相關(guān)申請的交叉參考

本申請要求2014年10月27日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/069,219的優(yōu)先權(quán)，將該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以其完整的形式并入本文作為參考。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于正交分離和分析化合物的混合物的多維色譜系統(tǒng)和方法。公開了示例性的兩向反相液相色譜-超臨界流體色譜系統(tǒng)及其使用方法。

發(fā)明背景

色譜法廣泛應(yīng)用于分離和分析化合物的混合物。由于單向色譜法的峰容量限制，所以已經(jīng)發(fā)明了具有增加的峰容量的多維色譜系統(tǒng)用于分析復(fù)雜的樣品。兩向(2d)色譜技術(shù)尤其是在分析復(fù)雜的混合物中已經(jīng)成為極為普遍的。與單向(1d)色譜法相比，2d色譜技術(shù)具有更高的選擇性和分辨能力，推定保留機(jī)制是互補(bǔ)的。當(dāng)各個分離的選擇性獨(dú)立時(正交)，實(shí)現(xiàn)了在兩向分離系統(tǒng)中的最大峰容量，使得在單向中難以分辨的成分可以在第二維度上得到完全分辨。如果正交分離機(jī)制用于兩向，則該系統(tǒng)的理論峰容量為各個峰容量的乘積。參見giddings，j.c.ana1.chem.1984，56：1258a；giddings，j.c.：cortes，h.j.(ed.)，multidimensionalchromatogra-phy：techniques和applications，marceldekker，newyork1990，p.1；jandera，p.等人，chromatographia2004，60：s27。

然而，對于2d色譜在靈敏度和溶劑兼容性方面存在一些限制。例如，從第一維度上攜帶的流動相通常產(chǎn)生對第二維度的干擾，由此限制了第二維度的分離能力。用于第一維度和第二維度的溶劑的不兼容性可以導(dǎo)致嚴(yán)重的帶分散或增寬和峰衰退，由此對界面設(shè)計提出了巨大的挑戰(zhàn)。tian，h.，等人，j.chromatogr.a2006，1137：42。為了緩解溶劑的不混溶性擔(dān)憂，研究人員已經(jīng)研發(fā)了幾種在兩個維度上使用兼容性流動相的2d系統(tǒng)。一些實(shí)例包括如下：2d反相液相色譜(rplcxrplc)(venkatramani，c.j.等人，j.sep.sci.2012，35：1748；zhang，j.等人，j.sep.sci.2009，32：2084；song，c.x.等人，ana1.chem.2010，82：53；liu，y.m.等人，j.chromatogr.a2008，1206：153)、2d親水性相互作用液相色譜(hilicxrplc)(liu，y.m.等人，j.chromatogr.a2008，1208：133；wang，y.等人，ana1.chem.2008，80：4680；louw，s.等人，j.chromatogr.a2008，1208：90)、2d正相液相色譜x超臨界流體色譜(nplcxsfc)(gao，l.等人，j.sep.sci.2010，33：3817)和2dsfcxsfc(zeng，l.等人，j.chromatogr.a2011，1218：3080；lavison，g.等人，j.chromatogr.a2007，1161：300；hirata，y.等人，j.sep.sci.2003，26：531；okamoto，d.等人，ana1.sci.2006，22：1437；guibal，p.等人，j.chromatogr.a2012，1255：252)。anderer等人的us2013/0134095公開了2dlc系統(tǒng)和方法，它們嘗試通過控制與第二lc狀態(tài)相關(guān)的將第一lc的輸出量注入第二lc的注射結(jié)果來進(jìn)一步減少第一lc對第二lc的干擾。

偶聯(lián)不兼容性“正相”和“反相”維度的一種技術(shù)是2dsfcxrplc(francois，i.等人，j.sep.sci.2008，31：3473-3478；francois，i.和sandra，p.j.chromatogr.a2009，1216：4005)。在這種情況中，sfc級分中的非極性超臨界二氧化碳被蒸發(fā)掉(此時暴露于大氣壓下)，得到與第二rplc維度具有兼容性流動相的級分(通常是醇調(diào)節(jié)劑)。francois，i.等人的sfcxrplc系統(tǒng)采用用于第一維度sfc單元與第二維度rplc單元之間的界面的2-位/10-孔口切換閥。該系統(tǒng)在界面上采用填充環(huán)路以防止從sfc柱上洗脫下的分析物被co2蒸氣壓迫入廢物管線和水被導(dǎo)入所述環(huán)路以減少第二維度中殘留co2氣體的干擾。

cortes和合作者(j.microcol.sep.1992，4：239-244；和美國專利us5,139,681)描述了2dlcxsfc系統(tǒng)，其包括樣品進(jìn)入毛細(xì)管，其中來自第一維度lc的揮發(fā)性溶劑被通道的氮?dú)庀z留洗脫的分析物的沉積物，然后其被co2流動相吸附用于第二維度sfc。然而，用通道的氮?dú)庀軇τ诓捎盟粤鲃酉嗟膔plc而言不切實(shí)際。

仍然需要用于分離和分析復(fù)雜樣品的有效的色譜系統(tǒng)和方法，其中有利地進(jìn)行第一維度rplc和第二維度sfc分離。

發(fā)明概述

公開了用于分離和/或分析復(fù)雜有機(jī)化合物的混合物的多維色譜系統(tǒng)和方法，例如，兩向反相液相色譜(rplc)-超臨界流體色譜(sfc)系統(tǒng)，特別是rplc×sfc系統(tǒng)，其包括能夠保留從rplc柱上洗脫下的分析物、同時使rplc流動相通過的界面，由此減少了sfc柱上攜帶的rplc溶劑的量。

在一個方面，提供了用于分離樣品的色譜系統(tǒng)，包含：(i)第一分離單元，包含：a)第一泵組件，用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元，b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器，和c)反相液體色譜(rplc)柱；(ii)第二分離單元，包含：a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件，和b)超臨界流體色譜(sfc)柱；和(iii)包含多個試樣環(huán)管的第一流體傳送路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至第一分離單元和第二分離單元，其中多個試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；并且其中所述色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離所述第一分離單元中的樣品，并隨后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)還包含用于第一分離單元和/或第二分離單元的檢測器。該系統(tǒng)還可以包含可操作地連接至系統(tǒng)組件中的一個或多個的一個或多個控制裝置。

在一些實(shí)施方案中，2drplcxsfc系統(tǒng)包含第一流體傳送路線單元，其包含兩個試樣環(huán)管；其中兩個試樣環(huán)管中的一個與第一分離單元流體連通，并且兩個試樣環(huán)管中的另一個與第二分離單元流體連通。在一些實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元包含三個或更多個試樣環(huán)管，并且其中試樣環(huán)管的一個或多個與第一分離單元和第二分離單元流體隔離。在一個變型中，與第一分離單元和第二分離單元流體隔離的至少一個試樣環(huán)管包含裝載有固定相材料的捕集柱。在一些實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元被配置為允許逆流洗脫保留在捕集柱中的分析物。在一些實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元被配置為允許保留在捕集柱中的分析物的并流洗脫。

在一些實(shí)施方案中，2drplcxsfc系統(tǒng)包含第二分離單元，其包含一個sfc柱，以及任選地位于sfc柱上游的聚焦柱(focuscolumn)。在一些實(shí)施方案中，第二分離單元包含sfc柱的平行陣列，它們各自任選地包含位于sfc柱上游的聚焦柱。

還提供了使用本文所述的色譜系統(tǒng)的方法。在一些實(shí)施方案中，提供了使用本文所述的色譜系統(tǒng)分析樣品(例如復(fù)雜樣品)的方法，其包含：首先通過rplc將復(fù)雜樣品分離成級分；并且通過第二維度中的sfc進(jìn)一步分離來自rplc維度的級分。

在一個實(shí)施方案中，提供了使用本文所述的色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)體成分的混合物的樣品進(jìn)行同步非手性-手性分析的方法，包含：通過rplc在第一維度中分離(或拆分)樣品中感興趣的一種或多種非對映體成分，這提供樣品的非手性純度；并且在相同分析運(yùn)行中在第二維度中通過sfc分離(或拆分)感興趣的對映異構(gòu)體對，這進(jìn)一步提供樣品中成分的手性純度。

在另一方面，提供了通過多維色譜(例如2drplcxsfc)分離樣品的方法，包含以下步驟：(i)在捕集柱上俘獲至少一部分樣品，所述部分來自通過反相液相色譜(rplc)分離的樣品，所述捕集柱包含固定相；和(ii)通過超臨界流體色譜(sfc)對俘獲在捕集柱上的樣品部分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

附圖簡述

圖1是示例性多維色譜系統(tǒng)10的示意圖。

圖2a是與第一流體傳送路線30接口的示例性第一分離單元20的示意圖。

圖2b是與第一流體傳送路線單元30接口的示例性第二分離單元40a和40b的示意圖。

圖3a和圖3b是包含捕集柱330的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖，其中第一流體傳送路線單元30的結(jié)構(gòu)被配置為用于使第一流動相和第二流動相逆流通過所述捕集柱330。

圖3c和圖3d是包含捕集柱370的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖，其中第一流體傳送路線單元30的結(jié)構(gòu)被配置為使用于第一流動相和第二流動相并流通過所述捕集柱370。

圖4a和圖4b是包含捕集柱430的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖，其中第一流體傳送路線單元30的結(jié)構(gòu)被配置為用于使第一流動相和第二流動相并流通過所述捕集柱430。

圖5a和圖5b是包含兩個捕集柱530和560的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖。其中，第一流體傳送路線單元30的結(jié)構(gòu)被配置為用于使第一流動相位和第二流動相逆流通過捕集柱530和560的每一個。

圖6a-圖6d是示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖，其包含兩個傳送路線結(jié)構(gòu)600和620。

圖7a和圖7b是包含sfc柱陣列的第二分離單元40b的示例性下游子單元的示意圖。

圖8a和圖8b分別示出了具有一個捕集柱(并流)的示例性2drplcxsfc系統(tǒng)的歸屬/分析位置和俘獲位置。

圖9顯示了使用捕集柱、聚焦柱和第二sfc柱的陣列的2drplc-sfc的示意圖。

圖10是示例性停車甲板閥的攝影圖像。

圖11是使用具有三個試樣環(huán)管配置(6μl、12μl、24μl)的系統(tǒng)對反式茋氧化物(tso)的多維分離的隨時間(分鐘)變化的吸光度測量值(mau)疊加色譜圖。

圖12是tso的評價濃度范圍(0.005-0.25mg/ml)的多維分離的uv吸光度測量(mau)隨時間(分鐘)變化的疊加色譜圖。

圖13是從2drplc-sfc系統(tǒng)獲得的藥物物質(zhì)a樣品的未加標(biāo)和加標(biāo)分析的疊加色譜圖。

圖14a和圖14b分別是包含不同水平的不期望的對映異構(gòu)體(0.1-2.0％范圍)的藥物物質(zhì)a樣品的常規(guī)sfc和2drplc-sfc色譜圖。

圖15是一系列色譜圖，其示例了使用2drplc-sfc系統(tǒng)分離藥物物質(zhì)a的樣品的8種立體異構(gòu)體。下部的色譜圖顯示在第一rplc維度中藥物物質(zhì)a的樣品的4個非對映異構(gòu)體對的分離。四個上部色譜圖顯示在第二sfc維度中進(jìn)一步分離每個非對映異構(gòu)體對。

圖16是使用帶有和不帶有位于sfc柱上游頭部的聚焦柱的2d

rplc-sfc系統(tǒng)的來自tso分析的峰高與峰面積在濃度范圍內(nèi)變化的曲線圖。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于分離和分析復(fù)雜樣品的有效色譜系統(tǒng)和方法，特別是兩向rplcxsfc系統(tǒng)及其使用方法。

除非另有明確說明，否則本文所用的術(shù)語“一個(a)”或“一個(an)”是指一個或多個。

本文涉及的“約”值或參數(shù)包括(并描述)涉及該值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。例如，涉及“約x”的描述包含“x”的描述。

系統(tǒng)

在一個方面，本發(fā)明提供了用于分離樣品的兩向rplc×sfc色譜系統(tǒng)，其中樣品在第一維度rplc中分離，且然后在第二維度sfc中分離，該系統(tǒng)包含用于反相液相色譜的第一分離單元、用于超臨界流體色譜的第二分離單元和作為流體路線傳送單元的界面。流體路線傳送單元包含多個試樣環(huán)管，它們各自具有可以放置在第一分離單元的流體路徑中的預(yù)定體積，用于收集從rplc柱上洗脫的級分。隨后將其中收集級分的試樣環(huán)管放置在第二分離單元的流體路徑中，用于將收集在試樣環(huán)管中的級分轉(zhuǎn)移到sfc柱以便進(jìn)一步分離。在本發(fā)明的系統(tǒng)中，試樣環(huán)管的至少一個包含捕集柱，該捕集柱包含固定相，用于保留從rplc柱上洗脫的分析物，同時使流動相通過。新的界面設(shè)計允許rplc和sfc的偶聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，提供了使用在第一維度中的rplc和第二維度中的sfc的在線兩向色譜系統(tǒng)，這可以實(shí)現(xiàn)藥物化合物的同時非手性和手性分析。在一些實(shí)施方案中，界面包含具有小體積c-18捕集柱的2-位/8-端口切換閥。來自第一rplc維度柱的感興趣的峰被有效地聚焦為小體積捕集柱(例如c-18捕集柱)上的尖銳濃度脈沖，且然后被注入到第二維度sfc柱上。第一維度rplc分離提供了非手性純度結(jié)果，而第二維度sfc分離提供手性純度結(jié)果(對映體過量)。

