本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、生物打印(例如3d生物打印)、組織工程學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種核-殼結(jié)構(gòu)的制備方法，該核-殼結(jié)構(gòu)可用于遞送活性物質(zhì)、或用于生物打印(例如3d生物打印)和組織工程。

背景技術(shù)：

核-殼結(jié)構(gòu)是指利用成膜材料將固體、液體或氣體包囊于其中，形成直徑幾十微米至上千微米的微小容器，其用于形成核層的物料稱為芯材(或稱為囊心物質(zhì))，用于形成外部包囊的殼層(壁膜)的物料稱為壁材(或稱為包囊材料)。

目前核-殼結(jié)構(gòu)的主要制備方法按照造粒原理可以分為化學(xué)法、物理法和物理化學(xué)法。化學(xué)法建立在化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上，主要利用單體小分子發(fā)生聚合反應(yīng)生成高分子或膜材料并將芯材包覆，其主要包括界面聚合法、原位聚合法、銳孔法等。物理法指通過機械力將高分子包覆在芯材物質(zhì)上，主要包括噴霧干燥法、噴霧凝凍法、空氣懸浮法、靜電結(jié)合法、擠壓法等。物理化學(xué)法是通過改變溫度、ph值、加入電解質(zhì)等，使溶解狀態(tài)的成膜材料從溶液中聚沉，并將芯材包覆形成核-殼結(jié)構(gòu)，其主要包括水相分離法、油相分離法、熔化分散冷凝法等。

現(xiàn)有技術(shù)中最常使用的是銳孔法。銳孔法通常將芯材物質(zhì)和高聚物壁材溶解在同一溶液中；然后，借助于滴管或注射器等微孔裝置，將此溶液滴到固化劑中；高聚物在固化劑中迅速固化從而形成核-殼結(jié)構(gòu)。最常見的制備核-殼結(jié)構(gòu)的自動化儀器一般基于振動原理和銳孔法，其在液滴噴射階段通過施加一定頻率、一定振幅的正弦波于噴嘴或射流，使射流破碎成液滴，滴入固化劑中，形成核-殼結(jié)構(gòu)。

現(xiàn)有的設(shè)備制備核-殼結(jié)構(gòu)時，通常需要借助單獨的振動裝置進行分液、以將核材料制成預(yù)設(shè)的粒徑大小。對于自身不易成球型的核材料，則需要將分液后的核材料人工倒入至盛裝有固化劑的容器內(nèi)，借助固化劑將核材料良好、均勻地固化成球狀，再將固化成球狀后的核材料人工倒入至殼溶液中進行包裹形成核-殼結(jié)構(gòu)。整個制備過程復(fù)雜繁瑣，并且通過振動法對核材料進行分液的過程難以兼顧細(xì)胞粒徑和活性，尤其體現(xiàn)在制備微小粒徑的核材料時，通常需要施加更高的振動頻率和振幅，而這樣的方式會大大影響細(xì)胞活性。

具體地，現(xiàn)有技術(shù)還存在以下不足之處：

(1)現(xiàn)有的制備核-殼結(jié)構(gòu)的方法通常需要借助固化劑使得液滴凝固成型。這種方式制備的殼層形成情況不可預(yù)期。由于有些固化劑具有一定的毒性，若采用上述方式制備包含細(xì)胞的核-殼結(jié)構(gòu)，含有毒性的物質(zhì)對細(xì)胞活性的影響較大，這樣就限制了核-殼結(jié)構(gòu)的材料選擇范圍。

(2)現(xiàn)有的基于銳孔法的制備儀器，通常是采用振動法或電壓脈沖法來進行分液。為使得液滴直徑更小，通常需要施加更高的振動頻率和振幅，這同時也會大大影響細(xì)胞活性，從而難以兼顧細(xì)胞液滴粒徑和細(xì)胞活性。

(3)核、殼的尺寸控制不精確?，F(xiàn)有的制備方法及其裝置只能依靠核、殼自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)制備成型，不能精確控制最終制得的核殼結(jié)構(gòu)尺寸，不能控制核、殼各自的厚度，重復(fù)性差，即難以實現(xiàn)核、殼的尺寸的按需單獨控制和調(diào)整。

(4)在采用溫敏性材料制備核-殼結(jié)構(gòu)的過程中，由于通常采用手動滴液的方式，難以保證多次、重復(fù)分量滴定過程的精準(zhǔn)性，所制得的核-殼結(jié)構(gòu)制備精度低，尺寸誤差大，并且難以制得多層殼、尤其是具有多層厚度不同的殼的核-殼結(jié)構(gòu)。

(6)采用銳孔法制備核-殼結(jié)構(gòu)時，對于一些主要含極性分子的溫敏材料，在制備時對于液滴的成型過程和分次滴定的包裹效率不能 保證，限制了自動化高效率的制備。

(7)對于包含有細(xì)胞的核-殼結(jié)構(gòu)，核結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞由外部的殼結(jié)構(gòu)進行包裹和保護，殼結(jié)構(gòu)的包裹效果會嚴(yán)重影響裹于其內(nèi)部的細(xì)胞的存活率。若外部的殼結(jié)構(gòu)包裹得不充分和/或不完整，核結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞容易從殼結(jié)構(gòu)的缺口或縫隙中脫離殼結(jié)構(gòu)的保護，即，若殼結(jié)構(gòu)包裹得不完整，核-殼結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞仍然非常容易受到損傷。

發(fā)明概述

為了解決上述一個或更多個問題，本申請的發(fā)明人開發(fā)了一種核-殼結(jié)構(gòu)的制備方法，其適用于制備包含各種芯材的核-殼結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法不涉及復(fù)雜步驟和儀器，容易實現(xiàn)，應(yīng)用性強，并且準(zhǔn)確性和重復(fù)性高，能夠有效控制核-殼結(jié)構(gòu)的尺寸、核殼層數(shù)以及殼層厚度。

此外，本發(fā)明的方法獲得的核-殼結(jié)構(gòu)能夠作為生物3d打印的基礎(chǔ)單元，即生物磚。本發(fā)明的生物磚所包裹的細(xì)胞類型和細(xì)胞數(shù)目是可控的，并且生物磚本身的尺寸也是可控的(例如粒徑低至約100μm的核-殼結(jié)構(gòu))，從而其可用于制備標(biāo)準(zhǔn)化、可控化的生物墨汁。在一些方面，本發(fā)明的生物磚能夠為細(xì)胞提供了有效的力學(xué)保護，從而確保了細(xì)胞在打印過程中的存活率(例如達到90％以上)。

因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種核-殼結(jié)構(gòu)的制備方法，包括以下步驟：a)提供疏水表面，優(yōu)選超疏水表面；b)將芯材溶液滴至步驟a)的疏水表面，形成液滴，以獲得最內(nèi)側(cè)的核層結(jié)構(gòu)；c)任選地，將芯材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得另一核層結(jié)構(gòu)；d)任選地，將壁材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得殼層結(jié)構(gòu)；e)任選地，重復(fù)步驟c)和/或步驟d)一次或更多次或者交替進行步驟c)和步驟d)一次或更多次；f)將壁材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得最外側(cè)的殼層結(jié)構(gòu)；其中，每一核層或殼層包含的芯材或壁材的選擇是各自獨立的。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的超疏水表面可以是超疏水涂層。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法-進一步包括使芯材和/或壁材成型的步驟,該成型步驟可以在步驟b)或步驟c) 或步驟d)或步驟e)或步驟f)之后進行。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，所述核層包裹細(xì)胞和/或活性物質(zhì)。

在另一個方面，本發(fā)明的方法獲得的核-殼結(jié)構(gòu)的核層包裹期望的活性物質(zhì)。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述核-殼結(jié)構(gòu)的核層包裹一種或多種細(xì)胞。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過本發(fā)明的方法獲得的生物磚，其，包括：細(xì)胞，包裹所述細(xì)胞的核層，和，封裝所述細(xì)胞和核層的殼層，其中所述核層和殼層各自由生物可降解材料制成。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，所述核層和殼層中的生物可降解材料能夠減少或避免生物磚內(nèi)的細(xì)胞在操作(例如生物打印)過程中遭受機械損傷，并且能夠提供物質(zhì)(例如營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞因子，藥物活性成分等)的可控釋放，以促進細(xì)胞活性和功能(增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝)。

下面將結(jié)合附圖和發(fā)明詳述來對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)闡釋。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和發(fā)明詳述僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和發(fā)明詳述的詳細(xì)公開內(nèi)容，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。

