本發(fā)明涉及一種用于確定層析柱的結(jié)合容量的方法、層析系統(tǒng)以及用于控制層析系統(tǒng)的方法。

背景技術(shù)：

用于溶質(zhì)的層析柱的結(jié)合容量是過程層析中的很重要因素。結(jié)合容量直接地影響層析步驟的生產(chǎn)率和成本。結(jié)合容量按照動態(tài)/穿透容量限定或限定為最大結(jié)合容量。動態(tài)容量取決于溶液流過裝填有層析介質(zhì)的柱所處的條件，諸如，限定為柱容積和供給流率之間的比率的停留時間。如果停留時間無限長，則最大結(jié)合容量代表柱的穿透容量。初始穿透容量限定為在溶質(zhì)首次在流出物中探測到的時間點處由柱占有的結(jié)合溶質(zhì)的量。穿透容量還可限定為給定穿透百分比下的容量，其中百分比代表以供給中存在的溶質(zhì)的百分比表達的來自柱中的流出物中存在的結(jié)合溶質(zhì)的量。根據(jù)此限定，最大結(jié)合容量將等于100%穿透下的穿透容量，即，沒有更多溶質(zhì)可結(jié)合至柱的點。因此，為了確定最大容量，穿透容量在不同的穿透水平下測量，其中該水平由樣本加載期間在來自柱的流出物中測得的溶質(zhì)的濃度的水平限定。通常，這些濃度由放置在流出物管線中的探測器連續(xù)地監(jiān)測穿過的流中的信號來確定。這些濃度(信號)相對于時間(或加載的容積或質(zhì)量)的圖表稱為穿透曲線。層析圖上的穿透的位置和其形狀關(guān)于多少溶質(zhì)可結(jié)合在柱上，以及所有吸附位點多快溶質(zhì)飽和。其還示出了在任何給定時間還有多少溶質(zhì)可結(jié)合至柱。

存在雜質(zhì)時的溶質(zhì)的穿透結(jié)合容量是開發(fā)純化規(guī)程時優(yōu)化的最關(guān)鍵參數(shù)之一。由于雜質(zhì)大多數(shù)具有與溶質(zhì)類似的光吸收性能，故確定結(jié)合穿透容量是冗長且艱苦的工作。在典型的實驗中，來自柱的流出物以一系列小部分收集，其隨后使用高分辨率的技術(shù)(諸如hplc)來針對溶質(zhì)分析。因此，確定層析柱的結(jié)合容量是相當復雜的。在供給溶液濃度在供給施加到層析柱上期間隨機變化的情況下，真實的穿透容量不可能測量到。如果一個人想要在最佳過程條件下操作柱，則后者是很重要的。例如，可示出在某些條件下，當所關(guān)心的溶質(zhì)在柱流出物中達到其濃度的某一值(例如，其初始濃度的10%)時，獲得捕集層析步驟的最大生產(chǎn)率。如果穿透容量根據(jù)上文描述的方法確定，而如果供給濃度或過程條件(包括流率和/或?qū)游鼋橘|(zhì)性能)以不可預計的方式隨時間變化，則不可能在準確的10%穿透下終止柱的加載。

此外，在變化的過程條件下確定不同穿透水平的穿透容量在連續(xù)層析的情況下很重要。

在連續(xù)層析中，若干相同的柱以允許柱取決于方法要求而串聯(lián)和/或并聯(lián)操作的布置來連接。因此，所有柱都可在原則上同時運行，但方法步驟略微移位。程序可重復，使得各個柱在過程中加載、洗脫和再生若干次。相比于'常規(guī)'層析，其中單個層析循環(huán)基于若干連貫的步驟，諸如，加載、清洗、洗脫和再生，在基于多個相同的柱的連續(xù)層析中，所有這些步驟同時發(fā)生，但各自在不同的柱上。連續(xù)層析操作導致層析樹脂的較好使用、減少處理時間和降低緩沖物要求，它們所有都有益于過程經(jīng)濟性。有時，連續(xù)層析稱為模擬移動床(smb)層析。模擬移動床層析是周期逆流過程的示例，因為包括該系統(tǒng)的所有層析柱都周期地同時沿與樣本流相對的方向移動。柱的明顯移動通過至/從柱的入口和出口流的適當再引導來實現(xiàn)。