參考附圖，圖1描繪了示例性多維色譜系統(tǒng)10的概述示意圖。第一分離單元20和第二分離單元40a和40b與第一流體傳送路線單元30相接。第一流動相通過第一分離單元20直接流至第一流體傳送路線單元30由箭頭50指示。由箭頭60指示的定向流通過第二分離單元的上游子單元40a傳送至第一流體傳送路線單元30并且隨后沿箭頭70指示的方向通過第二分離單元的下游子單元40b被引導(dǎo)返回。

在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含一個或多個可操作地連接至系統(tǒng)的一個或多個部件的控制裝置，用于控制系統(tǒng)的操作，例如泵組件、加樣注射器、第一流體傳送路線單元(界面)和存在的檢測器。所述控制裝置可以包括配備有用于控制每個單獨(dú)裝置的操作和用于自動化樣品分析的適當(dāng)軟件(例如agilent儀器控制軟件或automationstudio軟件)的計算機(jī)系統(tǒng)。參考圖1，控制裝置80可操作地連接至以下中的至少一個：第一分離單元20、第一傳送路線單元30和第二分離單元40a和40b。

色譜中流動相的組成可以隨時間保持恒定，本領(lǐng)域已知作為等度模式?；蛘?，可以隨時間改變流動相的組成，在本領(lǐng)域中稱為梯度模式。

2drplcxsfc色譜系統(tǒng)的第一分離單元包含用于驅(qū)動流動相通過第一分離單元的第一泵組件、用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的樣品注射器和反相液相色譜(rplc)柱。rplc的流動相可以包含雙溶劑系統(tǒng)(例如水-乙腈和水-甲醇混合物)和任選的某些添加劑(例如乙酸、三氟乙酸、甲酸、氫氧化銨、乙酸銨、乙酸鈉等))。泵組件包含用于驅(qū)動rplc的流動相的一個或多個泵。雖然用于液相色譜的適合的泵在本領(lǐng)域中是眾所周知的，但是在一些實(shí)施方案中，泵可以是往復(fù)泵、置換泵、氣動泵和/或上述至少一個的任何組合。該系統(tǒng)可以包含用于將樣品注入rplc的流動相的任何適合的加樣注射器，例如手動加樣注射器或自動進(jìn)樣器。rplc柱包含反相固定相例如c-18固定相的珠。反相固定相可以是基于二氧化硅的(例如包含硅膠的核心結(jié)構(gòu))或基于聚合物的(例如包含有機(jī)聚合物的核心結(jié)構(gòu)(例如聚苯乙烯))。適合于反相固定相的材料的非限制性實(shí)例包括c-18、c-8、c-4、苯基和苯基衍生物、極性包埋相、混合模式相等。

在一些實(shí)施方案中，第一分離單元還包括位于rplc柱下游的檢測器，以檢測從rplc柱洗脫的存在的分析物?？梢允褂眠m合于檢測樣品中化合物的任何檢測器，例如差示折射計、紫外分光光度計、紫外-可見分光光度計檢測器、帶電荷的氣溶膠檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，rplc維度的檢測器是紫外-可見分光光度計檢測器、帶電荷的氣溶膠檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜儀。

檢測器在系統(tǒng)中可以是任選的，其中分析物在預(yù)定時間被洗脫，例如，當(dāng)rplc在預(yù)先編程的條件下運(yùn)行時，且感興趣的分析物的保留時間是預(yù)先測定的。

參考附圖，圖2a顯示了與第一流體路線傳送單元30接口的示例性的第一分離單元20的示意圖。第一分離單元20包含第一個泵100，用于驅(qū)動第一流動相沿著由箭頭110指示的方向通過第一分離單元。在一些實(shí)施方案中，第一流動相可以僅由一種溶劑組成。在一些實(shí)施方案中，第一流動相可以由多種混合溶劑組成。在一些實(shí)施方案中，第一流動相的溶劑的混合可以被設(shè)置在泵100的上游，使得泵100接收作為第一流動相的混合溶劑。在一些實(shí)施例中，第一流動相被儲存在容器120中。在一些實(shí)施方案中，泵100可以由多個單獨(dú)的泵送單元構(gòu)成，其中多個泵送單元各自接收和泵送不同的溶劑或溶劑混合物，使得混合發(fā)生在泵100的下游。在一些實(shí)施方案中，第一流動相可以進(jìn)一步包含一種或多種添加劑。用于rplc流動相的添加劑的非限制性實(shí)例包含磷酸、磷酸鹽緩沖液、乙酸、三氟乙酸、甲酸、氫氧化銨、乙酸銨、乙酸鈉，烷基磺酸鹽等。

在一些實(shí)施方案中，第一流動相的組成可以隨時間保持恒定(以等度模式運(yùn)行)。在一些實(shí)施方案中，第一流動相的組成可能會隨時間變化(以梯度模式運(yùn)行)。在梯度模式下的操作通常需要兩個泵-一個用于驅(qū)動流動相中更具極性的溶劑(例如水)；另一個用于驅(qū)動極性較低的溶劑(例如乙腈或甲醇)。在等度模式下的操作可以使用具有兩個以恒定比例遞送兩種溶劑的泵的系統(tǒng)，或者使用具有一個驅(qū)動預(yù)混合流動相的泵的系統(tǒng)。

此外，圖2a的示意圖示例了位于泵100與反相液相色譜(rplc)柱150之間的加樣品注射器130。加樣注射器130將樣品沿箭頭140指示的方向?qū)氲谝环蛛x單元。在一些實(shí)施方案中，配備加樣注射器130以便將樣品添加到第一分離單元。在一些實(shí)施方案中，加樣注射器130可以包含閥和用于將樣品導(dǎo)入到第一分離單元的試樣環(huán)管。在一些實(shí)施方案中，加樣注射器130可以包含自動進(jìn)樣器。

如圖2a的示意圖中所示，rplc柱150位于加樣注射器130的下游。rplc柱150可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，rplc柱150可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心鍵合的烴鏈，例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)。

在一些實(shí)施方案中，可以將rplc柱150的溫度維持在選定的溫度。在一些實(shí)施方案中，可以將rplc柱150的溫度維持在約10℃至約50℃的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可以將rplc柱150的溫度維持在約40℃。

任選地位于第一分離單元20的rplc柱150與第一流體路線傳送單元30之間的是第一檢測器160(圖2a)。第一檢測器測量從rplc柱150洗脫的至少一部分樣品的存在。在一些實(shí)施方案中，第一檢測器150是光學(xué)檢測器。在一些實(shí)施方案中，第一檢測器150是分光光度檢測器。在一些實(shí)施方案中，第一檢測器150選自以下的一種或多種：紫外分光光度計、紫外-可見分光光度計檢測器和熒光檢測器。

2drplcxsfc色譜系統(tǒng)的第二分離單元包含驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件和超臨界流體色譜(sfc)柱。sfc的流動相包含超臨界流體(例如超臨界二氧化碳)和改性劑或共溶劑(例如甲醇、乙醇和異丙醇)、任選的一種或多種添加劑(例如氫氧化銨)。第二泵組件包含用于驅(qū)動超臨界流體流動相的一個或多個泵。適合于sfc的任何固定相可用于sfc柱。固定相材料的選擇可以取決于第二維度的分離標(biāo)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，sfc柱包含正相固定相，例如硅膠。在一些實(shí)施方案中，所述色譜系統(tǒng)還包含位于sfc柱下游的檢測器，用于檢測從sfc柱洗脫的分析物的存在?？梢允褂眠m合于sfc的任何檢測器，例如uv檢測器、光電二極管陣列檢測器、帶電荷的氣溶膠檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜儀(ms)。

參考附圖，圖2b描繪了示例性第二分離單元的示意圖，其包含與第一流體傳送路線單元30接口的上游子單元40a和下游子單元40b。第二分離單元的上游子單元40a包含第二個泵200，其用于驅(qū)動第二流動相沿箭頭210指示的方向通過第二分離單元40a和40b。第二分離單元的下游子單元40b包含sfc柱240，以及任選的聚焦柱260和/或檢測器250。在一些實(shí)施方案中，第二流動相可以僅由一種溶劑組成。在一些實(shí)施方案中，第二流動相可以由多種混合溶劑組成。在一些實(shí)施方案中，第二流動相的溶劑的混合可以設(shè)置在泵200的上游，使得泵200接收作為第二流動相的混合溶劑。在一些實(shí)施方案中，第二流動相被儲存在容器220中。在一些實(shí)施方案中，泵200可以由多個單獨(dú)的泵送單元組成，其中多個泵送單元各自接收和泵送不同的溶劑或溶劑的混合物，使得在泵200的下游發(fā)生混合。

在一些實(shí)施方案中，第二流動相的組成可以隨時間保持恒定(以等度模式運(yùn)行)。在一些實(shí)施方案中，第二流動相的組成可能隨時間變化(以梯度模式運(yùn)行)。雖然適合于超臨界流體色譜法的泵在本領(lǐng)域中是眾所周知的，但是在一些實(shí)施方案中，該泵可以是往復(fù)泵、置換泵、氣動泵和/或至少一個的任意組合。

如圖2b中所示，第二分離單元的上游子單元40a與泵200的下游的第一流體傳送路線單元30相接。第二流動相通過第二分離單元的下游子單元40b定向流動至第一流體傳送路線單元30下游由箭頭230示出。sfc柱240可以包含正相固定相。在一些實(shí)施方案中，正相固定相為二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用氰基丙基官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用氨基丙基官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用乙基吡啶官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用磺酸和/或苯基官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用1，2-二羥丙基丙基醚官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是聚合物，例如用官能團(tuán)(例如氰基丙基、氨基丙基、乙基吡啶、磺酸、苯基或1，2-二羥丙基丙基醚官能團(tuán))修飾的有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)。適用于sfc固定相的材料的其它實(shí)例包括二氧化硅、乙基吡啶、氰基、表二醇(epicdiol)、吡啶基酰胺，硝基等。

在一些實(shí)施方案中，可以將sfc柱240的溫度維持在選定的溫度。在一些實(shí)施方案中，可以將sfc柱240的溫度維持在約35℃至約45℃的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可以將sfc柱240的溫度維持在約40℃。

參考圖2b，在一些實(shí)施方案中，可選的聚焦柱260位于sfc柱240的上游。聚焦柱260包含固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相哇膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心、例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)鍵合的碳鏈(例如c-18、c-8或c-4鏈)。通常，聚焦柱將與在界面中使用的主維度和/或捕集柱中使用的反相匹配。

在一些實(shí)施方案中，可以將聚焦柱260的溫度維持在選定的溫度。在一些實(shí)施方案中，可以將聚焦柱維持與sfc柱相同的溫度。在一些實(shí)施方案中，可以將聚焦柱260的溫度維持在約35℃至約45℃。在一些實(shí)施方案中，可以將聚焦柱260的溫度維持在約40℃。

位于sfc柱240下游的是第二檢測器250(圖2b)。該檢測器測量從sfc柱240洗脫的分析物的存在和量。在一些實(shí)施方案中，第二檢測器250是光學(xué)檢測器。在一些實(shí)施方案中，第二檢測器250是分光光度檢測器。在一些實(shí)施方案中，第二檢測器250選自以下的一個或多個：差示折射計、紫外分光光度計、紫外-可見分光光度計檢測器、熒光檢測器和紅外分光光度計。在一些實(shí)施方案中，第二檢測器250是質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，所述質(zhì)譜儀可以選自以下的一種或多種：扇形儀器、四極濾質(zhì)器、飛行時間儀器、離子阱儀器、四極離子阱儀器、線性四極離子阱儀器、軌道離子阱儀器、傅里葉變換離子回旋共振儀器以及所列儀器類型的任意組合或混合體。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過電離技術(shù)將樣品導(dǎo)入質(zhì)譜儀，例如但不限于快原子轟擊、化學(xué)電離、大氣壓化學(xué)電離、電噴霧電離和納米電噴霧電離。在一些實(shí)施方案中，通過大氣壓化學(xué)電離或電噴霧電離將樣品導(dǎo)入質(zhì)譜儀。

在一些實(shí)施方案中，第二分離單元40b的下游部分還可以包含在適當(dāng)位置上、在第二檢測器之后或與第二檢測器平行位置上的級分收集器。

任選地，在一些實(shí)施方案中，控制裝置80可操作地連接至以下中的至少一個：泵100和/或200、樣品注射器130、第一檢測器160、第一流體傳送路線單元30和第二檢測器250。

2d色譜系統(tǒng)中的兩個維度之間的界面控制分離和從第一維度中洗脫出來的分析物傳送至用于進(jìn)一步分離的第二維度，并確定操作模式。本發(fā)明的2d色譜系統(tǒng)被配置為首先通過rplc分離第一分離單元中的樣品，且隨后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元，以通過sfc進(jìn)一步分離。

第一流體傳送路線單元包含多個試樣環(huán)管，所述第一流體傳送路線單元連接至第一分離單元和第二分離單元，其中多個試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相。捕集柱中的固定相材料可以與rplc柱中使用的固定相材料相同，或者與rplc柱中使用的固定相材料不同。在一些實(shí)施方案中，在捕集柱中使用的固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心、例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)鍵合的碳鏈(例如c-18、c-8或c-4鏈)。

在一些實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元包括包含多個端口的傳送路線結(jié)構(gòu)(例如切換閥)、允許液體在端口之間流動的通道和連接至端口的試樣環(huán)管。在一些實(shí)施方案中，傳送路線結(jié)構(gòu)是2-位/8-端口切換閥。在一些實(shí)施方案中，傳送路線結(jié)構(gòu)是2位/10-端口切換閥。在一些實(shí)施方案中，傳送路線結(jié)構(gòu)是一個2-位/4-端口雙向閥。在一些實(shí)施方案中，傳送路線結(jié)構(gòu)是2位8端口或10-端口切換閥。

