專利名稱：用于制備型自由流電泳的分離室裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化工的裝置技術領域，具體涉及ー種用于制備型自由流電泳(Free-flow electrophoresis,以下簡稱FFE)的分離室裝置。
背景技術：
由于電泳(Electrophoresis)技術能夠分離許多的生物分子,如蛋白質、多肽和細胞等，所以在生物化學領域得到了廣泛地應用。隨著電泳技術的發(fā)展，電泳過程中的支撐介質由最初的濾紙和醋酸纖維素膜逐漸被凝膠所取代。凝膠作為支持介質的引入大大促進了電泳技術的發(fā)展，使電泳技術成為分析蛋白質、核酸等生物大分子的重要手段之一。然而，固體介質填充的電泳有很多的缺點。首先，其處理樣品的含量不大，主要應用于分析以及小規(guī)模的分離純化，而很少用于大規(guī)模的制備。其次，固體物質對樣品的性質會產生一定的影響，如遷移距離、帶電能力的改變。最后，有些固體填充料還會引起樣品的吸附、變性，導致對樣品的分離純化以及大規(guī)模的制備都有很大的影響?？茖W技術的日益發(fā)展以及生物樣本對溫和分離條件的苛刻要求，迫切需要電泳技術在創(chuàng)新理念上做出革新。正是在這樣的背景下，FFE應運而生。至今，FFE已經發(fā)展成為一種水相制備技術，具有可連續(xù)分離、多種分離模式、無固體支持介質和分離條件溫和等優(yōu)勢，特別適用于生物材料的分離純化和制備，且有著極高的回收率。其基本形式就是在ー個薄的分離腔中，背景緩沖液和樣液以不同的流速流動，通過垂直于背景緩沖液流速方向的電場實現物質的分離、富集。由于可以連續(xù)進樣，所以這種電泳可以進行連續(xù)制備。(屈鋒，韓彬，鄧玉林等·色譜，2003，26(3) : 274-279 )
通常，FFE的原理可以簡述如下在兩塊平行板構成的薄的電泳室中，電場與溶液流向垂直，電泳遷移率不同的各種組分在電場力作用下與液流方向形成不同的偏轉角，在電泳室中表現出拋物線流型，在電泳室末端不同出口處流出并進行收集。(Roman M C，Brown PR. Anal Chem，1994, 66: 86A )
較之傳統(tǒng)的以固體介質為依托的電泳形式，FFE不再需要固體介質，而是在ー個水相條件下進行各種樣本的分離甚至制備，并顯現出以下優(yōu)勢效率高、設備操作簡單、分辨率好、過程和條件可控、對產物損傷小。同時又由于FFE是ー種全液相的電泳模式,分離速度快以及樣品回收率高也是其主要的特征。FFE有著極其廣泛的應用前景。根據相關的報道，小到藥物小分子，大到動物細胞甚至器官組織都可以用自由流電泳對其成功地進行分離。同時FFE分辨率也能夠達到很高的標準，利用該技術已經分離出了很多化學結構上只有細微差別的物質。FFE在蛋白質組分析，尤其在分離低豐度蛋白過程中起到了十分重要的作用。而且，FFE的優(yōu)點能使其在分離ー些特殊物質時發(fā)揮無比的優(yōu)越性，例如組織纖溶酶激活劑(t-PA)的分離。FFE在細胞的分離上也有廣泛的前途。目前，FFE也被廣泛地運用到制藥中去，其中用處最大的莫過于手性藥物的分離。