bishop等人("simulatedmovingbedtechnologyinbiopharmaceuticalprocessing"，bischops,m.和pennings,m.,recoverybiologicalproductsxi,(2003)banff,alberta,canada)公開了一種基于模擬移動床(smb)技術(shù)的連續(xù)層析方法，其成功地用于利用蛋白a親和樹脂的實驗室規(guī)模的igg純化。盡管實際上由smb提供的多柱和多區(qū)域連續(xù)途徑極大地提高過程效率，但smb系統(tǒng)迄今并未用于大規(guī)模的cgmp生物制藥生產(chǎn)，主要是因為從硬件和操作視角兩者的系統(tǒng)復雜性。操作視角是特別受關(guān)注的，因為連續(xù)方法更復雜，且需要許多操作(步驟)來在很精確預先限定的時間點同時發(fā)生。相比于批量層析，解決過程可變性的安全因素的實施對于連續(xù)過程不是推薦的，因為按限定，它們依據(jù)只有對系統(tǒng)的輸入沒有可變性時才建立的穩(wěn)態(tài)的假定來操作。

heeter等人(heeter,g.a.和liapis,a.i.,j.chroma,711(1995))提出了作為典型四區(qū)域smb系統(tǒng)的備選的基于三柱周期逆流層析(3c-pcc)原理的方法。后來，lacki等人("proteinacounter-currentchromatographyforcontinuousantibodypurification"，lacki,k.m.和bryntesson,l.m.,acs(2004)anaheim,causa)描述了使用此3c-pcc系統(tǒng)來用于igg吸附至mabselect^tm親和樹脂。該3c-pcc方法需要比典型四區(qū)域smb系統(tǒng)較簡單的硬件和較容易的操作，直接地降低與固定設備和系統(tǒng)維護相關(guān)聯(lián)的成本。

實際上，模擬移動床技術(shù)已經(jīng)在各種其他領(lǐng)域中使用了幾十年。例如，us3291726(universaloilproducts)早在1966年就描述了用于石油化學工業(yè)的連續(xù)模擬逆流吸附過程。

歷史上，可靠的連續(xù)過程的基本因素是：1)使用的柱的質(zhì)量，且更具體是柱之間的類似性或甚至等同性，2)恒定的供給成分，以及3)硬件可靠性，更具體是由泵輸送的恒定流率。如果柱不是相同的，則通常用于設計連續(xù)層析過程的理論計算將是不正確的，且設置有效且穩(wěn)健的連續(xù)層析過程將變得很難。如果供給濃度和流率以非預期方式隨時間變化，則同理適用。因此，對于以相同的柱擴大規(guī)模的考慮，系統(tǒng)中的可靠的泵是基本的。然而，為了獲得可重復的結(jié)果，向柱裝填層析介質(zhì)很復雜。板的數(shù)目或其他裝填性能的甚至很小的差異都可對最終結(jié)果具有巨大影響。此外，由于層析樹脂的容量通常在樹脂壽命/使用期間改變，故針對新鮮樹脂選擇的過程條件將不適用于已經(jīng)使用若干次的樹脂。如果供給溶液濃度也將變化，則設計將一直在其最佳值操作的有效連續(xù)層析過程將甚至更復雜。

最近，bangtssonp.等人提供了一種探測層析柱變得飽和至將滿足過程目標(例如，產(chǎn)量或生產(chǎn)率)的水平時的時間點的方法(us20120091063)。在該方法中，飽和水平的探測基于加載柱之前和之后的來自供給和流出物的uv信號的比較。盡管已經(jīng)證實該解決方案對于許多分離任務是穩(wěn)健的，但對于產(chǎn)物濃度較低和/或雜質(zhì)濃度較高的情況，該方法的高適用性可證實為受限的。需要的是開發(fā)一種可有效地監(jiān)測無論是單柱設置還是多柱系統(tǒng)中的層析介質(zhì)的飽和水平的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于確定和監(jiān)測柱中的層析介質(zhì)的飽和水平/結(jié)合容量的可靠和動態(tài)的方法。