附圖說明

圖1示意性描述了在未處理的玻璃表面和經(jīng)處理的玻璃表面(即超疏水表面)滴注待反應(yīng)液。

圖2示意性描述了可用于本發(fā)明的方法中的u型底孔板結(jié)構(gòu)。

圖3示意性描述了在u型底孔板滴注不同容量待反應(yīng)液、形成不同預(yù)設(shè)粒徑的核層。

圖4示意性描述了在平底孔板滴注不同容量待反應(yīng)液、形成不同預(yù)設(shè)粒徑的核層。

圖5示意性描述了可用于本發(fā)明的方法的裝置。

圖6顯示了根據(jù)實施例3-4制備的核-殼結(jié)構(gòu)的顯微照片。

圖7示意性描述了本發(fā)明的生物磚的結(jié)構(gòu)，其包括：細(xì)胞，其能夠進行生長、增殖、分化或遷移；包裹所述細(xì)胞的核層，其由生物可降解材料制成，并且為細(xì)胞的生命活動提供所需的物質(zhì)；和，封裝所述細(xì)胞和核層的殼層，其位于最外側(cè)，由生物可降解材料制成，并且為內(nèi)部的核層和細(xì)胞提供力學(xué)保護。

發(fā)明詳述

術(shù)語定義

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。然而，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供本說明書中的相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。當(dāng)本說明書中給出的定義與本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義相沖突時，以本說明書中的定義為準(zhǔn)。

如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。此外，本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有說明。

如本文中所使用的，術(shù)語“疏水表面”具有本領(lǐng)域通常理解的含義，其通常而言顯示大于或等于120°的水接觸角。

如本文中所使用的，術(shù)語“超疏水表面”具有本領(lǐng)域通常理解的含義，其是高度疏水的，即難以浸潤。通常而言，“超疏水表面”顯示大于或等于150°的水接觸角和小于10°的滾動接觸角。

如本文中所使用的，術(shù)語“核-殼結(jié)構(gòu)”是指利用成膜材料將固體、液體或氣體包囊于其中，形成直徑幾十微米至上千微米例如20-2000微米的微小容器，其用于形成核層的物料稱為芯材(或稱囊心物質(zhì))，用于形成外部包囊的殼層(壁膜)的物料稱為壁材(或稱為包囊材料)。

如本文中所使用的，術(shù)語“生物磚”用于指通過本發(fā)明的方法構(gòu)建的一種基本單元，其可用于多個領(lǐng)域，例如生物打印(如3d生物打印)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明的生物磚具有特定 的結(jié)構(gòu)和組成，即，其包括：細(xì)胞，包裹所述細(xì)胞的核層，和，封裝所述細(xì)胞和核層的殼層，其中所述核層和殼層各自由生物可降解材料制成。本發(fā)明的生物磚的示意性結(jié)構(gòu)可參見圖7。

如本文中使用的，術(shù)語“生物打印”是指：利用生物材料(包括但不限于，生物分子例如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸和代謝產(chǎn)物；細(xì)胞例如細(xì)胞溶液、含細(xì)胞的凝膠、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體和多細(xì)胞體；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞器和細(xì)胞膜；與生物分子相關(guān)的分子例如合成的生物分子或生物分子的類似物)的打印。如本文中使用的，術(shù)語“打印”是指，按照預(yù)定的模式沉積材料的過程。在本發(fā)明中，生物打印優(yōu)選地通過與自動的或半自動的、計算機輔助的三維原型裝置(例如生物打印機)相匹配的方法來實現(xiàn)。然而，在本發(fā)明中，“打印”(例如生物打印)可通過各種方法來進行，包括但不限于，使用打印機(例如3d打印機或生物打印機)進行打?。皇褂米詣踊蚍亲詣踊瘷C械過程(而非打印機)進行打??；通過手工放置或手工沉積(例如使用移液器)進行打印。

如本文中使用的，“生物相容性材料”是指這樣的材料，其(以及其降解產(chǎn)物)對于細(xì)胞是無毒性的，并且在植入宿主(例如人體)后與宿主相容，不會造成顯著的或者嚴(yán)重的副作用，例如，不會對宿主(例如人體組織)造成毒害作用，不會引起宿主的免疫排斥反應(yīng)、過敏反應(yīng)或炎癥反應(yīng)等等。

如本文中使用的，“生物可降解材料”是指這樣的材料，其能夠被細(xì)胞或生物體降解和吸收，并且其降解產(chǎn)物是生物相容性的。此類材料可以是天然來源的(例如來源于動植物)，也可以是人工合成的。

如本文中所使用的，術(shù)語“力學(xué)保護”是指，殼層具有一定的硬度和彈性模量，從而能夠減少或避免其封裝的細(xì)胞遭受外界的機械損傷/力學(xué)損傷(例如，3d生物打印過程中可能產(chǎn)生的剪切力，擠壓力等引起的損傷)。

如本文中使用的，“生物墨汁”是指，包含一種或多種本發(fā)明的生物磚的液體，半固體(例如凝膠)或固體組合物。例如，本發(fā)明的生 物墨汁可以是包含生物磚的溶液，懸浮液，凝膠，或濃縮物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物墨汁包含生物磚以及生物粘合劑。在本發(fā)明中，生物墨汁能夠被用于生物打印，以產(chǎn)生特定的平面和/或?qū)訝顜缀涡螤?；并且?yōu)選地，所產(chǎn)生的平面和/或?qū)訝顜缀涡螤钅軌蜻M一步堆疊，從而形成具有特定形狀和結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)建體。此外，在生物打印之前，期間和/或之后，生物墨汁中的生物磚內(nèi)的細(xì)胞能夠進行各種期望的生命活動。在優(yōu)選的實施方案中，生物磚內(nèi)的細(xì)胞在生物打印之前處于休眠狀態(tài)，而在生物打印之后進行生長和增殖，從而形成穩(wěn)固的三維構(gòu)建體。在優(yōu)選的實施方案中，生物墨汁是可擠出的組合物。如本文中所使用的，“可擠出的”是指，組合物能夠通過被迫(例如在壓力下)穿過噴嘴或孔口而成形。

如本文中使用的，“生物粘合劑”是指，起粘合作用的、與細(xì)胞和生物體相容的、可降解的材料。其具體實例可包括，但不限于膠原、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、淀粉、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、彈性蛋白、明膠、聚氨基酸、瓊脂、葡聚糖、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，或其任何組合。

如本文中使用的，“試劑”是指化學(xué)試劑、生化試劑或藥物，包括但不限于，小分子化合物，激素，肽(例如寡肽或蛋白質(zhì))，核酸(寡核苷酸，dna，rna或化學(xué)修飾的核酸)等，其對細(xì)胞活性，功能和/或行為具有作用或影響。試劑可以是天然來源的，重組產(chǎn)生的，或化學(xué)合成的?！按碳ぁ笔侵?，化學(xué)因素(例如試劑，酸，堿，氧濃度等)或物理因素(例如溫度，輻照，機械力等)，其對細(xì)胞活性，功能和/或行為具有作用或影響。

如本文中使用的，“受試者”是指動物，例如脊椎動物。優(yōu)選地，受試者為哺乳動物，例如人，?？苿游?，馬科動物，貓科動物，犬科動物，嚙齒類動物或靈長類動物。特別優(yōu)選地，受試者為人。在本文中，該術(shù)語可以與“患者”、“受體”和“供體”互換使用。

因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種核-殼結(jié)構(gòu)的制備方法，包括以下步驟：a)提供疏水表面，優(yōu)選超疏水表面；b)將芯材溶液滴至步驟a)的疏水表面，形成液滴，以獲得最內(nèi)側(cè)的核層結(jié)構(gòu)；c)任選地，將芯材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得另一核層結(jié)構(gòu)；d)任選地，將壁材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得殼層結(jié)構(gòu)；e)任選地，重復(fù)步驟c)和/或步驟d)一次或更多次或者交替進行步驟c)和步驟d)一次或更多次；f)將壁材溶液滴至形成的液滴表面，以獲得最外側(cè)的殼層結(jié)構(gòu)；其中，每一核層或殼層包含的芯材或壁材的選擇是各自獨立的。

