心內(nèi)膜炎)引起的。已報道冠狀動脈痙攣病人以及甚至冠狀動脈正常的病人可出現(xiàn)心肌梗塞。可卡因使冠狀動脈痙攣加劇，使用者可能患有由可卡因誘導(dǎo)的心絞痛或心肌梗塞。尸檢研究和冠狀動脈造影顯示，正常冠狀動脈可能發(fā)生可卡因誘導(dǎo)的冠狀動脈血栓，或者與原有的動脈粥樣化重疊。
心肌梗塞主要是左心室疾病，但損害可延伸至右心室或心房。右心室梗塞通常是由右冠狀動脈或主左旋動脈支閉塞造成，特征為右心室充盈壓高、往往有嚴(yán)重的三尖瓣關(guān)閉不全及心輸出量低。約一半下壁/前壁心肌梗塞的病人發(fā)生某種程度的右心室功能障礙，10％至15％血液動力學(xué)出現(xiàn)異常。
心臟繼續(xù)發(fā)揮泵功能的能力與心肌受損的程度直接相關(guān)。
透壁性梗塞包括從心內(nèi)膜到心外膜的整個心肌層厚度，其常見特征為心電圖(ECG)的Q波異常。非透壁性梗塞或心內(nèi)膜下梗塞不延伸到心室壁，而且只造成ST段和T波異常。心內(nèi)膜下梗塞常涉及心肌的內(nèi)三分之一，此處壁張力最高，心肌血流最易受循環(huán)變化的損傷。它們也可發(fā)生在血壓長期過低之后。因為在臨床上不能準(zhǔn)確測定壞死的透壁深度，心電圖則能較好地將梗塞分為Q波或非Q波。通過膽堿激酶升高的程度及持續(xù)時間可估計心肌受破壞的體積。
缺血性心肌病是另一種缺血性心臟病。這種情況以前可能有心肌梗塞，但該疾病由冠狀動脈嚴(yán)重的粥樣硬化造成涉及所有主要分支。這一結(jié)果是血管供血不足，導(dǎo)致肌細(xì)胞損失。肌細(xì)胞損失與間質(zhì)膠原沉積形成的纖維化一起導(dǎo)致順應(yīng)性下降，并伴有心臟擴張，致使其余的肌細(xì)胞負(fù)荷過重。這個過程一直持續(xù)下去，直到肌細(xì)胞不斷地過度生長作出補償。甚至通過增生和肥大來補償，這可解釋心臟最后的尺寸很大(是正常心臟尺寸的2至3倍)。最后，心臟無法再補償，心力衰竭，心律不齊和/或缺血。所以，臨床上心力衰竭是緩慢、進(jìn)行性的，先前有或沒有心肌梗塞或心紋痛的病史。缺血性心臟病死亡中高達(dá)40％是缺血性心肌病所致。
心臟缺血和再灌注期間產(chǎn)生許多內(nèi)源性介質(zhì)，如小分子第二信使，它們影響心肌功能。心肌收縮力在缺血發(fā)生數(shù)分鐘內(nèi)減少，收縮力的完全恢復(fù)主要取決于缺血持續(xù)的時間(Daemen等人，1999)。例如，在缺血期間，Ca2+的體內(nèi)平衡被擾亂，產(chǎn)生氧衍生的游離基，并發(fā)生一氧化氮的合成和釋放。另外，還局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，特別是TNFα和IL-1β(Bolli，1990)。在完整的心臟中，這些細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶(iNOS)(Daemen等人，1999)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)和磷脂酶A2以及血管黏附分子和幾種趨化因子的基因表達(dá)，對缺血誘導(dǎo)的心肌功能障礙起作用。因此，小分子信使介導(dǎo)了心肌收縮力的立即下降，隨后為細(xì)胞因子介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞浸潤，使心肌進(jìn)一步受損。在血液或血產(chǎn)物不存在的情況下進(jìn)行的動物心臟研究詳細(xì)闡明了缺血性攻擊期間TNFα(Herskowitz等人，1995)和IL-1β的作用。由于這些內(nèi)源性細(xì)胞因子的作用，心肌細(xì)胞也失去了收縮力(Meldrum等人，1998)。
大部分有關(guān)TNFα和IL-1β介導(dǎo)的心肌功能障礙實驗數(shù)據(jù)都來自動物研究。然而，已在受控條件如活體外條件下研究了獲自經(jīng)歷了選擇性心肺旁路手術(shù)病人獲得的人心肌組織(Gurevitch等人，1996；Cleveland等人，1997)。在此實驗?zāi)Ｐ椭?，將人心房小梁懸于無血的生理性氧化的緩沖液浴槽中，然后暴露于模擬的缺血發(fā)作。在此期間，收縮力顯著下降；當(dāng)組織再次與氧氣接觸時，收縮力回升，但有所下降(下降60-70％)，通過膽堿激酶(CK)的釋放觀察到心肌受損的證據(jù)(Gurevitch等人，1996；Cleveland等人，1997)。當(dāng)TNF的生物活性在缺血/再灌注期間被特異性中和時，發(fā)現(xiàn)收縮力更大回升，提示內(nèi)源性心肌TNF活性對缺血所誘導(dǎo)的收縮功能障礙有作用(Cain等人，1999)。
Daemen等人(1999)采用腎缺血小鼠模型研究了缺血隨后再灌注所引起的組織損傷。研究顯示，缺血后第1日，腎IL-18mRNA上調(diào)與caspase-1的活化相一致。缺血后第6日，IFN-γ和IL-12mRNA隨后上調(diào)。綜合起來而不是分開地看，體內(nèi)中和IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-12和IL-18使依賴于IFN-γ的MHCI和II類上調(diào)減少，減少的程度與IFN-γ的中和程度相類似。
然而，迄今為止，IL-18在心臟病所起的作用還沒有敘述。
發(fā)明概述本發(fā)明的根據(jù)是以下發(fā)現(xiàn)IL-18抑制劑在上融合(suprafused)的人心房心肌缺血/再灌注模型中大大改善了心臟的收縮功能。抑制caspase-1(ICE)也能減少缺血和再灌注后收縮力的下降。
此外，給予心肌梗塞小鼠模型IL-8抑制劑導(dǎo)致提高存活率，并顯著改善心室功能。
這些研究證明，IL-18抑制劑適合治療或預(yù)防心肌功能障礙。
因此，本發(fā)明涉及用IL-18抑制劑來制備治療和/或預(yù)防心臟病，特別是缺血性心臟病和/或心臟衰竭的藥物。
為了應(yīng)用基因療法將IL-18抑制劑輸送到患病組織或細(xì)胞，本發(fā)明還涉及采用含IL-18抑制劑編碼序列的表達(dá)載體來治療和/或預(yù)防心臟病。
附圖簡要說明

圖1顯示IL-18BP對缺血誘導(dǎo)的心肌收縮功能障礙的影響。
(A)對缺血性損傷的動力學(xué)反應(yīng)。平衡后，在含氧量正常的條件下在實驗全過程使對照小梁上融合。使小梁在IL-18BP不存在或存在(5微克/毫升)下經(jīng)歷缺血/再灌注?？v軸表示產(chǎn)生的收縮力與實驗開始(時間為0)相比的百分比。數(shù)據(jù)來自一個病人的小梁，是用來計算90分鐘內(nèi)產(chǎn)生的收縮力的平均變化的典型方法。
(B)用1或5微克/毫升IL-18BP中和IL-18后缺血后產(chǎn)生的收縮力。結(jié)果以完成再灌注(90分鐘)后產(chǎn)生的收縮力相對于對照的平均百分比變化表示。括號中的數(shù)字表示IL-18BP的濃度單位是微克/毫升。N＝6。*表示與缺血/再灌注比較p＜0.01。
圖2顯示心肌IL-18蛋白質(zhì)含量。在含氧量正常的條件下(對照)上融合90分鐘或缺血30分鐘再灌注45分鐘(缺血/再灌注)后均質(zhì)化小梁。使同一受試者的小梁匹配?？v軸表示IL-18水平，濃度單位為皮克/毫升。N＝4。*表示p＜0.01。
圖3顯示對照和缺血心房組織中穩(wěn)態(tài)IL-18和IL-18BP mRNA水平。IL-18和IL-18BP mRNA水平由RT-PCR技術(shù)測定。數(shù)據(jù)來自兩個評估受試者之一。A表示溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠，其中PCR產(chǎn)物是分開的，B表示PCR產(chǎn)物含量的定量分析結(jié)果，相對于對照(GAPDH)倍數(shù)改變。
圖4顯示ICE的抑制對缺血后產(chǎn)生的收縮力的影響。結(jié)果表示為缺血/再灌注后產(chǎn)生的收縮力相對對照的平均百分比變化。括號中的數(shù)字表示ICEi的濃度單位是微克/毫升。N＝7。*表示與缺血/再灌注比較p＜0.01。
圖5顯示組織膽堿激酶(CK)在缺血/再灌注后的活性，以每毫克組織(濕重)的活性單位表示。實驗條件顯示在橫軸下面。對照和缺血/再灌注，N＝6；IL-18BP(5微克/毫升)，N＝5；ICEi(10和20微克/毫升)，各為N＝5；*表示與缺血/再灌注比較p＜0.01。
圖6顯示產(chǎn)生的收縮力相對于平衡期后產(chǎn)生的收縮力的變化均值，該平衡期是加入TNFα(1納克/毫升)前先使10微克/毫升小梁培育15分鐘，設(shè)定為100％(n＝5)。加入TNFα和IL-18BP，直到每個浴槽改變。
圖7顯示在含氧量正常的條件下人心房小梁對IL-18的短暫反應(yīng)。將成熟的IL-18(100納克/毫升)在90分鐘實驗期間加到心房小梁中?？v軸表示與產(chǎn)生的收縮基線力的百分比變化均值。基線是在平衡期結(jié)束時測定的(未示出)。(n＝6)。*表示在相同時間間隔與對照比較p＜0.05，**表示實驗期其余時間與對照比較p＜0.001。
