本發(fā)明涉及微液滴生物醫(yī)學檢測領域，特別涉及微液滴反應編碼檢測方法及其系統(tǒng)。

背景技術：

液滴微流控技術是微流控芯技術的一個重要的組成部分，其特征是在微流道或毛細管中將兩種不相容的流體形成微米尺度的液滴。生物醫(yī)學檢測領域中最常見的是“油包水”的液滴。其中，油作為將每個液滴相互隔離的載體。這種微米尺度的液滴也被作為微反應器。也就是說，一個直徑幾十微米的液滴可以看成是一個傳統(tǒng)生化檢測中使用的試管，同樣可以在微液滴內(nèi)進行生化反應和用于生物醫(yī)學中目標分子的檢測。相比于傳統(tǒng)的試管，微液滴反應的優(yōu)點包括：(1)微液滴的體積只有皮升級，相當于反應體積縮小了6個數(shù)量級。因此，微液滴反應所需的試劑量大大減少，反應成本大幅降低；(2)一次反應中使用的微液滴數(shù)量可以高達上千萬個，這使得檢測通量能夠得到極大的提高；(3)由于微液滴體積小，其背景噪聲也相應的得到了很大程度的降低，使得檢測靈敏度能有很大的提升。因此，微液滴技術是一項很有前景的生化分析檢測技術。

基于微液滴的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種基于單分子PCR方法來對核酸進行絕對精確定量的方法。其原理是將大量稀釋后的核酸溶液分散至微液滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)只有0個和1個兩種情況。經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)定量PCR不同，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)的方法，可以實現(xiàn)起始核酸模板的絕對定量。

在傳統(tǒng)的多指標檢測當中，每一個反應試管里進行一種特定反應。因而需要對每一個試管貼上特定的標簽，以標識其管內(nèi)的反應物。同理，一個微液滴就相當于一個反應試管，那么在多指標檢測當中，也需要特殊的“標簽”來識別和區(qū)分每一個微液滴內(nèi)的反應物。給微液滴反應貼“標簽”的技術，叫做微液滴的編碼技術。高通量多指標檢測對微液滴的編碼技術提出了新的挑戰(zhàn)。目前常用的微液滴編碼方法包括以下三種：

(1)基于顏色信息的微液滴編碼方法。通過在不同的微液滴中加入不同顏色的染料，并通過檢測其顏色信息來實現(xiàn)解碼?；陬伾畔⒌奈⒁旱尉幋a方法具有編碼直觀和無需復雜的檢測設備的優(yōu)勢，但是基于顏色信息的編碼方法存在編碼容量不高、編碼染料影響生化反應效率等不足。

(2)基于空間位置信息的微液滴編碼方法。在已知空間位置的微結構加入已編號的生化反應信息的液滴，并通過檢測其空間位置信息來實現(xiàn)解碼?？臻g位置信息編碼的方法具有解碼方便、解碼速度快等優(yōu)點。但受到加工工藝和空間體積限制等因素限制，使其編碼的容量容易受到限制。同時，在液滴加樣環(huán)節(jié)，也存在一定的挑戰(zhàn)，對加工工藝和檢測設備都提出了更高的要求。

(3)基于核酸序列的微液滴編碼方法。在不同種類的微液滴內(nèi)加入不同已知的特定核酸序列，并通過對核酸序列的測序來完成微液滴的解碼?；诤怂嵝蛄械木幋a方法具有很高的編碼容量，但是由于核酸序列測序需要比較復雜的過程，因而這種編碼方式只適合一些特定的場合。

由于現(xiàn)有方法編碼能力的限制，目前多指標的數(shù)字PCR只能實現(xiàn)數(shù)個到十數(shù)個的不同位點的同步檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服前面所說的幾種微液滴編碼方法的不足，提出一種基于標志液滴的時序編碼方法。

在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種微液滴反應編碼檢測方法，其特征在于包括以下步驟：不同的試劑按順序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后順序排成一個隊列；帶有標記信息的微液滴成為標志液滴，其所在隊列中的區(qū)域成為編碼區(qū)；帶有生化反應試劑的微液滴成為功能液滴，其所在隊列中的區(qū)域稱為功能區(qū)；每個功能區(qū)之間都間隔著一個編碼區(qū)，由這種反應區(qū)加編碼區(qū)的重復結構組成了完整的編碼隊列；和當編碼隊列進入檢測區(qū)時，根據(jù)進樣的先后順序以及各個編碼區(qū)信息，解碼每個功能區(qū)內(nèi)包含的功能液滴所對應的反應物。