(Lanz M, Caslavska J, Thormann ff. Electrophoresis, 1998, 19,1081 - 1090; Valery C，Boris B，Sergey P. Rj Andreas C. Electrophoresis，1998，19,1211-1214; Hoffmann P, Hong J, Moritz R. L, Connoly L. M et al. Proteomics,2001，I, 807-818; Hannig K. Electrophoresis, 1982，3，235-243;夏其昌，宋金芳，蛋白質化學研究技術與進展連續(xù)自由流電泳，科學出版社，1997，151-158;劉韜，王升年·《生物化學與生物物理學報英文版》1999，31，5，590-593; Hoffmann P, WagnerH, Weber G, Lanz M, Caslavska J, Thormann ff. Anal. Chem，1999, 71, 1840-1850;Wind M, Hoffmann P, Wagner H, Thormann ff. J. Chromatogr. A, 2000, 895, 51 - 65; )o迄今為止，FFE主要有三種基本的操作模式自由流區(qū)帶電泳(Free-f lowzone electropnoresis, ZE-FFE目由、/i · 3 電 y永(Free—fiow isotachophoreticelectrophoresis, ITP-FFE)、自由流等電聚焦電泳(Free-flow isoelectric focusing,IEF-FFE)0由這三種基本的FFE模式，科學家們又逐漸發(fā)展出其他模式的FFE，如自由流場梯度電泳(Free-flow field step electrophoresis, FSE-FFE),自由流免疫電泳(Immunefree-f low electrophoresis, IMM-FFE),移動反應界面自由流電泳(Moving reactionboundary free-flow electrophoresis, MRB-FFE),循環(huán)等電聚焦自由流電泳(Recyclingisoelectric focusing free-flow electrophoresis, RIEF-FFE)。(L. Knvankova, P.BoEek. Electrophoresis 1998, 19, 1064-1074;屈鋒，韓彬，鄧玉林，張I 華，張玉奎·色譜· 2008，26 (3)，274-279; Chen, S·，Palmer, J. F·，Zhang, ff. , Shao,J. , Li, S. , Fan, L. Y. , Sun, R., Dong, Y. C. , Cao, C. X., Electrophoresis 2009,30，1998 - 2007;)
本研究組在新近的研究中，利用一種基于聚丙烯酰胺凝膠膜的自由流電泳分離室(專利授權號ZL200710042306. 3)自組裝了大型、中型、小型的重力自平衡自由流電泳儀器。用這三種型號的自由流電泳儀，我們分別純化了 Pseudomorms sp. M18菌株發(fā)酵液中低濃度的吩嗪-I-羧酸(phenazine-l-carboxylic acid, PCA)、分離了coli 和
Staphylococcus aareM細胞及三種蛋白、微制備了豬胰液中的胰蛋白酶。研究結果表明，這種傳統(tǒng)的分離室能夠很好地應用于自由流電泳裝置。然而，這種聚丙烯酰胺膜在電泳操作前的制備相當繁瑣，而且分離室的密封性不強，從而降低了 FFE的操作效率。而且，這種膜的自身屬性使得這種電泳分離室的壽命很短。另外，這種膜材質導電性能一般，導致電壓有效利用率比較低。基于實驗操作的高效性原則考慮，極有必要對這種傳統(tǒng)類型的分離室裝置進行改進。