在一些實(shí)施方案中，2drplcxsfc系統(tǒng)的第一流體傳送路線單元包含兩個試樣環(huán)管；其中兩個試樣環(huán)管中的一個與第一分離單元流體連通，并且兩個試樣環(huán)管中的另一個處于與第二分離單元的流體連通。在一些實(shí)施方案中，兩個試樣環(huán)管之一包含含有固定相的捕集柱。在一些實(shí)施方案中，兩個試樣環(huán)管各自包含含有固定相的捕集柱。

圖3a描繪了與第一分離單元20和第二分離單元40a和40b接口的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖。在這種情況下，接口流體傳送路線單元包含傳送路線結(jié)構(gòu)300，其在一種變型中是2-位/8-端口切換閥，包含多個端口305a-305h、多個通道310a-310d和兩個試樣環(huán)管315和320。如圖3a中所示，在兩個可能的配置中的第一個中示出了多個通道310a-310d。

如圖3a中所示例的，第一分離單元20在端口305a連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300。第一流動相通過第一分離單元20沿箭頭325指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)300通過通道310a將第一流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管315。試樣環(huán)管315在端口305b和端口305f連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300。試樣環(huán)管315包含捕集柱330，所述捕集柱包含固定相。

傳送路線結(jié)構(gòu)300通過通道310c將第一流動相沿箭頭345指示的方向引導(dǎo)至下游容器340。在一些實(shí)施方案中，下游容器340是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器340是級分收集器。

如圖3a中所示，第二分離單元的上游子單元40a在端口305g連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300。第二流動相通過第二分離單元40a沿箭頭350指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)300通過通道310d將第二流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管320。試樣環(huán)管320在端口305h和端口305d連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300，其中第一流動相沿箭頭355指示的方向行進(jìn)。傳送路線結(jié)構(gòu)300通過端口305c連接至第二分離單元的下游子單元40b。傳送路線結(jié)構(gòu)300沿箭頭360指示的方向?qū)⒌诙鲃酉嘁龑?dǎo)通過第二分離單元的下游子單元40b。

圖3b中所示例的示意圖描繪了如圖3a中所示的第一流體傳送路線單元的相同配置，除外圖3a中的傳送路線結(jié)構(gòu)300的多個通道310a-310d現(xiàn)在處于兩個可能位置中的第二個，即通道310e-310h，如圖3b所示。圖3b中的傳送路線結(jié)構(gòu)將來自第一分離單元20的第一流動相沿箭頭325指示的方向通過通過310h引導(dǎo)至試樣環(huán)管320。試樣環(huán)管320在端口305h和端口305d連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300，其中通過通道310f，第一流動相通過箭頭345指示的方向被引導(dǎo)到下游容器340。

如圖3b中所示，第二分離單元的上游子單元40a在端口305g連接至傳送路線結(jié)構(gòu)300。第二流動相通過第二分離單元40a沿箭頭350指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)300現(xiàn)在通過通道310g將第二流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管315。試樣環(huán)管315在端口305b和端口305f連接至傳送路線結(jié)構(gòu)。傳送路線結(jié)構(gòu)300沿箭頭365指示的方向引導(dǎo)第二流動相流過捕集柱330。與圖3a相比，如圖3b中所示的傳送路線結(jié)構(gòu)300引導(dǎo)第二流動相沿通過與圖3a所示相同的試樣環(huán)管315的第一流動相相反的流動方向流過試樣環(huán)管315。傳送路線結(jié)構(gòu)300的示例性配置以在本領(lǐng)域中已知為“逆流”方式引導(dǎo)流動相流過試樣環(huán)管315。

圖3c和圖3d中示例的示例性示意圖描繪了圖3a和圖3b中所示的第一流體傳送路線單元的類似配置，除外如圖3c和圖3d所示，捕集柱370位于加樣試管320上。傳送路線結(jié)構(gòu)300沿箭頭355指示的方向引導(dǎo)第一流動相的流過包含捕集柱370的試樣環(huán)管320(圖3c)。在圖3d中，傳送路線結(jié)構(gòu)300的多個通道310a-310d處于兩個可能位置的第二位置。傳送路線結(jié)構(gòu)300引導(dǎo)第二流動相從第二分離單元的上游子單元40a通過包含捕集柱370的試樣環(huán)管320，并通過箭頭355和360指示的方向通過第二分離單元40b的下游部分。如圖3c和圖3d中所示例的，第一流動相和第二流動相的流動按照在本領(lǐng)域中稱為“并流”的方式沿相同的方向行進(jìn)通過捕集柱370。

在接口流體傳送路線單元中使用2-位/8-端口切換閥(300)的系統(tǒng)的情況下，可以通過將捕集柱(370)放置在試樣環(huán)管315或320中來控制并流/逆流配置?；蛘撸梢酝ㄟ^將第二分離單元的上游子單元40a和下游子單元40b的連接端口切換到接口流體傳送路線單元來改變并流/逆流配置。

圖4a描繪了與第一分離單元20和第二分離單元40a和40b接口的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖。在這種情況下，接口流體傳送路線單元包含傳送路線結(jié)構(gòu)400，其在一種變型中是2-位/10-端口切換閥，其包含多個端口405a-405j、多個通道410a-410e和兩個試樣環(huán)管415和420。如圖4a中所示，在兩個可能的配置中的第一個中示出了多個通道410a-410e。

如圖4a中所示，第一分離單元20連接至在端口405a處的傳送路線結(jié)構(gòu)400。傳送路線結(jié)構(gòu)400通過通道410a沿著箭頭425指示的方向?qū)⒌谝涣鲃酉嘁龑?dǎo)至多個試樣環(huán)管415中的一個。試樣環(huán)管415連接至在端口405b和端口405e處的傳送路線結(jié)構(gòu)400。試樣環(huán)管415包含捕集柱430，所述捕集柱包含固定相。

傳送路線結(jié)構(gòu)400通過通道410c將第一流動相引導(dǎo)至下游容器440。在一些實(shí)施方案中，下游容器440是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器440是級分收集器。

如圖4a中所示，第二分離單元40在端口405c連接至傳送路線結(jié)構(gòu)400。傳送路線結(jié)構(gòu)400通過兩個連接的通道410d和410e將第二流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管420。試樣環(huán)管420在端口405j和端口405g連接至傳送路線結(jié)構(gòu)400。傳送路線結(jié)構(gòu)400通過端口405h連接至第二分離單元的下游子單元40b。傳送路線結(jié)構(gòu)400引導(dǎo)第二流動相沿箭頭435指示的方向通過第二流體傳送路線單元40b的下游部分。

圖4b中所示例的示意圖描繪了如圖4a所示的第一流體傳送路線單元的相同配置，除外圖4a中的傳送路線結(jié)構(gòu)400的多個通道410a-410e現(xiàn)在處于兩個可能位置中的第二個，即通道410f-410j，如圖4b所示。如圖4a和圖4b所示，第一分離單元30的傳送路線結(jié)構(gòu)400可以被配置為使得通過試樣環(huán)管415的第一流動相的流動方向(圖4a)處于與第二流動相流過同一試樣環(huán)管415相同的方向(圖4b)，由箭頭425指示。傳送路線結(jié)構(gòu)400的這種示例性配置引導(dǎo)流動相以并流方式流過試樣環(huán)管415。

在接口流體傳送路線單元中使用2-位/10-端口切換閥(400)的系統(tǒng)的情況下，如圖4a和圖4b中所示，兩個試樣環(huán)管以并流方式配置。然而，通過將第二分離單元的上游子單元40a和下游子單元40b的連接端口切換到接口流體傳送路線單元，可以將兩個試樣環(huán)管配置為逆流方式。

圖5a描繪了與第一分離單元20和第二分離單元40a和40b接口的示例性第一流體傳送路線單元30的示意圖。在這種情況下，接口流體傳送路線單元包括傳送路線結(jié)構(gòu)500，其在一種變型中是2-位/4-端口二重閥，包含多個端口505a-505h、多個通道510a-510d和兩個試樣環(huán)管515和520。如圖5a中所示，在兩個可能配置中的第一個中示出了多個通道510a-510d。

如圖5a中所示例的，第一分離單元20在端口505g連接至傳送路線結(jié)構(gòu)500。第一流動相通過第一分離單元20沿箭頭525指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)500通過通道510a引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管520。試樣環(huán)管520連接至在端口505h和端口505b處的傳送路線結(jié)構(gòu)500。傳送路線結(jié)構(gòu)500沿箭頭535指示的方向引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管520。試樣環(huán)管520包含捕集柱530，所述捕集柱包含固定相。

傳送路線結(jié)構(gòu)500通過通道510b將第一流動相沿箭頭545指示的方向引導(dǎo)至下游容器540。在一些實(shí)施方案中，下游容器540是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器540是級分收集器。

如圖5a中所示，第二分離單元的上游子單元40a連接至在端口505e的傳送路線結(jié)構(gòu)500。第二流動相通過第二分離單元40a沿箭頭550指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)500通過通道510c將第二流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管515。試樣環(huán)管515連接至在端口505f和端口505c處的傳送路線結(jié)構(gòu)500，其中第一流動相沿箭頭555指示的方向行進(jìn)。試樣環(huán)管515包含捕集柱560，所述捕集柱包含固定相。傳送路線結(jié)構(gòu)500通過端口505d連接至第二分離單元的下游子單元40b。傳送路線結(jié)構(gòu)500沿著箭頭565指示的方向引導(dǎo)第二流動相通過第二分離單元的下游子單元40b。

在一些實(shí)施方案中，捕集柱530和560包含相同的固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，捕集柱530和560包含不同的固定相。

圖5b中所示例的示意圖描繪了與如圖5a中所示的第一流體傳送路線單元的相同配置，除外圖5a中的傳送路線結(jié)構(gòu)500的多個通道510a-510d現(xiàn)在處于兩個可能位置中的第二個，即通道510e-510g，如圖5b所示。圖5b中的傳送路線結(jié)構(gòu)500現(xiàn)在將來自第一分離單元20的第一流動相沿箭頭525指示的方向通過通道510e引導(dǎo)至試樣環(huán)管515。試樣環(huán)管515連接至在端口505c和端口505f處的傳送路線結(jié)構(gòu)500，其中第一流動相通過通道510f沿箭頭545指示的方向定向于下游容器540。在圖5b中，傳送路線結(jié)構(gòu)500引導(dǎo)第一流動相沿與第二流動相通過圖5a中同一試樣環(huán)管515相反的方向流過試樣環(huán)管515。

如圖5b中所示，第二分離單元的上游子單元40a在端口505e處連接至傳送路線結(jié)構(gòu)500。第二流動相通過第二分離單元40a沿箭頭550指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)500現(xiàn)在通過通道510g將第二流動相引導(dǎo)至試樣環(huán)管520。試樣環(huán)管520在端口505b和端口505h處連接至傳送路線結(jié)構(gòu)。傳送路線結(jié)構(gòu)500沿箭頭575指示的方向引導(dǎo)第二流動相流過捕集柱530。在圖5b中，傳送路線結(jié)構(gòu)500引導(dǎo)第二流動相沿與第一流動相通過圖5a中同一試樣環(huán)管520相反的方向流過試樣環(huán)管520。

在接口流體傳送路線單元中使用2-位/4-端口二重閥(500)的系統(tǒng)的情況下，兩個試樣環(huán)管以逆流方式配置，如圖5a和圖5b所示。然而，如果期望，可以通過將用于第二分離單元的上游子單元40a和下游子單元40b的連接端口切換到接口流體傳送路線單元，可以以并流方式配置兩個試樣環(huán)管。

在一些實(shí)施方案中，2drplcxsfc系統(tǒng)的第一流體傳送路線單元包含至少三個試樣環(huán)管，并且其中試樣環(huán)管的至少一個與第一分離單元和第二分離單元流體隔離。在這樣的系統(tǒng)中，一個試樣環(huán)管與第一分離單元流體連通，一個試樣環(huán)管與第二分離單元流體連通，并且一個或多個試樣環(huán)管與第一分離單元和第二分離單元流體隔離。在一些實(shí)施方案中，試樣環(huán)管的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相。在一些實(shí)施方案中，包含捕集柱的至少一個試樣環(huán)管與第一分離單元和第二分離單元流體隔離，所述捕集柱包含固定相。在一些實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元包含多個捕集柱，每個捕集柱位于試樣環(huán)管中。在一些實(shí)施方案中，每個捕集柱上裝載有相同的固定相材料。在其它實(shí)施方案中，固定相材料可適于保留的特定分析物，因此，不同的固定相材料可用于從第一分離單元洗脫的不同級分。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18反相硅膠或c18硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相硅膠或c8硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4反相硅膠或c4硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心、例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)結(jié)合的碳鏈(例如c-18、c-8或c-4碳鏈)。

包含接口流體傳送路線單元的系統(tǒng)(其中一個或多個試樣環(huán)管可以放置在與第一分離單元和所述第二分離單元流體隔離的位置上)提供了一種用于“峰停車”特征。當(dāng)從第一維度色譜分離和洗脫的多個級分需要在第二維度進(jìn)一步分離時，從第一分離單元洗脫的級分之間的時間間隔可能不足以用于第一級分運(yùn)行通過第二分離單元中。而第二分離單元在使用中用于分析的早期級分時，可以在附加環(huán)管的捕集柱中采集后期的級分(或截留的級分(cuts))并且保持它們在流體隔離(“停放”)，直到第二分離單元準(zhǔn)備分析下一個級分。