圖8顯示經(jīng)過缺血/再灌注、與TNFα(1納克/毫升)和TNFα(10納克/毫升)+IL-18BP接觸后肌細(xì)胞組織膽堿激酶活性的保留。膽堿激酶活性以每毫克組織(濕重)的膽堿激酶活性單位表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明的根據(jù)是發(fā)現(xiàn)IL-18抑制劑在心臟病特別是缺血性心臟病發(fā)揮了有益的作用。如以下實施例所示，幾種不同的IL-18抑制劑顯示對心肌缺血后產(chǎn)生的收縮力具有顯著的有益作用。
另外，在心肌梗塞的體內(nèi)模型中測試了一種IL-18抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存活率提高，心室功能得到顯著改善。
因此，本發(fā)明涉及用IL-18抑制劑來制造治療和/或預(yù)防心臟病的藥物。
本發(fā)明的術(shù)語“心臟病”包括心臟功能障礙在內(nèi)的疾病。它們通常也稱心血管疾患。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，心臟病是缺血性心臟病。
本文所用的術(shù)語“缺血性心臟病”包括全部不同類型的缺血性心臟病，包括但不限于在“發(fā)明背景”中詳細(xì)解釋的那些缺血性心臟病，以及與缺血性心臟病相關(guān)的心血管病或疾患。
本發(fā)明的應(yīng)用很適合長期治療，故特別適用在與慢性心臟病相關(guān)的應(yīng)用中。所以，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，缺血性心臟病是慢性病。心絞痛具有缺血性心臟病長期病史患者最常見的一種臨床癥狀。以前有過一次或多次心肌梗塞后左心室功能受損，可導(dǎo)致左心室衰竭，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭。所以，本發(fā)明還涉及用IL-18抑制劑來治療和/或預(yù)防心絞痛。
在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，缺血性心臟病是急性病，更優(yōu)選為心肌梗塞。
急性心肌性心臟病或心肌梗塞一般涉及心肌壞死，常見是左心室心肌壞死。它通常是由于冠狀動脈粥樣硬化與血栓或斑塊出血重疊所引起。壞死隨后發(fā)生炎癥浸潤、壞死肌肉釋放纖維修復(fù)酶到血液中以及白細(xì)胞增多，這些在診斷上有用。急性心肌梗塞并發(fā)癥包括心律不齊、心力衰竭、導(dǎo)致心包積血的心肌破裂、導(dǎo)致栓塞的壁血栓及心臟動脈瘤。其他并發(fā)癥還包括突然死亡、心律不齊、持續(xù)疼痛、心絞痛、心力衰竭、二尖瓣關(guān)閉不全、心包炎、心臟破裂(心室痛、隔膜或乳突肌肉)、壁血栓形成、心室動脈瘤、德雷斯勒氏綜合征(Dressler’s syndrome)(胸痛、發(fā)燒、滲出)、肺栓塞。本發(fā)明的藥物也可用來治療和/或預(yù)防心肌梗塞的這些并發(fā)癥。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，心臟病是心力衰竭。心力衰竭是一種患病狀態(tài)，在該狀態(tài)時心臟不能以正常代謝所需的速率供血。幾乎所有形式的心力衰竭中心輸出量都減少，這導(dǎo)致一定程度的灌注不足，稱為動脈充盈不足。機體通過保留液體增加血量來補償。心力衰竭可以是急性或慢性。心力衰竭的早期臨床癥狀似乎是一側(cè)的，但因為左右心室共享中間的心室隔膜，所以一個心室衰竭，另一個心室不可避免會跟著衰竭。心力衰竭可能由缺血性心臟病引起。它也可能由其它原因引起，如系統(tǒng)性高血壓、瓣膜性心臟病或?qū)е鲁溲孕牧λソ叩姆尾　?br> 心力衰竭可以是充血性心力衰竭，這是一種癥狀性心肌功能障礙導(dǎo)致特征型式的血液動力學(xué)、腎臟和神經(jīng)激素反應(yīng)。心力衰竭的臨床表現(xiàn)可以是左心室衰竭或右心室衰竭。心力衰竭表現(xiàn)為心臟收縮或舒張性功能障礙，或二者。常見是聯(lián)合性心臟收縮或心臟舒張異常。
在另一優(yōu)選實施例中，心臟病是心肌病。心肌病是心室心肌層中任何一種結(jié)構(gòu)或功能異常。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“預(yù)防”，不僅指完全預(yù)防某一種作用，也指在發(fā)病前或發(fā)病早期任何部分的或?qū)嵸|(zhì)上的預(yù)防、減弱、降低、減退或消除這種作用。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“治療”，指任何對疾病的進(jìn)展有益的作用，包括在發(fā)病后減弱、降低、減退或消除病理性進(jìn)展。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“IL-18抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、實質(zhì)上或完全地防止或阻斷IL-18產(chǎn)生和/或作用的方式，來調(diào)節(jié)IL-18的產(chǎn)生和/或作用的任何分子。
一種生產(chǎn)的抑制劑可以是任何一種對IL-18合成、加工或成熟有負(fù)面影響的分子。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是，例如，白介素IL-18基因表達(dá)的抑制劑、降低或阻止IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄或?qū)е略搈RNA降解的反義mRNA、損害正確折迭或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白質(zhì)、IL-18一旦合成后能降解它的蛋白酶、切割前IL-18產(chǎn)生成熟的IL-18的蛋白酶的抑制劑，如Caspase-1抑制劑等。
IL-18作用的抑制劑可以是，例如，IL-18拮抗劑。拮抗劑可以以足夠親和力和特異性結(jié)合或隔離IL-18分子本身而部分或基本上中和IL-18負(fù)責(zé)IL-18與其配體(例如，其受體)結(jié)合的IL-18結(jié)合位點。拮抗劑也可抑制細(xì)胞中IL-18/受體結(jié)合時被激活的IL-18信號傳遞通道。
IL-18作用的抑制劑也可以是可溶性IL-18受體或模擬這些受體的分子，或能封閉IL-18受體的制劑，或IL-18抗體，如多克隆或單克隆抗體，或能阻止IL-18與其靶結(jié)合，從而減弱或防止觸發(fā)IL-18介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外反應(yīng)的其它制劑或分子。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑選自Caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗IL-18受體亞基之一的抗體、IL-18信號傳遞通道抑制劑、能與IL-18競爭和封閉IL-18受體的IL-18拮抗劑、以及其能抑制IL-18生物活性的IL-18結(jié)合蛋白、同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
本文所用的術(shù)語“IL-18結(jié)合蛋白”與“IL-18BP”同義。它包括WO 99/09063或Novick等人(1999)所確定的IL-18結(jié)合蛋白，包括Kim等人(2000)所確定的能與IL-18結(jié)合的IL-18結(jié)合蛋白的剪接變體和/或同種型。具體地說，人IL-18BP同種型a和c可用在本發(fā)明中。本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)可以糖基化或非糖基化，它們可來自天然來源，如尿液，或者它們最好是重組產(chǎn)生的?？稍谠松锉磉_(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌，或真核生物最好是在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)。
本文所用的術(shù)語“突變蛋白”指IL-18BP的同類物，或病毒性IL-18BP的同類物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所取代，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產(chǎn)生的產(chǎn)物的活性與野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比無顯著改變。這些突變型蛋白可用已知的合成和/或定點誘變技術(shù)，或任何適合的其它已知技術(shù)制備。
