本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微流體技術(shù)，具體涉及一種外泌體捕獲微流體芯片設(shè)計和制備。

背景技術(shù)：

外泌體(exosomes)是一種直徑約為30-150nm具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，由細胞通過胞吐作用釋放至細胞外隙或生物學體液中；近年來，外泌體受到越來越多的關(guān)注，成為新的研究熱點，外泌體內(nèi)包含來源細胞所特有的mrnas、micrornas和蛋白質(zhì)等多種生物分子，在信號傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)中起重要作用，更有研究表明外泌體與腫瘤的轉(zhuǎn)移、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)，其內(nèi)容物也是多種疾病臨床檢測和診斷的標志分子。

目前外泌體的分離技術(shù)包括超速離心法、過濾離心法、密度梯度超速離心法、免疫磁珠結(jié)合超速離心法和色譜法等；這些技術(shù)對儀器設(shè)備要求高、操作繁瑣耗時，因此需要有效的外泌體捕獲技術(shù)解決這些問題。

基于以上所述，本發(fā)明擬將微流控技術(shù)、微陣列和特異性親和捕獲技術(shù)結(jié)合，制備一種基于生物特異性分子的微柱陣列流體芯片，并將其應(yīng)用于外泌體的捕獲。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有特異性分子修飾的微柱陣列流體芯片，用于外泌體的分離和捕獲。

本發(fā)明的技術(shù)方案：包括上層蓋片和下層基片，在所述上層蓋片上設(shè)有進樣孔和出樣孔；

在所述下層基片上設(shè)有分離室，在所述分離室兩端設(shè)有與分離室連接在一起的緩沖室，

所述的分離室為蛇形通道，在所述蛇形通道的內(nèi)部設(shè)有交叉排列的微柱陣列，

所述微柱陣列的表面修飾有特異性識別分子。

所述微流體芯片的體積大小為40mm×30mm×2mm，

所述的緩沖室為方形，寬10-20um，長1-10mm，高5-20um，；

所述的分離室寬10-20um，高5-20um。

所述的微柱陣列頂部為圓形、三角形、橢圓形、水滴形及多邊形中的一種；

所述微柱陣列直徑0.5-5um,高4-9um，間距0.5-2um。

所述的特異性識別分子包括特異性識別外泌體表面標志的適配體和特異性識別外泌體表面標志的抗體中的一種。

所述上層蓋片為玻璃片，大小為40mm×30mm，所述上層蓋片上的進樣孔和出樣孔的位置與所述下層基片上緩沖室的位置對應(yīng)。

本發(fā)明是通過在微流體芯片中的微陣列住上修飾特異性生物分子，從而將樣本中的外泌體親和捕獲。

具體的說本發(fā)明是由微流體芯片的制備、微陣列柱的表面修飾過程組成，主要通過微陣列柱的排列增加樣本與微流體芯片微流體芯片的接觸面積，以及柱表面的特異性生物分子與外泌體親和作用，從而實現(xiàn)外泌體的分離和捕獲。

具體制備方法步驟：

(一)微流體芯片的制備：利用標準的光刻工藝實現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作；整個微流體芯片大小約為40mm×30mm×2mm，制備過程如下：

1)、材料預(yù)準備：預(yù)準備大小相等的一片硅片和一片上層蓋片，

2)、硅片處理：經(jīng)清洗硅片、烘干、勻膠(su-8光刻膠)、甩膠、前烘、曝光、厚烘和顯影等步驟制作模具；

將pdms、固化劑以10∶1的質(zhì)量比混合均勻，除去混合物中氣泡后澆注在模具上，90℃加熱固化1小時，將模具與pdms固化物小心剝離，得到微流體芯片的下層基片；

等離子體處理微流體芯片的下層基片，

gptms無水乙醇溶液對微流體芯片的下層基片進行表面硅烷化修飾；

將微流體芯片的蓋片和基片進行不可逆鍵合，

用打孔針在上層蓋片上打進樣孔和出樣孔；得到制備完成的微流體芯片。

(二)特異性生物分子修飾：在完成微流體芯片微流體芯片的制作后，對微流體芯片表面進行修飾生物特異性分子，制備過程如下：

用0.1mol/l,2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)、2mol/l的n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)和5mol/l的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)混合溶液通入微流體微流體芯片中反應(yīng)30min，0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗微流體芯片，通入10ug/ml的特異性抗體工作液，室溫下反應(yīng)4小時后，用滅菌的去離子水沖洗微流體芯片蛇形通道，并用bsa溶液封閉，0.01mol/lpbs緩沖洗，4度條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