本發(fā)明的疏水表面例如超疏水表面的示意圖可參見圖1，其顯示所滴注的待反應(yīng)液在超疏水處理前后的玻璃表面上的接觸角?？捎糜诒景l(fā)明的表面可以是任何表面，只要其是疏水性的，優(yōu)選超疏水性的。疏水表面例如超疏水表面可以是固體表面，也可以是薄膜表面。疏水表面例如超疏水表面還可以是涂覆于表面上的疏水涂層諸如超疏水涂層。例如，疏水表面例如超疏水表面可以是容器的疏水表面例如超疏水表面；優(yōu)選地，容器為平板諸如玻璃平板，孔板諸如96、384或1536孔標(biāo)準(zhǔn)孔板、或者燒杯，優(yōu)選孔板，例如底部呈u型的孔板(參見圖2)。在滴入液體體積遠(yuǎn)小于孔板底部直徑時，u型底的弧面構(gòu)型更加有利于核殼溶液匯聚于中心，從而提高包裹效率。

疏水表面例如超疏水表面可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法產(chǎn)生，例如選自刻蝕法、相分離與自組裝法、化學(xué)沉積與電沉積法、溶膠-凝膠法、靜電紡絲法、碳納米管法、模板法、納米二氧化硅法、腐蝕法、全氟化處理法、硅烷化處理法和納米疏水涂層法。疏水表面使得型材溶液滴在其表面后能夠成型，其中當(dāng)接觸角大于或等于150°時，能夠成基本上規(guī)則的圓形，而接觸角大于120°但小于150°時，能夠成橢圓形。

在某些優(yōu)選的實施方案中，其中在步驟b)中使用移液裝置，優(yōu)選能夠準(zhǔn)確定量控制吸入和排出體積的移液裝置，更優(yōu)選能夠分次定量排出液體的移液裝置，進一步優(yōu)選電子式移液裝置，進一步優(yōu)選能夠吸取和排出納升級液體的電子式移液裝置吸取芯材溶液，并將其滴 至所述疏水表面諸如超疏水表面，形成液滴。采用能夠準(zhǔn)確定量控制吸入和排出體積的移液裝置，能夠精確吸取小量核層和殼層溶液，且重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度好。圖3顯示了在未經(jīng)超疏水化處理和經(jīng)超疏水化處理的u型底孔板上滴注不同容量的芯材溶液，以形成不同預(yù)設(shè)粒徑的核層。圖4顯示了在未經(jīng)超疏水化處理和經(jīng)超疏水化處理的平板底孔板上滴注不同容量的芯材溶液，以形成不同預(yù)設(shè)粒徑的核層。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括根據(jù)芯材的性質(zhì)使芯材和/或壁材成型的步驟。該成型步驟可以在步驟b)或步驟c)或步驟d)或步驟e)或步驟f)之后進行。在一個實施方案中，該成型步驟包括向步驟b)或步驟c)或步驟d)或步驟e)或步驟f)中形成的液滴表面滴入固化劑使其成型。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)所使用的芯材和壁材的性質(zhì)選擇適合的固化劑，例如氯化鈣。不受特別的固化作用機理的限制，能夠與芯材或壁材發(fā)生反應(yīng)而使液滴固化成型的固化劑均可用于本發(fā)明。在一個實施方案中，該成型步驟包括向步驟b)或步驟c)或步驟d)或步驟e)或步驟f)中形成的液滴施加外部作用例如升高的溫度，使其成型。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)所使用的芯材和壁材的性質(zhì)選擇合適的外部作用，例如溫度控制，諸如對于溫敏材料(如膠原，優(yōu)選i型膠原)采用溫度控制的方式進行成型。例如，當(dāng)使用i型膠原作為芯材時，外部作用為在37℃恒溫保持，優(yōu)選保持20-40min，優(yōu)選30min。值得注意的是，本發(fā)明的方法也可以不包括額外的成型步驟，而是通過超疏水表面的形狀而呈一定的形狀，例如圓形或橢圓形。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，步驟c)-f)任一項中的芯材或壁材溶液通過選自靜電吸附、氫鍵相互作用、共價鍵作用、電荷轉(zhuǎn)移相互作用、配位鍵相互作用、疏水相互作用、生物分子間特異性生物作用和鹵鍵的一種或多種方式結(jié)合到液滴表面，優(yōu)選通過靜電吸附的方式。例如，在一個芯材為膠原而壁材為聚賴氨酸的實施方案中，帶正電荷的聚賴氨酸通過靜電吸附的方式吸附到帶負(fù)電荷的膠原表面。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括在步驟c)-f) 任一項中的芯材或壁材溶液滴入后，手動或通過微振動裝置輕微振動疏水表面使得溶液中的芯材或壁材完全結(jié)合。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，當(dāng)制備多層殼結(jié)構(gòu)時，在一層壁材溶液吸附完全后、在滴加下一層壁材溶液之前，還包括清洗步驟。優(yōu)選地，所述清洗步驟包括滴加清洗溶液，清洗1次或更多次例如2次，以去除多余的壁材溶液；優(yōu)選地，所述清洗溶液為細(xì)胞培養(yǎng)基溶液。清洗步驟可以去除容器內(nèi)多余的壁材溶液，避免其吸附在包裹了一層壁材溶液的微球表面，或者與后面添加的壁材溶液反應(yīng)，導(dǎo)致后續(xù)殼層包裹不均勻，從而核-殼結(jié)構(gòu)出現(xiàn)凸起或其它不規(guī)則結(jié)構(gòu)。

圖5是可用于實施本發(fā)明的方法的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。該裝置包括數(shù)字滴液器，其能夠準(zhǔn)確定量控制吸入和排出體積，優(yōu)選能夠吸取和排出納升級液體的數(shù)字滴液器。該數(shù)字滴液器與控制器連接，從而通過控制器準(zhǔn)確定量控制吸入和排出的液體體積。該控制器還與二維運動平臺連接并操縱該平臺在水平方式上的運動，由此控制布置于該平臺上的微孔板的運動。以這種方式，控制器能夠控制數(shù)字滴液器以期望的體積將芯材溶液滴注至微孔板中，以形成核層。任選地，微孔板置于恒溫板上，以向微孔板中的芯材溶液提供期望的溫度，從而使滴注的核層成型。任選地，在通過更換吸頭模塊更換吸頭后，通過數(shù)字滴液器從待反應(yīng)液培養(yǎng)皿吸取固化劑溶液，將其滴注至芯材液滴表面，使其固化成型。然后，通過更換吸頭模塊更換吸頭后，通過數(shù)字滴液器從待反應(yīng)液培養(yǎng)皿吸取壁材溶液，并滴至核層表面，以形成殼層。殼層的厚度也可根據(jù)與控制器連接的數(shù)字滴液器加以調(diào)整和控制，例如，可以通過控制和調(diào)整數(shù)字滴液器吸取和滴加的殼層材料的量來控制和調(diào)整殼層厚度。通過本發(fā)明的方法制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的核層尺寸和殼層厚度是可控的，可根據(jù)需要進行選擇。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法獲得的核-殼結(jié)構(gòu)為微膠囊或生物磚。

在本發(fā)明的某些實施方案中，微膠囊的核層包裹期望的活性物質(zhì)。取決于微膠囊的具體應(yīng)用，活性物質(zhì)可以為化合物、蛋白質(zhì)、核苷酸等 具有期望活性的物質(zhì)，例如氨基酸、多肽、核苷酸載體、小分子化合物、碳水化合物、生物酶等。

在本發(fā)明的某些實施方案中，生物磚的核層包裹一種或多種細(xì)胞，諸如一個或多個細(xì)胞，例如1-10⁶個細(xì)胞,例如1-10⁵、1-10⁴、1-5000、1-2000、10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100個細(xì)胞。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞為細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為粘附細(xì)胞，例如分化的粘附細(xì)胞或未分化的粘附細(xì)胞；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為多能干細(xì)胞。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞來源于選自下述的組織：結(jié)締組織(例如，疏松結(jié)締組織、致密結(jié)締組織、彈性組織、網(wǎng)狀結(jié)締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經(jīng)組織和上皮組織(例如，單層上皮和復(fù)層上皮)、內(nèi)胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織；