因此，一方面，本發(fā)明提供了一種監(jiān)測柱中的層析介質(zhì)的飽和水平的方法，該方法包括：測量未加載柱的入口處的第一壓力；測量加載柱的入口處的第二壓力；以及比較第一壓力測量結(jié)果和第二壓力測量結(jié)果來確定層析介質(zhì)的飽和水平。

在某些實施例中，通過連續(xù)測量第二壓力，在層析過程期間連續(xù)地監(jiān)測飽和水平。在某些實施例中，該方法還包括將壓力差計算為層析過程期間的兩個不同時間點處的第一壓力和第二壓力之間的差異；以及使用壓力差來確定柱的飽和點(f)。

在某些實施例中，該方法還包括：分別測量來自未加載柱和加載柱的流出物管線的壓力；以及通過利用來自流出物管線的對應壓力調(diào)整第一壓力和第二壓力來生成未加載柱和加載柱的校正的壓力；其中比較步驟比較校正的第一壓力和第二壓力。

在某些實施例中，該方法還包括：測量來自周期逆流pcc系統(tǒng)中的各個層析柱的第一壓力和第二壓力，以及與第一壓力一起使用這些第二壓力來在層析過程期間連續(xù)地確定pcc系統(tǒng)的不同層析柱的飽和水平。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種層析系統(tǒng)來實現(xiàn)確定和監(jiān)測柱中的層析介質(zhì)的飽和水平/結(jié)合容量的方法。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了一種包括至少一個層析柱的層析系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包括：適于在供給泵和該至少一個柱的入口之間測量供給管線處的第一壓力和第二壓力的第一探測器，其中第一壓力針對未加載柱測量且第二壓力針對加載柱測量；適于測量來自系統(tǒng)的第一柱的流出物管線處的壓力的可選的第二探測器；以及連接到探測器上且適于基于比較第一壓力和第二壓力來確定第一柱的飽和水平的確定單元。

在某些實施例中，層析系統(tǒng)的確定單元適于在層析過程期間基于由第一探測器和/或第二探測器測得的壓力來連續(xù)地確定該至少一個柱的飽和水平。在某些實施例中，確定單元進一步適于將壓力差計算為層析過程期間的兩個不同時間點處的第一壓力和第二壓力之間的差異；以及使用壓力差來確定柱的飽和點。在某些實施例中，確定單元適于使用測得的壓力來針對各個柱確定校正的第一壓力和第二壓力，其分別為來自供給管線的第一壓力和第二壓力減去流出物管線處的壓力；以及比較校正的第一壓力和第二壓力。在某些實施例中，確定單元進一步適于將壓力差計算為層析過程期間的兩個不同時間點處的校正的第一壓力和校正的第二壓力之間的差異；以及使用壓力差來確定柱的飽和點。

在某些實施例中，層析系統(tǒng)包括周期逆流系統(tǒng)中的至少兩個柱，且還包括其他探測器，各個其他柱之后各一個探測器，各個其他探測器適于測量來自各個其他柱的流出物管線處的另一壓力，各個探測器連接到確定單元上，確定單元適于在層析過程期間基于由第一探測器、第二探測器和其他探測器測得的壓力連續(xù)地確定各個層析柱的飽和水平。

在某些實施例中，層析系統(tǒng)還包括控制單元，其連接到確定單元上，且適于在層析過程期間連續(xù)地監(jiān)測確定的飽和水平，且取決于確定的飽和水平而實時控制不同層析過程步驟的開始和停止。