使用時將樣品經(jīng)進樣孔通入微流體芯片，調(diào)整樣品流速為流速0-10ml/h，樣品流經(jīng)緩沖室和蛇形通道的分離室，樣品中的外泌體特異性與微陣列柱上修飾的特異性分子作用并結(jié)合，從而捕獲外泌體。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：在微流體芯片中增加微陣列柱的結(jié)構(gòu)顯著增大了流體環(huán)境的面積/體積比例，并在微柱陣列上修飾特異性結(jié)合外泌體的生物分子，從而大大提高了反應(yīng)的效率，減少了試樣和試劑的消耗量，降低了成本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中微流體陣列微流體芯片的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明中微流體陣列微流體芯片中上層蓋片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明中微流體陣列微流體芯片中下層基板的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明中微流體陣列微流體芯片蛇形通道上微陣列柱示意圖，

圖5是本發(fā)明中微陣列柱表面修飾示意圖；

圖中1是上層蓋片，2是下層基片，3是進樣孔，4是出樣孔，5是分離室，6是緩沖室。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖說明就具體實施方式，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

為了理解本發(fā)明，下面對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。

如圖所示，包括上層蓋片1和下層基片2，所述上層蓋片1優(yōu)先為玻璃片，也可以是pdms，

在所述上層蓋片1上設(shè)有進樣孔3和出樣孔4；

在所述下層基片2上設(shè)有分離室5，在所述分離室5兩端設(shè)有與分離室5連接在一起的緩沖室6，

所述的分離室5為蛇形通道，在所述蛇形通道的內(nèi)部設(shè)有交叉排列的微柱陣列，

所述微柱陣列的表面修飾有特異性識別分子。

所述微流體芯片的體積大小為40mm×30mm×2mm，

所述的緩沖室6為方形，寬10-20um，長1-10mm，高5-20um，；

所述的分離室5寬10-20um，高5-20um。

所述的微柱陣列頂部為圓形、三角形、橢圓形、水滴形及多邊形中的一種；

所述微柱陣列直徑0.5-5um,高4-9um，間距0.5-2um。

所述的特異性識別分子包括特異性識別外泌體表面標志的適配體和特異性識別外泌體表面標志的抗體中的一種。

實施例1

微流體芯片的制備：微流體芯片中微結(jié)構(gòu)的示意圖如圖1所示；利用標準的光刻工藝實現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作；整個微流體芯片的體積大小約為40mm×30mm×2mm，微柱為圓柱形，直徑0.5um，分離室為寬10um，高5um，微柱陣列直徑0.5um，高4um，間距0.5um。

制備過程如下：

1)、材料預(yù)準備：預(yù)準備大小相等的一片硅片和一片上層蓋片1，硅片為基底材料，

2)、硅片處理：經(jīng)清洗硅片、烘干、勻膠(su-8光刻膠)、甩膠、前烘、曝光、厚烘和顯影等步驟制作模具；

將pdms、固化劑以10∶1的質(zhì)量比混合均勻，除去混合物中氣泡后澆注在模具上，90℃加熱固化1小時，將模具與pdms固化物小心剝離，得到微流體芯片的下層基片2；

等離子體處理微流體芯片的下層基片2，

gptms無水乙醇溶液對微流體芯片的下層基片2進行表面硅烷化修飾；

將微流體芯片的上層蓋片1和下層基片2進行不可逆鍵合，

用打孔針在上層蓋片1上打進樣孔3和出樣孔4；得到制備完成的微流體芯片。

特異性生物分子修飾：在完成微流體芯片的制作后，對微流體芯片表面進行修飾生物特異性分子，制備過程如下：

用0.1mol/l,2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)、2mol/l的n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)和5mol/l的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)混合溶液通入微流體芯片中反應(yīng)30min，0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗微流體芯片，通入10ug/ml的特異性抗體工作液，室溫下反應(yīng)4小時后，用滅菌的去離子水沖洗微流體芯片蛇形通道，并用bsa溶液封閉，0.01mol/lpbs緩沖洗，4度條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

使用時將樣品經(jīng)進樣孔3通入微流體芯片，調(diào)整樣品流速為流速0-10ml/h，樣品流經(jīng)緩沖室6和蛇形通道的分離室5，樣品中的外泌體特異性與微陣列柱上修飾的特異性分子作用并結(jié)合，從而捕獲外泌體。