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞選自肌肉細(xì)胞(例如，骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(例如，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或淋巴組織的細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、腎細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、實質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、未分化的細(xì)胞(如干細(xì)胞和祖細(xì)胞)、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞、外胚層來源的細(xì)胞、癌來源的細(xì)胞，細(xì)胞系、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips)、或其任何組合。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，芯材材料為溫敏材料或非溫敏材料；優(yōu)選地，所述溫敏材料為明膠或膠原或其組合；優(yōu)選地，非溫敏材料為海藻酸鹽、可降解聚氨酯或其組合；優(yōu)選地，當(dāng)芯材為膠原時，所 述第一溶液的液滴在37℃成型，優(yōu)選在ph7.6的條件下成型，優(yōu)選成型約20-40min，更優(yōu)選約30min。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，芯材能夠為細(xì)胞的生命活動提供所需的物質(zhì)；優(yōu)選地，所述芯材為生物可降解材料，并且所述生物可降解材料是生物相容性的；優(yōu)選地，所述生物可降解材料是適合細(xì)胞生長和/或遷移的材料；優(yōu)選地，所述生物可降解材料是天然存在的(例如來源于動植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重組產(chǎn)生的，或者其任何組合；優(yōu)選地，所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合；和/或合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(pla)，聚羥基乙酸(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)，聚原酸酯(poe)，聚己內(nèi)酯(pcl)，聚羥基丁酸酯(phb)，聚氨基酸，可降解性聚氨酯，以及其任何組合；優(yōu)選地，所述生物可降解材料能夠被酶(例如細(xì)胞分泌的酶)所降解；優(yōu)選地，所述核層的降解能夠提供維持或促進所述細(xì)胞的生命活動的物質(zhì)；優(yōu)選地，所述生物可降解材料選自膠原蛋白(例如i型，ii型，iii型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)、淀粉、透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸、瓊脂，或其任何組合；優(yōu)選地，所述核層包含i型膠原蛋白和/或海藻酸鹽，例如包含i型膠原蛋白和海藻酸鈉；

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，最內(nèi)側(cè)核層的尺寸為20-2000μm，例如30-1900μm、40-1800μm、50-1700μm、60-1600μm、70-1500μm、80-1400μm、90-1300μm、100-1200μm、200-1000μm、300-800μm、400-600μm或100-500μm。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核-殼結(jié)構(gòu)包含一個或更多個額外的核層，優(yōu)選地，所述額外的核層的厚度獨立地為20-1000μm，例如30-900μm、40-800μm、50-700μm、60-600μm、70-500μm、80-400μm、90-300μm、100-200μm、110-190μm、120-180μm、130-160μm或140-150μm。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，壁材能夠為細(xì)胞的生命活動提供微環(huán)境((例如，促進細(xì)胞的生命活動的物理、生物或化學(xué)因素)；優(yōu)選地，壁材為生物可降解材料，并且所述生物可降解材料是生物相容性的；優(yōu)選地，所述生物可降解材料是天然存在的(例如來源于動植物的天然存在的生物可降解材料)，人工合成的，重組產(chǎn)生的，或者其任何組合；優(yōu)選地，所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合；和/或，合成的可降解聚合物，例如聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(pla)，聚羥基乙酸(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)，聚原酸酯(poe)，聚己內(nèi)酯(pcl)，聚羥基丁酸酯(phb)，聚氨基酸，可降解性聚氨酯，以及其任何組合；優(yōu)選地，所述生物可降解材料能夠被酶(例如細(xì)胞分泌的酶)所降解；優(yōu)選地，所述殼層的降解能夠提供維持或促進所述細(xì)胞的生命活動的物質(zhì)；優(yōu)選地，所述生物可降解材料選自膠原蛋白(例如i型，ii型，iii型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、淀粉、透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸、瓊脂，或其任何組合；優(yōu)選地，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，例如包含海藻酸鈣和明膠，任選地還包含彈性蛋白。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，殼層為通透性的；例如，所述殼層對于水，氧氣，和營養(yǎng)物質(zhì)(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質(zhì)，氨基酸，短肽，礦物質(zhì)，維生素、細(xì)胞因子、核苷酸)是通透性的；優(yōu)選地，所述殼層具有用于生物磚內(nèi)外物質(zhì)交換的通道或孔；優(yōu)選地，通道的直徑為至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm；優(yōu)選地，所述孔的直徑為至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，殼層的厚度為0.1-50μm，例如0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，核層和/或殼層還包含額外的試劑，例如，營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和/或藥物活性成分；優(yōu)選地，所述額外的試劑能夠調(diào)控(例如促進)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝；優(yōu)選地，所述營養(yǎng)物質(zhì)包括但不限于，微量元素，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如單糖，寡糖，多糖)，脂質(zhì)，維生素；優(yōu)選地，細(xì)胞外基質(zhì)選自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；結(jié)構(gòu)蛋白，例如膠原和彈性蛋白；粘著蛋白，例如纖粘連蛋白和層粘連蛋白；優(yōu)選地，所述細(xì)胞因子可以是用于調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的細(xì)胞因子，包括但不限于：

-與細(xì)胞生長相關(guān)的細(xì)胞因子，例如胰島素、類胰島素生長因子(如igf-ⅰ、igf-ⅱ)、轉(zhuǎn)化生長因子(如tgfα和tgfβ)、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、成纖細(xì)胞生長因子、血小板來源生長因子、骨肉瘤來源生長因子、生長激素釋放抑制因子、神經(jīng)生長因子、白細(xì)胞介素(如il-1、il-1、il-3)、紅細(xì)胞生長素、集落刺激因子、皮質(zhì)醇、甲狀腺素，或其任何組合；

-與細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子，例如oct3/4，sox2，klf4，c-myc，gata4，tsp1，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素c，胰島素，ibmx，吲哚美鋅，血小板衍生生長因子bb(pdgf-bb)，5-氮雜胞苷，或其任何組合；

-與細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞因子，例如環(huán)磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、n-鈣粘蛋白，核因子κb，骨連接素，血栓素a2，ras，或其任何組合；和/或

-與細(xì)胞新陳代謝相關(guān)的細(xì)胞因子，例如胰島素生長因子1、trip-br2、dkk-1、srankl、opg、tracp-5b、alp、sirt1(2-7)、pgc-1α，pgc-1β、opg、il-3、il-4、il-6、tgf-β、pge2、g-csf、tnf-α，或其任何組合；

優(yōu)選地，所述藥物活性成分為能夠調(diào)控(例如促進)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的試劑；優(yōu)選地，所述藥物活性成分選自rhil-2、rhil-11、rhepo、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、g-csf、 gm-csf、rhuepo、stnf-r1、和rhtnf-α。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)為球形或橢圓形。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，所述核-殼結(jié)構(gòu)為固體或半固體，例如凝膠態(tài)。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，步驟c)和上述的任選的成型步驟可以交替重復(fù)進行，以制備一層或多層核層結(jié)構(gòu)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10層核層結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，步驟d)也可重復(fù)進行，以制備得到一層或多層殼層結(jié)構(gòu)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10層殼層結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，重復(fù)步驟c)和/或步驟d)一次或更多次或者交替進行步驟c)和步驟d)一次或更多次，從而制備兩層或更多層的核層結(jié)構(gòu)和/或殼層結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過本發(fā)明的方法制備的生物磚，其包括：細(xì)胞，包裹所述細(xì)胞的核層，和，封裝所述細(xì)胞和核層的殼層，其中所述核層和殼層各自由生物可降解材料制成。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，所述核層和殼層中的生物可降解材料能夠減少或避免生物磚內(nèi)的細(xì)胞在操作(例如生物打印)過程中遭受機械損傷，并且能夠提供物質(zhì)(例如營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞因子或藥物活性成分等)的可控釋放，以促進細(xì)胞活性和功能(增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝)。

生物磚的核層提供了適合細(xì)胞粘附和伸展的空間結(jié)構(gòu)，從而細(xì)胞在該結(jié)構(gòu)內(nèi)能夠正常進行增殖、分化、遷移、分泌或新陳代謝。在某些實施方案中，所述核層能夠為細(xì)胞的生命活動提供微環(huán)境(例如，促進細(xì)胞的生命活動的物理、生物或化學(xué)因素)。優(yōu)選地，所述核層由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。在本發(fā)明的實施方案中，用于制備核層的生物可降解材料可以是天然存在的(例如來源于動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白， 瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產(chǎn)生的，或者其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優(yōu)選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(pla)，聚羥基乙酸(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)，聚原酸酯(poe)，聚己內(nèi)酯(pcl)，聚羥基丁酸酯(phb)，聚氨基酸(polyaminoacid)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細(xì)胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差異很大，其范圍可以為一個月到數(shù)年。然而在本發(fā)明中，特別優(yōu)選地，用于制備核層的生物可降解材料在不超過2個月的時間內(nèi)降解，例如在不超過1個月的時間內(nèi)降解，例如在不超過30天、不超過25天、不超過20天、不超過15天、不超過10天、不超過5天、不超過4天、不超過3天、不超過2天、或不超過1天的時間內(nèi)降解。例如，用于制備核層的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的時間內(nèi)降解。降解速率與生物可降解材料的分子組成、分子量大小和分子排列(例如，直鏈或支鏈)密切相關(guān)。一般情況下，分子量越高、分子排列越緊密，降解時間越長。因此，核層的降解速率可通過對核層的組分和/或含量的配置來控制。例如，為了獲得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500da、1kda、2kda、3kda、 5kda、或10kda)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。為了獲得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500da、1kda、2kda、3kda、5kda、或10kda)的生物可降解材料，和/或具有緊密分子排布的生物可降解材料。另外，還可通過改變生物磚的結(jié)構(gòu)(如：多層包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面積等)來調(diào)節(jié)生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率還可以通過改變合成該材料的聚合方式和共聚物比例來進行調(diào)節(jié)；或者，可通過對該材料的交聯(lián)來進行調(diào)節(jié)。