在一種實施方式中，通過控制外部各個進樣器例如注射器的工作順序，實現(xiàn)不同的試劑按順序在微流控芯片管道中生成微液滴。

在一種實施方式中，進樣器通過配件例如特氟龍卡具與芯片入口相連。

在一種實施方式中，包括二個裝載礦物油用于后續(xù)液滴生成的注射器，一個裝載標志溶液用于生成標志液滴的注射器；和多個裝載生化反應試劑用于生成功能液滴的注射器。

在一種實施方式中，標志溶液和各個生化反應試劑按照進樣順序在微流控芯片內(nèi)“十字”液滴生成區(qū)域與礦物油匯合，形成“油包水”的液滴。

在一種實施方式中，在編碼時通過控制標志液滴的熒光強度，使得標志液滴與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，在編碼時通過控制標志液滴體積的不同，從而控制熒光信號持續(xù)時間的長短，使標志液滴與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，通過控制標志液滴的顏色，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，通過控制標志液滴的吸光度的變化，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，通過控制標志液滴的反射角度的變化，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，標志液滴自身內(nèi)部的排列組合產(chǎn)生特定順序和意義，使其與功能液滴相區(qū)分。

在一種實施方式中，提供一種在本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測方法中應用的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括進樣區(qū)、液滴生成區(qū)、反應區(qū)和檢測區(qū)。

本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測方法及其系統(tǒng)具有以下四個優(yōu)點：

(1)本發(fā)明具有編碼容量大，編碼容量不受編碼方法限制的優(yōu)點。

普通的液滴編碼方法，比如顏色和熒光強度編碼方法，編碼容量會受到檢測系統(tǒng)對于編碼特征的分辨能力的限制，比如對顏色差別或熒光強度差別的分辨能力限制，而存在編碼能力的上限，限制了微液滴的實際應用。而本發(fā)明提供的編碼方法，不受系統(tǒng)對編碼特征的分辨能力的限制，理論上不存在編碼容量的上限，這將使得微液滴的多指標分析能力大大增強。

(2)本發(fā)明提供的編碼方法，具有編碼物質(zhì)和生化反應在空間上完全隔離的優(yōu)點。這使得編碼物質(zhì)不會對生化反應產(chǎn)生任何的影響，這對保證高靈敏度的生化檢測反應能夠正常進行尤為重要。

(3)本發(fā)明提供的編碼還具有易于解碼和解碼魯棒性高的優(yōu)點。

由于液滴隊列中標志液滴和功能液滴在空間上不互相混合，因而不需要同時解碼編碼信息和讀取生化反應的信息，降低對系統(tǒng)讀取和處理信息能力的要求。同時，由于液滴隊列中各個功能區(qū)是相互分隔的，也就是含有不同的生化反應的液滴是被編碼區(qū)所隔離，解碼的時候就不容易發(fā)生對生化反應類別判讀錯誤的情況，從而實現(xiàn)高的解碼魯棒性。

(4)本發(fā)明提供的編碼方法還具有易于集成芯片實驗室的優(yōu)點。

由于編碼方法要求液滴保持隊列的形式，因此整個過程都是要求在封閉的管道內(nèi)的，適合集成芯片實驗室的特點。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請中記載的一些實施例，對于本領域普通技術人員來說，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1是本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測方法示意圖；

圖2是本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測系統(tǒng)示意圖；

圖3是高熒光強度作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測中經(jīng)過PCR反應后的陽性液滴與陰性液滴的熒光信號；

圖4是高熒光強度作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測中含有量子點的標志液滴的熒光信號；

圖5是具有高熒光強度為特征的標志液滴的編碼原理示意圖；

圖6是以不同體積作為標志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖7是以不同顏色作為標志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖8是以不同吸光度作為標志液滴特征的編碼方法示意圖；

圖9是以不同反光度作為標志液滴特征的編碼方法示意圖；和

圖10是具有多種特征的標志液滴的編碼方法示意圖。

具體實施方式

為了使本領域技術領域人員更好地理解本申請中的技術方案，下面將結合本申請實施例中的附圖，對本申請實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例。以下實施例中所提到的方位用語，例如：上、下、左、右、前、后等，僅是參考附圖的方向；因此使用的方位用語是用來說明并非限制本發(fā)明?；诒旧暾堉械膶嵤├绢I域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都應當屬于本申請保護的范圍。

