一種雙螺旋微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙螺旋微流控芯片，其包括芯片入口、雙螺旋芯片、紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口、流體出口和細(xì)胞濾膜，其中所述芯片由雙螺旋型通道構(gòu)成，該雙螺旋通道分別沿兩個相互平行的芯片切線方向開孔，形成兩個平行反向的開口，一個開口與所述芯片入口相連，另一個開口分別與紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口以及流體出口相連。所述雙螺旋微流控芯片可自動對樣品進(jìn)行上樣、染色和洗滌，可高通量和自動化的分離、富集白血病人血液或/和胸腔積液的白細(xì)胞，這極大的提高診斷的準(zhǔn)確性和精確度，同時也可用于對患者體內(nèi)病變白細(xì)胞的分離，具有治療效果。
【專利說明】一種雙螺旋微流控芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于疾病檢測和治療的芯片，具體涉及一種 用于白血病檢測和治療的微流控芯片。

【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因為增殖失控、分 化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官， 同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和 骨骼疼痛。據(jù)報道，我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。兒童及青少年急 性白血病多起病急驟。常見的首發(fā)癥狀包括發(fā)熱、進(jìn)行性貧血、顯著的出血傾向或骨關(guān)節(jié)疼 痛等。起病緩慢者以老年及部分青年病人居多，病情逐漸進(jìn)展。此外，少數(shù)患者可以抽搐、 失明、牙痛、牙齦腫脹、心包積液、雙下肢截癱等為首發(fā)癥狀。
[0003] 微流控芯片（microfluidics)，是指把化學(xué)生物領(lǐng)域所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分 離檢測，以及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成到一塊很小的芯片上，芯片內(nèi)設(shè)計 了適當(dāng)結(jié)構(gòu)的微通道網(wǎng)絡(luò)以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以實現(xiàn)常規(guī)化學(xué)或生物實驗室的各 種功能。微流控芯片在疾病診斷、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、司法鑒定等事關(guān)人類生存 質(zhì)量的許多方面具有非常強大的運用前景?，F(xiàn)階段，微流控芯片在生物學(xué)最重要的應(yīng)用領(lǐng) 域是細(xì)胞生物學(xué)。微流控芯片的研究對象是活細(xì)胞，它可直接觀察實驗條件下的細(xì)胞變化， 是普通蛋白或者基因芯片無法替代的。
[0004] 專利CN102879377A公開了一種早期檢測白血病的微流控芯片，該芯片由基片和 檢測器組成，其特征在于：微流控檢測裝置貼附于基片上，微流控檢測裝置順序地包括細(xì) 胞進(jìn)樣元件、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染元件、蛇形通道相通、細(xì)胞捕獲元件以及生化試劑及生長因子加載元 件。細(xì)胞在泵的壓力下，會沿螺旋通道運動，依靠不同的離心力，使細(xì)胞走不同的通道。同 時每一條通道的另一端安裝有電場分選裝置，經(jīng)過電場分選裝置的通道與細(xì)胞捕獲元件連 通，細(xì)胞進(jìn)入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染元件相再與接液池相連通。該芯片需要電場分選裝置實現(xiàn)細(xì)胞的分 離，并通過細(xì)胞捕獲元件與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染元件確認(rèn)分離后的白細(xì)胞。該芯片整體制備復(fù)雜、操作 流程多且成本高。
[0005] 因此，需要一種制備簡單、流程較少、成本低且診斷效果良好的微流控芯片。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提出一種自動分離、富集外周血中病變的白細(xì)胞，并對其自動 染色的微流控芯片系統(tǒng)。
[0007] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種雙螺旋微流控芯片，其包括芯片入口、雙螺旋芯片、紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口、 流體出口和細(xì)胞濾膜，其中所述芯片由雙螺旋型通道構(gòu)成，該雙螺旋通道分別沿兩個相互 平行的芯片切線方向開孔，形成兩個平行反向的開口，一個開口與所述芯片入口相連，另一 個開口分別與紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口以及流體出口相連。三個出口的寬度分別為100 μ m、 110 μ m和90 μ m，且此三個出□互相平行。