各種生物可降解材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且其降解性能已被進行了廣泛研究(參見例如，alexanderd.augst,hyunjoonkong,davidj.mooney,alginatehydrogelsasbiomaterials,macromol.biosci.2006,6,623-633)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要，選擇合適的生物可降解材料來制備核層。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層的降解能夠提供維持或促進所述細(xì)胞的生命活動的物質(zhì)。在某些優(yōu)選的實施方案中，核層的降解產(chǎn)物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質(zhì)等。此類降解產(chǎn)物可參與到細(xì)胞的新陳代謝活動中，用于合成細(xì)胞外基質(zhì)或轉(zhuǎn)化為活動所需的能量。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的生物可降解材料及其降解產(chǎn)物對于細(xì)胞是無毒的，和/或?qū)τ谒拗魇欠敲庖咴缘摹?/p>

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層的生物可降解材料選自膠原蛋白(例如i型，ii型，iii型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉)、淀粉、透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸、瓊脂，或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層包含i型膠原蛋白和/或海藻酸鹽，例如包含i型膠原蛋白和海藻酸鈉。在某些優(yōu)選的實施方案中，i型膠原蛋白和海藻酸鈉在核層中的重量比為約1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、3:25、1:9、1:10、1:20、1:30、或1:50。在某些優(yōu)選的實施方 案中，i型膠原蛋白和海藻酸鈉在核層中的重量比為1:1-1:2、1:2-1:4、1:4-1:6、1:6-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、1:10-1:20、1:20-1:30、1:30-1:50、1:1-1:5、1:5-1:10、1:7-1:10、或1:8-1:9。在某些優(yōu)選的實施方案中，i型膠原蛋白在核層中的重量百分比為約0.01％、0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％。在某些優(yōu)選的實施方案中，i型膠原蛋白在核層中的重量百分比為0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.125％、0.125％-0.15％、0.15％-0.175％、0.175％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、0.01％-0.1％、0.1％-0.2％、0.125％-0.175％、0.2％-0.5％、0.1％-0.5％、0.1％-1％、或0.05％-5％。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鈉在核層中的重量百分比為約0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鈉在核層中的重量百分比為0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5-5％。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層為凝膠狀。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層也能夠為細(xì)胞的生命活動提供所需的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述殼層由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。在本發(fā)明的實施方案中，用于制備殼層的生物可降解材料可以是天然存在的(例如來源于動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產(chǎn)生的，或者其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的所述生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優(yōu)選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的所述生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(pla)，聚羥基乙酸(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)，聚原酸酯(poe)，聚己內(nèi)酯(pcl)，聚羥基丁酸酯(phb)，聚氨基酸(polyaminoacid)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物和合成的可降解聚合物。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備核層和殼層的生物可降解材料是相同的或不同的。在某些優(yōu)選的實施方案中，核層和殼層分別以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的所述生物可降解材料能夠被酶(例如細(xì)胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差異很大，其范圍可以為一個月到數(shù)年。在某些優(yōu)選的實施方案中，生物可降解材料在1天、2天、3天、5天、10天或更長的時間內(nèi)降解。降解速率與生物可降解材料的分子組成、分子量大小和分子排列(例如，直鏈或支鏈)密切相關(guān)。一般情況下，分子量越高、分子排列越緊密，降解時間越長。因此，殼層的降解速率可通過對殼層的組分和/或含量的配置來控制。例如，為了獲得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500da、1kda、2kda、3kda、5kda、或10kda)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。為了獲得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500da、1kda、2kda、3kda、5kda、或10kda)的生物可降解材料，和/或具有緊密分子排布的生物可降解材料。另外，還可通過改變生物磚的結(jié)構(gòu)(如：多層包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面積等)來調(diào)節(jié)生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率還可以通過改變合成該材料的聚合方式和共聚物比例來進行調(diào)節(jié)；或者，可通過對該材 料的交聯(lián)來進行調(diào)節(jié)。

各種生物可降解材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且其降解性能已被進行了廣泛研究(參見例如，alexanderd.augst,hyunjoonkong,davidj.mooney,alginatehydrogelsasbiomaterials,macromol.biosci.2006,6,623-633)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要，選擇合適的生物可降解材料來制備殼層。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層的降解能夠提供維持或促進所述細(xì)胞的生命活動的物質(zhì)。在某些優(yōu)選的實施方案中，殼層的降解產(chǎn)物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質(zhì)等。此類降解產(chǎn)物可參與到細(xì)胞的新陳代謝活動中，用于合成細(xì)胞外基質(zhì)或轉(zhuǎn)化為活動所需的能量。

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的生物可降解材料及其降解產(chǎn)物對于細(xì)胞是無毒的，和/或?qū)τ谒拗魇欠敲庖咴缘摹?/p>

在某些優(yōu)選的實施方案中，用于制備殼層的生物可降解材料選自膠原蛋白(例如i型，ii型，iii型膠原蛋白)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、淀粉、透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，彈性蛋白，明膠、葡聚糖、聚氨基酸、瓊脂，或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)，例如包含海藻酸鈣和明膠，任選地還包含彈性蛋白。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層包含海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠在殼層中的重量比為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和明膠在殼層中的重量比為10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層還包含 彈性蛋白。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和彈性蛋白在殼層中的重量比為約1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)和彈性蛋白在殼層中的重量比為10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些優(yōu)選的實施方案中，明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為約1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些優(yōu)選的實施方案中，明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)、明膠和彈性蛋白在殼層中的重量比為約250:250:1。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)在殼層中的重量百分比為約0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些優(yōu)選的實施方案中，海藻酸鹽(例如海藻酸鈉或海藻酸鈣)在殼層中的重量百分比為0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些優(yōu)選的實施方案中，明膠在殼層中的重量百分比為約0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些優(yōu)選的實施方案中，明膠在殼層中的重量百分比為0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些優(yōu)選的實施方案中，彈性蛋白在殼層中的重量百分比為約0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、或0.5％。在某些優(yōu)選的實施方案中，彈性蛋白在殼層中的重量百分比為 0.01％-0.02％、0.02％-0.03％、0.03％-0.04％、0.04％-0.05％、0.05％-0.06％、0.06％-0.07％、0.07％-0.08％、0.08％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％、0.2％-0.5％、0.01％-0.03％、0.03％-0.05％、0.05％-0.08％、0.08％-0.15％、0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.03％-0.07％、0.04％-0.06％、0.01％-0.1％、0.1％-0.5％、或0.01％-0.5％。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層為包裹的細(xì)胞提供了力學(xué)保護。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述生物磚(殼層)具有約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、或0.4gpa的硬度。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述生物磚(殼層)具有0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1gpa的硬度。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述生物磚(殼層)具有約0.083gpa的硬度。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述生物磚(殼層)具有約0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.8、3.2、4、10、20、30、40、50、80、或100mpa的彈性模量。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述生物磚(殼層)具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50mpa的彈性模量。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層具有約1.683mpa的彈性模量。殼層的力學(xué)保護作用(例如，硬度和彈性模量)可通過對殼層的組分和/或含量的配置來控制。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層是通透性的。例如，所述殼層對于水，氧氣，和營養(yǎng)物質(zhì)(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質(zhì)，氨基酸，短肽，礦物質(zhì)，維生素、細(xì)胞因子、核苷酸等)是通透性的。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述殼層具有用于生物磚內(nèi)外物質(zhì)交換的通道或孔。 在某些優(yōu)選的實施方案中，營養(yǎng)物質(zhì)(糖類例如葡萄糖，脂肪，蛋白質(zhì)，氨基酸，短肽，礦物質(zhì)，維生素、細(xì)胞因子、核苷酸等)通過所述通道或孔擴散進入所述生物磚內(nèi)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述通道的直徑為至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述通道的直徑為例如1nm-5μm；10nm-2μm；100nm-1μm；200-800nm等。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述孔的直徑為至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。