參考附圖，圖6a描繪了與第一分離單元20和第二分離單元40a和40b接口的示例性第一流體路線單元30的示意圖。在這種情況下，接口流體傳送路線單元包括：第一傳送路線結(jié)構(gòu)600，其在一種變型中是2-位/4-雙重閥，包含多個端口605a-605h、多個通道610a-610d、一個試樣環(huán)管615和第二傳送路線結(jié)構(gòu)620，其包含多個端口，例如625a-625e、多個試樣環(huán)管例如630a-630c、多個捕集柱635a-635e和多個通道675a和675b。試樣環(huán)管630b提供了沒有捕集柱的旁路環(huán)管。如圖6a中所示，在兩種可能配置中的第一種中示出了第一傳送路線結(jié)構(gòu)600的多個通道610a-610d。

如圖6a中所示例的，第一分離單元20在端口605g處連接至傳送路線結(jié)構(gòu)600。第一流動相通過第一分離單元20沿箭頭640指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)600通過通道610a引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管615。試樣環(huán)管615在端口605h和端口605b處連接至第一傳送路線結(jié)構(gòu)600。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600沿箭頭645指示的方向引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管615。如圖6a中所示，傳送路線結(jié)構(gòu)600通過通道610b將第一流動相沿箭頭655指示的方向引導(dǎo)至下游容器650。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是級分收集器。

如圖6a中所示，第二分離單元的上游子單元40a在端口605e連接至傳送路線結(jié)構(gòu)600。第二流動相通過第二分離單元的上游子單元40a沿箭頭660指示的方向被驅(qū)動。傳送路線結(jié)構(gòu)600通過通道610c將第二流動相沿箭頭665指示的方向引導(dǎo)至第二傳送路線結(jié)構(gòu)620。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600和第二傳送路線結(jié)構(gòu)620通過端口605f和端口625a連接。

在圖6a中，第二傳送路線結(jié)構(gòu)620被配置為通過通道675a沿箭頭670指示的方向引導(dǎo)第二流動相通過試樣環(huán)管630b。試樣環(huán)管630b通過端口625b和端口625e連接至第二傳送路線結(jié)構(gòu)620，端口625e通過通道675b連接至端口625d。第二傳送路線結(jié)構(gòu)620和第一傳送路線結(jié)構(gòu)600通過端口625f和端口605c連接。第二傳送路線結(jié)構(gòu)620將第二流動相沿箭頭680指示的方向流過第一傳送路線結(jié)構(gòu)600。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600引導(dǎo)第二流動相沿箭頭690指示的方向經(jīng)由通道610d流動通過第二分離單元的下游亞單元40b。

圖6a描繪了沒有捕集柱與第一分離單元或第二分離單元流體連通的配置。例如，當(dāng)無感興趣的峰從第一維度柱出來或在第二維度柱中被分析時，系統(tǒng)可以被設(shè)置為這種配置。當(dāng)兩個分離單元中的柱處于空閑狀態(tài)或柱正在進(jìn)行再生/平衡時，該系統(tǒng)也可以被設(shè)定為這種配置。捕集柱635a-635e中的每一個與第一和第二分離單元流體隔離。

圖6b中所示例的示意圖描繪了與如圖6a中所示的第一流體傳送路線單元的相同配置，除外圖6a中的第一傳送路線結(jié)構(gòu)600的多個通道610a-610d現(xiàn)在處于如圖6b中所示的兩個可能位置610e-610h的第二個。圖6b中的傳送路線結(jié)構(gòu)600現(xiàn)在將來自第一分離單元20的第一流動相沿箭頭640指示的方向通過通道610e引導(dǎo)至第二傳送路線結(jié)構(gòu)620。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600和第二傳送路線結(jié)構(gòu)620連接在端口605c和端口625f。此外，在圖6b中，第二傳送路線結(jié)構(gòu)620現(xiàn)在被配置為沿箭頭705指示的方向引導(dǎo)第一流動相的流動通過試樣環(huán)管630a。試樣環(huán)管630a包含捕集柱635a。試樣環(huán)管630a通過端口625f和端口625c連接至第二傳送路線結(jié)構(gòu)620。如圖6b中所示，第二傳送路線結(jié)構(gòu)620和第一傳送路線結(jié)構(gòu)600通過端口625a和端口605f連接。第二傳送路線結(jié)構(gòu)620引導(dǎo)第一流動相沿箭頭710指示的方向到達(dá)第一傳送路線結(jié)構(gòu)600。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600引導(dǎo)第一流動相沿箭頭655指示的方向通過通道610f到達(dá)下游容器650。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是級分收集器。在一些實(shí)施方案中，可以使用flexcube(agilent)用作第二傳送路線結(jié)構(gòu)的一部分。

在一些實(shí)施方案中，圖6b所示的第一流體傳送路線單元30的配置可以用于引導(dǎo)從第一分離單元洗脫的樣品的一部分被選擇性地保留在捕集柱上，例如635a。在一些實(shí)施方案中，捕集柱可包含固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠(例如c18硅膠、c8硅膠和c4硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心、例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)結(jié)合的碳鏈(例如c-18、c-8或c-4碳鏈)。

在捕集柱例如635a上保留了峰之后，傳送路線結(jié)構(gòu)600和620可被切換或設(shè)置為允許進(jìn)行洗脫和進(jìn)一步分析保留峰的位置，例如圖6c中所示；或傳送路線結(jié)構(gòu)600和620可以被切換或設(shè)置為允許在捕集柱635a上保留的峰停放以及在不同捕集柱(例如635b)上采集另一個峰的位置，如圖6d中所示。

圖6c中所示例的示意圖描繪了第一流體傳送路線單元30的示例性配置，其中第一傳送路線結(jié)構(gòu)600被配置為將第一流動相引導(dǎo)流至下游容器650，如圖6a所示。如圖6c中所示例的，第一流動相通過第一分離單元20沿箭頭640指示的方向被驅(qū)動，并且傳送路線結(jié)構(gòu)600通過通道610a引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管615。試樣環(huán)管615在端口605h和端口605b處連接至第一傳送路線結(jié)構(gòu)600。第一傳送路線結(jié)構(gòu)600沿箭頭645指示的方向引導(dǎo)第一流動相通過試樣環(huán)管615。如圖6a中所示，傳送路線結(jié)構(gòu)600引導(dǎo)第一流動相沿箭頭655指示的方向通過通道610b到達(dá)下游容器650。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是廢物容器。在一些實(shí)施方案中，下游容器650是級分收集器。

在圖6c中，第一傳送路線結(jié)構(gòu)600將第二流動相流動沿箭頭665指示的方向引導(dǎo)至第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)620。第二傳送路線結(jié)構(gòu)620被配置為將第二流動相沿箭頭715指示的方向通過通道675d引導(dǎo)至試樣環(huán)管635a。試樣環(huán)管635a通過端口625c和端口625f連接至第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)。第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)620被配置為沿箭頭680指示的方向通過通道675c將第二流動相的流動引導(dǎo)至第一流體傳送路線結(jié)構(gòu)600。第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)和第一流體傳送路線結(jié)構(gòu)通過端口625d和605c連接，并且第二流動相沿箭頭690指示的方向通過通道610d被引導(dǎo)至第二分離單元的下游部分40b。

圖6d中所示例的示意圖描繪了與如圖6b中所示的第一流體傳送路線結(jié)構(gòu)600和第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)620的相同配置，除外在圖6d中，第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)現(xiàn)在引導(dǎo)第一流動相流動沿箭頭720指示的方向到達(dá)試樣環(huán)管630c。試樣環(huán)管630c通過端口625g和端口625h連接至第二流體傳送路線結(jié)構(gòu)。通道675f連接端口625a和端口625g。通道675e連接端口625d和端口625h。如圖6b所示，試樣環(huán)管630c包含捕集柱635b，捕集柱635b可以包含固定相，例如本文所述的固定相。

如圖6d中所示例的，從第一分離單元洗脫并且選擇性地保留在捕集柱635a上的樣品的部分現(xiàn)在與第一分離單元20和第二分離單元40a和40b隔離。

在一些實(shí)施方案中，多個捕集柱635a-635e、如圖6a-圖6d中所示可以包含相同的固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，例如圖6a-圖6d中所示的多個捕集柱635a-635e中的至少一個可以包含與在第一維度rplc柱中使用的固定相材料相同的固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈的鍵合硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核心、例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)結(jié)合的烴鏈(例如c-18、c-8或c-4鏈)。

2d色譜可以在中心切割、假擬綜合或綜合模式下進(jìn)行。中心切割提供了色譜圖選定區(qū)域的表征，而綜合模式提供了整個色譜圖的表征。假擬綜合模式提供了色譜圖的所選區(qū)域的全面分離。參見venkatramani，c.j.等人，j.sep.sci.2014，22，印刷中。2drplcxsfc系統(tǒng)中的接口，即第一流體傳送路線單元，可適用于以中心切割、假擬綜合和綜合模式的任意一種或多種進(jìn)行。例如，具有如圖3-6中所示的任何接口流體傳送路線單元的2drplcxsfc系統(tǒng)可以用于中心切割模式。具有如圖5a和5b中所示的包含兩個試樣環(huán)管(各種具有捕集柱)的接口流體傳送路線單元的系統(tǒng)可以用于假擬綜合模式，條件是與第一維度中的流動相的慢流速相結(jié)合的長rplc柱在將允許在第二維度分離中完全運(yùn)行一個級分，而在第二個試樣環(huán)管中收集另一個級分。具有如圖6a-6d中所示的采樣停車特征的界面流體傳送路線單元的系統(tǒng)可以以綜合模式或假擬綜合模式使用，因為可以收集來自第一維度分離的多個級分，并保留以便當(dāng)?shù)诙蛛x單元可用時用于第二維度中的后續(xù)分析。

第二維度中的分離標(biāo)準(zhǔn)可以取決于所分離的分析物的性質(zhì)。sfc柱可能需要不同的固定相材料，以便為從第一維度rplc柱洗脫的各種分析物提供最佳分離。因此，提供了本文所述的2drplcxsfc色譜系統(tǒng)，其中第二分離單元包含sfc柱陣列，其中該陣列中的sfc柱以平行配置排列；以及第二流體布線單元，其用于引導(dǎo)第二個流動相流動至陣列中期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱。在一些實(shí)施方案中，第二分離單元還包含位于sfc柱陣列中的每個sfc柱的上游的聚焦柱。在一些實(shí)施方案中，聚焦柱包含固定相。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含碳鏈鍵合的硅膠。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為18個碳的碳鏈(即c18-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為8個碳的碳鏈(即c8-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，碳鏈鍵合的硅膠可以包含長度為4個碳的碳鏈(即c4-反相硅膠)。在一些實(shí)施方案中，反相固定相可以包含與聚合物核結(jié)合的烴鏈(例如c-18、c-8或c-4鏈)，例如有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)。

參考附圖，圖7a和圖7b是包含第二流體傳送路線單元800和sfc柱陣列的第二分離單元的示例性下游子單元40b的示意圖。第一流體傳送路線單元30在端口805a連接至第二流體傳送路線單元800。第一流體傳送路線單元30沿箭頭810指示的方向?qū)⒌诙鲃酉嘁龑?dǎo)至第二傳送路線單元800。第二傳送路線單元800包含多個端口、例如端口805a和端口805b以及多個通道、例如810a。如圖7a中所示，第二流體路線單元800將第二流動相沿箭頭825指示的方向引導(dǎo)至期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱815a。任選地，聚焦柱820a位于sfc柱815a的上游。

在一些實(shí)施方案中，傳送路線結(jié)構(gòu)830任選地位于sfc柱的下游。如圖7a中所示，傳送路線結(jié)構(gòu)830沿箭頭835指示的方向通過通道810b將第二流動相引導(dǎo)至檢測器250。

圖7b描繪了與如圖7a中所示相同的sfc柱陣列，但是在圖7b中，第二流體路線單元800被配置為將第二流動相從第一流體路線單元引導(dǎo)至第二期望的sfc色譜柱815b。如圖7b中所示，第二期望的sfc色譜柱通過端口805e和端口805f連接至第二流體傳送路線單元800和傳送路線結(jié)構(gòu)830。第二流體路線單元800沿箭頭840指示的方向引導(dǎo)第二流動相。任選地，聚焦柱820b位于sfc柱815b的上游。

在一些實(shí)施方案中，sfc柱陣列包含多個sfc柱，其中單獨(dú)的sfc柱(例如815a)可以包含與陣列中的至少一個其它單獨(dú)sfc柱相同的固定相，例如815b。在一些實(shí)施方案中，sfc柱陣列包含多個sfc柱，其中單個sfc柱(例如815a)可以包含與陣列中的所有其它單獨(dú)sfc柱不同的固定相，例如815b。在一些實(shí)施方案中，固定相可以包含正相固定相。在一些實(shí)施方案中，正相固定相為二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用丙基氰官能團(tuán)二氧化硅修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用氨基丙基官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用乙基吡啶官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用磺酸和/或苯基官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是用1，2-二羥丙基丙基醚官能團(tuán)修飾的二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，正相固定相是聚合物，例如用官能團(tuán)(例如氰基丙基、氨基丙基、乙基吡啶、磺酸、苯基或1，2-二羥丙基丙醚官能團(tuán))修飾的有機(jī)聚合物(例如聚苯乙烯)。

在一些實(shí)施方案中，sfc柱陣列包含多個聚焦柱，其中單個聚焦柱(例如820a)可以包含與該陣列中的至少另一個單獨(dú)的聚焦柱相同的固定相，例如820b。在一些實(shí)施方案中，sfc柱陣列包含多個聚焦柱，其中單個聚焦柱(例如820a)可以包含與該陣列中的所有其它單獨(dú)聚焦柱不同的固定相，例如820b。