實施例2

微流體芯片的制備：微流體芯片中微結(jié)構(gòu)的示意圖如圖1所示；利用標準的光刻工藝實現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作；整個微流體芯片大小約為40mm×30mm×2mm，微柱為圓柱形，直徑2.5um，分離室為寬15um，高13um，微柱陣列直徑2.5um，高6.5um，間距1.5um。

制備過程如下：

1)、材料預(yù)準備：預(yù)準備大小相等的一片硅片和一片上層蓋片1，硅片為基底材料，

2)、硅片處理：經(jīng)清洗硅片、烘干、勻膠(su-8光刻膠)、甩膠、前烘、曝光、厚烘和顯影等步驟制作模具；

將pdms、固化劑以10∶1的質(zhì)量比混合均勻，除去混合物中氣泡后澆注在模具上，90℃加熱固化1小時，將模具與pdms固化物小心剝離，得到微流體芯片的下層基片2；

等離子體處理微流體芯片的下層基片2，

gptms無水乙醇溶液對微流體芯片的下層基片2進行表面硅烷化修飾；

將微流體芯片的上層蓋片1和下層基片2進行不可逆鍵合，

用打孔針在上層蓋片1上打進樣孔3和出樣孔4；得到制備完成的微流體芯片。

特異性生物分子修飾：在完成微流體芯片的制作后，對微流體芯片表面進行修飾生物特異性分子，制備過程如下：

用0.1mol/l,2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)、2mol/l的n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)和5mol/l的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)混合溶液通入微流體芯片中反應(yīng)30min，0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗微流體芯片，通入10ug/ml的特異性抗體工作液，室溫下反應(yīng)4小時后，用滅菌的去離子水沖洗微流體芯片蛇形通道，并用bsa溶液封閉，0.01mol/lpbs緩沖洗，4度條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

使用時將樣品經(jīng)進樣孔3通入微流體芯片，調(diào)整樣品流速為流速0-10ml/h，樣品流經(jīng)緩沖室6和蛇形通道的分離室5，樣品中的外泌體特異性與微陣列柱上修飾的特異性分子作用并結(jié)合，從而捕獲外泌體。

實施例3

微流體芯片的制備：微流體芯片中微結(jié)構(gòu)的示意圖如圖1所示；利用標準的光刻工藝實現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作；整個微流體芯片大小約為40mm×30mm×2mm，微柱為等邊三角形，邊長5um，分離室為寬20um，高10um，微柱陣列直徑5um，高9um，間距2um。

制備過程如下：

1)、材料預(yù)準備：預(yù)準備大小相等的一片硅片和一片上層蓋片1，硅片為基底材料，

2)、硅片處理：經(jīng)清洗硅片、烘干、勻膠(su-8光刻膠)、甩膠、前烘、曝光、厚烘和顯影等步驟制作模具；

將pdms、固化劑以10∶1的質(zhì)量比混合均勻，除去混合物中氣泡后澆注在模具上，90℃加熱固化1小時，將模具與pdms固化物小心剝離，得到微流體芯片的下層基片2；

等離子體處理微流體芯片的下層基片2，

gptms無水乙醇溶液對微流體芯片的下層基片進行表面硅烷化修飾；

將微流體芯片的上層蓋片1和下層基片2進行不可逆鍵合，

用打孔針在上層蓋片1上打進樣孔3和出樣孔4；得到制備完成的微流體芯片。

特異性生物分子修飾：在完成微流體芯片的制作后，對微流體芯片表面進行修飾生物特異性分子，制備過程如下：

用0.1mol/l,2-(n-嗎啉)乙磺酸(mes)、2mol/l的n-乙基-n′-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(edc)和5mol/l的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)混合溶液通入微流體芯片中反應(yīng)30min，0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗微流體芯片，通入10ug/ml的特異性抗體工作液，室溫下反應(yīng)4小時后，用滅菌的去離子水沖洗微流體芯片蛇形通道，并用bsa溶液封閉，0.01mol/lpbs緩沖洗，4度條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

使用時將樣品經(jīng)進樣孔3通入微流體芯片，調(diào)整樣品流速為流速0-10ml/h，樣品流經(jīng)緩沖室6和蛇形通道的分離室5，樣品中的外泌體特異性與微陣列柱上修飾的特異性分子作用并結(jié)合，從而捕獲外泌體。