在本發(fā)明的一個實施例中，層析系統(tǒng)是周期逆流系統(tǒng)。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于控制層析系統(tǒng)的可靠和動態(tài)的方法。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種用于控制包括至少一個柱的層析系統(tǒng)的方法，其包括以下步驟：根據(jù)本發(fā)明的某些方面確定該至少一個層析柱的飽和水平；以及根據(jù)確定的飽和水平來控制不同層析過程步驟的開始和停止。在某些實施例中，該方法特征在于，在層析過程期間連續(xù)地確定飽和水平，且根據(jù)確定的飽和水平實時控制不同層析過程步驟的開始和停止。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于控制周期逆流層析系統(tǒng)的可靠和動態(tài)的方法。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種用于控制包括至少兩個柱的周期逆流層析系統(tǒng)的方法，包括以下步驟：從系統(tǒng)中的各個柱測量代表未加載柱的第一壓力；從系統(tǒng)中的各個柱測量代表加載柱的第二壓力；根據(jù)本發(fā)明的某些實施例確定各個層析柱的飽和水平；以及取決于確定的飽和水平控制至柱以及柱之間的供給。

在某些實施例中，用于控制周期逆流層析系統(tǒng)的方法特征在于，在層析過程期間連續(xù)地確定飽和水平，以及取決于確定的飽和水平實時控制至柱以及柱之間的供給。

在某些實施例中，用于控制周期逆流層析系統(tǒng)的方法還包括，取決于確定飽和水平來控制供給泵和緩沖物泵的流率。

在某些實施例中，用于控制周期逆流層析系統(tǒng)的方法還包括，通過根據(jù)確定的飽和水平調(diào)整不同的柱應當在加載區(qū)域多久和處于哪個位置來補償不同的柱性能和/或流率的任何差異。

附圖說明

圖1示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的包括一個層析柱和兩個探測器的層析系統(tǒng)。

圖2為根據(jù)圖1的層析系統(tǒng)設計的比較從探測器獲得的uv信號對壓力信號的圖表。

圖3示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的包括四個探測器的三柱周期逆流(3c-pcc)系統(tǒng)。

圖4a、b和c示意性地示出了圖3的三個閥。

圖5為比較從3c-pcc系統(tǒng)中的三個探測器獲得的uv信號對壓力信號的圖表。實線：uv信號；虛線：壓力信號。

具體實施方式

為了避開關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)所述論述的困難，由本發(fā)明提供基于類反饋控制原理的實時控制算法。因此，用于在該過程的任何給定時刻評估不同的柱的狀態(tài)的方法是特別關(guān)注的。例如，獲知特定穿透水平下的層析柱的結(jié)合容量將允許一個人評估柱是否還可結(jié)合溶質(zhì)以及在柱達到完全飽和之前還可結(jié)合多少溶質(zhì)。類似地，從過程產(chǎn)量視角看首要關(guān)注的是獲知是否達到初始穿透容量，因為在該點上，將在來自柱的流出物流中發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)，且如果不采取適當?shù)膭幼?，則將導致浪費，或?qū)⑴c其他非結(jié)合的成分收集在一起。

因此，本發(fā)明的實施例提供了一種基于監(jiān)測飽和的柱上的壓力降低和使用該信息來探測期望的穿透點而探測柱飽和水平或穿透的方法。這可通過(1)探測壓力降低的確切值，或(2)探測隨時間和/或施加的容積或質(zhì)量變化的壓力降低的變化速率來實現(xiàn)。本發(fā)明的另一個實施例提供了一種用于探測柱飽和水平或穿透的較簡單的方法。因此，探測可基于將來自未加載柱的壓力與加載柱的壓力相比較。"未加載柱"意思是未加載待分離的樣本或在目標化合物或雜質(zhì)的任何穿透之前不久的相同的柱。備選地，"未加載柱"可為裝填與分離柱相同類型的樹脂且與相同的柱平衡緩沖物平衡的相同的柱。