本發(fā)明的突變蛋白包括由核酸如DNA或RNA編碼的蛋白質(zhì)，所述的核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與編碼本發(fā)明的IL-18BP或病毒性IL-18BP的DNA或RNA雜交。術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指雜交和隨后的洗滌條件，這些條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)所指“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹睏l件。參見上述文獻(xiàn)Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及上述引用的文獻(xiàn)Sambrook等人。不受限制、嚴(yán)謹(jǐn)條件的例子包括比研究中計算的雜交溫度Tm低12-20℃的洗滌條件，在例如以2×SSC和0.5％SDS洗5分鐘，以2×SSC和0.1％SDS洗15分鐘；37℃以0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分鐘，然后68℃以0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分鐘。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道嚴(yán)謹(jǐn)條件還取決于DNA序列的長度、寡核苷酸探針(如10-40個堿基)或混合的寡核苷酸探針。如果采用混合的探針，最好用四甲基氯化銨(TMAC)代替SSC。參見上述引用的文獻(xiàn)Ausubel。
任何這樣一種突變蛋白最好具有一IL-18BP充分復(fù)制、或病毒性IL-18BP充分復(fù)制的氨基酸序列，從而具有與IL-18BP相當(dāng)?shù)幕钚?。IL-18BP的活性之一是其能結(jié)合IL-18。只要該突變蛋白對IL-18具有基本的結(jié)合活性。它就可用于純化IL-18，如借助親和層析法，從而認(rèn)為其具有與IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常規(guī)實驗方法來確定任何一個給定的突變蛋白是否具有與IL-18BP基本相同的活性，其方法包括對這樣一種突變蛋白進(jìn)行諸如簡單的夾心競爭試驗(simplesandwich competition assay)來確定它是否能與適當(dāng)標(biāo)記的IL-18結(jié)合，如放射免疫試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。
在一優(yōu)選實施例中，任何這樣一種突變蛋白與WO 99/09063所確定的IL-18BP或病毒性編碼的IL-18BP同類物的序列具有至少40％相同性或同源性。更優(yōu)選具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最優(yōu)選至少90％相同性或同源性。
可用于本發(fā)明的IL-18BP多肽突變蛋白或病毒性IL-18BP突變蛋白，或編碼它們的核酸，包括一組有限的基本上與取代肽或多核苷酸相應(yīng)的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)本文所述和提供的指南用常規(guī)方法獲得，而無須進(jìn)行過多實驗。
本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變化是稱為“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一組內(nèi)的同義氨基酸，其具有足夠相似的生理化學(xué)特性，該組成員之間的取代將保留該分子的生物功能(Grantham，1974)。顯然，在上述序列中也可進(jìn)行氨基酸的插入和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸時，如30個以下，最好為10個以下，而且不除去或取代對功能性構(gòu)型起關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。
優(yōu)選的同義氨基酸分組是表1列出的那些組；更優(yōu)選的同義氨基酸分組是表2列出的那些組；最優(yōu)選的同義氨基酸分組是表3列出的那些組。
表1 優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義組Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，Hi s，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsh Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp
表2更優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp
表3最優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義組Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe PheTyr TyrCys Cys，SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met，Ile，LeuTrp Met在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸取代的實施例可用來獲得本發(fā)明中所用的IL-18BP多肽或蛋白質(zhì)的突變蛋白，或病毒性IL-18BP的突變蛋白，其包括任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691專利中提出的方法，以及美國專利4,904,584(Shaw等人)中提出的賴氨酸取代的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“融合蛋白”指包含有IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突變蛋白或片段與另一蛋白質(zhì)(如能延長在體液中停留時間的蛋白質(zhì))相融合的多肽。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可與另一蛋白質(zhì)、多肽等，如免疫球蛋白或其片段相融合。
本文所用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP或病毒性IL-18BP的衍生物及其突變蛋白和融合蛋白，它們可用本領(lǐng)域已知方法從存在于殘基的側(cè)鏈或N末端或C末端基團上的功能性基團制備。只要它們?nèi)匀皇撬帉W(xué)上可接受的，即只要它們沒有破壞該蛋白質(zhì)與IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的活性，并且不會使含它們的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。
這些衍生物例如可以包括聚乙二醇側(cè)鏈，其可遮蔽抗原位點并延長IL-18BP或病毒性IL-18BP在體液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與酰基部分(如烷?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的N-酰基衍生物、或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與酰基部分形成的O-?；苌铩?br> 本發(fā)明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突變蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括單獨蛋白分子多肽鏈的片段或前體，或蛋白分子與相關(guān)分子或與其相連的殘基，如糖或磷酸根殘基一起，或蛋白分子或糖殘基自身的聚集物，只要所述部分具有與IL-18BP基本上相似的活性。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是抗IL-18抗體或其受體IL-18R的抗體?？谷魏蜪L-18R亞基的抗體稱為IL-18Rα和β，可用在本發(fā)明中。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆、嵌合、人源化或甚至完全的人抗體。重組抗體及其片段的特征是在體內(nèi)能與IL-18或IL-18R高親和力結(jié)合，而且毒性低?？捎糜诒景l(fā)明的抗體應(yīng)具有的特征是對病人進(jìn)行足夠時間的治療，它們能夠良好至優(yōu)異地減退或緩解病情或與病情相關(guān)的任何一種癥狀或一組癥狀，并且毒性低。