圖8a和圖8b描繪了具有涉及電子控制的2-位/4-端口二重閥v1和捕集柱阱1的界面的示例性2dlc-sfc系統(tǒng)的示意圖。來自泵1的流動相流經(jīng)注射器到反相主柱。檢測后洗脫液d1流至取樣閥v1。在原位/分析位置，主柱洗脫液流經(jīng)試樣環(huán)管環(huán)管1出口排出廢物。來自sfc泵的流動相流經(jīng)捕集柱阱1-sfc柱(圖8a)。這樣可以決定捕集陷阱1和sfc柱的條件。流動相不間斷流過主柱和輔助柱。當(dāng)感興趣的成分從主柱洗脫時，閥v1被轉(zhuǎn)換(俘獲位置)，將主柱洗脫液轉(zhuǎn)移到捕集柱阱1(圖8b)。將閥v1切換原位/分析位置，從捕集柱t1-sfc柱中沖洗樣品成分。使用uv檢測器d2和/或質(zhì)譜儀監(jiān)測sfc柱分離。sfc泵和閥v1的交替位置會在閥切換期間產(chǎn)生逆流。

在涉及二維中的重復(fù)梯度的2d色譜中，將主柱洗脫液轉(zhuǎn)移(采樣)到輔助柱中的頻率取決于輔助柱的拆分速度，包含再平衡時間。在2dlc-sfc中，二維分離持續(xù)約2-3分鐘，從而限制了將主柱洗脫液轉(zhuǎn)移到輔助柱的頻率。如果在2-3分鐘內(nèi)從主柱洗脫多個分析物級分(例如包含立體異構(gòu)體混合物的樣品中的非對映異構(gòu)體對)，則具有圖8a和圖8b中所示的單一捕集柱的2dlc-sfc界面可能不切實(shí)際。降低主柱流速和梯度以補(bǔ)償輔助柱速度的采樣需求是一個選擇。然而，這將導(dǎo)致峰形差，且由此排除同時的非手性/手性分析。這將需要與多個捕集柱的接口來滿足輔助柱的采樣需求。

圖9顯示了使用捕集柱和輔助sfc柱陣列的界面的示例性2dlc-sfc系統(tǒng)的示意圖。這種配置用于分析色譜圖的多個部分。在圖9中所示的原位/分析位置，來自檢測后主柱的洗脫液流經(jīng)全自動的2-位/4-端口二重閥v1排出廢物(excitingtowaste)。sfc流動相流程如下：sfc泵通過閥v1，到達(dá)停車甲板閥v2，返回到閥v1，然后到sfc柱。在閥v2中，sfc流動相流經(jīng)旁路管或捕集柱陣列。這樣可以調(diào)節(jié)阱和sfc柱。流動相通過主柱和輔助柱不間斷流動。當(dāng)感興趣的成分從主柱洗脫時，閥v1被切換(主轉(zhuǎn)移)，將主柱洗脫液轉(zhuǎn)移到停放甲板閥v2(出)。通過在旁路模式和俘獲位置之間向后和向前切換停車甲板閥v2，將成分轉(zhuǎn)移到不同的捕集柱。在轉(zhuǎn)移主柱洗脫液之后，將閥v1切換到原位，從而將主柱洗脫液轉(zhuǎn)移到廢液中。這樣可以使進(jìn)入閥v2的流動相的流向反轉(zhuǎn)(v2-出到v2-進(jìn))。停車甲板閥v2中sfc流動方向相反。隨后將保留在捕集柱中的成分反沖洗入sfc柱或sfc柱陣列，以便根據(jù)應(yīng)用的不同進(jìn)一步分離。sfc柱陣列為系統(tǒng)提供了額外的靈活性，因為在單一手性固定相上拆分不同的成分可能不切實(shí)際。使用uv或ms檢測器監(jiān)測輔柱分離。自動化界面是2dlc-sfc系統(tǒng)的關(guān)鍵組件，可在單一色譜運(yùn)行中同時對樣品進(jìn)行非手性、手性分析。

應(yīng)當(dāng)預(yù)期和理解，在2d色譜系統(tǒng)中，本文所述的第一分離單元的每個和每一變型可以與本文所述的第二分離單元的每個和每一變型和/或本文所述的第一流體傳送路線單元每個和每一組合進(jìn)行組合，如同每個和每一組合被單獨(dú)描述一樣。例如，在一些實(shí)施方案中，提供了2d色譜系

統(tǒng)，包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入到第一分離單元的加樣注射器；

c)反相液相色譜(rplc)柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)超臨界流體色譜(sfc)柱；和

c)第二檢測器；

和

(iii)包含多個試樣環(huán)管的第一流體傳送路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述多個試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包

含固定相；

且

其中該色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離第一分離單元中的樣品，且然后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。

在一些實(shí)施方案中，提供了2d色譜系統(tǒng)，包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入到第一分離單元的加樣注射器；

c)反相液相色譜(rplc)柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)超臨界流體色譜(sfc)柱；和

c)第二檢測器；

(iii)包含兩個試樣環(huán)管的第一流體路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至第一分離單元和第二分離單元，

其中所述試樣環(huán)管中的一個與第一分離單元流體連通，并且所述

試樣環(huán)管中的另一個與第二分離單元流體連通；

并且其中試樣環(huán)管的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含c-18固定相(例如c-18二氧化硅)；

和

(iv)至少一個控制裝置，其可操作地連接至以下的一個或多個：

a)第一泵組件；

b)加樣注射器；

c)第一檢測器；

d)第一流體傳送路線單元；

e)第二泵組件；和

f)第二檢測器；

且

其中該色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離第一分離單元中的樣品，且

然后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。

在一種變型中，2d色譜系統(tǒng)還包含至少一個可操作地連接至以下一個或多個的控制裝置：a)第一泵組件；b)加樣注射器；c)第一檢測器；d)第一流體傳送路線單元；e)第二泵組件；和f)第二檢測器。

在一些實(shí)施方案中，提供了2d色譜系統(tǒng)，包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器；

c)包含c-18固定相(例如c-18二氧化硅)的rplc柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)包含正相固定相的sfc柱；和

c)第二檢測器；

(iii)包含至少三個試樣環(huán)管的第一流體路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述試樣環(huán)管中的一個與所述第一分離單元流體連通，所述試樣環(huán)管中的另一個與所述第二分離單元流體連通，并且所述試樣環(huán)管中的至少一個與所述第一分離單元和第二分離單元流體隔離；

并且其中試樣環(huán)管的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含c-18固定相(例如c-18二氧化硅)；

和

(iv)至少一個控制裝置，其可操作地連接至以下的一個或多個：

a)第一泵組件；

b)加樣注射器；

c)第一檢測器；

d)第一流體傳送路線單元；

e)第二泵組件；和

f)第二檢測器；

且

其中色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離第一分離單元中的樣品，然后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。

在一種變型中，第二分離單元包含：a)sfc柱陣列，其中該陣列中的sfc柱以平行配置排列；和b)第二流體傳送路線單元，用于將第二流動相的流動引導(dǎo)至陣列中期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱。在另一種變型中，第二分離單元還包含位于sfc柱上游的聚焦柱(例如，包含c-18固定相材料(例如c-18二氧化硅)的聚焦柱)。

在一些實(shí)施方案中，提供了2d色譜系統(tǒng)，包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器；

c)rplc柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)sfc柱陣列，其中該陣列中的sfc柱以平行配置排列；

c)第二流體傳送路線單元，用于將第二流動相的流動引導(dǎo)至陣列中期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱；和

c)第二檢測器；

和

(iii)包含至少三個試樣環(huán)管的第一流體路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述試樣環(huán)管中的一個與第一分離單元流體連通，所述試樣環(huán)管中的另一個與第二分離單元流體連通，并且所述試樣環(huán)管中的至少一個與所述第一分離單元和第二分離單元流體隔離；

并且其中所述試樣環(huán)管的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；

且

其中色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離第一分離單元中的樣品，然后將從rplc柱洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。

在一些變型中，rplc柱包含c-18固定相(例如c-18二氧化硅)。在一些變型中，sfc柱包含正相二氧化硅固定相。在一些變型中，該系統(tǒng)還包含至少一個控制裝置，其可操作地連接至以下中的一個或多個：

a)第一泵組件；

b)加樣注射器；

c)第一檢測器；

d)第一流體傳送路線單元；

e)第二泵組件；和

f)第二檢測器。

本發(fā)明的2drplcxsfc系統(tǒng)通過使用捕集柱解決與第一維rplc中使用的溶劑的不相容性和第二維度sfc相關(guān)的問題。捕集柱中的固定相保留分析物，同時使來自rplc的溶劑流過。這樣可以使分析物濃縮在小體積中，以便注入sfc以進(jìn)一步分離。sfc維度中較高的含水量會降低分辨率/靈敏度。如實(shí)施例2中所示，使用沒有捕集柱的系統(tǒng)，只有少部分可以被轉(zhuǎn)移到sfc柱，而不會對sfc分析的分辨率和靈敏度產(chǎn)生不利影響(圖11)。12μl轉(zhuǎn)移體積導(dǎo)致第二個峰的輕微增寬。當(dāng)轉(zhuǎn)移24μl級分時，觀察到第二個峰的顯著增寬，這轉(zhuǎn)化為顯著的靈敏度損失。相反，如實(shí)施例3中所示，當(dāng)使用具有包含c-18固定相材料(例如c-18二氧化硅)的捕集柱的如圖8a和8b中所示的系統(tǒng)時，轉(zhuǎn)移160μl窗口，并且得到極佳的分辨率和靈敏度(圖12)。該系統(tǒng)允許將峰從第一維度rplc注射到第二維度sfc，其中對sfc分析的分辨率和靈敏度影響最小。例如，實(shí)施例5比較了使用本發(fā)明的常規(guī)sfc系統(tǒng)和2dlc-sfc系統(tǒng)將手性藥物物質(zhì)與其對映異構(gòu)體的分離。結(jié)果表明，與常規(guī)sfc相比，2dlc-sfc中的分辨率和靈敏度均得到保持。由于多維系統(tǒng)的倍增峰容量，所以兩維度中的正交方法、反相和正相條件可用于增加hplc峰純度評價的置信水平。

使用方法

開發(fā)2d系統(tǒng)時需考慮的另一個因素是在線模式下運(yùn)行的能力。這種方法的一些優(yōu)點(diǎn)包含易于自動化、分析的可重復(fù)性和從第一維度到第二維度精確地傳遞級分，而沒有任何收率損耗或污染。

2d系統(tǒng)被忽視的應(yīng)用是在高流通量分析中的應(yīng)用。在制藥行業(yè)，例如，根據(jù)ich指南，必須對活性藥物成分(api)進(jìn)行全面表征。參見

internationalconferenceonharmonisation(2006)，q3a(r2)：impuritiesinnewdrugsubstances。對于純度分析，開發(fā)了兩種獨(dú)立的分析方法。rplc方法通常評估非手性純度(雜質(zhì)和相關(guān)物質(zhì)方法)，以及用于評價手性純度(不期望的對映異構(gòu)體的量)的手性方法。可以同時產(chǎn)生非手性和手性結(jié)果的2d系統(tǒng)將在api過程開發(fā)過程中產(chǎn)生巨大的影響。樣品制備、色譜分析次數(shù)和數(shù)據(jù)分析將減少，以允許更高的流通量分析。

我們預(yù)先報道了使用2drplcxrplc分析同時進(jìn)行非手性-手性分析(j.sep.sci.2012，35：1748)。然而，在api世界中，大多數(shù)手性方法是nplc方法，因此，2drplcxnplc系統(tǒng)將在同時實(shí)現(xiàn)非手性-手性分析方面具有重要意義。如上所述，反相和正相流動相的不相容性將使得該方法非常具有挑戰(zhàn)性。超臨界流體色譜法是一種正相技術(shù)，其也用于分析和制備規(guī)模的api手性分析。除了作為“綠色”技術(shù)之外，由于其通用性、更高的效率、更高流通量和更快的分析時間，sfc優(yōu)于nplc。超臨界流體具有低粘度和高擴(kuò)散性(類似于氣體)，以允許更高的流速和更快的再平衡時間，并且具有高密度(類似于液體)以提供高溶劑化能力。cortes等人于1992年報道了第一個在線2dlcxsfc(j.microcol。9月1992，4：239-244)。cortes等人開發(fā)的界面相當(dāng)復(fù)雜并且涉及多個階段：通過氮?dú)庀谝痪S度溶劑，使用加壓co2將分析物轉(zhuǎn)移到?jīng)_擊器界面上，且然后通過二氧化碳流動相的壓力編程將分析物從沖擊器界面洗脫至sfc毛細(xì)管柱。由于溶劑消除步驟，采用該常規(guī)2drplcxsfc分離的界面將受到限制。cortes等人使用thf(相對低沸點(diǎn)，66℃)作為lc流動相，而大多數(shù)常規(guī)的rplc分離是基于水的。

本發(fā)明展示了一種新的自動化接口來偶合rplc和sfc。因此，提供了使用本文描述的2drplcxsfc色譜系統(tǒng)的方法來分離和分析樣品，例如可能難以通過1d色譜法或其它2d色譜法進(jìn)行綜合分析的復(fù)雜樣品混合物。

在一些實(shí)施方案中，提供了使用本文所述的色譜系統(tǒng)分析樣品(例如復(fù)雜樣品)的方法，其包含：首先通過反相液相色譜(rplc)將復(fù)雜樣品分離成級分；并進(jìn)一步通過第二維度中的超臨界流體色譜(sfc)分離來自rplc維度的級分。第一維度中的分離(例如c-18固定相上的rplc)依賴于復(fù)雜樣品中成分的某些特征或特性的差異(例如疏水性)；而在第二維度中的分離(例如在正相硅膠上的sfc凝膠固定相)依賴于成分的其它屬性或特性的差異(例如手性)，從而提供比使用一維度色譜法更好的綜合分析。