圖1示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例的簡單層析系統(tǒng)的一部分。該層析系統(tǒng)包括一個層析柱1。它還包括連接到層析柱1的入口端5上的供給管線3。待經(jīng)過柱1的樣本可穿過供給管線3加入。該系統(tǒng)還包括連接到相對端(即，層析柱1的出口端7)上的流出物管線9。經(jīng)過層析柱1的樣本可經(jīng)過流出物管線9。層析系統(tǒng)包括沿供給管線3定位在某處(優(yōu)選接近柱1的入口端5)的第一探測器11。第一探測器11適于探測供給管線中的信號。此外，層析系統(tǒng)包括第二探測器13，其沿流出物管線9定位在某處(優(yōu)選接近柱1的出口端7)，且適于探測流出物信號。第一探測器11和第二探測器13適合為相同類型的探測器。在某些實施例中，第一探測器和第二探測器是壓力傳感器，即，測量樣本的壓力。壓力傳感器是公知的，且備選地可稱為壓力換能器、壓力發(fā)射器、壓力發(fā)送器、壓力指示器、壓強計和壓力計等。其他可能類型的探測器測量uv、ph、傳導性、光散射、熒光、ir或可見光。如果系統(tǒng)中的不同探測器不是相同類型的探測器，則探測到的信號在用于根據(jù)本發(fā)明的其他計算時需要關(guān)聯(lián)。

此外，根據(jù)本發(fā)明，第一探測器11和/或第二探測器13連接到確定單元15上。該單元分析第一探測器11和第二探測器13中探測到的信號，以便確定層析柱的結(jié)合容量。

在本發(fā)明的另一個實施例中，相比于圖1中所示的層析系統(tǒng)，該層析系統(tǒng)包括沿供給管線定位在某處(優(yōu)選接近柱的入口端)的單個探測器。該探測器適于在層析過程期間探測供給管線中的壓力信號，而不論是柱未加載時或是柱加載時。在某些實施例中，探測器是壓力傳感器。此外，探測器連接到確定單元上，確定單元分析探測器中探測到的信號，以便確定層析柱的結(jié)合容量和/或飽和水平。

在本發(fā)明的另一個實施例中，相比于圖1和上文所示的備選層析系統(tǒng)，層析系統(tǒng)還可包括沿柱的供給管線定位在某處的另一個探測器。探測器適于探測與供給管線中的壓力不同的信號。此外，層析系統(tǒng)包括另一個探測器，其沿流出物管線定位在某處，且適于探測除壓力外的流出物信號。這些探測器可適合為相同類型的探測器。在某些實施例中，探測器測量uv、ph、傳導性、光散射、熒光、ir或可見光。此外，這些探測器還連接到確定單元上。該單元分析探測到的信號，且與壓力信號一起使用這些信號來評估層析柱的結(jié)合容量和/或飽和水平。

為了展示本發(fā)明的某些實施例，在圖2，以示出一定時間內(nèi)的信號強度的圖表，示出了探測到的壓力信號，且與uv信號相比較。圖2示出了曲線，其代表：前柱uv信號(21，供給信號)、后柱uv信號(25，流出物信號)、和供給管線上測得的壓力信號(28)。

曲線21和25用于確定代表供給中的產(chǎn)物的總濃度的uv值(27)。通過遵循21和25之間的差異的變化，一個人可監(jiān)測來自柱的流出物流中的產(chǎn)物的濃度，且使用其計算柱中產(chǎn)物飽和的水平(us20120091063)。供給信號21基本上是直線，因為供給樣本在該情況下和在該時間窗口期間成分是恒定的。一旦樣本中的一些經(jīng)過柱1且進入第二探測器13定位之處的流出物管線9的通道，則流出物信號23在a點處將從零開始上升。信號然后將上升，直到其變平到穩(wěn)定階段25的點b。該穩(wěn)定階段25在供給中的所有非結(jié)合成分經(jīng)過柱時上升。當信號23又開始上升時，穿透點c在穩(wěn)定階段25之后進一步限定。這是由于實際上，柱1中的層析介質(zhì)開始變得飽和且應當結(jié)合在柱中的樣本的部分中的一些開始穿透柱。當信號23接近信號21時，進一步限定穿透點d。該點限定為飽和點，且代表層析介質(zhì)以樣本的結(jié)合組分幾乎完全飽和的時刻。