實施例一本發(fā)明的微液滴反應編碼原理

如圖1所示，通過控制外部各個注射泵的工作順序，來實現(xiàn)不同的試劑按特定的順序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照這樣的先后順序排成一個隊列。帶有標記信息的微液滴成為標志液滴，其所在隊列中的區(qū)域成為編碼區(qū)；帶有生化反應試劑的微液滴成為功能液滴，其所在隊列中的區(qū)域稱為功能區(qū)，每個功能區(qū)之間都間隔著一個編碼區(qū)。由這種反應區(qū)加編碼區(qū)的重復結構組成了完整的編碼“隊列”。當編碼“隊列”進入檢測區(qū)時，根據(jù)進樣的先后順序以及各個編碼區(qū)信息，能夠解碼每個功能區(qū)內(nèi)的包含的功能液滴所對應的反應物。

實施例二本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測系統(tǒng)

圖2為本發(fā)明的微液滴反應編碼檢測系統(tǒng)示意圖，該系統(tǒng)分為四個區(qū)域：進樣區(qū)、液滴生成區(qū)、反應區(qū)和檢測區(qū)。A1,A2……An是對應著不同的進樣口，用注射泵進行進樣。A1是用于生成標志液滴的進樣口，A2，A3……An是用于生成功能液滴的進樣口，在整個系統(tǒng)進行工作時，進樣的順序是A1-A2-A1-A3-A1……即在進樣時用標志液滴將功能液滴分隔開。在通過B1，B2相連的交叉點(即液滴生成區(qū))，通過油包水的方式生成液滴后，按照一定的先后順序在反應區(qū)內(nèi)排布并發(fā)生一定的生化反應。反應結束后，在C口的檢測區(qū)域內(nèi)進行檢測時，每一次檢測到與功能液滴不同的標志液滴時，便可獲知上一功能液滴即將結束，下一功能液滴即將開始通過檢測通道。

實施例三以高熒光強度作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測

步驟1液體試劑進樣控制

本發(fā)明提出的編碼方法，需要液滴在管道中形成編碼區(qū)和功能區(qū)交錯的“隊列”，因此對不同試劑進樣的順序有一定的要求，而進樣的順序通過控制外部的注射泵的工作順序來決定。

圖2所示的的注射泵采用高精度的注射泵(Harvard Apparatus，PHD Ultra)，每個注射泵上固定有一個1ml的注射器，并通過特氟龍管與芯片入口相連。每個注射器內(nèi)裝載有不同的試劑，其中B1和B2對應的注射器內(nèi)裝載的是礦物油，用于后續(xù)液滴生成；A1對應的注射器內(nèi)裝載的是濃度為1的M，熒光波長是525nm的水溶性CdSe量子點溶液，用于生成標志液滴；A2，A3，A4對應的注射器都裝載了包含50μL的Bio-Rad ddPCR Supermix for Probes，25μL含有20ng基因組DNA的溶液和25μL引物，其中A2、A3和A4包含的引物分別為GJB2基因、MTRNR1基因和MYO7a基因的上下游引物。A2、A3和A4中的溶液用于形成不同的功能液滴。通過控制注射泵的工作，不同試劑按以下順序進樣，A1、A2、A1、A3、A1、A4、A1，每次試劑進樣速度為400μL/h，進樣時間30秒，其中B1和B2是全程持續(xù)進樣，進樣速度為400μL/h。

步驟2液滴生成

進樣試劑會按照進樣順序在芯片內(nèi)“十字”液滴生成區(qū)域與B1和B2中的礦物油匯合，形成“油包水”的液滴。“十字”區(qū)域管道深50μm，寬為50μm，按前面所述的液體進樣速度，將會生成直徑大約為80前面的均一液滴。反應區(qū)管道寬度為80μm，深度為50μm，長度為1m。根據(jù)管道尺寸，液滴將會被略微壓扁，并一一排列在管道中，而反應區(qū)管道長度設計能夠同時容納下步驟1中所有進樣試劑生成的液滴。反應區(qū)內(nèi)走在最前面的是最先進樣的A1編碼微液滴，其后面的是之后進樣的A2功能液滴，后續(xù)的微液滴排列也以此類推。