通過以IL-18或IL-18Rα或β免疫的動物不難在家兔、山羊或小鼠等動物中產(chǎn)生中和性抗體。免疫小鼠特別適用于提供B細(xì)胞來源以制備雜交瘤，進(jìn)而培養(yǎng)雜交瘤產(chǎn)生大量抗IL-18單克隆抗體。
嵌合抗體是具有衍生自不同種動物的二個或多個節(jié)段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗體的可變區(qū)來自非人哺乳動物抗體，如小鼠單克隆抗體，而該免疫球蛋白的恒定區(qū)來自人免疫球蛋白分子。這兩個區(qū)及其組合最好如常規(guī)方法測定那樣具有低免疫原性(Elliott等人，1994)。人源化抗體是用基因工程技術(shù)構(gòu)建的免疫球蛋白分子，其中用人的恒定區(qū)置換小鼠恒定區(qū)，而保留小鼠抗原結(jié)合區(qū)。所產(chǎn)生的小鼠-人嵌合抗體宜具有降低的免疫原性，和改善的人體中的藥物動力學(xué)(Knight等人，1993)。
因此，在另一優(yōu)選實施例中，IL-18或IL-18R抗體是人源化抗體，例如，歐洲專利申請EP0974600敘述了人源化抗IL-18抗體的優(yōu)選例子。
在另一優(yōu)選實施例中，此抗體是完全的人抗體。在WO 00/76310，WO 99/53049，US6,162,963或AU5336100中詳細(xì)敘述了產(chǎn)生人抗體的技術(shù)。
一種完全的人抗體的制備方法包括小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”，即通過將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入內(nèi)源性Ig基因已被滅活的小鼠中，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生人Ig(異種小鼠)的小鼠品系。Ig基因座在其物理結(jié)構(gòu)和基因重排上很復(fù)雜，而表達(dá)過程要求最終產(chǎn)生寬廣的免疫應(yīng)答?？贵w多樣性主要由Ig基因座中的不同V、D和J基因之間的組合性重排所產(chǎn)生。這些基因座也含有散布的調(diào)節(jié)元件，其控制抗體的表達(dá)、等位基因排斥、類型的轉(zhuǎn)換和親和力成熟。將非重排的人Ig轉(zhuǎn)基因引入小鼠證明小鼠重組機制與人基因是相容的。此外，用抗原免疫的異種小鼠可獲得分泌各種同型抗原特異性人-小鼠抗體的雜交瘤。
完全的人抗體及其制備方法已為本領(lǐng)域所公知(Mendez等人(1997)；Buggemann等人(1991)；Tomizuka等人，(2000)，專利WO 98/24893)。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是IL-18BP，或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循環(huán)變換衍生物。這些同種型、突變蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特別是結(jié)合IL-18的活性，優(yōu)選具有至少基本上類似于IL-18BP的活性。理想的，這些蛋白質(zhì)具有的生物活性比未修飾的IL-18BP更高。優(yōu)選的活性組分具有的活性比IL-18BP的活性更好或具有其他優(yōu)點，如穩(wěn)定性更好，毒性或免疫原性更低，或它們更易大量生產(chǎn)，或更易提純。
IL-18BP及其剪接變體/同種型的序列可從WO 99/09063或Novick等人(1999)以及Kim等人(2000)獲得。
可將IL-18BP的功能性衍生物與多聚物偶聯(lián)以改進(jìn)該蛋白質(zhì)的性能，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用性、人體耐受性、或免疫原性。為達(dá)到此目的，可將IL-18BP與聚乙二醇(PEG)聯(lián)接。例如，可按WO92/13095所述的已知方法進(jìn)行聚乙二醇化。
因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑特別是IL-18BP抑制劑是聚乙二醇化的。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑包括免疫球蛋白融合，即IL-18抑制劑是一種融合蛋白，包含IL-18結(jié)合蛋白的全部或一部分，其與免疫球蛋白全部或一部分融合。免疫球蛋白融合蛋白的制備方法是本領(lǐng)域所公知的，如WO 01/03737所述的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道本發(fā)明所產(chǎn)生的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特別是結(jié)合IL-18的活性。這種融合可以是直接的，或通過一個短接頭肽，長度短至1-3個氨基酸殘基或較長，如13到20個氨基酸殘基的長度相融合。例如，所述接頭可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或13個氨基酸的接頭序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met，將其導(dǎo)入IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之間。所產(chǎn)生的融合蛋白具有改進(jìn)的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，比活性提高，表達(dá)水平增加或有利于該融合蛋白的純化。
在一優(yōu)選實施例中，將IL-18BP融合于Ig分子的恒定區(qū)。優(yōu)選融合于重鏈區(qū)，例如，人IgG1的CH2和CH3區(qū)。產(chǎn)生的特異性融合蛋白包含有WO 99/09063的實施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同種型也適合用來產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，例如，同種型IgG2或IgG4，或其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質(zhì)或同質(zhì)多聚體。
在本發(fā)明另一實施例中，IL-18抑制劑與TNF拮抗劑聯(lián)合使用。TNF拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。首先，拮抗劑能以足夠的親和力和特異性結(jié)合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或負(fù)責(zé)與TNF受體結(jié)合的表位(下文稱為“遮蔽性拮抗劑”)。例如，一種遮蔽性拮抗劑可以是抗TNF的抗體。
另一方面，TNF拮抗劑可抑制TNF結(jié)合后由細(xì)胞表面受體所激活的TNF信號傳遞通道(以下稱為“信號傳遞拮抗劑”)。這二組拮抗劑可單獨或一起，與IL-18抑制劑聯(lián)合應(yīng)用來治療或預(yù)防心臟病。
TNF拮抗劑不難鑒定并通過常規(guī)篩選方法評價，即在體外敏感細(xì)胞系中，例如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B細(xì)胞中，篩選候選拮抗劑對天然TNF活性的作用來評價。該試驗包括不同稀釋度的候選拮抗劑的TNF制劑，例如，試驗所用的TNF摩爾量的0.1倍到100倍，對照組無TNF或只有拮抗劑(Tucci等人，1992)。
封蔽拮抗劑是本發(fā)明優(yōu)選使用的TNF拮抗劑。在封蔽拮抗劑中，優(yōu)選使用那些以高親和力結(jié)合TNF并具有低免疫原性的多肽。特別優(yōu)選可溶性TNF受體分子和抗TNF的中和抗體。例如，可溶性TNF-RI和TNF-RII可用于本發(fā)明中。這些截短型受體是本發(fā)明更優(yōu)選的拮抗劑，其包含該受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性部分，例如，EP914431敘述了截短的可溶性TNF-I型和II型受體。
截短型TNF受體是可溶的并在尿和血清中檢測到30kDa和40kDa的TNF抑制性結(jié)合蛋白，這兩種TNF抑制性結(jié)合蛋白分別稱為TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑與TNF拮抗劑可同時、先后或分開使用。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本發(fā)明采用的TNF拮抗劑。歐洲專利EP 308378、EP 398327和EP 433900敘述了天然和重組的可溶性TNF受體分子及其制備方法。