曲線28代表柱的供給施加期間在供給管線上測得的壓力的變化。加載階段期間的壓力的穩(wěn)定升高允許了使柱上和/或供給管線中測得的壓力與以產(chǎn)物飽和的柱關(guān)聯(lián)。壓力曲線(28)還可用于探測來自柱的產(chǎn)物的各種穿透水平，例如由點e和f代表的水平，如使用us20120091063中的deltauv方法另外測得的那樣(點c和d)。在一個實施例中，如果uv曲線是已知的，則壓力曲線和uv曲線(25)的穿透部分之間的關(guān)聯(lián)可建立。在另一個實施例中，壓力的變化(曲線28)通過執(zhí)行實驗來與柱飽和水平關(guān)聯(lián)，在實驗中，柱加載不同量的產(chǎn)物，測量壓力，且以從來自柱的流出物收集的小部分來確定產(chǎn)物的濃度。用于層析系統(tǒng)的測得的壓力可例如取決于樹脂的多孔性、樹脂的顆粒尺寸、供給的粘性、柱的長度和寬度而改變。

根據(jù)本發(fā)明，在任何給定的時間點，可計算deltasignal，其限定為例如在給定時間下測得的例如點(e)或(f)處的信號減去之前時間測得的信號(g)之間的信號差異?？捎嬎鉪eltasignalmax，其限定為完全柱飽和下測得的信號減去樣本施加開始(點g)處測得的信號。例如，該deltasignal然后可用于限定飽和點和穿透點的適合水平。穿透點可適合限定為deltasignalmax的某一預先限定的百分比，例如，1%-10%的范圍或更適合是1%-3%的范圍中的某處，且飽和點可適合限定為deltasignalmax的某一預先限定的百分比，例如，60%-90%的范圍或更適合是70%-80%的范圍中的某處。在其他實施例中，穿透點可適合限定為deltasignal的某一預先限定的水平。

確定穿透點和飽和點的該途徑的一個優(yōu)點在于這可自動地實時完成，且其獨立于供給濃度。

在本發(fā)明的另一方面，結(jié)合容量(例如，穿透和飽和點)的這些確定用于自動地控制不同層析過程步驟的開始和停止，即，在已經(jīng)達到某一穿透或飽和點水平時，控制系統(tǒng)可控制層析系統(tǒng)，以進行至下一個過程步驟，諸如，將柱流出物再引導至不同的收集點，或停止加載步驟和開始柱清洗步驟。

在本發(fā)明的另一方面，層析系統(tǒng)包括所謂的周期逆流(pcc)系統(tǒng)中的多于一個層析柱。在周期逆流系統(tǒng)中，大部分時間，供給經(jīng)過串聯(lián)連接的至少兩個柱。該串聯(lián)通常稱為加載區(qū)域，柱加入加載區(qū)域/從加載區(qū)域除去分別基于串聯(lián)的最后的柱和第一柱的預定穿透和飽和點。在圖3中，示意性地示出了包括三個柱的根據(jù)本發(fā)明的此系統(tǒng)。本發(fā)明的益處在該示例中甚至更確切，因為pcc系統(tǒng)中的一個常見問題在于，為了能夠得到有效的系統(tǒng)操作，用于系統(tǒng)中的柱需要盡可能相同，且供給成分和流率應當恒定，或至少其隨過程時間的變化應當預先獲知。利用本發(fā)明，柱結(jié)合容量和/或流率中的任何差異可通過根據(jù)確定的穿透和飽和點調(diào)整不同的柱應當在加載區(qū)域中多久以及處于哪個位置來補償。

在圖3中，供給泵31示為經(jīng)由第一探測器33連接到第一閥組35上。緩沖物泵37也連接到該第一閥組35上。第一閥組35經(jīng)由第一t閥41進一步連接到第一柱39的入口上。第一柱39的出口端通過第二探測器45連接到第二t閥43上。第一閥組35經(jīng)由第二閥組49進一步連接到第二柱47的入口上。第二柱47的出口端經(jīng)由第三探測器53連接到第三閥組51上。此外，第三t閥55連接在第二t閥43和第三閥組51之間。第三t閥55還連接到第四t閥57上，第四t閥57還連接到第一t閥41和第二閥組49上。由此，來自第一柱39的流出物可通過t閥43、55、57和閥組49引導至第二柱47的入口。