本發(fā)明的生物磚的殼層的厚度可以根據(jù)實際需要進行選擇，而不受特別限制。例如，本發(fā)明生物磚的殼層的厚度可以為0.1-50μm，例如1-20μm，例如5-15μm，例如8-12μm。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物磚的殼層的厚度可以為約0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、或50μm。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的生物磚的殼層的厚度可以為0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層和/或殼層還包含額外的試劑，例如，營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和/或藥物活性成分。優(yōu)選地，所述額外的試劑能夠調(diào)控(例如促進)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層包含至少一種(例如1、2、3、4、5或更多種)能夠調(diào)控(例如促進)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的額外的試劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核層能夠以受控的方式釋放所述額外的試劑。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述營養(yǎng)物質(zhì)包括但不限于，微量元素，核苷酸，氨基酸，多肽，碳水化合物(例如單糖，寡糖，多糖)，脂質(zhì)，維生素等。

在某些優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)選自多糖，例如糖胺聚糖、蛋白聚糖；結(jié)構(gòu)蛋白，例如膠原和彈性蛋白；粘著蛋白，例如纖粘連 蛋白和層粘連蛋白。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞因子可以是用于調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的細(xì)胞因子，包括但不限于：

-與細(xì)胞生長相關(guān)的細(xì)胞因子，例如胰島素、類胰島素生長因子(如igf-ⅰ、igf-ⅱ)、轉(zhuǎn)化生長因子(如tgfα和tgfβ)、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、成纖細(xì)胞生長因子、血小板來源生長因子、骨肉瘤來源生長因子、生長激素釋放抑制因子、神經(jīng)生長因子、白細(xì)胞介素(如il-1、il-11、il-3)、紅細(xì)胞生長素、集落刺激因子、皮質(zhì)醇、甲狀腺素，或其任何組合；

-與細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子，例如oct3/4，sox2，klf4，c-myc，gata4，tsp1，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素c，胰島素，ibmx，吲哚美鋅，血小板衍生生長因子bb(pdgf-bb)，5-氮雜胞苷，或其任何組合；

-與細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞因子，例如環(huán)磷酸腺苷，三磷酸磷脂酰肌醇，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、n-鈣粘蛋白，核因子κb，骨連接素，血栓素a2，ras，或其任何組合；和/或

-與細(xì)胞新陳代謝相關(guān)的細(xì)胞因子，例如胰島素生長因子1、trip-br2、dkk-1、srankl、opg、tracp-5b、alp、sirt1(2-7)、pgc-1α，pgc-1β、opg、il-3、il-4、il-6、tgf-β、pge2、g-csf、tnf-α，或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物活性成分為能夠調(diào)控(例如促進)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝的試劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物活性成分選自rhil-2、rhil-11、rhepo、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、g-csf、gm-csf、rhuepo、stnf-r1、和rhtnf-α。

本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含的細(xì)胞的數(shù)量可以根據(jù)實際需要進行選擇，而不受特別限制。例如，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚可以包含1-10⁶個細(xì)胞,例如1-10⁵、1-10⁴、1-5000、1-2000、1-1000、10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、 10-100個細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、或2000個細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚可以包含1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000個細(xì)胞。

不受理論限制，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚可以包含任何種類和類型的細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多種類型的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以為細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為粘附細(xì)胞，例如分化的粘附細(xì)胞或未分化的粘附細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為多能干細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述粘附細(xì)胞來源于選自下述的組織：結(jié)締組織(例如，疏松結(jié)締組織、致密結(jié)締組織、彈性組織、網(wǎng)狀結(jié)締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經(jīng)組織和上皮組織(例如，單層上皮和復(fù)層上皮)、內(nèi)胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述粘附細(xì)胞選自肌肉細(xì)胞(例如，骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(例如，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或淋巴組織的細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、腎細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、實質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、未分化的細(xì)胞(如干細(xì)胞和祖細(xì)胞)、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞、外胚層來 源的細(xì)胞、癌來源的細(xì)胞，細(xì)胞系、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips)、或其任何組合。

可根據(jù)實際需要來選擇合適的細(xì)胞。例如，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含心肌細(xì)胞，并且其用于產(chǎn)生心臟組織。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并且其用于產(chǎn)生血管。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含內(nèi)皮細(xì)胞，并且其用于產(chǎn)生皮膚組織。

本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的尺寸可以根據(jù)實際需要進行選擇，而不受特別限制。球形生物磚的尺寸通?？梢酝ㄟ^其直徑來進行明確定義。在嚴(yán)格定義的情況下，術(shù)語“直徑”不能用于描述非球形的結(jié)構(gòu)。然而，在本發(fā)明中，也使用術(shù)語“直徑”來描述非球形的生物磚的尺寸。在此情況下，術(shù)語“直徑”表示，與非球形的生物磚具有相同體積的球形核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚生物磚的直徑。換言之，在本發(fā)明中，使用球形核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的直徑來描述具有相同體積的非球形的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的尺寸。因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)可以為20-2500μm，例如20-2300μm，25-2100μm，30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)可以為20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、或1000-2000μm。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的尺寸(即，本文所定義的直徑)為至少20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。

在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚為固體或半固體。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚為凝膠態(tài)。例如，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚的核層和/或殼層可以為凝膠態(tài)。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚包含水凝膠。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述水凝膠包含海藻酸鹽，瓊脂糖，明膠，殼聚糖，或其它水溶性或親水性聚合物。

在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚能夠減少細(xì)胞在生物打印過程中受到的機械損傷。例如，在某些優(yōu)選的實施方案中，在使用相同生物打印機和相同打印條件的情況下，與將細(xì)胞直接用于生物打印相比，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚能夠減少細(xì)胞受到的機械損傷至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、80％、或90％。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚能夠在生物打印過程中保留核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)的細(xì)胞的生物活性(例如，增殖、分化、遷移、分泌和/或新陳代謝)。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的細(xì)胞在生物打印后存活至少24小時。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少90％的細(xì)胞在生物打印后存活至少3小時、6小時、12小時、1天、2天、4天、或7天。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的細(xì)胞在生物打印24小時后能夠增殖和/或分化。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的細(xì)胞在生物打印24小時后具有正常的新陳代謝。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的細(xì)胞在生物打印24小時后能夠遷移。在某些優(yōu)選的實施方案中，核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的細(xì)胞在生物打印24小時后能夠分泌。

本發(fā)明的生物磚的示意性結(jié)構(gòu)示于圖7中。如圖1所示，本發(fā)明的 生物磚包括：細(xì)胞，其能夠進行生長、增殖、分化或遷移；包裹所述細(xì)胞的核層，其由生物可降解材料制成，并且為細(xì)胞的生命活動提供所需的物質(zhì)；和，封裝所述細(xì)胞和核層的殼層，其位于最外側(cè)，由生物可降解材料制成，并且為內(nèi)部的核層和細(xì)胞提供力學(xué)保護。在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞可均勻分散于核層中，或者可以聚集在一起，位于核層內(nèi)部。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的生物磚。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包含生物磚和載體(所述載體優(yōu)選包含生物粘合劑)。特別優(yōu)選地，此類組合物可用作生物墨汁，用于生物打印。因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種生物墨汁，其包含本發(fā)明的生物磚，以及任選的載體(所述載體優(yōu)選包含生物粘合劑)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體包含生物粘合劑，或者由生物粘合劑組成。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)及其降解產(chǎn)物對于細(xì)胞是無毒的，和/或?qū)τ谒拗魇欠敲庖咴缘?。在某些?yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)包含生物可降解材料。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料是生物相容性的。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料的降解能夠提供維持或促進生物磚內(nèi)的細(xì)胞的生命活動的物質(zhì)。在某些優(yōu)選的實施方案中，降解產(chǎn)物為小分子化合物，例如有機酸、單糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂質(zhì)等。此類降解產(chǎn)物可參與到細(xì)胞的新陳代謝活動中(例如用于合成細(xì)胞外基質(zhì))，用于合成細(xì)胞外基質(zhì)或轉(zhuǎn)化為活動所需的能量。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料是天然存在的(例如來源于動植物的天然存在的生物可降解材料，例如膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，瓊脂糖，明膠，葡聚糖，以及其任意組合)，人工合成的，重組產(chǎn)生的，或者其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料是天然存在的可降解聚合物。優(yōu)選地，所述可降解聚合物選自膠原蛋白，纖維蛋白，殼聚糖，海藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸，層粘連蛋白，明膠，葡聚糖，彈性蛋白，以及其任意組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料是合成的可降解聚合物。此類可降解聚合物包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(pla)，聚羥基乙酸(pga)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)，聚原酸酯(poe)，聚己內(nèi)酯(pcl)，聚羥基丁酸酯(phb)，聚氨基酸(polyaminoacid)，可降解性聚氨酯，以及其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)中的生物可降解材料選自膠原、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、淀粉、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、彈性蛋白、明膠、聚氨基酸、瓊脂、葡聚糖、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯酰胺、聚n-取代丙烯酰胺或其任何組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)包含海藻酸鈉。