這些受體分子的衍生物、片段、區(qū)段和生物活性部分在功能上類似于受體分子也可用于本發(fā)明。該受體分子的這些生物活性等價物或衍生物指該多肽的、或編碼該受體分子的序列的一部分，其尺寸足夠大，并能以這種親和力與TNF結(jié)合，從而抑制或阻斷與膜結(jié)合的TNF受體發(fā)生相互作用。
IL-18抑制劑可與TNF抑制劑同時、先后或分開使用。
本發(fā)明的藥物還可含有已知的用來治療心臟病的藥物，例如硝酸鹽，象硝化甘油、利尿劑、ACE抑制劑、洋地黃、β-阻斷劑或鈣阻斷劑，與IL-18抑制劑聯(lián)用。這些活性成分可以同時、先后或分開使用。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑的用量大約為0.001-100毫克/千克，或約1-10毫克/千克或2-5毫克/千克。
本發(fā)明的IL-18抑制劑宜全身性給藥，最好皮下或肌肉內(nèi)給藥。
本發(fā)明還涉及采用含有IL-18抑制劑編碼序列的表達(dá)載體來制備預(yù)防和/或治療心臟病的藥物。所以，考慮用基因療法將IL-18抑制劑輸送到需要該抑制劑的部位。為了治療和/或預(yù)防心臟病，可將含有IL-18抑制劑序列的基因治療載體直接注入患病組織中，從而可以避免例如全身性給予基因治療載體所涉及的問題，如載體的稀釋、到達(dá)和靶向靶細(xì)胞或組織，及副作用。
本發(fā)明還考慮在正常不表達(dá)IL-18抑制劑或表達(dá)該抑制劑的量不充足的細(xì)胞中，使用能誘導(dǎo)和/或增強內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體。該載體可包含在需要表達(dá)IL-18抑制劑的細(xì)胞中起作用的調(diào)控序列。例如，這類調(diào)控序列可以是啟動子或增強子。然后，可通過同源重組將該調(diào)控序列導(dǎo)入基因組的正確基因座中，使調(diào)控序列與基因作可操作性相連，所需要的基因表達(dá)即被誘導(dǎo)或被增強。該技術(shù)通常稱為“內(nèi)源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所敘述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，也可用同一技術(shù)直接關(guān)閉IL-18的表達(dá)，而無需用IL-18抑制劑。要進(jìn)行上述操作，可導(dǎo)入一個負(fù)調(diào)節(jié)元件，如沉默元件，到IL-18的基因座中，從而導(dǎo)致下調(diào)或防止IL-18的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，IL-18表達(dá)的這種下調(diào)或沉默與使用IL-18抑制劑的效果相同，用于預(yù)防和/或治療疾病。
本發(fā)明還涉及使用經(jīng)過基因修飾的細(xì)胞，以產(chǎn)生IL-18抑制劑來制備治療和/或預(yù)防心臟病的藥物。
本發(fā)明所用的IL-18抑制劑宜作為藥物組合物給予，可任選地與治療有效量的TNF抑制劑聯(lián)用。
藥物組合物的優(yōu)選活性成分是上述IL-18BP及其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性組分或循環(huán)變換衍生物。
定義“藥學(xué)上可接受的”指包含不干擾活性成分的生物活性作用，并對給予的宿主無毒性的任何運載體。例如，為了腸胃外給藥，可將這些活性蛋白以注射用單位劑量形式配制在運載體，如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液中。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以以各種途徑給予個體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋制劑)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、顱骨內(nèi)、硬膜外、局部和鼻內(nèi)等途徑。也可采用其它有效治療途徑給藥，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因療法將編碼活性藥物的DNA分子給予病人(如通過載體)，導(dǎo)致該活性藥物在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與生物活性藥物的其它組分，如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、運載體、稀釋劑和載體劑等，一起給予。
對于腸胃外(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))給藥，可將活性蛋白質(zhì)與藥學(xué)上可接受的腸胃外運載體(如水、鹽水、葡萄糖液)以及能維持等滲性(如甘露糖醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。以常用技術(shù)給這些制劑滅菌。
也可用共偶聯(lián)方法增加本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)分子在人體內(nèi)的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT專利申請WO 92/13095所述那樣，將該分子與聚乙二醇聯(lián)接。
該活性蛋白的有效治療量是很多變量的函數(shù)，包括拮抗劑的類型、拮抗劑對IL-18的親和力、拮抗劑顯示的持續(xù)細(xì)胞毒活性、給藥途徑、病人的臨床狀態(tài)(包括維持內(nèi)源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。
“治療有效量”是給藥時IL-18抑制劑抑制IL-18生物活性的量。給予個體單一劑量或多個劑量的劑量取決于各種因素，包括IL-18抑制劑的藥物動力學(xué)性能、給藥途徑、病人的病情和特征(性別、年齡、體重、健康狀況和身型大小)、癥狀輕重程度、并行治療、治療頻度和所要求的效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員都掌握了調(diào)整和操作已確定的劑量范圍以及在體內(nèi)外測定個體抑制IL-18的方法。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑的用量約為0.001-100毫克/千克體重，或約0.01-10毫克/千克體重，或約0.1-5毫克/千克體重，或約1-3毫克/千克體重，或約2毫克/千克體重。
本發(fā)明優(yōu)選的給藥途徑是皮下給藥途徑，本發(fā)明更優(yōu)選的是肌肉內(nèi)給藥。為了將IL-18抑制劑直接給予到其作用部分，最好是局部給予。
在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是每天或每隔一天給予。
每日劑量通常分成幾劑或以緩釋形式給予，以有效獲得所希望的結(jié)果。第二次或隨后給藥可以與首次或先前給予該個體的相同劑量、少于或多于此劑量進(jìn)行。可在發(fā)病時或發(fā)病前進(jìn)行第二次或隨后給藥。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑可以以治療有效量先于、同時或依次與其它治療方案或藥物(如多種藥物方案)預(yù)防性或治療性地給予個體，特別是與TNF抑制劑和/或其它心臟保護(hù)藥物一起?；钚运幬锟稍谙嗤虿煌慕M合物中與其它治療劑同時給予。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物的制備方法，所述的藥物組合物包括將有效量的IL-18抑制劑和/或TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體摻合。
本發(fā)明還涉及一種治療心臟病的方法，該方法包括給予需要的病人藥學(xué)上有效量的IL-18抑制劑，可任選地與藥學(xué)上有效量的TNF拮抗劑聯(lián)用。
以上對本發(fā)明進(jìn)行了敘述，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的思路和范圍內(nèi)，可以在寬范圍的等效參數(shù)、濃度和條件內(nèi)進(jìn)行相同的工作，而無需作多余的實驗。