(Shao, J. , Fan, L. Y·, Zhang, ff. , Guo, C. G. , Li, S·，Xu, Y. Q.,Cao, C. X·，Electrophoresis 2010, 31, 3499 - 3507; Y. C. Dong, J. Shao, X. Y.Yin, L. Y. Fan, C. X. Cao, J. Sep. Sci. 2011，34, 1683-1691; J. Z. Geng, J. Shao.J. H. Yang, B. Pang, C. X. Cao, L. Y. Fan, Electrophoresis 2011,323248-3256)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供一種用于自由流電泳的分離裝置，高效地對樣本進行分離純化。本發(fā)明的技術解決方案如下
一種用于制備型自由流電泳的分離室裝置，包括第一有機玻璃平板、第二有機玻璃平板、電泳室和電極室，電極室中安裝有鉬電極，第二有機玻璃平板的一端設有多個電泳緩沖液進液ロ，第一有機玻璃平板的另一端對稱地設有多個電泳緩沖液出液ロ，形成電泳緩沖液泳道，其特征在于，在所述的第一有機玻璃平板和第二有機玻璃平板之間還設有離子交換膜與框形的塑料薄膜；
該離子交換膜的中央區(qū)域設有長形分離孔，在分離孔的兩側各設有ー個與該分離孔平行的長形電極孔，
所述的第一有機玻璃平板和第二有機玻璃平板之間夾有由離子交換膜的分離孔和電極孔及塑料薄膜形成電泳室 和電極室，并用塑料螺絲通過所述的第一有機玻璃平板的上螺絲孔、第二有機玻璃平板的下螺絲孔和塑料薄膜的薄膜螺絲孔固定；
在所述的第一有機玻璃平板上，且對應于離子交換膜的電極孔的兩端，分別設有電極緩沖液進液ロ和電極緩沖液出液ロ，用于循環(huán)電極液，在電極緩沖液進液ロ的外側還設有電極固定孔，用于固定所述的鉬電極。所述的塑料薄膜的外徑大小與第一有機玻璃平板和第二有機玻璃平板的大小相同，塑料薄膜的內徑大小與離子交換膜的大小相適配。所述的離子交換膜是厚度為O. 8-1.0 mm的高效離子交換膜。所述的電泳緩沖液進液口內插有槍頭，該槍頭的下端與硅膠管連接；所述的緩沖液出液ロ內插有槍頭，該槍頭的上端與娃膠管連接。電泳緩沖液進液口和電泳緩沖液出液ロ分別是由數量分別為24、48或96個孔組成。所述的槍頭為圓柱形短管。在所述的第二有機玻璃平板的底部中央設置水冷卻槽，該水冷卻槽的位置、面積和所述電泳室的位置、面積對應一致。本發(fā)明分離室裝置的電泳緩沖液進液ロ端與氣液緩沖分流裝置(發(fā)明專利授權號Z1200510024412.X)相連接，電泳緩沖液出液ロ端與分離液自平衡連通收集裝置(發(fā)明專利授權號Z1200510024413. 4)相連接，從而使得進液口和出液ロ的液體流量均勻一致，最終在FFE分離室中形成穩(wěn)定均勻的流體動力學環(huán)境。使用這種FFE分離室，我們采用水/有機混合相自由流電泳技術，提高了弱極性物質(PCA)在FFE中的分離通量約11. 9倍(相對于之前的FFE分離PCA技術而言)。本發(fā)明FFE分離室裝置被設計成三明治夾心結構，由上下兩塊第一有機玻璃板和第二有機玻璃板夾著ー張厚度O. 8-1. O mm的離子交換膜組成。離子交換膜的中央區(qū)域被挖空，自然地形成樣品電泳室和兩個電極室，用塑料螺絲進行密封固定。厚度為O. 8-1. O mm的高效離子交換膜,如圖4所示,長為310 mm,寬為200 mm。這樣的長寬比(2. 5)，相比以前的設計，更為“窄長”，對整個自由流電泳儀的分離能力有一定程度上的提升。同時，中空的離子交換膜也將整個電泳室和電極室完全隔離開來，使電泳緩沖液和電極緩沖液之間無法形成對流。同時由于離子交換膜具有很好的導電能力，因此在電泳室中起到了 “電橋”的作用。電泳室的上下兩板米用厚度為10 mm的PMMA板作為基體材料。