[0009] 所述芯片入口連接塑料管，塑料管另一端連接生物樣品注射器，通過注射泵將生 物樣品恒速注入所述芯片，該流速為10_300ml/h，優(yōu)選10-60ml/h，例如10ml/h、20ml/h、 25ml/h、30ml/h或60ml/h。所述生物樣品為外周血、末梢血和/或胸腔積液，其中含有不同 大小及種類的細(xì)胞，本發(fā)明的主要目的是分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞，血小板直徑較小，對白細(xì)胞 的分離富集影響不大。
[0010] 注射器中的生物樣品，通過注射泵恒速流入雙螺旋芯片。當(dāng)樣品高速連續(xù)通過雙 螺旋微通道時，不同大小的白細(xì)胞和血細(xì)胞在流體力作用下，逐漸匯聚成線并產(chǎn)生不同的 橫向遷移。通過在通道下游設(shè)計3個平行出口，不同大小、種類的細(xì)胞可在不同的出口富 集，在本發(fā)明限定的流速范圍內(nèi)，細(xì)胞會因其尺寸大小的差異，承受不同的流體力，各尺寸 細(xì)胞在管道內(nèi)形成空間上的差異排列，最終從不同的出口流出。其中，大部分的白細(xì)胞在匯 聚成線后，會從中間的出口流出，實現(xiàn)白細(xì)胞與紅細(xì)胞的初步分離。
[0011] 所述細(xì)胞濾膜位于所述白細(xì)胞出口，孔徑為1-1〇μπι，優(yōu)選為8-10μπι，最優(yōu)選 8 μ m?？赏ㄟ^調(diào)整孔徑大小來攔截正常細(xì)胞、病變白細(xì)胞、或正常白細(xì)胞和病變白細(xì)胞。該 細(xì)胞濾膜具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑較小于直徑為10-12 μ m的白細(xì)胞，當(dāng)匯聚后的白細(xì)胞通過所 述白細(xì)胞出口處時，濾膜可以使流體通過，并將白細(xì)胞攔截在膜上，實現(xiàn)白細(xì)胞的進(jìn)一步富 集。在白細(xì)胞富集的基礎(chǔ)上，我們通過使用注射泵從所述芯片入口注入細(xì)胞染色劑，可實現(xiàn) 細(xì)胞濾膜上白細(xì)胞的自動染色?？墒褂萌我膺m合于細(xì)胞染色的染色劑，在本發(fā)明的一個實 施例中，所用染色法為Gomori&Masson法。
[0012] 在本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片的工作過程中，首先將待測生物樣品裝載入生物注 射器，在注射泵的壓力下，將樣品通過塑料管恒速注入所述芯片入口，從而進(jìn)入所述雙螺旋 微流控芯片并在芯片內(nèi)受到流體力作用。由于不同細(xì)胞受到不同的離心力，生物樣品內(nèi)的 不同細(xì)胞產(chǎn)生不同的橫向遷移，而同種細(xì)胞匯聚成線。因此，各種細(xì)胞自動分離，形成互相 平行的匯聚線，分別對應(yīng)通道開口上設(shè)置的三個平行出口。生物樣品中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和 包含其他物質(zhì)的流體分別從雙螺旋管道中流入紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口和流體出口。其中 紅細(xì)胞和流體從對應(yīng)的出口流出。白細(xì)胞出口含有細(xì)胞濾膜，通過了解濾膜的孔徑，可選擇 性地截留正常白細(xì)胞和/或病變白細(xì)胞。此時按照注入生物樣品的方法注入細(xì)胞染色劑， 截留在白細(xì)胞出口濾膜上的細(xì)胞可被染色。
[0013] 此外，所述雙螺旋微流控芯片可用于去除患者血液中病變白細(xì)胞。該用途的操作 方法和原理為：利用與上述相同的雙螺旋微流控芯片，先用塑料管將白血病患者血液樣品 和注射器/注射泵相連，通過注射器/注射泵，在10-300ml/h的流速范圍內(nèi)，將白血病患者 血液從芯片入口，恒速注入芯片，當(dāng)樣品高速連續(xù)通過雙螺旋微通道時，不同大小的血細(xì)胞 在流體力作用下，逐漸匯聚成線并產(chǎn)生不同的橫向遷移。通過在通道下游設(shè)計3個平行出 口，細(xì)胞會因其尺寸大小的差異，承受不同的流體力，各尺寸細(xì)胞在管道內(nèi)形成空間上的差 異排列，最終從不同的出口流出。其中，大部分的病變白細(xì)胞會因其尺寸過大，會在管道內(nèi) 匯聚成線，從中間的出口流出，實現(xiàn)病變白細(xì)胞與正常細(xì)胞的初步分離。
[0014] 從此可見，本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片整體設(shè)計及制備簡單，成本低；可以實現(xiàn)白 細(xì)胞的自動分離、富集以及染色，針對目前操作復(fù)雜，檢出率低，成本高，無法實現(xiàn)自動化等 問題，提供一種可自動分離、富集外周血中病變的白細(xì)胞，并對其自動染色的微流控芯片系 統(tǒng)。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供一種自動裝置，其包括本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片?；?于芯片的作用原理，所述自動裝置可實現(xiàn)細(xì)胞的自動染色和洗脫。