此外，第一閥組35經(jīng)由第五t閥61連接到第三柱59的入口上。第三柱59的出口端經(jīng)由第四探測器65連接到第六t閥63上。此外，第七t閥67連接在第三閥組51和第六t閥63之間。第七t閥67還連接到第八t閥69上，第八t閥69還連接到第二閥組49和第五t閥61上。由此，來自第二柱47的流出物可引導至第三柱59的入口。來自第三柱59的流出物可經(jīng)由閥63、67、51、55、57和41引導至第一柱59的入口。第一閥組35的構(gòu)造在圖4a中示意性示出，第二閥組49的構(gòu)造在圖4b中示意性示出，且第三閥組51的構(gòu)造在圖4c中示意性示出。在這些圖中，各組的四個框代表t閥(三通閥)。此外，根據(jù)本發(fā)明，第一探測器33、第二探測器45、第三探測器53和第四探測器65所有都連接到確定單元71上。確定單元適于使用來自探測器的探測到的信號來確定三個不同的柱的穿透和飽和點。確定單元71和所有閥組和t閥和泵進一步連接到控制單元73(所有連接都未在圖中示出)上，控制單元73適于按照何時將柱從加載區(qū)域除去/將柱加入加載區(qū)域、改變流率、開始新清洗步驟等來控制層析系統(tǒng)。探測器33、45、53、65在一個實施例中是壓力傳感器。之前已經(jīng)論述了可用于本發(fā)明的探測器的其他示例。

在本發(fā)明的一個實施例中，在圖3的系統(tǒng)中執(zhí)行的層析過程包括：

(a)利用第一探測器33連續(xù)地監(jiān)測供給管線中、以及來自柱39、47、59(利用第二探測器45、第三探測器53和第四探測器65)中的每一個的流出物中的信號，且計算各個柱39、47、59的校正的信號；

(b)使包括至少一種目標化合物的供給經(jīng)過第一吸附劑(第一柱39中的層析介質(zhì))，且在針對第一吸附劑測得的校正的信號(如上文關(guān)于圖2描述的那樣限定)達到預定值x1時，將來自第一吸附劑的流出物引導至第二吸附劑(第二柱47中的層析介質(zhì))；

(c)將供給再引導至第二吸附劑，且使清洗液體經(jīng)過第一吸附劑，當針對第一吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x2時，目標化合物已經(jīng)結(jié)合第一吸附劑；

(d)將清洗液體流出物引導至第三吸附劑(第三柱59中的層析介質(zhì))，且隨后當針對第二吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x1時，將來自第二吸附劑的流出物引導至第三吸附劑；

(e)再生第一吸附劑；

(f)將供給再引導至第三吸附劑，且使清洗液體經(jīng)過第二吸附劑，當針對第二吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x2時，目標化合物已經(jīng)結(jié)合第二吸附劑；

(g)將清洗液體流出物引導至第一吸附劑，且隨后在針對第三吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x1時，將來自第三吸附劑的流出物引導至第一吸附劑；

(h)再生第二吸附劑；

(i)將供給再引導至第一吸附劑，且使清洗液體經(jīng)過第三吸附劑，當針對第三吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x2時，目標化合物已經(jīng)結(jié)合第三吸附劑；

(j)將清洗液體流出物引導至第二吸附劑，且隨后在針對第一吸附劑獲得的校正的信號達到預定值x1時，將來自第一吸附劑的流出物引導至第二吸附劑；

(k)再生第三吸附劑；

(l)重復步驟(b)-(k)；

其中至少一種目標化合物在步驟(d)、(g)和/或(j)中收集。x1和x2的預定值分別代表穿透和飽和點。

在操作逆流系統(tǒng)時，本發(fā)明允許使用不同的柱，因為柱性能的任何差異可通過基于針對柱中的每一個測得的deltasignal和deltsignalmax自動地調(diào)整穿透和飽和切換點來補償。其還允許了當供給濃度的非預期變化發(fā)生為供給濃度的任何變化時操作逆流系統(tǒng)，且因此加載到各個柱中的質(zhì)量的變化可通過基于deltasignal(其自動地補償加載到柱上的目標量的變化)自動地調(diào)整穿透和飽和切換點來補償。