步驟3 PCR反應

將芯片放入PCR儀進行在片的PCR擴增，PCR循環(huán)程序為：95℃10min預變性，95℃10s，55℃20s，72℃25s循環(huán)，共40個循環(huán)，最后4℃保溫。

步驟4液滴解碼與反應結果讀取

經(jīng)過溫度循環(huán)的芯片從PCR儀中取出，并通過注射泵將礦物油通過B1和B2入口進樣到芯片內(nèi)，這樣反應區(qū)的液滴隊列就會繼續(xù)向出口方向移動，并在到達出口前通過檢測區(qū)。在檢測區(qū)內(nèi)引入液滴熒光激發(fā)光源和檢測光路，能夠?qū)崿F(xiàn)對液滴熒光的激發(fā)和檢測。不同類型的液滴具有不同的熒光強度，其中熒光最強的是編碼區(qū)的液滴，其次是經(jīng)過PCR反應后，液滴內(nèi)原本就具有DNA模板并完成了擴增的陽性液滴，還有原本不具有DNA模板因此未完成擴增的陰性液滴，陰性液滴的熒光來自于液滴內(nèi)探針的背景熒光，熒光檢測結果如圖3、圖4所示。因此，通過識別液滴信號的強度，就能區(qū)分標志液滴與功能液滴。

隊列中每個液滴會依次經(jīng)過檢測區(qū)，根據(jù)每個液滴的熒光強度，檢測系統(tǒng)也會檢測到對應的信號，而這些信號序列將會按先后順序被系統(tǒng)記錄，最后再進行解碼和反應結果判讀。液滴隊列中各個功能區(qū)與編碼區(qū)的排列順序是由步驟2決定的，是已知的，因此檢測隊列中各個標志液滴的在整個信號序列中位置，就能解碼其相鄰的功能液滴所對應的反應。如圖5所示，圖5是具有高熒光強度為特征的標志液滴的編碼原理示意圖，其中標志液滴具有高的熒光強度，因而在液滴熒光檢測時，通過對熒光強度的判斷就能區(qū)分出標志液滴與功能液滴。通過確定標志液滴1和標志液滴2所在信號序列中的位置，就能確定夾在他們兩者當中的信號序列是屬于功能液滴1的，從而完成對功能液滴1信號的提取和識別。同樣，通過識別后續(xù)的標志液滴，就能完成所有功能區(qū)液滴信號的提取和識別，然后再對各個功能區(qū)信號進行陰陽性液滴的判讀，完成對各個目標分子的精確定量。

圖5具有高熒光強度為特征的標志液滴的編碼原理示意圖，其中標志液滴具有高的熒光強度，因而在液滴熒光檢測時，通過對熒光強度的判斷就能區(qū)分出標志液滴與功能液滴。

實施例四以不同體積作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測

如圖6所示，圖6是以不同體積作為標志液滴特征的編碼方法示意圖；其中標志液滴具有較大的體積，因而在液滴熒光檢測時，標志液滴的熒光信號峰寬比較大，通過對信號峰寬的判斷就能區(qū)分出標志液滴與功能液滴。

本實施例實現(xiàn)多位點的基因檢測需要四個步驟。

步驟1與實施例三中的步驟1大體相同，不同的是B1和B2進樣速度有兩種情況，當A1進樣時，B1和B2的進樣速度為100μL/h；當A2、A3或A4進樣時，B1和B2的進樣速度為400μL/h。這樣就存在兩種油相和水相的流速比，會得到兩種大小不一樣的液滴，A1進樣所生成的標志液滴體積要比A2、A3和A4進樣生成的功能液滴要大。

步驟2與實施例三中的步驟2大體相同，不同的是標志液滴直徑約為110μm。

步驟3與實施例三中的步驟3相同。

步驟4與實施例三中的步驟4大體相同，不同的是對標志液滴特征的檢測方法。由于標志液滴體積比功能液滴的體積要大，因此經(jīng)過檢測區(qū)域的時間更長，檢測系統(tǒng)將讀取到更寬的熒光信號，最后檢測系統(tǒng)通過熒光信號峰寬識別標志液滴，如圖6所示。