當(dāng)潛在的立體異構(gòu)體的數(shù)量隨著手性中心數(shù)量的增加(立體異構(gòu)體數(shù)＝2ⁿ，其中n是化合物中的手性中心數(shù))而顯著增加時，開發(fā)具有多個手性中心的化合物的手性色譜方法可能是具有挑戰(zhàn)性的。手性方法開發(fā)大多是一個試驗和錯誤過程，其中進(jìn)行了廣泛的柱和流動相篩選以鑒定潛在的命中數(shù)。然而，由于立體異構(gòu)體數(shù)量的顯著增加，開發(fā)具有3個或更多個手性中心的化合物的手性色譜方法可能是非常具有挑戰(zhàn)性的。對于具有多個手性中心的藥物化合物，一種常見的做法是控制進(jìn)入的原料的對映體純度，并顯示過程控制(差向異構(gòu)化的可能性)。這將限制最終api中潛在的立體異構(gòu)體的數(shù)量。然而，這一控制策略可能受到一些監(jiān)管結(jié)構(gòu)的質(zhì)疑，這些監(jiān)管結(jié)構(gòu)要求開發(fā)api手性方法。

本發(fā)明的在線2drplcxsfc允許對藥物樣品同時進(jìn)行非手性和手性分析(通過單一樣品注射或在相同的分析運(yùn)行中進(jìn)行分析)。在水和有機(jī)物內(nèi)含物的混合物中的api峰將保留在小體積c-18捕集柱上，且然后被反沖洗到第二維度sfc柱上。因此，在一些實(shí)施方案中，提供了使用本文所述的色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)成分的混合物的樣品進(jìn)行非手性-手性分析的方法，其包含：通過在第一維度中的rplc拆分樣品中的非對映異構(gòu)體成分，這提供樣品的非手性純度；以及在相同分析允許條件下通過在第二維度中的sfc拆分對映異構(gòu)體對，這進(jìn)一步提供樣品中成分的手性純度(％對映異構(gòu)體過量)。樣品的非手性純度可以基于來自rplc分離的色譜圖確定，例如通過在第一分離單元的uv檢測器上獲得的色譜圖上的峰的相對峰面積來確定。每個對映異構(gòu)體對的手性純度或?qū)τ钞悩?gòu)體過量可以基于sfc分離的色譜圖確定，例如根據(jù)在第二分離單元的uv檢測器上獲得的色譜圖上的峰的相對峰面積或連接至第二分離單元的ms光譜儀上獲得的總離子色譜圖來確定。

應(yīng)當(dāng)預(yù)期和理解，可以將2d色譜系統(tǒng)的每個和每一實(shí)施方案用于分析復(fù)雜樣品的方法中或同時進(jìn)行非手性-手性分析的方法中，就如同每個和每一組合被單獨(dú)描述一樣。例如，在一些實(shí)施方案中，提供了使用2d色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)體成分的混合物的樣品同時進(jìn)行非手性-手性分析的方法，所述2d色譜系統(tǒng)包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器；

c)反相液相色譜(rplc)柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)超臨界流體色譜(sfc)柱；和

c)第二檢測器；

和

(iii)包含多個試樣環(huán)管的第一流體傳送路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述多個試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；

該方法包含：首先通過rplc在第一分離單元上拆分樣品中的非對映體成分，且然后在同一分析試驗中通過sfc在第二分離單元上拆分對映異構(gòu)體對。

在一些實(shí)施方案中，提供了使用2d色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)體成分的混合物的樣品同時進(jìn)行非手性-手性分析的方法，所述2d色譜系統(tǒng)包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器；

c)rplc柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)sfc柱陣列，其中該陣列中的sfc柱以平行配置排列；

c)第二流體傳送路線單元，其用于將第二流動相的流動引導(dǎo)至陣列中期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱；和

d)第二檢測器；

和

(iii)包含至少三個試樣環(huán)管的第一流體路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述試樣環(huán)管中的一個與上述第一分離單元流體連通，所述試樣環(huán)管中的另一個與第二分離單元流體連通，并且所述試樣環(huán)管中的至少一個與第一分離單元和第二分離單元流體隔離；

并且其中所述試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；

該方法包含：首先通過rplc在第一分離單元上拆分樣品中的非對映體成分，且然后在同一分析試驗中通過sfc在第二分離單元上拆分對映異構(gòu)體對。

在一些實(shí)施方案中，提供了使用2d色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)體成分的混合物的樣品同時進(jìn)行非手性-手性分析的方法，所述2d色譜系統(tǒng)包含：

(i)第一分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件；

b)用于將樣品導(dǎo)入第一分離單元的加樣注射器；

c)rplc柱；和

d)第一檢測器；

(ii)第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件；

b)sfc柱；和

c)第二檢測器；

(iii)包含至少三個試樣環(huán)管的第一流體路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至所述第一分離單元和所述第二分離單元，

其中所述試樣環(huán)管中的一個與所述第一分離單元流體連通，所述試樣環(huán)管中的另一個與所述第二分離單元流體連通，并且所述試樣環(huán)管中的至少一個與所述第一分離單元和第二分離單元流體隔離；

并且其中所述試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；

和

(iv)至少一個控制裝置，其可操作地連接至以下的一個或多個：

a)第一泵組件；

b)加樣注射器；

c)第一檢測器；

d)第一流體傳送路線單元；

e)第二泵組件；和

f)第二檢測器；

該方法包含：首先通過rplc在第一分離單元上拆分樣品中的非對映體成分，且然后在同一分析試驗中通過sfc在第二分離單元上拆分對映異構(gòu)體對。

方法

在另一個方面，提供了一種通過多維色譜(例如2drplc×sfc)分離樣品的方法，包含對俘獲在捕集柱上的一部分樣品進(jìn)行處理，所述部分通過反相液相色譜法(rplc)分離樣品而獲得，所述捕集柱包含固定相，以便通過超臨界流體色譜(sfc)進(jìn)一步分離。在一些實(shí)施方案中，提供了一種用于分離樣品的方法，包含以下步驟：(i)在俘獲柱上俘獲至少一部分樣品，所述部分通過反相液相色譜法(rplc)分離樣品而獲得，所述捕集柱包含固定相；和(ii)通過超臨界流體色譜(sfc)使捕集在捕集柱上的樣品的部分進(jìn)一步分離。

在一些實(shí)施方案中，該方法還包含通過反相液相色譜(rplc)分離樣品的步驟，包含：(i)將樣品導(dǎo)入第一流動相；(ii)驅(qū)動含有樣品的第一流動相通過rplc柱；和(iii)在rplc柱上分離樣品。在一些實(shí)施方案中，該方法還包含在通過rplc柱之后檢測在第一流動相中樣品成分的存在。在一些實(shí)施方案中，該方法還包含從捕集柱上洗脫捕集柱上俘獲的樣品的部分。在一些實(shí)施方案中，該方法還包含在進(jìn)一步分離后通過sfc檢測樣品的成分。

在一些實(shí)施方案中，該方法還包含將捕集柱定位在rplc柱下游的第一流動相的流動路徑中，以俘獲由rplc柱分離的樣品的至少一部分，和/或?qū)y帶俘獲部分的捕集柱切換至第二流動相的流動路徑，用于從捕集柱洗脫下俘獲的部分。rplc/sfc單元的流動相的流動路徑的捕集柱進(jìn)/出定位/切換可以在與2drplcxsfc色譜系統(tǒng)中的rplc單元和sfc單元接口的流體傳送路線裝置中進(jìn)行該裝置接口。

在一些實(shí)施方案中，該方法可以在2drplcxsfc色譜系統(tǒng)上進(jìn)行，配置該系統(tǒng)用于俘獲在捕集柱上的分析物的逆流洗脫。在這種變型中，第一流動相在第一方向上流經(jīng)捕集柱，并且俘獲在捕集柱上的部分樣品通過使第二流動相沿與第一方向相反的方向流過捕集柱而從捕集柱被洗脫出來。在一些實(shí)施方案中，該方法可以在2drplcxsfc色譜系統(tǒng)上進(jìn)行，配置該系統(tǒng)用于并流洗脫捕集柱上俘獲的分析物。在這種變型中，第一流動相在第一方向上流經(jīng)捕集柱，并且俘獲在捕集柱上的部分樣品通過使第二流動相沿與第一個方向相同的方向流過捕集柱而從捕集柱被洗脫出來。

在一些實(shí)施方案中，提供了用所述的多維色譜(例如本文所述的2drplc×sfc色譜系統(tǒng)或其任何變化形式)分離樣品的方法，其包含以下步驟：

(i)將樣品導(dǎo)入第一流動相中；

(ii)驅(qū)動包含樣品的第一流動相通過rplc柱；

(iii)在rplc柱上分離樣品；

(iv)在通過rplc柱后檢測第一流動相中樣品成分的存在；

(v)在第一捕集柱上俘獲在rplc柱上分離的樣品的至少第一部分，所述第一捕集柱包含固定相；

(vi)將在第一捕集柱上俘獲的樣品的第一部分從第一捕集柱上洗脫出來；

(vii)通過sfc對第一捕集柱上俘獲的樣品的第一部分進(jìn)行進(jìn)一步分離；和

(viii)在進(jìn)一步分離后通過sfc檢測樣品的成分。

在2d色譜的某些情況下，例如在綜合或假擬綜合模式中，可以將俘獲來自第一維度rplc的一個以上的級分俘獲在一個或多個捕集柱上，并在第二維度sfc中釋放用于分析。因此，在一些實(shí)施方案中，該方法還包含以下步驟：

(ix)在第二捕集柱上俘獲在rplc柱上分離的樣品的至少第二部分，所述第二捕集柱包含固定相；

(x)將俘獲在第二捕集柱上的樣品的第二部分從第二捕集柱洗脫出來；

(xi)通過sfc對俘獲在第二捕集柱上的樣品的第二部分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

這些步驟可以重復(fù)多次以俘獲/釋放多個級分。

在一些實(shí)施方案中，提供了使用多維色譜(例如本文所述的2drplcxsfc色譜系統(tǒng)或其任何變化形式)分離樣品的方法，包含以下步驟：

(i)將樣品導(dǎo)入第一流動相中；

(ii)驅(qū)動包含樣品的第一流動相通過rplc柱；

(iii)在rplc柱上分離樣品；

(iv)在通過rplc柱后檢測第一流動相中樣品成分的存在；

(v)將捕集柱定位在rplc柱下游的第一流動相的流動路徑中；

(vi)在捕集柱上俘獲在rplc柱上分離的樣品的至少一部分，所述捕集柱包含固定相；

(vii)將攜帶俘獲部分的捕集柱切換到第二流動相的流動路徑；

(viii)將從捕集柱上俘獲的樣品的部分從捕集柱上洗脫出來；

(ix)通過sfc對俘獲在捕集柱上的樣品的一部分進(jìn)行進(jìn)一步分離；和

(x)通過sfc進(jìn)一步分離后檢測樣品的成分。

在一些實(shí)施方案中，步驟(i)至(x)按照列出的順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，重復(fù)步驟(iv)至(x)一次或多次，直到所有感興趣的級分得到分析為止。

在這些實(shí)施方案的一些中，rplc柱包含反相固定相，例如，包含反相材料例如c-18相(例如c-18二氧化硅)、c-8相(例如c-8二氧化硅)、c-4相(例如c-4二氧化硅)或本文所述的其它反相材料的固定相。在這些實(shí)施方案的一些中，捕集柱中的固定相包含反相材料，例如c-18相(例如c-18二氧化硅)、c-8相(例如c-8二氧化硅)、c-4相(例如c-4二氧化硅)或本文所述的其它反相材料。

在這些實(shí)施方案的一些中，sfc分離在包含正相固定相的sfc柱上進(jìn)行，例如包含正相硅膠或本文所述的其它正相材料的固定相。在這些實(shí)施方案的一些中，sfc分離在選自平行配置的sfc柱的陣列的sfc柱上進(jìn)行，該陣列中的每個sfc柱可以包含可以相同或不同的固定相。scf柱中的固定相材料可以適于分離樣品中的特定成分。

在這些實(shí)施方案中的一些中，該方法還可以包含在sfc柱上進(jìn)一步分離之前，將俘獲在捕集柱上的級分洗脫的分析物集中于聚焦柱上。聚焦柱包含固定相，其可以與捕集柱中使用的固定相相同，也可以不同。在一些實(shí)施方案中，聚焦柱裝載了包含反相材料例如本文所述的c-18相、c-8相、c-4相或其它反相材料的固定相。

用于分離本文所描述的樣本的方法可以適用于本文描述的2drplcxsfc色譜系統(tǒng)或其所描述的任何實(shí)施方案或其變化形式。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例來示例而不是限制本發(fā)明。

化學(xué)品和試劑

二氧化碳(co2)得自praxair(danbury，ct，usa)。乙腈(acn)購自avantor’sj.t.baker(centervalley，pa，usa)。甲醇(meoh)、異丙醇(ipa)、乙醇(etoh)、98.0％-100.0％甲酸和28.0％-30.0％氫氧化銨(nh4oh)購自emdchemicals(gibbstown，nj，usa)。甲酸銨購自sigmaaldrich(st.louis，mo，usa)。hplc級微孔水得自purelab超微孔水分配器。反式茋氧化物(tso)購自tci(tokyo，japan)。本研究中使用的藥物物質(zhì)a由genentech，ca，usa的加工化學(xué)系合成。