在本發(fā)明的另一個實施例中，包括多于2個層析柱的層析系統(tǒng)可用于從源自灌注細胞培養(yǎng)的供給流的產(chǎn)物的直接捕集。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，公知的是此流中的組分的濃度將隨時間而變化，且在沒有自動化控制算法的情況下，在沒有由于錯誤地預先分配的再引導點而引起的產(chǎn)物的顯著產(chǎn)物損失的風險的情況下，層析系統(tǒng)的操作將是不可能的。

示例

本示例僅出于示范性目的而提供，且不應當解釋為限制如由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明。

該示例示出了用于使用根據(jù)本發(fā)明的三柱周期逆流(3c-pcc)系統(tǒng)(即，在該示例中，探測器是uv探測器或壓力傳感器)在蛋白a層析樹脂上從包含mab和宿主細胞蛋白的混合物純化單克隆抗體(mab)的連續(xù)主要捕集步驟。更具體而言，三個類似的柱裝填有蛋白a層析樹脂mabselect^tmsurelx(gehealthcarebio-sciences,uppsala,sweden)。柱連接到?kta^tmpcc(gehealthcarebio-sciences,uppsala,sweden)層析系統(tǒng)上，該層析系統(tǒng)配置成三柱周期逆流系統(tǒng)3c-pcc，具有基于三個柱中的每一個之前和之后測得的uv或壓力信號的連續(xù)比較的自動化控制功能。來自各個探測器的吸收率使用unicorn^tm軟件(gehealthcarebio-sciences,uppsala,sweden)記錄。unicorn^tm還用于控制所有泵和閥。來自蛋白a柱mab的洗脫劑收集在單個池中。

以下的單柱層析循環(huán)用作以連續(xù)方式操作三柱?ktapcc系統(tǒng)的基礎(chǔ)：a)與緩沖物a的5柱容積(cv)的柱平衡；2)加載有供給的柱；3)以5cv的緩沖物a的柱清洗；4)以1cv的緩沖物的柱清洗；5)以4cv的緩沖物c的柱洗脫；6)以2cv的緩沖物d的柱剝離；7)以3cv的緩沖物的柱cip。所有步驟在0.94ml/min流率下執(zhí)行。

溶液的成分在以下給出：

緩沖物a：pbs緩沖物，ph7.4

緩沖物b：50mm醋酸鹽緩沖物，ph6

緩沖物c：50mm醋酸鹽緩沖物，ph3.5

緩沖物d：100mm醋酸鹽，ph2.9

緩沖物e：100mmnaoh

供給：包含宿主細胞蛋白質(zhì)的澄清的細胞培養(yǎng)流體中的~2.00g/lmab。

包含供給的幾百毫升的溶液連續(xù)地供給到上文描述的實驗性3c-pcc設置中。供給溶液的吸收率和壓力由定位在供給管線中的第一探測器連續(xù)地測量。純化的mab通過將緩沖物b施加到飽和的柱來以離散方式從系統(tǒng)洗脫。飽和柱在洗脫步驟之前清洗。

圖5示出了使用三柱周期逆流系統(tǒng)在蛋白a柱上連續(xù)捕集單克隆抗體期間獲得的部分數(shù)據(jù)。如針對三個不同的加載循環(huán)測得的隨uv信號變化的壓力的對應變化得到很好記錄。各個循環(huán)結(jié)束時的初始壓力升高和壓力降低由于關(guān)于pcc操作期間的相應流路的打開和閉合的系統(tǒng)配制效果。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的特定實施例，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚的是，可進行變化和改型，而不脫離本發(fā)明的教導內(nèi)容。前面描述和附圖中闡釋的主題僅為了說明提供而不作為限制。在基于現(xiàn)有技術(shù)以其適當?shù)囊暯遣殚啎r，本發(fā)明的實際范圍旨在限定于以下權(quán)利要求中。