實施例五以不同顏色作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測

如圖7所示，以不同顏色作為標志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標志液滴具有紅色的特征，而A、B、C和D為無色透明的不同功能液滴，通過對液滴色彩信息的讀取能區(qū)分標志液滴與功能液滴。

本實施例實現(xiàn)多位點的基因檢測需要四個步驟。

步驟1與實施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對應的注射器內(nèi)裝載的是濃度為100μg/mL的水溶性胭脂紅色素溶液，用于生成標志液滴。

步驟2與實施例三中的步驟2相同。

步驟3與實施例三中的步驟3相同。

步驟4與實施例三中的步驟4大體相同，不同的是對標志液滴特征的檢測方法。由于標志液滴具有特別的色彩信息，檢測系統(tǒng)通過對其特定的色彩信息進行判讀來識別標志液滴，如圖7所示。

實施例六以不同吸光度作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測

如圖8所示，圖8是以不同吸光度作為標志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標志液滴具有較高的吸光度，而A、B為無色透明的不同功能液滴，通過對液滴透射光強度的檢測，區(qū)分標志液滴與功能液滴。

本實施例實現(xiàn)多位點的基因檢測需要四個步驟。

步驟1與實施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對應的注射器內(nèi)裝載的是濃度為100μg/mL的亞甲基藍溶液，用于生成標志液滴。

步驟2與實施例三中的步驟2相同。

步驟3與實施例三中的步驟3相同。

步驟4與實施例三中的步驟4大體相同，不同的是對標志液滴特征的檢測方法。由于標志液滴具有較高的吸光度，檢測系統(tǒng)通過對液滴發(fā)射相同強度的白光作為入射光，標志液滴的吸光度強，因此從液滴另一側射出的透射光強度比功能液滴的弱，于是檢測透射光的強度能測量液滴的吸光度，通過判別不同的吸光度來識別標志液滴，如圖8所示。

實施例七以不同反光度作為標志液滴特征的編碼實現(xiàn)多位點的基因檢測

如圖9所示，圖9是以不同反光度作為標志液滴特征的編碼方法示意圖，其中標志液滴具有較高的反光度，而功能液滴具有較低的反光度，通過檢測液滴的透射光與反射光強度來區(qū)分標志液滴與功能液滴。

本實施例實現(xiàn)多位點的基因檢測需要四個步驟。

步驟1與實施例三中的步驟1大體相同，不同的是A1對應的注射器內(nèi)裝載的是濃度約為10⁷/mL，直徑約為10約為的二氧化硅玻璃微珠懸濁液，用于生成標志液滴。

步驟2與實施例三中的步驟2相同。

步驟3與實施例三中的步驟3相同。

步驟4與實施例三中的步驟4大體相同，不同的是對標志液滴特征的檢測方法。由于標志液滴具有較高的反光度，檢測系統(tǒng)通過對液滴發(fā)射相同強度的白光作為入射光，并在光源一側與對側分別安裝光強傳感器。標志液滴的反光度強，因而能在光源側的光強傳感器上檢測到較強的反射光信號。而功能液滴反光度低，因而能在非光源側檢測到較強的透射光信息。通過判別不同的結果來識別標志液滴，如圖9所示。

實施例八具有多種特征的標志液滴的編碼方法

圖10具有多種特征的標志液滴的編碼方法示意圖。其中A、B、C是不同的功能液滴，而編碼區(qū)的標志液滴具有不同的特征和數(shù)量，形成不同的組合，這些特征包括實施例三到七中的一種或多種。

本實施例中液滴隊列的生成方式與實施例三中的類似，不同的是編碼區(qū)的標志液滴可以不止一種，比如標志液滴1是具有較強反射率的特征，而標志液滴2則是具有較強的熒光信號。通過組合不同特征和數(shù)量的標志液滴，形成每個編碼區(qū)都具有獨特的編碼特征，使得編碼信息更加豐富，編碼魯棒性更強，如圖10所示。

應該理解到披露的本發(fā)明不僅僅限于描述的特定的方法、方案和物質(zhì)，因為這些均可變化。還應理解這里所用的術語僅僅是為了描述特定的實施方式方案的目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受限于所附的權利要求。

本領域的技術人員還將認識到，或者能夠確認使用不超過常規(guī)實驗，在本文中所述的本發(fā)明的具體的實施方案的許多等價物。這些等價物也包含在所附的權利要求中。