實(shí)施例1-儀器

分析儀器是帶有來自agilenttechnologies(santaclara，ca，usa)的質(zhì)譜儀的agilenttechnologies(santaclara，ca，usa)定制的二維12602d-lc-sfc系統(tǒng)。rplc單元由agilent1260四元泵(g1311b)、1260hipals自動進(jìn)樣器(g1367e)和agilent1260多波長紫外檢測器(g1365c)組成。由于高壓考慮，整個系統(tǒng)都使用不銹鋼管件和管道。sfc單元由帶有三位溶劑控制閥的1260sfc二元泵(g4302a)、1260hip脫氣器(g4225a)、1290恒溫柱室(g1316c)、8-位agilent1290無限遠(yuǎn)程閥門驅(qū)動器(g1170a)、配備高壓流動池的agilent1260dad(g1315c)和agilent1260無限sfc控制模塊(g4301a)組成。sfc流動的一部分定向于agilent6120四極ms。使用agilent1260iso泵(g1310b)產(chǎn)生0.15ml/min的補(bǔ)充流量，以補(bǔ)償scco2的損耗。安裝了agilent1290flexcube(g4227a)，以便能夠使用定制的12-端口切換閥在不同的捕集柱上實(shí)現(xiàn)多峰停車。儀器控制和數(shù)據(jù)采集由agilentchemstation軟件(santaclara，ca，usa)完成。

圖10是示例性停車甲板閥(例如圖9中中所示的閥v2)的攝影圖像。如圖10中所示，有四個捕集柱可用于峰停車。另外，如圖中所示，存在旁路環(huán)管，其允許來源于第一分離單元的流動相或來源于第二分離單元的流動相流向下游而不通過捕集柱。

實(shí)施例2

這項研究的主要目的在于評價從第一維度向第二維度轉(zhuǎn)移的流動相的體積對第二維度(sfc)中分離的分辨率的影響。此處，使用多維色譜系統(tǒng)分離反式茋氧化物(tso)的對映異構(gòu)體。第一維度(rplc)使用具有無捕集柱的試樣環(huán)管的閥與第二維(sfc)接口。試樣環(huán)管用于存儲選定體積的第一流動相，其含有從第一維度洗脫的樣品的一部分。隨后，將存儲在試樣環(huán)管中的第一流動相的體積轉(zhuǎn)移到第二維以便進(jìn)一步分離。使用允許存儲和隨后轉(zhuǎn)移6μl、12μl和24μl流動相的試樣環(huán)管。

對于第一rplc維度，在0.2ml/min的流速下，在使用90/10acn/水的等度條件下使用acquityuplchsst31.8μm2.1×50mm柱。uv檢測在225nm進(jìn)行。

對于第二sfc維度，在40℃下使用chiralcelod33.0μm4.6mm×50mm柱，其具有95：5scco2(mpa)/ipa與0.1％nh4oh(mpb)的等度流。流量為4.0ml/min，出口壓力為130巴，噴嘴溫度為60℃。

用于該實(shí)驗的俘獲環(huán)管是彎曲毛細(xì)管(0.5mm×150mm，內(nèi)部體積約29μl)。三次切換時間為分別相當(dāng)于6μl、12μl和24μl轉(zhuǎn)移體積(基于0.2ml/min的流速)的0.03min、0.06min和0.12min。

圖11是使用具有三個試樣環(huán)管配置(6μl、12μl、24μl)的系統(tǒng)的tso的多維分離的uv吸光度測量(mau)隨時間(分鐘)變化的編輯色譜圖。如圖11中所示，將第一流動相的轉(zhuǎn)移體積增加到第二維度降低了第二維度中的分辨率和靈敏度。

實(shí)施例3

在本實(shí)施例中，評價了使用包含捕集柱的界面將樣品從第一維度(rplc)轉(zhuǎn)移到第二維度(sfc)的效率。

使用圖8a和圖8b中所示例的2dlc-sfc系統(tǒng)分析了從0.005mg/ml至0.25mg/ml的tso標(biāo)準(zhǔn)溶液。第二檢測器是uv檢測器?；趤碜詫?shí)施例2的結(jié)果，評價內(nèi)部體積低的c18反相捕集柱。

在第一維度中使用的反相色譜儀是來自waterscorporation(milford，ma，usa)的acquityuplchsst3柱(50×2.1mm，1.8μm)。第一維度中的分離在0.2ml/min的流速下、在50：50(50％甲酸水溶液)：0.05％acn中的甲酸)的等度條件下進(jìn)行。rplc柱在40℃下置于sfc熱柱室中。在225nm處進(jìn)行uv檢測。第一維度注射體積為5μl。

在第二維度中使用的超臨界流體色譜儀是來自chiraltechnologies(westchester，pa，usa)的chiralcelod3柱(50×4.6mm，3.0μm)。在第二維度中的分離在95：5(scco2)：異丙醇與0.1％氫氧化銨的等度流下進(jìn)行。使用的柱溫為40℃，并且將流速設(shè)定在4.0ml/min，出口壓力為130巴，噴嘴溫度為60℃。sfc柱頂部處使用聚焦柱是可選的。

如上所述，在二維界面中使用了小體積捕集柱。具體地，使用的捕集柱是來自chromaniktechnologies(osaka，japan)的sunshellc18柱(5.0×1.0mm，5μm)。

在50∶50acn/水中制備tso標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005mg/ml)。將跨越tso峰頂點(diǎn)的0.8min(～160μl)的窗口轉(zhuǎn)移到用初始sfc條件(100％scco2)調(diào)節(jié)的捕集柱。初始保持在0％(ipa與0.1％nh4oh)，切換后維持第一個0.2min，然后在0.1min內(nèi)升至5％(ipa與0.1％nh4oh)，保持2.35min。柱用0％(ipa與0.1％nh4oh)再平衡0.2min。樣品一式三份運(yùn)行。在第二維度中的檢測通過在225nm處的uv檢測進(jìn)行。

圖12是不同濃度的tso的多維分離的uv吸光度測量(mau)隨時間(分鐘)變化的編輯色譜圖。在第一維度中分離后測量上部色譜圖。觀察到tso標(biāo)準(zhǔn)品的對映異構(gòu)體在反相主柱中共洗脫。從檢測后主柱洗脫出來的峰被轉(zhuǎn)移到捕集柱，并反沖洗入次級柱用于進(jìn)一步分離。如圖12中所示，在第二維度中分離后測量下部色譜圖。此處，觀察到tso標(biāo)準(zhǔn)品的對映體為在第二手性柱中拆分的基線。

此外，如圖12中所示，疊加圖顯示了檢測器響應(yīng)在相關(guān)系數(shù)大于0.99的評價濃度范圍內(nèi)的線性(數(shù)據(jù)未顯示)。在不同的研究中，將10至100μl(通過定時閥v1)的體積轉(zhuǎn)移到次級sfc柱。本研究的結(jié)果顯示了在評價范圍內(nèi)的線性響應(yīng)(結(jié)果未顯示)。

實(shí)施例4

在本實(shí)施例中，進(jìn)一步測試實(shí)施例3中描述的2dlc-sfc系統(tǒng)，以證明對藥物物質(zhì)a的樣品同時進(jìn)行非手性-手性分析的能力。

在第一維度中使用的反相色譜圖是來自waterscorporation(milford，ma，usa)的sunfirec18柱(150×3.0mm，3.5μm)，溫度為40℃。mpa為5mm甲酸銨，ph3.3而mpb在acn中為0.05％甲酸。rplc柱的mp程序在5分鐘內(nèi)為5％b至25％b，在25分鐘內(nèi)至29％b，30分鐘內(nèi)至90％b，然后在5％b下再平衡5min。將流速設(shè)定為1.0ml/min。第一維度uv檢測在340nm進(jìn)行。第一維注射體積為5μl。

在第二維度中使用的超臨界流體色譜圖是來自chiraltechnologies(westchester，pa，usa)的chiralpakic3柱(50×4.6mm，3μm)，其中溫度為40℃，初始mp流量為包含0.1％氫氧化銨(mpb)的65：35scco2(mpa)/甲醇。流速為4.0ml/min，出口壓力為130巴，噴嘴溫度為60℃。來自agilenttechnologies(santaclara，ca，usa)的四個zorbaxeclipsexdb-c18柱(5.0x2.1mm，1.8μm)用作捕集柱。

在具有0.05％fa的25：75acn/水中以0.5mg/ml制備藥物物質(zhì)a的樣品。將跨越頂點(diǎn)的0.1min(100μl)的窗口轉(zhuǎn)移到預(yù)調(diào)整的捕集柱。將sfc柱維持在等度保持(35％mpb)0.5min，然后在2min分鐘內(nèi)至55％b，保持3min分鐘。將柱在35％b下再平衡0.2min。第二維度中的檢測通過在565m/z的sim-ms檢測進(jìn)行。

如圖13中所示，非手性和手性純度結(jié)果分別為99.0％和100％對映異構(gòu)體過量(％ee)。未檢測到測定對映體的未標(biāo)記樣品(下部)、具有0.1％不期望的對映異構(gòu)體的樣品(中部)以及具有0.5％不期望的對映異構(gòu)體的樣品(上部)的重疊圖顯示該系統(tǒng)檢測不期望的對映異構(gòu)體在0.1％的水平的能力。

實(shí)施例5

進(jìn)行本研究以證明在2dlc-sfc系統(tǒng)的第二維度sfc和常規(guī)(1d)sfc之間的靈敏度和分辨率的可比性。

2dlc-sfc系統(tǒng)與實(shí)施例4中使用的系統(tǒng)相同。流動相程序和切換時間被修改。在第一維度中，流動相程序為25％b，5分鐘，25％至90％b，15分鐘，然后在25％b下再平衡5分鐘。在峰頂?shù)?.1min(100μl)的窗口被轉(zhuǎn)移到捕集柱。常規(guī)sfc的條件與2dlc-sfc(在實(shí)施例4中描述)的第二維度中使用的條件相同。

使用兩種技術(shù)(2dlc-sfc和sfc)分析包含不同水平的不期望的對映異構(gòu)體(0.1-2.0％范圍)的藥物物質(zhì)a樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液。來自sfc和2dlc-sfc技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖的疊加分別顯示在圖14a和圖14b中。結(jié)果示例了用兩種技術(shù)獲得的相差無幾的分離。與常規(guī)sfc相比，在2dlc-sfc中的分辨率和靈敏度均保留下來。

如實(shí)施例2中所示，將反相流動相導(dǎo)入sfc維度不利地影響sfc分離的分辨率和靈敏度。盡管此處描述的2dlc-sfc系統(tǒng)仍將反相流動相導(dǎo)入sfc維度，但是使用捕集柱可以允許不損害下游sfc分離的lc-sfc界面。

實(shí)施例6

在本實(shí)施例中，顯示了在單一分析中期望的靈敏度和選擇性的復(fù)雜手性色譜分離。

藥物物質(zhì)a具有三個手性中心且由此具有四對非對映體(八個潛在的立體異構(gòu)體)。在30/70acn/水中以0.05mg/ml制備4種非對映異構(gòu)體對的混合物。每對中兩種對映異構(gòu)體的比例(rrs/srr，srs/rsr，sss/rrr；rrs/ssr)約為2∶1。

使用圖9中所示的2dlc-sfc系統(tǒng)分離各立體異構(gòu)體。主柱中的實(shí)驗條件與實(shí)施例4中所述的實(shí)驗條件相同。使用四個捕集柱與第二維度中的flexcube(agilent)一起以俘獲4個非對映異構(gòu)體對。樣品注射后，捕集柱用包含0.1％氫氧化銨(mpb)的60∶40scco2(mpa)/甲醇(mpb)調(diào)節(jié)1分鐘，捕集柱2除外，其用含有0.1％氫氧化銨(mpb)的65∶35scco2(mpa)/甲醇調(diào)節(jié)。相當(dāng)于在10.55min、10.95min、11.80min和13.30min的非對映峰頂點(diǎn)的0.1min(100μl)窗口的主柱洗脫液依次被轉(zhuǎn)移入四個捕集柱中。將俘獲的成分在第二維度分別于14.0min、18.0min、23.5min和27.5min依次開始進(jìn)行色譜。初始保持包含0.1％氫氧化銨(mpb)的60∶40scco2(mpa)/甲醇，在切換后維持第一個0.5min，然后在2.5min內(nèi)升至包含0.1％氫氧化銨(mpb)的40∶60scco2(mpa)/甲醇，保持0.3min，除外俘獲的成分2。對于成分2，初始保持在包含0.1％氫氧化銨(mpb)的65∶35scco2(mpa)/甲醇中，在切換后第一分鐘維持1min，然后在3.0min內(nèi)升至包含0.1％氫氧化銨(mpb)的55∶45scco2(mpa)/甲醇(mpb)，保持0.3min。第二維度中的檢測通過在565m/z的sim-ms檢測進(jìn)行。

如圖15中所示例的，主要的非手性rplc柱拆分了來自api的四種非對映體對(rss/srr，srs/rsr，rrr/sss，ssr/rrs)和其它與工藝相關(guān)的雜質(zhì)，從而提供了非手性純度。然后將這些非對映異構(gòu)體對中的每一個從主rplc柱(檢測后)依次轉(zhuǎn)移到閥2中的四個不同的捕集柱(v2；圖9)。然后將俘獲的非對映體級分依次反沖洗并在次級sfc手性柱上進(jìn)行分析，從而提供手性純度。通過向次級手性柱提供更簡單的樣品混合物，可以更有效地拆分潛在的立體異構(gòu)體。如圖15中所示，相當(dāng)于四個非對映異構(gòu)體對的八個立體異構(gòu)體在第二sfc維度上使用ms檢測被成功拆分。使用停車甲板閥，2dlc-sfc的應(yīng)用擴(kuò)展到具有難以通過常規(guī)手性色譜法拆分的多個手性中心的化合物的分析。