雖然結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行了敘述，但應(yīng)明白，它能夠作其它改進(jìn)?？傊?，本申請包括遵循本發(fā)明的原理而對本發(fā)明作出的任何改變、應(yīng)用或適應(yīng)性變化，包括那些本發(fā)明沒有公開的內(nèi)容，其通過與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域所公知或常規(guī)技術(shù)推導(dǎo)出的并可應(yīng)用于上文所述的在所附權(quán)利要求書范圍內(nèi)的基本專題。
本文所引用的全部文獻(xiàn)，包括期刊文章或摘要、公開或未公開的美國或外國專利申請、已授權(quán)的美國或外國專利或其它文獻(xiàn)，均納入本文參考文獻(xiàn)中。包括引用文獻(xiàn)中提供的全部數(shù)據(jù)、表格、圖形及文字。此外，本文引用文獻(xiàn)內(nèi)所引用的內(nèi)容也整體納入作為參考。
總之，參考已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知方法或常規(guī)方法并不是承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、敘述或?qū)嵤├言谙嚓P(guān)技術(shù)領(lǐng)域中公開得到、啟發(fā)或者暗示。
上述對具體實施例的敘述將完整地揭示本發(fā)明的總體特征，其他人運用本領(lǐng)域的一般技術(shù)的常識(包括本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)可在無需過多的實驗和不脫離本發(fā)明總體概念的條件下，不難對這些具體實施例的各種應(yīng)用作出改變和/或調(diào)整。所以，根據(jù)本文所述和指引，意味著這樣一些改變和/或調(diào)整在本發(fā)明所公開的實施例相等的范圍內(nèi)。需要知道的是，本文的用語或術(shù)語是為了說明而不具有限制性，因此這些術(shù)語或用語可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所述和提供的指引，并結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的常識作出解釋。
實施例實施例1體外抑制IL-18減少了心肌缺血功能障礙材料和方法試劑在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中用表達(dá)帶有末端(His)6尾的IL-18BPa同種型，并純化至均一。有人已敘述了IL-18BPa-(His)6中和IL-18的能力(Kim等人，2000)。從Alexis Biochemicals(San Diego)購買了ICE抑制劑(ICEi)Ac-Try-Val-Ala-Asp-氯甲酮(YVAD)，將它溶于DMSO中，配成10毫克/毫升的濃度。使用前ICE抑制劑用泰洛氏(Tyrode’s)溶液稀釋。通過ELISA(Cistron Biotechnology，Pine Brook，NJ)測定，ICEi使內(nèi)毒素誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞分泌成熟的IL-1β減少92％。
分離的心房小梁接受用泵式氧合機進(jìn)行選擇性冠狀動脈搭橋手術(shù)的病人需要將一根導(dǎo)管插入右心房。那時，常規(guī)要切除并棄掉一小段右心耳。從該棄掉的組織獲得小梁。4℃將人心房組織置于經(jīng)過氧合改性的泰洛氏緩沖液中。用去離子蒸餾水每天制備改性的泰洛氏溶液，該溶液含有5.0毫摩爾/升D-葡萄糖、2.0毫摩爾/升氯化鈣、118.0毫摩爾/升氯化鈉、4.0毫摩爾/升氯化鉀、1.2毫摩爾/升硫酸鎂7水合物、25.0毫摩爾/升碳酸氫鈉和1.2毫摩爾/升磷酸二氫鈉。不含底物的泰洛氏溶液含7毫摩爾/升氯化膽堿，以維持滲透壓。除非另外指出，這些化學(xué)物質(zhì)和試劑都購自Sigma。將2-4個小梁(長4-7毫米，直徑小于1.0毫米)附著在一個力轉(zhuǎn)導(dǎo)感測器上，并浸在30毫升改性的泰洛氏溶液熱浴(37℃)中；在含氧量正常期間，92.5％氧氣/7.5％二氧化碳混合氣體冒泡而出。這種混合氣體中的氧分壓大于350mmHg(1mmHg＝133Pa)，二氧化碳分壓是36-40mmHg，pH值等于7.35-7.45。用自動血液氣體分析儀按常規(guī)方法檢查每個參數(shù)。實驗全過程有機浴槽的溫度保持在37℃。在模擬缺血期間將混合氣體改為92.5％氮氣/7.5％二氧化碳。這種混合氣體產(chǎn)生的氧分壓小于50mmHg。除了在30分鐘模擬缺血期間，該緩沖液每20分鐘更換一次。
實驗設(shè)計使小梁平衡90分鐘以將基線伸力提高到1000毫克，而且可使產(chǎn)生的收縮力穩(wěn)定。研究時排除所產(chǎn)生收縮力不超過250毫克的小梁。在90分鐘平衡期中，電場刺激用鉑電極(Radnoti Glass，Monrovia，CA)進(jìn)行步測。電極置于小梁每一側(cè)，用6毫秒脈沖刺激(Grass SD9 stimulator，Warwick，RI)，電壓高于閾值20％，含氧量正常時步測的頻率為1Hz，缺血時的頻率為3Hz。通過力轉(zhuǎn)導(dǎo)感測器(GrassFT03)監(jiān)測收縮情況，用計算機控制的前置放大器和數(shù)字轉(zhuǎn)換器(MacLab QuadBridge，MacLab/8e，AD Instruments，Milford，MA)記錄，并用Macintosh計算機連續(xù)監(jiān)控。
經(jīng)過平衡后，在三種實驗條件下研究了一個病人的小梁對照條件是90分鐘含氧量正常的上融合；缺血/再灌注為30分鐘模擬缺血，然后45分鐘再灌注；而第三種條件是抗細(xì)胞因子干預(yù)。在后一種情況中，將抗細(xì)胞因子在缺血發(fā)生之前即刻加到上融合浴槽中，45分鐘再灌注全過程都存在此抗細(xì)胞因子。
保存的小梁膽堿激酶活性如所述那樣(Kaplan等人1993)，測定再灌注組織(90分鐘)的膽堿激酶活性。這些組織在100體積的冰凍等滲提取緩沖液中均漿化(Cleveland等人，1997，Kaplan等人，1993)。通過自動分光光度計用膽堿激酶試劑盒(Sigma)進(jìn)行試驗。結(jié)果以每毫克(濕重組織)的堿激酶活性單位表示。
RNA的分離和逆轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的PCR將新鮮小梁在Tri-Reagent試劑(Molecular Research Center，Cincinnati)中均漿化，用氯仿抽提和異丙醇沉淀分離得到總RNA。將RNA溶于經(jīng)焦碳酸二乙酯處理過的水中，用脫氧核糖核酸酶處理，并用GeneQuant(Amersham PharmaciaBiotech)定量分析。已有人對cDNA方法作了敘述(Reznikov等人，2000)。每次PCR按以下順序進(jìn)行95℃預(yù)熱15分鐘，再94℃ 40秒，55℃ 45秒，72℃ 1分鐘循環(huán)多輪，最后在72℃延伸10分鐘。確定最佳循環(huán)次數(shù)為35輪。三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、人IL-18(Reznikov等人，2000)以及人IL-18BPa(Kim等人，2000)的引物已有報導(dǎo)。PCR產(chǎn)物用0.5毫克/毫升的溴化乙錠在含0.5×TBE(50mMTris/45mM硼酸/0.5mM EDTA，pH8.3)的1.5％瓊脂糖凝膠上分離，用紫外線照明顯現(xiàn)，并拍照。對負(fù)片影像進(jìn)行密度計量(IMAGEQUANT軟件，MolecularDynamics)，修正IL-18和IL-18BP的PCR產(chǎn)物相對于GAPDH吸光值的相對吸光值。
IL-18的測定如上所述使新鮮的小梁均漿化，以測定膽堿激酶。用液相電化學(xué)發(fā)光法(ECL，Igen，Gaithersburg，MD)分析IL-18。小鼠抗人IL-18單抗(R & D Systems)用釕(Igen)標(biāo)記。另外，經(jīng)親和純化的山羊抗人IL-18抗體(R & D Systems)用生物素(Igen)標(biāo)記。將生物素化的抗體用PBS(pH7.4)稀釋至終濃度為1微克/毫升(此PBS溶液含有0.25％BSA、0.5％Tween-20和0.01％疊氮化合物(ECL緩沖液))。每支分析試管裝25微升生物素化抗體，室溫下與25微升1微克/微升包被鏈霉親和素的順磁珠強烈搖動預(yù)培育30分鐘。各試管中加入測試樣品(25微升)或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入25微升經(jīng)釕化的抗體(終濃度為1微克/微升，用ECL緩沖液稀釋)。然后將試管搖動24小時。每支試管加入200微升PBS淬滅反應(yīng)，用Origen分析儀(Igen)測定化學(xué)發(fā)光量。IL-18的檢測極限是16皮克/微升。