[0016] 較本領(lǐng)域已知的白細(xì)胞診斷技術(shù)，本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片具有以下有益效 果：
[0017] (1)高效：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片經(jīng)富集后，目標(biāo)白血病細(xì)胞的富集率可高 至上千倍，整個過程中細(xì)胞的形態(tài)保持完好，利于后期臨床的診斷。
[0018] (2)自動化：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片使用慣性微流，借助注射泵的壓力，實現(xiàn) 生物樣品中不同細(xì)胞的分離和富集的自動化進(jìn)行。
[0019] (3)可實現(xiàn)染色：通過使用注射泵從所述芯片入口注入細(xì)胞染色劑，可實現(xiàn)細(xì)胞 濾膜上白細(xì)胞的自動染色。
[0020] (4)準(zhǔn)確度高：由于富集率高，通過染色和洗滌，可極大提高診斷的準(zhǔn)確度和精確 度。
[0021] (5)具有治療效果：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片的應(yīng)用可更好的幫助醫(yī)生對患者 樣本中含量極少的病變白細(xì)胞進(jìn)行檢測，也可去除病人血液中的病變白細(xì)胞，緩解病情。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明雙螺旋微流控芯片的結(jié)構(gòu)圖。1為芯片入口，2為雙螺旋芯片，3為紅 細(xì)胞出口，4為白細(xì)胞出口，5為流體出口，6為細(xì)胞濾膜。
[0023] 圖2為紅細(xì)胞和白細(xì)胞在出口處的分離結(jié)果圖。1為體積較大的白細(xì)胞，2為紅細(xì) 胞。
[0024] 圖3為血液中白細(xì)胞染色對比圖，其中，圖㈧為使用本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片 進(jìn)行染色的白細(xì)胞染色效果圖；圖（B)為普通染色方法所得的染色效果圖。
[0025] 圖4為胸腔積液中白細(xì)胞染色對比圖，其中，圖（A)為使用本發(fā)明的雙螺旋微流控 芯片進(jìn)行染色的白細(xì)胞染色效果圖；圖（B)為普通染色方法所得的染色效果圖。

【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0027] 實施例1 :微流控裝置分離血液中的白細(xì)胞
[0028] (1)血液樣本被來回輕柔顛倒，使之混勻；
[0029] (2)用PBS將血液稀釋10倍，用5ml的注射器吸?。蝗缓笞⑸淦髡w固定于恒流 泵上，注射器出口與微流控芯片裝置的接口相連，血液泵入的流速為20ml/h;與此同時，相 同的樣本被加載到載玻片上，均勻涂開，風(fēng)干；
[0030] (3)血液經(jīng)過微流控裝置后，姬姆薩染液自動以lml/h的速度沿通道注入，對附著 目標(biāo)細(xì)胞的膜進(jìn)行染色l〇min ;與此同時，將姬姆薩染液附著于含有血液樣本的細(xì)胞玻片 上，染色lOmin ;
[0031] (4)染色完成后，PBS洗液自動以10ml/h的速度沿通道注入，對染色的膜進(jìn)行洗滌 lOmin ;與此同時，用PBS洗滌已經(jīng)染色完成的、含有血液樣本的細(xì)胞玻片；
[0032] (5)在光學(xué)顯微鏡下，對細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行鑒定。
[0033] 使用所述芯片染色和普通染色的結(jié)果見圖3?？梢娊?jīng)所述雙螺旋微流控分離富集 后染色的白細(xì)胞染色狀態(tài)良好、清晰且便于分析；普通方法染色的樣品在同比例的視角范 圍內(nèi)找不到白細(xì)胞。
[0034] 實施例2 :微流控裝置分離胸腔積液中的白細(xì)胞
[0035] (1)胸腔積液樣本被來回輕柔顛倒，使之混勻；
[0036] (2)用PBS將胸腔積液稀釋100倍，用5ml的注射器吸??；然后注射器整體固定于 恒流泵上，注射器出口與微流控芯片裝置的接口相連，胸腔積液泵入的流速為20ml/h;與 此同時，相同的樣本被加載到載玻片上，均勻涂開，風(fēng)干；
[0037] (3)胸腔積液經(jīng)過微流控裝置后，姬姆薩染液自動以lml/h的速度沿通道注入，對 附著目標(biāo)細(xì)胞的膜進(jìn)行染色l〇min ;與此同時，將姬姆薩染液附著于含有胸腔積液樣本的 細(xì)胞玻片上，染色lOmin ;
[0038] (4)染色完成后，PBS洗液自動以10ml/h的速度沿通道注入，對染色的膜進(jìn)行洗滌 lOmin ;與此同時，用PBS洗滌已經(jīng)染色完成的、含有胸腔積液樣本的細(xì)胞玻片；