在某些優(yōu)選的實施方案中，與生物磚的核層或殼層相比，所述載體(例如生物粘合劑)以不同的濃度包含相同的生物可降解材料，或者以不同的重量比包含相同的生物可降解材料的組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，與生物磚的核層或殼層相比，所述載體(例如生物粘合劑)包含不同的生物可降解材料。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體還包含水，無機鹽，ph緩沖劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)促進生物磚在構(gòu)建體(例如三維構(gòu)建體，組織前體，或組織)上的安置，和/或?qū)⑸锎u固定在構(gòu)建體(例如三維構(gòu)建體，組織前體，或組織)上。

在某些優(yōu)選的實施方案中，載體(例如生物粘合劑)為液體或半液體(例如凝膠)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)的粘度為1-1000pas，例如30-160pas。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述 載體(例如生物粘合劑)的粘度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、50、80、100、200、300、400、500、800、或1000pas。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述載體(例如生物粘合劑)的粘度為1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160pas、或30-160pas。

發(fā)明的有益效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的方法不涉及復(fù)雜步驟和儀器、操作性和應(yīng)用性強，可適用于由各種芯材制備的核-殼結(jié)構(gòu)。

(2)本發(fā)明的方法可以在不使用固化劑的情況下利用疏水作用使液滴成型。

(3)通過本發(fā)明的方法制備的核-殼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)品的制備效率高。當(dāng)所制備的核-殼結(jié)構(gòu)用于包裹細(xì)胞時，充分和完整包裹的殼結(jié)構(gòu)給細(xì)胞提供了有效的力學(xué)保護，有效地減少或避免細(xì)胞遭受外界的機械損傷/力學(xué)損傷(例如，在生物打印過程中)，從而確保了細(xì)胞在打印過程中存活率。

(4)本發(fā)明的方法可通過精確調(diào)節(jié)和控制所吸取的芯材和壁材的量，有效控制核-殼結(jié)構(gòu)的尺寸、核殼層數(shù)以及殼層厚度。因為這種方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好，所以可以批量化制備產(chǎn)品。

(5)本發(fā)明的方法由于無需施加振動或電壓脈沖即可實現(xiàn)小的液滴尺寸，從而可以兼顧細(xì)胞液滴尺寸和細(xì)胞活性，例如能夠制備粒徑低至約100μm的核-殼結(jié)構(gòu)。

具體實施方式

現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實施例來描述本發(fā)明。

實施例中未指明其來源的試劑、試劑盒或儀器均為市場上商購可 得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護的范圍。

實施例1超疏水表面的制備

在本發(fā)明的方法中使用的超疏水表面可以采用下列方法制備：

在超凈室內(nèi)將u型底孔板用酒精、丙酮浸泡或擦洗進行清潔除塵后，用浸泡、噴槍噴涂等方式將超疏水涂料涂布至孔板內(nèi)壁以形成超疏水涂層，然后在恒溫箱加熱烘干。

在本發(fā)明的方法中使用的超疏水表面也可以采用下列方法制備：

在超凈室內(nèi)將u型底孔板用酒精清洗干凈后，將u型底孔板置于過氧化氫/濃硫酸溶液(30％(v/v)h2o2:h2so4＝1:3)中，于80℃反應(yīng)1小時，以進行羥基化處理。將羥基化的u型底孔板放入濃度為1％(v/v)的1h,1h,2h,2h-全氟癸基三乙氧基硅烷(sigma)溶液中12h，再在100℃烘箱中加熱4h，以進行硅化處理。最后，清洗u型底孔板并風(fēng)干。

在本發(fā)明的方法中使用的超疏水表面也可以采用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備超疏水表面的方法制備得到，或者也可通過商業(yè)購買得到。

實施例2.細(xì)胞生存率/活力檢測方法

在本實驗中，通過染色法檢測了核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚內(nèi)的細(xì)胞活性。所使用的試劑如下：

鈣黃綠素caam(公司：invitrogen，貨號：c3100mp)，其用于活細(xì)胞染色，能夠?qū)?xì)胞漿進行標(biāo)記，顯示綠色熒光。使用方法：用10uldmso溶解50ug鈣黃綠素，然后添加10mlpbs并混勻。所獲得的溶液中鈣黃綠素的終濃度為5mmol/l。

碘化丙啶核酸染料(公司：invitrogen，貨號：p1304mp)，其用于死細(xì)胞染色，能夠?qū)?xì)胞核進行標(biāo)記，顯示紅色熒光。使用方法：用雙蒸水將碘化丙啶核酸染料稀釋至1mg/ml，用作儲存液；然后用pbs 將儲存液以1:3000的比例稀釋至終濃度500nm，用作工作液。

染色方法如下：

將所制備的核-殼結(jié)構(gòu)或生物磚置于1mlcaam中，于37℃孵育1h；然后加入1ml碘化丙啶核酸染料，染色15min。之后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物磚的染色結(jié)果。高亮點為紅色熒光(代表死細(xì)胞)，低亮點為綠色熒光(代表活細(xì)胞)。使用imageproplus軟件，對紅色和綠色熒光進行顏色聚類統(tǒng)計，并計算紅光斑和綠光斑的數(shù)量、面積、平均光密度、直徑、累計光密度，由此確定紅、綠像素點的個數(shù)，并計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率＝活細(xì)胞數(shù)量/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))。

實施例3.400μm膠原-聚賴氨酸核殼結(jié)構(gòu)的制備

本實施例通過本發(fā)明的方法制備尺寸約為400μm、包裹細(xì)胞的核-殼結(jié)構(gòu)，其步驟如下：

1、制備u型底超疏水孔板：在超凈室內(nèi)將u型底孔板用酒精清洗干凈后，將u型底孔板置入過氧化氫/濃硫酸溶液(30％(v/v)，h2o2:h2so4＝1:3)中，80℃反應(yīng)1小時，以進行羥基化處理。將羥基化的u型底孔板放入濃度為1％的1h,1h,2h,2h-全氟癸基三乙氧基硅烷(sigma)溶液中12h，再在100℃烘箱中加熱4h，以進行硅化處理。最后，清洗u型底孔板并風(fēng)干。

2、制備含細(xì)胞的膠原溶液：將120μlnaoh溶液(1mol/l)與750μli型膠原(4mg/ml)混合，然后向其中加入130μl經(jīng)trackercm-dil標(biāo)記的大鼠msc細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1x10⁵個/ml，懸浮于pbs中)，獲得混合了細(xì)胞的膠原溶液。

3、制備聚賴氨酸-fitc溶液：將經(jīng)fitc(綠色熒光)標(biāo)記的聚賴氨酸(sigma，數(shù)均分子量mn為150,000-300,000)溶于ph7.2的dmem高糖培養(yǎng)基，得到濃度為0.05wt％的聚賴氨酸溶液。

4、膠原滴加(形成核層結(jié)構(gòu))：采用能夠吸取和排出納升級液體的電子式吸取裝置(例如eppendorfxplorer0.5-10ul或transferpetteelectronic0.5-10ul，借助他們的分液功能，每分液量最低可達到0.1μ l；或者采用sge自動進樣器1μl或0.5μl，可分別實現(xiàn)10次和5次的0.1μl液體滴定，特殊地，可選用錐形特質(zhì)針頭進行滴定，提高精確度。)精密吸取0.1μl步驟2制備的i型膠原溶液，滴入步驟1制備的u型底超疏水孔板中，形成液滴，在37℃恒溫保持30min，使其成型。

5、滴加聚賴氨酸-fitc溶液(殼層結(jié)構(gòu))：更換吸頭后，精密吸取0.5μl步驟3制備的聚賴氨酸-fitc溶液，在超疏水孔板中央位置將其滴入步驟4中成型的核層表面，反應(yīng)10min，以形成核-殼結(jié)構(gòu)。