將插入泵式氧合機導(dǎo)管時獲得的共聚焦顯微鏡人心房組織置于一個1厘米長的塑料支架上，包埋并在干冰冷卻的異戊烷上在組織凍結(jié)培養(yǎng)基(TriangleBiomedical Sciences，Durham，NC)中凍結(jié)。在Leica CM 1850深低溫箱(Leica，Deerfield，IL)中切成冰凍切片(5微米)。切片在4％多聚甲醛中固定10分鐘，風(fēng)干，在添加有10％正常山羊血清的PBS中培養(yǎng)20分鐘。使切片在兔抗人IL-18抗體的1100稀釋液(Peprotch，Rocky Hill，NJ)或1微克/毫升非免疫兔IgG(作為對照)中培養(yǎng)?？贵w用含1％BSA的PBS稀釋。經(jīng)過4℃培養(yǎng)過夜后，這些切片用含0.5％BSA的PBS洗三次。然后使切片與偶聯(lián)于Alexa488(Molecular Probes)的山羊抗兔第二抗體室溫暗處培養(yǎng)60分鐘。每100毫升胞核用1微克bisbenzimide螢光染劑(Sigma)染上藍(lán)色。染色后，洗滌切片，用Leica DM RXA(Leica)共聚激光掃描系統(tǒng)檢查，并以供MacIntosh使用的SLIDEBOOK軟件(Intelligent ImagingInnovations，Denver)分析。
統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值±SEM表達(dá)。計算每個病人組織在90分鐘時產(chǎn)生的收縮力相對于對照值的平均變化。用Bonferroni-Dunn后hoc分析(Bonferroni-Dunn post hocanalysis)經(jīng)析因(factorial)ANOVA確定了組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義。用STAT-VIEW4.51軟件(Abacus Concepts，Calabasas，CA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果用IL-18BP中和內(nèi)源性IL-18對缺血后產(chǎn)生的收縮力的影響圖1A顯示小梁對缺血/再灌注損傷的動力學(xué)反應(yīng)。圖中示出平衡的最后15分鐘，在實驗期開始時標(biāo)準(zhǔn)化為100％。在實驗全過程中對照小梁在含氧量正確的條件下上融合。如圖所示，對照小梁產(chǎn)生的收縮力有所下降(10％)。經(jīng)歷缺血的小梁的收縮功能顯示急速下降；再灌注后，收縮力回升至對照產(chǎn)生的收縮力的約25％。與此相反，經(jīng)歷缺血但在IL-18BP存在下小梁的收縮力回升至對照產(chǎn)生的收縮力的約55％。為了評估多個病人心臟組織的缺血/再灌注反應(yīng)，將每個病人樣品的對照小梁在90分鐘時產(chǎn)生的收縮力的水平定為100％，計算出實驗各組產(chǎn)生的力的相對百分比變化。
如圖1B所示，未經(jīng)處理的小梁(缺血/再灌注)缺血后產(chǎn)生的力下降到對照組平均值的35％。然而，在1微克/毫升和5微克/毫升IL-18BP存在下，這種下降分別減至對照組平均值的66.2％和76％。這些結(jié)果提示，經(jīng)過ICE加工內(nèi)源性前體IL-18后，缺血/再灌注導(dǎo)致釋放出生物活性IL-18。因此，測定了新鮮獲得的心房組織中的IL-18。如圖2所示，在泵式氧合機導(dǎo)管插入右心房之前獲得小梁，其含有基本的IL-18。經(jīng)過90分鐘平衡、30分鐘缺血和45分鐘再氧合后，使小梁均漿化，測定IL-18水平。缺血/再灌注后組織中的IL-18上升了4.5倍(圖2)。
還測定了這些組織中IL-18和IL-18BP的穩(wěn)態(tài)mRNA水平。我們觀察了新鮮得到的缺血前心房組織勻漿中IL-18和IL-18BP的基本基因表達(dá)(圖3A、B)。與IL-18蛋白質(zhì)的增加相似，缺血/再灌注誘導(dǎo)了穩(wěn)態(tài)mRNA水平進(jìn)一步上升(上升4.7倍)。也觀察了IL-18BP在新鮮得到的心房組織中的IL-18BP基因表達(dá)，其在缺血/再灌注后只有輕微上升(1.3倍)。
IL-18在人心肌層中的定位因為如ECL測定的那樣，新鮮得到的心肌勻漿中含有IL-18蛋白質(zhì)和IL-18mRNA，所以采用組織化學(xué)染色測定了IL-18的定位。在插入泵式氧合機導(dǎo)管之前即刻取得心房組織，并立即速凍(未圖示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18存在于駐留的心肌巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中在手術(shù)相關(guān)的缺血發(fā)生之前都有IL-18在不與外源性表面接觸時IL-18也存在。IL-18在駐留巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的位置，與以前在健康受試者新鮮取得的人外周血單核細(xì)胞中組成性預(yù)先形成的前體(constitutive preformed precursor)IL-18的研究相一致(Puren等人，1999)。所以，可得出結(jié)論，是按期進(jìn)行缺血性心臟病冠狀動脈分流術(shù)的病人的心肌層中存在預(yù)先形成的前體IL-18。
ICE抑制對缺血后產(chǎn)生的收縮力的影響因為IL-18BP有效地減弱缺血誘導(dǎo)的心肌功能障礙，我們假設(shè)抑制預(yù)先形成的前體IL-18轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腎L-18也會減弱缺血誘導(dǎo)的心肌功能障礙。因此，在缺血發(fā)病前將特異性ICE抑制劑YVAD加入上融合浴槽中。整個缺血期和再灌注期間加入YVAD持續(xù)進(jìn)行ICE抑制。YVAD介導(dǎo)的ICE抑制導(dǎo)致緩解了缺血誘導(dǎo)的心肌功能障礙，如圖所示，在10微克/毫升ICE時缺血/再灌注的收縮功能從對照組的35％上升到60％，在20微克/毫升ICE時上升到75.8％(圖4)。這些結(jié)果證實了人心肌內(nèi)的生物活性IL-18是預(yù)先形成的前體IL-18被ICE切斷的結(jié)果。另外，這些結(jié)果也提示心肌缺血可激活潛在的ICE。
細(xì)胞活力的保存用細(xì)胞內(nèi)膽堿激酶水平評估在缺血/再灌注后細(xì)胞存活的程度。在此試驗中，膽堿激酶值越高，存活細(xì)胞的數(shù)目越大。每次抗細(xì)胞因子干預(yù)都導(dǎo)致細(xì)胞存活力的保存。如圖5所示，IL-18BP和ICE抑制(10和20微克/毫升)增加了缺血/再灌注后細(xì)胞內(nèi)膽堿激酶水平，從每毫克(濕組織)膽堿激酶1,399活性單位分別提高到5,921、5,675、6,624和4,662單位。這些結(jié)果提示此活體外模型中抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的IL-18活化可保存心肌細(xì)胞的活力。
中和TNFα誘導(dǎo)的心肌功能的作用如圖6所示，小梁與外源性TNFcα接觸90分鐘后，其產(chǎn)生的收縮力(DF)下降了18％。加入TNFα之前，通過與IL-18BP培育10分鐘，中和接觸外源性TNF的人心肌的內(nèi)源性IL-18，對所述人心肌的收縮功能使產(chǎn)生的收縮力(DF)下降的數(shù)量級減少，參見圖6。90分鐘后，對照組中產(chǎn)生的收縮力下降了18％，而接觸TNFα的小梁中與對照組相比下降了58％。然而，在IL-18存在下接觸TNFα的小梁中產(chǎn)生的收縮力與對照組相比僅下降了30％。這些數(shù)據(jù)提示TNFα對心肌收縮力降低的直接作用至少部分是由生物活性內(nèi)源性IL-18介導(dǎo)的。
外源性IL-18對產(chǎn)生的收縮力的作用接著，確定了外源性IL-18對心肌收縮功能的直接作用。經(jīng)過90分鐘平衡并改變每個浴槽后，在上融合的小梁中加入IL-18，。如圖7所示，IL-18導(dǎo)致產(chǎn)生的收縮力在實驗期間緩慢但漸進(jìn)式下降。與IL-18連續(xù)接觸90分鐘后，產(chǎn)生的收縮力下降了42％。這些數(shù)據(jù)證明，外源性IL-18與TNFα相類似，起著心肌抑制劑的作用。
令人感興趣的是，IL-18的心肌抑制劑作用不如TNFα那樣強。
細(xì)胞活力的保存細(xì)胞凋亡通常與酪蛋白有關(guān)。為了評估與TNFα接觸的小梁中細(xì)胞的存活力，測定了組織的細(xì)胞內(nèi)膽堿激酶。在此試驗中，膽堿激酶水平高表示為活細(xì)胞。如圖8所示，對照小梁經(jīng)歷90分鐘含氧量正常的上融合，每毫克濕重組織所含的膽堿激酶活性為6801±276單位。相比之下，經(jīng)歷30/45分鐘缺血/再灌注損傷或與TNFα接觸90分鐘的小梁顯示保存的膽堿激酶水平下降，分別為1774±181和3246±217單位/毫克。在IL-18BP存在下與TNFα接觸的小梁所含的膽堿激酶水平為5605±212單位/毫克組織。令人感興趣的是，用TNFα處理過的小梁與缺血/再灌注小梁相比，其保存的膽堿激酶水平更高。這是一個出乎意外的發(fā)現(xiàn)，因為實驗結(jié)束時產(chǎn)生的收縮力的數(shù)量級與缺血/再灌注及TNFα的數(shù)量級相似。