[0039] (5)在光學(xué)顯微鏡下，對細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行鑒定。
[0040] 使用所述芯片染色和普通染色的結(jié)果見圖4?？梢娊?jīng)所述雙螺旋微流控分離富集 后染色的白細(xì)胞染色狀態(tài)良好、清晰且便于分析；普通方法染色的樣品在同比例的視角范 圍內(nèi)白細(xì)胞密度極低。
[0041] 較本領(lǐng)域已知的白細(xì)胞診斷技術(shù)，本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片具有以下有益效 果：
[0042] (1)高效：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片經(jīng)富集后，目標(biāo)白血病細(xì)胞的富集率可高 至上千倍，整個過程中細(xì)胞的形態(tài)保持完好，利于后期臨床的診斷。
[0043] (2)自動化：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片使用慣性微流，借助注射泵的壓力，實現(xiàn) 生物樣品中不同細(xì)胞的分離和富集的自動化進(jìn)行。
[0044] (3)可實現(xiàn)染色：通過使用注射泵從所述芯片入口注入細(xì)胞染色劑，可實現(xiàn)細(xì)胞 濾膜上白細(xì)胞的自動染色。
[0045] (4)準(zhǔn)確度高：由于富集率高，通過染色和洗滌，可極大提高診斷的準(zhǔn)確度和精確 度。
[0046] (5)具有治療效果：本發(fā)明的雙螺旋微流控芯片的應(yīng)用可更好的幫助醫(yī)生對患者 樣本中含量極少的病變白細(xì)胞進(jìn)行檢測，也可去除病人血液中的病變白細(xì)胞，緩解病情。 [〇〇47] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局 限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的 技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的 添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述雙螺旋微流控芯片包括芯片入口、雙螺旋 芯片、紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口、流體出口和細(xì)胞濾膜，其中所述芯片由雙螺旋型通道構(gòu)成， 該雙螺旋通道分別沿兩個相互平行的芯片切線方向開孔，形成兩個平行反向的開口，一個 開口與所述芯片入口相連，另一個開口分別與紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口以及流體出口相連。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出 口和流體出口的寬度分別為100 μ m、110 μ m和90 μ m，且此三個出口互相平行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述芯片入口連接塑料 管，塑料管另一端連接生物樣品注射器，通過注射泵將生物樣品恒速注入所述芯片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，將生物樣品恒速注入的流 速為 10-300ml/h，優(yōu)選 l-60ml/h，更優(yōu)選為 20ml/h、25ml/h 或 30ml/h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述生物樣品為外周 血、末梢血、胸腔積液、腦脊液、骨髓液和/或尿液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞濾膜位 于所述白細(xì)胞出口。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞濾膜的 孔徑為l-30um，優(yōu)選8-10 μ m，最優(yōu)選8 μ m。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞濾膜攔 截白細(xì)胞后，通過使用注射泵從所述芯片入口注入細(xì)胞染色劑，可實現(xiàn)細(xì)胞濾膜上白細(xì)胞 的染色。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的雙螺旋微流控芯片，其特征在于所述雙螺旋微流控芯片可 用于去除患者血液中病變白細(xì)胞。
10. -種細(xì)胞染色和洗脫自動裝置，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的雙螺旋微流控芯 片。
【文檔編號】B01L3/00GK104111190SQ201410345305
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】蔣興宇, 劉野, 孫佳姝, 王紀(jì)東 申請人:國家納米科學(xué)中心