在第一有機玻璃板的一端打出半徑I mm的小孔48個，將白色的IOuL槍頭截取中間一部分插進小孔，作為電泳緩沖液進出液的轉接頭，連接硅膠管。第二有機玻璃板尺寸和第一有機玻璃板尺寸完全符合，只是在與第一有機玻璃板對應的另一端打出半徑同為I mm的小孔48個。在第一有機玻璃板和第二有機玻璃板之間采用挖空的厚度為O. 8-1. O mm的離子交換膜，三者共同形成電泳室，而電泳緩沖液液流就在其中流動。液流從第二有機玻璃板的孔道進入電泳室，橫貫電泳室后，再從第一有機玻璃板的孔道流出。整個電泳室的長度為300 mm,寬為120 _。電泳室的電泳緩沖液進(出)液ロ孔道的空間安排上，擯棄了商業(yè)化儀器一排孔的設計，而改用交錯角度為60度的兩排交錯孔設計。這樣在限定的總寬度之內，孔與孔間能獲得最大的間距，獲得最小的平面應力，干擾因素也最少。電泳室兩側同時各 設計ー個與電泳室平行等長、10 mm寬的電極室。在電泳過程中，通過其電極緩沖液進液ロ注入與電泳緩沖液流向相同的電極緩沖液。電極室中安裝有鉬絲電極，與電壓裝置通過導線相連，為電極處提供一定的電壓。離子交換膜將整個電泳室和電極室完全隔離開來，使電泳緩沖液和電極緩沖液之間無法形成對流，同時起到“電橋”的作用。為了擴散分離過程中產生的焦耳熱，將水冷卻裝置(專利授權號ZL200710042306. 3)安裝于本發(fā)明第二有機玻璃板底部，冷卻水從裝置的進ロ進入散熱槽，分散分布于分離室中的焦耳熱，再從裝置的出口處流出。對電泳室的密封，本發(fā)明通過在兩層有機玻璃板四周鉆孔并利用塑料螺絲來進行。儀器操作過程中，將本發(fā)明裝置斜上放置，將電泳緩沖液和電極緩沖液緩緩地泵入電泳室和電極室，以排盡內腔及硅膠管中的氣泡，并平衡一段時間使得分離室中的液流穩(wěn)定均一。隨后，將本分離室裝置水平放置，并啟動水冷卻裝置、打開電源，即可進行樣品的分離純化。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下
(I)采用商業(yè)化的離子交換膜替換了之前的聚丙烯酰胺凝膠膜用于FFE分離室，改進了傳統(tǒng)的分離室裝置，能夠較好地用于常規(guī)模式的各種樣本的高效分離純化。(2)穩(wěn)定性強，可以連續(xù)反復使用I年以上時間。對許多凝膠膜進行測試，其中包括聚丙烯酰胺凝膠、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜等，發(fā)現其穩(wěn)定性不夠高，使用壽命大多在I個月左右。(3)導電性能強。使用凝膠膜設計分離室時，在施加較高電壓的時候，膜的電流很不穩(wěn)定。商業(yè)化的離子交換膜相比凝膠膜而言，導電性能強，對電壓的利用率要高出很多，而且耐受的電壓強度要比凝膠膜大。因此采用了商業(yè)化的離子交換膜后的自由流電泳裝置，其導電能力得到了大幅度提高，同時也極大地提高了待分離物質的分離能力。(4)密封性能和制作方便。傳統(tǒng)分離室的密封主要由上下兩板夾著透明密封橡膠的未挖空部分完成，采用C形夾承壓。由于C形夾在有機玻璃板上施的力難以在各處均勻分布，故而使得分離室密封效果欠佳。而使用高效分離膜后，可以采用塑料螺絲設計密封分離室，從而達到完全密封的效果，同時制作方便。


圖I為本發(fā)明用于制備型自由流電泳的分離室裝置的結構示意圖。圖2為本發(fā)明中第一有機玻璃平板的平面示意圖。圖3為本發(fā)明中第二有機玻璃平板的平面示意圖。
圖4為本發(fā)明中離子交換膜的平面示意圖。圖5為本發(fā)明中塑料薄膜的平面示意圖。