6、從孔板中收集所制備的核-殼結(jié)構(gòu)，并使用激光共聚焦顯微鏡來觀察所制備的核-殼結(jié)構(gòu)以及通過實施例2描述的方法測試細(xì)胞的生存率。

結(jié)果：

使用該方法得到的核-殼結(jié)構(gòu)具有單層殼結(jié)構(gòu)，其中核層結(jié)構(gòu)通過溫度控制的方式使核層材料膠原成型。所制備得到的核-殼粒徑為約400μm(圖6a，標(biāo)尺為100μm)。在圖6a中，綠色部分代表該核-殼結(jié)構(gòu)的殼層。從圖中可以看出，壁材(殼層)能夠均勻包裹在芯材(核層)表面。所制備得到的核-殼結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的細(xì)胞生存率為97％以上。

實施例4.800μm聚氨酯-海藻酸鈉核殼結(jié)構(gòu)的制備

本實施例通過本發(fā)明的方法制備尺寸約為800μm、包裹細(xì)胞的核-殼結(jié)構(gòu)，其步驟如下：

1、制備u型底超疏水孔板：在超凈室內(nèi)將u型底孔板用酒精清洗干凈后，將u型底孔板置入過氧化氫/濃硫酸溶液(30％(v/v)，h2o2:h2so4＝1:3)中，80℃反應(yīng)1小時，以進行羥基化處理。將羥基化的u型底孔板放入濃度為1％(v/v)的1h,1h,2h,2h-全氟癸基三乙氧基硅烷(sigma)溶液中12h，再在100℃烘箱中加熱4h，以進行硅化處理。最后，清洗u型底孔板并風(fēng)干。

2、制備含細(xì)胞的聚氨酯溶液：

在裝有機械攪拌、溫度計的三口燒瓶中，加入20g聚己內(nèi)酯(pcl2000,sigma)和7.5g聚乙二醇(peg1450,sigma)。脫水2h后， 冷卻到70℃。在n2保護下，將9.99g異氟爾酮二異氰酸酯(ipdi,sigma)和占原料總量0.5wt‰的催化劑辛酸亞錫(sigma)加入反應(yīng)瓶，70-75℃反應(yīng)1h。接著，將1.01g擴鏈劑(1,4-丁二醇，bdo)加入反應(yīng)體系，60-65℃反應(yīng)2h。然后，將所獲得的預(yù)聚物倒入高速攪拌的l-賴氨酸(1.64g)水溶液中乳化，同時，將稀釋的氫氧化鈉(0.45g)溶液逐滴滴入乳化物中以中和l-賴氨酸中的羧基。最后，在室溫下高速攪拌乳化2h，得到聚氨酯水乳液。

取850μl聚氨酯水乳液與150μl血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1x10⁵個/ml，懸浮于pbs中)混合，使細(xì)胞均勻分散，得到1ml混合了細(xì)胞的聚氨酯水乳液。

3、制備海藻酸鈉溶液：將海藻酸鈉溶于去離子水中，得到濃度為2wt％的海藻酸鈉溶液。

4、聚氨酯水乳液滴加(形成核層結(jié)構(gòu))：采用能夠吸取和排出納升級液體的電子式吸取裝置(例如eppendorfxplorer0.5-10ul或transferpetteelectronic0.5-10ul，借助他們的分液功能，每分液量0.25μl；或者采用sge自動進樣器1μl，可實現(xiàn)4次液體滴定，特殊地，可選用錐形特質(zhì)針頭進行滴定，提高精確度。)精密吸取0.25μl步驟2制備的聚氨酯水乳液，滴入步驟1制備的u型底超疏水孔板中，形成液滴。

5、滴加海藻酸鈉溶液(殼層結(jié)構(gòu))：更換吸頭后，精密吸取0.5μl步驟3制備的海藻酸鈉溶液，在超疏水孔板中央位置將其滴入步驟4中液滴表面，反應(yīng)10min，以形成核-殼結(jié)構(gòu)。

6、氯化鈣滴加：向步驟5中反應(yīng)后的核-殼結(jié)構(gòu)表面滴入0.5μlcacl2溶液(0.1mol/l)，反應(yīng)5min。

7、從孔板中收集所制備的核-殼結(jié)構(gòu)，并使用顯微鏡來觀察所制備的核-殼結(jié)構(gòu)以及通過實施例2描述的方法測試細(xì)胞的生存率。

結(jié)果：

使用該方法制備得到的核-殼結(jié)構(gòu)具有單層殼結(jié)構(gòu)，其中核層材料聚氨酯溶液在超疏水板上以液滴形式存在，其無需恒溫或其它額外成 型步驟。直接在該液滴表面滴加殼層材料海藻酸鈉溶液后，在殼層材料表面再滴加氯化鈣溶液(0.1m)使得該核-殼結(jié)構(gòu)成型。制備得到的核-殼粒徑為約800μm(圖6b，標(biāo)尺為100μm)。在圖6b中，高亮部分代表核-殼結(jié)構(gòu)的殼層。從圖中可以看出，壁材(殼層)均勻包裹在芯材(核層)表面。所制備得到的核-殼結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的生存率為98％以上。

實施例5.100μm膠原-聚賴氨酸-海藻酸鈉多層核殼結(jié)構(gòu)的制備

本實施例通過本發(fā)明的方法制備尺寸約為100μm、包裹細(xì)胞的多層核-殼結(jié)構(gòu)，其步驟如下：

1、制備u型底超疏水孔板：在超凈室內(nèi)將u型底孔板用酒精清洗干凈后，將u型底孔板置入過氧化氫/濃硫酸溶液(30％(v/v)，h2o2:h2so4＝1:3)中，80℃反應(yīng)1小時，以進行羥基化處理。將羥基化的u型底孔板放入濃度為1％的1h,1h,2h,2h-全氟癸基三乙氧基硅烷(sigma)溶液中12h，再在100℃烘箱中加熱4h，以進行硅化處理。最后，清洗u型底孔板并風(fēng)干。

2、制備含細(xì)胞的膠原溶液：將120μlnaoh溶液(0.1m)與750μli型膠原(4mg/ml)混合，然后向其中加入130μl血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1x10⁵個/ml，懸浮于pbs中)，獲得混合了細(xì)胞的膠原溶液。

3、制備海藻酸鈉溶液：將海藻酸鈉溶于dmem高糖培養(yǎng)基中，得到濃度為0.03wt％的海藻酸鈉溶液。

4、制備聚賴氨酸溶液：將聚賴氨酸(sigma，數(shù)均分子量mn為150,000-300,000)溶于ph7.2的dmem高糖培養(yǎng)基，得到濃度為0.05wt％的聚賴氨酸溶液。

5、膠原滴加(形成核層結(jié)構(gòu))：采用能夠吸取和排出納升級液體的電子式吸取裝置(例如微流控芯片裝置)精密吸取2nl步驟2制備的i型膠原溶液，滴入步驟1制備的u型底超疏水孔板中，形成液滴，在37℃恒溫保持30min，使其成型。

6、滴加聚賴氨酸溶液(第一殼層結(jié)構(gòu))：更換吸頭后，精密吸取0.1μl步驟4制備的聚賴氨酸溶液，在超疏水孔板中央位置將其滴入步驟5中成型的核層表面，反應(yīng)10min，以形成核-殼結(jié)構(gòu)。

7、清洗步驟：滴加入1μl無血清dmem培養(yǎng)基清洗2遍，去掉多余的聚賴氨酸溶液溶液。

8、滴加海藻酸鈉溶液(第二殼層結(jié)構(gòu))：吸取1μl步驟3制備的海藻酸鈉溶液，在超疏水孔板中央位置將其滴至步驟7中經(jīng)清洗的核-殼結(jié)構(gòu)的表面，然后反應(yīng)10min。

9、從孔板中收集所制備的核-殼結(jié)構(gòu)，并使用顯微鏡來觀察所制備的核-殼結(jié)構(gòu)以及通過實施例2描述的方法測試細(xì)胞的生存率。

結(jié)果：

使用該方法得到的核-殼結(jié)構(gòu)具有雙層殼結(jié)構(gòu)，其中核層結(jié)構(gòu)通過溫度控制的方式使核層材料成型，所獲得的核-殼結(jié)構(gòu)的粒徑為約100μm。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對細(xì)節(jié)進行各種修改和變動，并且這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。