實施例3方法小鼠IL-18BP表達(dá)質(zhì)粒的體內(nèi)肌肉內(nèi)電轉(zhuǎn)移C57BL/6小鼠每隔3星期注射3次含有IL-18BP cDNA的表達(dá)質(zhì)粒(稱為pcDNA3-IL18BP，如WO 01/85201所述)。對照小鼠注射對照空質(zhì)粒。按所述的方法(查詢號是#Q9ZOM9)(Kim等人，2000)分離小鼠IL-18BP同種型d的cDNA，將它亞克隆到在巨細(xì)胞病毒啟動子(Invitrogen)調(diào)控下的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3的EcoR1/Not1位點中。對照質(zhì)粒是一種不含治療性cDNA的相似構(gòu)建物。對照組有31只小鼠，接受注射IL-18BP的實驗組有27只小鼠。
按照前述方法(Mallat等人，1999)，在麻醉小鼠的兩側(cè)脛骨顱側(cè)肌肉內(nèi)注射IL-18BP或?qū)φ毡磉_(dá)質(zhì)粒(60微克)。簡言之，在大腿兩側(cè)放置相距4.2至5.3厘米的兩塊不銹鋼電極板，以PS-15電脈沖儀輸出透皮電脈沖(200伏/厘米的8方波電脈沖，在2Hz持續(xù)20毫秒)。
左心室梗塞的誘導(dǎo)給予IL-18BP質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒24小時后，腹膜內(nèi)注射甲苯噻嗪(xylazine)和克他命(ketamine)麻醉小鼠，通風(fēng)條件下接受開胸開術(shù)。左主冠狀動脈用8-0聚丙烯紡織纖維線永久性結(jié)扎，以誘導(dǎo)心肌梗塞，然后，縫合胸部，讓動物從麻醉中恢復(fù)過來。全手術(shù)死亡率不到20％，對照組的術(shù)后死亡率是48％，而實驗組的術(shù)后死亡率是26％，死亡幾乎都是在結(jié)扎后第4-5天發(fā)生。
結(jié)扎后第7天，再次麻醉小鼠，利用ATL HDI 5000超聲心動描記器在胸縫合狀態(tài)下以超聲心動描記評估左心室尺寸。由測出的舒張末期直徑和收縮末期直徑計算出左心室部分縮短(Fractional shortening)。超聲心動描記測量結(jié)束時取出心臟，固定，然后切片。然后，將組織切片用天狼星紅染色，以測定梗塞的大小。
結(jié)果存活的小鼠結(jié)扎后7天左心室舒張直徑如下
經(jīng)IL-18BP處理小鼠是0.53+0.01厘米(n＝20)，而對照小鼠是0.59+0.01厘米(n＝16)，p＜0.01。
存活的小鼠結(jié)扎后7天左心室收縮直徑如下經(jīng)IL-18BP處理小鼠是0.45+0.02厘米，而對照小鼠是0.52+0.02厘米，p＜0.01。
左心室部分縮短經(jīng)IL-18BP處理小鼠是15+1％，而對照小鼠是11+1％，p＜0.01。
結(jié)論IL-18BP降低了小鼠在左心室冠狀動脈完全結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗塞后的死亡率50％。此外，如左心室的收縮和舒張直徑減少所示，左心室的功能也得到顯著改善。
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權(quán)利要求
1.一種IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防心臟病的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是缺血性心臟病。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是慢性病。
4.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是心絞痛。
5.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是急性病。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是心肌梗塞。
7.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是心力衰竭。
8.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟病是心肌病。
9.如權(quán)利要求1到8中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任IL-18受體亞基之一的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，或其能抑制IL-18生物活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)性變換衍生物。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是抗IL-18抗體。
11.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是抗IL-18受體α的抗體。
12.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是抗IL-18受體β的抗體。
13.如權(quán)利要求9至12中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抗體是人源化抗體或人抗體。
14.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，或其能抑制IL-18生物活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)性變換衍生物。
15.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑的一個或多個位點是糖基化的。
16.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于所述的融合蛋白包含一個免疫球蛋白(Ig)融合。
17.如權(quán)利要求9或14所述的應(yīng)用，其特征在于所述的功能性衍生物包含至少一個連接于作為氨基酸殘基的一條或多條側(cè)鏈存在的一個或多個功能基團的部分。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于所述的部分是聚乙二醇部分。
19.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物還包含腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于IL-18抑制劑與TNF拮抗劑同時、先后或分開使用。
21.如權(quán)利要求19或20所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TNF拮抗劑是TBPI和/或TBPII。
22.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑的使用濃度范圍為約0.001-100毫克/千克(體重)，或約1-10毫克/千克，或2-5毫克/千克(體重)。
23.一種含有IL-18抑制劑編碼序列的表達(dá)載體在制備治療和/或預(yù)防心臟病的藥物中的應(yīng)用。
24.一種能誘導(dǎo)和/或增強細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的表達(dá)載體在制備治療和/或預(yù)防心臟病的藥物中的應(yīng)用。
25.一種心臟病的治療方法，其特征在于所述方法包括給予需要的宿主抑制有效量的IL-18抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL－18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防心臟病特別是缺血性心臟病的藥物中的應(yīng)用。也考慮了聯(lián)用IL－18抑制劑和/或TNF拮抗劑來治療和/或預(yù)防心臟病。
文檔編號A61K45/06GK1499982SQ02807503
公開日2004年5月26日 申請日期2002年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月29日
發(fā)明者C·迪納洛, B·波梅蘭茨, L·列茲尼科夫, A·哈肯, Y·奇韋提克, C 迪納洛, ぬ崢, 防即, 饒崢品 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司