圖中，I-第一有機玻璃平板，11-上螺絲孔，12-電極緩沖液進液ロ，13-電極緩沖液出液ロ，14-電泳緩沖液出液ロ，15-電極固定孔，2-離子交換膜，21-分離孔，22-電極孔，3-第二有機玻璃平板，31-下螺絲孔，32-電泳緩沖液進液ロ，4-塑料薄膜，41-薄膜螺絲孔5-塑料螺絲，6-水冷槽，7-冷卻水進液ロ，8-冷卻水出液ロ。
具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明的技術方案作進ー步說明，但不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。請先參閱圖1，圖I為本發(fā)明用于自由流電泳的分離室裝置的結構示意圖，如圖所示，第一有機玻璃平板I和第二有機玻璃平板3之間是挖空的離子交換膜2和塑料薄膜4，三者采用“三明治夾心”的方式，共同形成電泳分離室(分離孔21)和電極室(電極孔22)。位于周邊各處均勻分布的的塑料螺絲5依次貫穿第一有機玻璃平板I、塑料薄膜4和第二有機玻璃平板3，達到密封的效果。第二有機玻璃平板3的底部中央設置水冷卻槽6，水槽的位置、面積和電泳室的位置、面積對應一致，冷卻水從冷卻水進液ロ 7進入水冷卻槽6，再由冷卻水出液ロ 8流出，起到分散焦耳熱的作用。圖3為本發(fā)明中第二有機玻璃平板的平面示意圖，主要起引入分離電泳緩沖液和支持電泳室的作用。如圖所示，第二有機玻璃平板3開有電泳緩沖液進液ロ 32以及在對應塑料薄膜的位置打有下螺絲孔31。電泳緩沖液進液ロ 32通過插在下端的槍頭和硅膠管連接儲液槽。電泳緩沖液進液ロ 32呈兩排設計，相鄰孔的位置呈現鋸齒型排列，孔與孔之間夾角為60度。離子交換膜2，用于隔離電泳緩沖液和電極緩沖液形成分離室(分離孔21)和電極室(電極孔22)。周圍均勻分布的塑料螺絲5，密封整個分離室裝置。圖2為本發(fā)明中第一有機玻璃平板的平面示意圖，主要起送出電泳緩沖液和循環(huán)電極緩沖液的作用。電泳緩沖液出液ロ 14，通過插在上端的槍頭和硅膠管連接分餾收集裝置。電極室(電極孔22)的一端設置電極固定孔15，通過螺栓固定鉬電極，外部可加入絕緣材料用以防止漏電。電極室的兩端設置了電極緩沖液進液ロ 12和電極緩沖液出液ロ 13，用于循環(huán)電極緩沖液。裝置的固定，出液ロ的接頭以及密封的方法均與前段的描述一致。圖4為本發(fā)明中離子交換膜的平面示意圖，如圖所示，離子交換膜2按照電泳室、電極室的大小進行加工，整體上與塑料薄膜4的挖空區(qū)域相適配。將離子交換膜中間相對應的部分挖去形成電泳室(分離孔21) I以及電極室(電極孔22)。離子交換膜在電泳緩沖液進出液ロ端鋸齒放射型的引流設計能夠使流入的液流呈現穩(wěn)定勻速的層流。圖5為本發(fā)明中塑料薄膜的平面示意圖，如圖所示，塑料薄膜4按照第一、ニ有機玻璃平板的大小以及各孔的位置進行加工，將中間的部分挖去，形成外圍絕緣的套環(huán)，起到絕緣保護的作用。工作時，首先關閉電泳電源和冷卻裝置系統(tǒng)，將本發(fā)明分離室裝置斜上放置，將電泳緩沖液和電極緩沖液緩緩地泵入電泳室和電極室，以排盡內腔及硅膠管中的氣泡，并平衡一段時間使得分離室中的液流穩(wěn)定均一。隨后，將分離室裝置水平放置，并啟動冷卻裝置、打開電源，即可進行樣品的分離純化。實驗結束后，先關閉電源，再依次關閉恒流泵和水冷裝置，收集48管(或96管)進行 離線分析檢測。
權利要求