實(shí)施例7

進(jìn)行本研究以測試2dlc-sfc系統(tǒng)，其中聚焦柱位于sfc柱的頂部。

2dlc-sfc條件與實(shí)施例3中所述的相同。此外，以與實(shí)施例3中所述相同的方式制備tso樣品。簡言之，tso標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005mg/ml)在50∶50acn/水中制備。第一維度注射體積為5μl。此外，對于用聚焦柱完成的那些分析，將聚焦柱放置在sfc柱的頂部。使用的聚焦柱是來自agilenttechnologies(santaclara，ca，usa)的pursuitxrc18(20x2.0mm，5um)。

圖16中顯示了使用和不使用聚焦柱的tso標(biāo)準(zhǔn)品的一系列濃度的2dlc-sfc分離。在兩種條件下對tso對映異構(gòu)體進(jìn)行基線拆分。然而，使用聚焦柱，導(dǎo)致峰高v/s峰面積的斜率的增加，從而改善了第二維度(峰1)中的信噪比(s/n)比。對峰2觀察到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

示例性實(shí)施方案

通過以下實(shí)施方案進(jìn)一步描述本發(fā)明。如果適合和切實(shí)可行，則所述實(shí)施方案各自的特征可以與另外的實(shí)施方案的任一項組合。

實(shí)施方案1.在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于分離樣品的色譜系統(tǒng)，包含：

第一分離單元，其包含：

a)用于驅(qū)動第一流動相通過第一分離單元的第一泵組件，

b)用于將樣品導(dǎo)入到第一分離單元的加樣注射器；和

c)反相液相色譜(rplc)柱；

第二分離單元，包含：

a)用于驅(qū)動第二流動相通過第二分離單元的第二泵組件，

和

b)超臨界流體色譜(sfc)柱；

和

包含多個試樣環(huán)管的第一流體傳送路線單元，所述第一流體傳送路線單元連接至第一分離單元和第二分離單元，

其中所述多個試樣環(huán)管中的至少一個包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；

且

其中色譜系統(tǒng)被配置用于首先分離第一分離單元中的樣品，且然后將從rplc柱上洗脫的樣品的至少一部分導(dǎo)入第二分離單元。

實(shí)施方案2.在實(shí)施方案1的另一個實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元包含兩個試樣環(huán)管；其中兩個試樣環(huán)管中的一個與第一分離單元流體連通，并且兩個試樣環(huán)管中的另一個與第二分離單元流體連通。

實(shí)施方案3.在實(shí)施方案1的另一個實(shí)施方案中，其中第一流體傳送路線單元包含至少三個樣品環(huán)管，并且其中至少一個樣品環(huán)管與第一分離單元和第二分離單元流體隔離。

實(shí)施方案4.在實(shí)施方案3的另一個實(shí)施方案中，包含固定相材料的至少一個試樣環(huán)管與第一分離單元和第二分離單元流體隔離。

實(shí)施方案5.在實(shí)施方案1的另一個實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元包含多個捕集柱，每個捕集柱位于試樣環(huán)管中。

實(shí)施方案6.在實(shí)施方案1-5的任一項的另一個實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元被配置為當(dāng)所述試樣環(huán)管位于與第一分離流體連通時，允許流體沿第一方向流過試樣環(huán)管，并且當(dāng)所述試樣環(huán)管位于與第二分離單元流體連通時，允許流體沿著與第一方向相反的方向流過所述試樣環(huán)管。

實(shí)施方案7.在實(shí)施方案1-5的任一項的另一個實(shí)施方案中，第一流體傳送路線單元被配置為當(dāng)所述試樣環(huán)管位于與第一分離單元流體連通時允許流體沿第一方向流過試樣環(huán)管，并且當(dāng)所述試樣環(huán)管位于與第二分離單元流體連通時，允許流體沿與第一方向相同的方向流過所述試樣環(huán)管。

實(shí)施方案8.在實(shí)施方案1-7的任一項的另一個實(shí)施方案中，rplc柱包含反相固定相。

實(shí)施方案9.在實(shí)施方案8的另一個實(shí)施方案中，反相固定相包含c-18相(例如c-18二氧化硅)。

實(shí)施方案10.在實(shí)施方案8或9的另一個實(shí)施方案中，捕集柱中的固定相包含反相材料。

實(shí)施方案11.在實(shí)施方案9的另一個實(shí)施方案中，反相材料包含c-18相(例如c-18二氧化硅)。

實(shí)施方案12.在實(shí)施方案1-11的任一項的另一個實(shí)施方案中，第二分離單元包含一個sfc柱。

實(shí)施方案13.在實(shí)施方案12的另一個實(shí)施方案中，sfc柱包含正相固定相。

實(shí)施方案14.在實(shí)施方案13的另一個實(shí)施方案中，正相固定相包含硅膠。

實(shí)施方案15.在實(shí)施方案1-14的任一項的另一個實(shí)施方案中，第二分離單元還包含位于sfc柱上游的聚焦柱。

實(shí)施方案16.在實(shí)施方案15的另一個實(shí)施方案中，所述聚焦柱包含反相材料。

實(shí)施方案17.在實(shí)施方案1-11的任一項的另一個實(shí)施方案中，第二分離單元包含：a)sfc柱陣列，其中該陣列中的sfc柱以平行結(jié)構(gòu)排列；和b)第二流體傳送路線單元，用于將第二流動相的流體引導(dǎo)至所述陣列中期望的(或預(yù)先鑒定的)sfc柱。

實(shí)施方案18.在實(shí)施方案17的另一個實(shí)施方案中，第二分離單元還包含位于sfc柱陣列中的每個sfc柱的上游的聚焦柱。

實(shí)施方案19.在實(shí)施方案1-18的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含位于rplc柱下游的第一檢測器。

實(shí)施方案20.在實(shí)施方案1-19的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含位于sfc柱下游的第二檢測器。

實(shí)施方案21.在實(shí)施方案1-20的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含至少一個可操作地連接至以下一個或多個的控制裝置：a)第一泵組件；b)加樣注射器；c)第一檢測器；d)第一流體傳送路線單元；e)第二泵組件；和f)第二檢測器。

實(shí)施方案22.在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于分離樣品的方法，包含以下步驟：

(i)在捕集柱上俘獲樣品的至少一部分，所述部分通過反相液相色譜(rplc)分離樣品獲得，所述捕集柱包含固定相；和

(ii)通過超臨界流體色譜(sfc)對俘獲在捕集柱上的樣品的部分進(jìn)行分離。

實(shí)施方案23.在實(shí)施方案22的另一個實(shí)施方案中，還包含用反相液相色譜分離樣品，包含：

(i)將樣品導(dǎo)入第一流動相中；

(ii)驅(qū)動含有樣品的第一流動相通過rplc柱；和

(iii)在rplc柱上分離樣品。

實(shí)施方案24.在實(shí)施方案23的另一個實(shí)施方案中，還包含在通過rplc柱之后檢測在第一流動相中樣品成分的存在。

實(shí)施方案25.在實(shí)施方案22-24的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含將捕集柱俘獲上的樣品的部分從捕集柱上洗脫掉。

實(shí)施方案26.在實(shí)施方案22-25的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含檢測通過sfc進(jìn)一步分離后樣品的成分。

實(shí)施方案27.在實(shí)施方案22-26的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含將捕集柱定位在rplc柱第一流動相下游的流動路徑中，用于俘獲通過rplc柱分離的樣品的至少一部分。

實(shí)施方案28.在實(shí)施方案27的另一個實(shí)施方案中，還包含將攜帶俘獲部分的捕集柱切換到第二流動相的流動路徑，用于從捕集柱上洗脫俘獲的部分。

實(shí)施方案29.在實(shí)施方案28的另一個實(shí)施方案中，將捕集柱定位在第一流動相的流動路徑中的步驟或?qū)⒉都袚Q到第二流動相的流動路徑的步驟在與prlc的流體路徑和sfc的流體路徑的接口的流體傳送路線單元中進(jìn)行。

實(shí)施方案30.在實(shí)施方案22-29的任一項的另一個實(shí)施方案中，還包含在通過sfc進(jìn)一步分離之前，再俘獲從聚焦柱上的捕集柱上洗脫出來的至少一部分樣品。

實(shí)施方案31.在實(shí)施方案22-30的任一項的另一個實(shí)施方案中，第一流動相沿第一個方向流過捕集柱，且俘獲在捕集柱上的部分樣品從俘獲通過使第二流動相以與第一方向相反的方向流過捕集柱從捕集柱上被洗脫出來。

實(shí)施方案32.在實(shí)施方案22-30的任一項的另一個實(shí)施方案中，第一個流動相沿第一個方向流過捕集柱，且俘獲在捕集柱上的部分樣品通過使第二流動相以與第一方向相同的方向流過捕集柱從捕集柱上被洗脫出來。

實(shí)施方案33.在實(shí)施方案22的另一個實(shí)施方案中，包含下列步驟：

(i)將樣品導(dǎo)入第一流動相中；

(ii)驅(qū)動包含樣品的第一流動相通過rplc柱；

(iii)在rplc柱上分離樣品；

(iv)在通過rplc柱后檢測第一流動相中樣品成分的存在；

(v)在第一捕集柱上俘獲在rplc柱上分離的樣品的至少第一部分，所述第一捕集柱包含固定相；

(vi)從第一捕集柱上洗脫下在第一捕集柱上俘獲的樣品的第一部分；

(vii)通過sfc對第一捕集柱上俘獲的樣品的第一部分進(jìn)行進(jìn)一步分離；和

(viii)檢測通過sfc進(jìn)一步分離后樣品的成分。

實(shí)施方案34.在實(shí)施方案33的另一個實(shí)施方案中，還包含下列步驟：

(ix)在第二捕集柱上俘獲在rplc柱上分離的樣品的至少第二部分，所述第二捕集柱包含固定相；

(x)從第二捕集柱上洗脫下俘獲在第二捕集柱上的樣品的第二部分；

(xi)通過sfc對俘獲在第二捕集柱上的樣品的第二部分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

實(shí)施方案35.在實(shí)施方案22-34的任一項的另一個實(shí)施方案中，rplc柱包含反相固定相。

實(shí)施方案36.在實(shí)施方案22-35的任一項的另一個實(shí)施方案中，捕集柱中的固定相包含反相材料。

實(shí)施方案37.在實(shí)施方案22-36的任一項的另一個實(shí)施方案中，通過sfc的進(jìn)一步分離在包含正相固定相的sfc柱上進(jìn)行。

實(shí)施方案38.在實(shí)施方案22-36的任一項的另一個實(shí)施方案中，通過sfc的進(jìn)一步分離在包含sfc柱陣列的sfc系統(tǒng)上進(jìn)行。

實(shí)施方案39.在實(shí)施方案38的另一個實(shí)施方案中，sfc柱各自獨(dú)立地包含正相固定相。

實(shí)施方案40.在實(shí)施方案39的另一個實(shí)施方案中，還包含使捕集柱上俘獲的樣品的部分按照傳送路線至sfc柱以進(jìn)一步分離，所述sfc柱包含適于分離樣品中的成分的固定相。

實(shí)施方案40a.在實(shí)施方案22的另一個實(shí)施方案中，包含使俘獲在捕集柱上的樣品的部分按照傳送路線至sfc柱以用于進(jìn)一步分離，所述sfc柱包含適于分離樣品中的成分的固定相。

實(shí)施方案41.在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用實(shí)施方案1的色譜系統(tǒng)分析樣品的方法，包含：通過反相液相色譜(rplc)在第一分離單元上將復(fù)雜樣品分離成第一組級分；并且在第二分離單元上通過超臨界流體色譜(sfc)進(jìn)一步分離一個或多個級分。

實(shí)施方案42.在實(shí)施方案41的另一個實(shí)施方案中，第一分離單元上通過rplc的分離部分地基于復(fù)雜樣品的第一個特征，且在第二分離單元上通過sfc的分離部分地基于復(fù)雜樣品的第二個特征，所述復(fù)雜樣品的第二個特征與復(fù)雜樣品的第一個特征不同。

實(shí)施方案43.在實(shí)施方案41的另一個實(shí)施方案中，所述復(fù)雜樣品包含立體異構(gòu)體成分的混合物。

實(shí)施方案44.在實(shí)施方案43的另一個實(shí)施方案中，通過第一分離單元上的rplc將非對映異構(gòu)體成分分離為一個或多個級分，所述級分各自包含對映異構(gòu)體對。

實(shí)施方案45.在實(shí)施方案44的另一個實(shí)施方案中，第一分離單元上通過rplc的分離部分地基于復(fù)雜樣品的疏水性。

實(shí)施方案46.在實(shí)施方案44或45的另一個實(shí)施方案中，在第二分離單元上通過sfc進(jìn)一步將對映異構(gòu)體對分離為單獨(dú)的對映異構(gòu)體。

實(shí)施方案47.在實(shí)施方案46的另一個實(shí)施方案中，第二分離單元上通過sfc的分離部分地基于復(fù)雜樣品的手性。

實(shí)施方案48.在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用實(shí)施方案1的色譜系統(tǒng)對包含立體異構(gòu)體成分的混合物的樣品進(jìn)行非手性手性分析的方法，包含：在第一分離單元上通過rplc分離樣品中感興趣的一個或多個非對映體成分；和在相同的分析試驗中在第二分離單元上通過sfc分離感興趣的對映異構(gòu)體對。

實(shí)施方案49.在實(shí)施方案48的另一個實(shí)施方案中，還包含基于來自rplc分離的色譜圖確定非手性純度，并且基于來自sfc分離的色譜圖確定手性純度。

將貫穿于始終的全部參考文獻(xiàn)例如出版物、專利、專利申請和公布的專利申請以其完整的形式并入本文作為參考。

盡管已經(jīng)為清楚理解的目的通過示例和實(shí)施例在一定程度上詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可以實(shí)施一些小的改變和變型。因此，所述描述和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被視為限定本發(fā)明的范圍。