1.一種用于制備型自由流電泳的分離室裝置，包括第一有機玻璃平板(I)、第二有機玻璃平板(3)、電泳室和電極室，電極室中安裝有鉬電極，第二有機玻璃平板(3)的一端設有多個電泳緩沖液進液ロ(32)，第一有機玻璃平板(I)的另一端對稱地設有多個電泳緩沖液出液ロ( 14)，形成電泳緩沖液泳道，其特征在于，在所述的第一有機玻璃平板(I)和第二有機玻璃平板(3)之間還設有離子交換膜(2)與框形的塑料薄膜(4)； 該離子交換膜(2)的中央區(qū)域設有長形分離孔(21)，在分離孔(21)的兩側各設有ー個與該分離孔(21)平行的長形電極孔(22 )， 所述的第一有機玻璃平板(I)和第二有機玻璃平板(3)之間夾有由離子交換膜(2)的分離孔(21)和電極孔(22)及塑料薄膜(4)形成電泳室和電極室，并用塑料螺絲(5)通過所述的第一有機玻璃平板(I)的上螺絲孔(11)、第二有機玻璃平板(3)的下螺絲孔(31)和塑料薄膜(4)的薄膜螺絲孔(41)固定； 在所述的第一有機玻璃平板(I)上，且對應于離子交換膜(2)的電極孔(22)的兩端，分別設有電極緩沖液進液ロ(12)和電極緩沖液出液ロ(13)，用于循環(huán)電極液，在電極緩沖液進液ロ(12)的外側還設有電極固定孔(15)，用于固定所述的鉬電極。
2.根據權利要求I所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在于，所述的塑料薄膜(4)的外徑大小與第一有機玻璃平板(I)和第二有機玻璃平板(3)的大小相同，塑料薄膜(4)的內徑大小與離子交換膜(2)的大小相適配。
3.根據權利要求I所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在于，所述的離子交換膜(2)是厚度為O. 8-1. O mm的高效離子交換膜。
4.根據權利要求I所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在于，所述的電泳緩沖液進液ロ(32)內插有槍頭，該槍頭的下端與硅膠管連接；所述的緩沖液出液ロ(14)內插有槍頭，該槍頭的上端與硅膠管連接。
5.根據權利要求4所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在干，電泳緩沖液進液ロ(32)和電泳緩沖液出液ロ(14)分別是由數量分別為24、48或96個孔組成。
6.根據權利要求4所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在干，所述的槍頭為圓柱形短管。
7.根據權利要求I所述的用于制備型自由流電泳的分離室裝置，其特征在于，在所述的第二有機玻璃平板(3)的底部中央設置水冷卻槽(6)，該水冷卻槽(6)的位置、面積和所述電泳室的位置、面積對應一致。
全文摘要
一種用于制備型自由流電泳的分離室裝置，包括第一、第二有機玻璃平板、電泳室和電極室，第一和第二有機玻璃平板之間夾有由離子交換膜的分離孔和電極孔及塑料薄膜形成電泳室和電極室，并用塑料螺絲通過所述的第一有機玻璃平板的上螺絲孔、第二有機玻璃平板的下螺絲孔和塑料薄膜的薄膜螺絲孔固定，在第一有機玻璃平板上，且對應于離子交換膜的電極孔的兩端，分別設有電極緩沖液進液口和電極緩沖液出液口，用于循環(huán)電極液。本發(fā)明能夠解決傳統(tǒng)自由流電泳中密封性問題和穩(wěn)定性問題，提供高穩(wěn)定高度均勻的流體動力學環(huán)境，廣泛應用于核酸/蛋白質/多肽/細胞/病毒等多種樣品的常規(guī)FFE分離，可應用于各種在FFE裝置進行的樣品純化。
文檔編號B01D57/02GK102688692SQ20121016799
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權日2012年5月28日
發(fā)明者孔凡志, 曹成喜, 楊成章, 楊經華, 樊柳蔭, 王后禹, 郭陳剛 申請人:上海交通大學