專利名稱：控制液態(tài)組合物的pH和靶標離子水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制液態(tài)組合物的PH和靶標離子水平的方法。更特別地，本發(fā)明涉及反向電增強透析(REED)用于萃取反應(yīng)器中產(chǎn)生的低分子帶電物質(zhì)的用途。還更特別地，本發(fā)明涉及用于生物反應(yīng)器中PH控制和抑制劑控制的方法。
背景技術(shù)：
控制液態(tài)組合物的pH和/或靶標離子水平是在廣泛技術(shù)領(lǐng)域比如金屬精制和自發(fā)酵液體純化有機物質(zhì)中所運用的重要工業(yè)方法。已引入許多方法以便控制液態(tài)組合物的pH和/或靶標離子水平。在所述方法中尤其提及微量過濾法和超濾法，離子交換法和電透析法。比如說，生物反應(yīng)器在工業(yè)中廣泛地用于制備寬范圍的有機化學品，藥物蛋白，氨基酸，引子培養(yǎng)物，生物燃料等，或用于生物降解目的。最通常地，生物反應(yīng)器含有需要一定 PH水平以維持最佳功能性的微生物。在生物反應(yīng)器pH調(diào)節(jié)的標準手段包括將堿性或酸性中和劑直接滴定入生物反應(yīng)器，從而中和微生物所產(chǎn)生的酸性或堿性代謝物。然而，當達到一定濃度時這些代謝物的鹽則常常抑制生長。某些鹽和代謝物比如生物學反應(yīng)的抑制劑的積累限制了生物反應(yīng)器在一般批量處理中的生產(chǎn)能力。最小化抑制的可能方案包括灌注系統(tǒng)，其中通過過濾方法(例如超濾或微量過濾)連續(xù)萃取含抑制劑的發(fā)酵肉湯，在此期間保留微生物并將新鮮底物溶液加入發(fā)酵器。在灌注系統(tǒng)中，仍然必需通過滴定中和劑來調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器PH而有價值底物組分也與透過物一起丟失。與超濾和微量過濾中一般所用的膜相比，電透析也即所謂的Dorman透析法中所用的離子交換膜使得可以更有選擇性地萃取小帶電物質(zhì)。然而，當與生物反應(yīng)器直接組合時常規(guī)電透析會遭受膜污染，因而仍必需中和劑滴定來進行PH控制。EP專利1 237 823公開用于在包含陽離子交換膜或陰離子交換膜的電增強透析池中自第一液體轉(zhuǎn)移離子物質(zhì)至第二液體的設(shè)備和方法。US專利5，114，554公開自陰極電涂浴除去酸的方法，其中用陽離子樹脂涂覆導電性基材，涂覆浴的至少一部分經(jīng)過超濾，而超濾液的至少一部分在包含陰離子交換膜的直流型電透析池中經(jīng)過特定的電透析處理。
發(fā)明概要需要控制液態(tài)組合物的pH和靶標離子水平的方法，該方法使得可以更精確地控制PH而無需直接加入化學品并且該方法使得可以獨立于所希望pH設(shè)定點地控制靶標離子水平。因此，在第一方面本發(fā)明涉及控制液態(tài)組合物的pH和靶標離子水平的方法，其包括任意順序的下述步驟a)將所述液體通過至少一個反向電增強透析(REED)膜堆的至少一個步驟，所述膜堆具有i)至少兩張離子交換膜，其間限定用于第一液體的第一室；ii)至少兩個用于第二液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第一室；iii) 一組終端膜；和iv)通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；以及b)在所述液體中控制靶標離子水平的至少一個步驟。本發(fā)明第二方面是系統(tǒng)，其包含a)至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆，其具有i.至少兩張陰離子交換膜，其間限定用于第一液體的第一室；ii.至少兩個用于第二液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第一室；iii. 一組終端膜；和iv.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；和b)至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆，其具有v.至少兩張陽離子交換膜，其間限定用于第三液體的第三室；vi.至少兩個用于第四液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第三室；vii. 一組終端膜；和viii.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；其中所述至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆和所述至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆為串聯(lián)或并聯(lián)。本發(fā)明第三方面是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)用于控制液態(tài)組合物的pH和靶標離子水平的用途。本發(fā)明的其它方面對本領(lǐng)域技術(shù)人員將由下述詳述和實施例變得明顯。定義在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"靶標離子"意在涵蓋不希望的離子例如發(fā)酵過程中的抑制劑，以及構(gòu)成自液態(tài)組合物除去的希望產(chǎn)品的離子。作為靶標離子的非限制性實例可以提及乳酸根離子。乳酸是乳酸細菌(LAB)培養(yǎng)物的已知抑制劑，并且因此對于含活LAB 培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，乳酸可以是REED方法的靶標離子。術(shù)語"靶標離子"不涵蓋氫離子。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語〃反向電增強透析〃或〃 REED"涵蓋AX-REED和 CX-REED。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"AX-REED"意指這樣的REED設(shè)置，其中陰離子交換膜用作在料液與透析液之間的屏障并且使得便于在兩種液體間交換陰離子。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語〃 CX-REED"意指這樣的REED設(shè)置，其中陽離子交換膜用作在料液與透析液之間的屏障并且使得便于在兩種液體間交換陽離子。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"堆"意指REED系統(tǒng)的單元，其包含至少兩張離子交換膜、一組終端膜和圍繞所述膜的至少兩個電極的組合的一個或多個重復套組。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"多REED膜堆"意指膜和間隔物的兩個或多個堆，各堆置于一對電極之間。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"電場反轉(zhuǎn)"或"電流反轉(zhuǎn)"意指REED電極的極性變
5化，引起DC電流方向反轉(zhuǎn)，這使得便于離子通過離子交換膜的遷移。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語"控制"或"調(diào)控"意指用REED和/或滴定和/或加水來手動或自動調(diào)節(jié)所希望的參數(shù)例如靶標離子濃度的能力。


本發(fā)明隨附圖進行公開，其中圖1顯示工藝設(shè)置，其中AX-REED和CX-REED的組合并聯(lián)至生物反應(yīng)器，和圖2顯示用AX-和CX-REED的組合控制pH和乳酸濃度。發(fā)明詳述REED 原理反向電增強透析(REED)法在類似所謂的Dorman透析設(shè)置的板框式 (plate-and-frame)膜設(shè)置中運用離子交換膜。Dorman透析設(shè)置運用由化學勢差異作驅(qū)動力引起的擴散，而在REED法中由跨膜DC電流設(shè)置來推進和調(diào)控離子交換。REED法期望用于將會導致過大而無法穿透膜的傾向于聚集在離子交換膜表面(該效果稱為膜污染)的組分(例如蛋白)的工作液。通過運用REED法的對稱設(shè)置，能夠以有規(guī)律的間隔反轉(zhuǎn)電流方向而不顯著干擾分離過程。一般地，工作液(料液)流經(jīng)REED系統(tǒng)，其中帶負電的離子(陰離子)與其它陰離子交換，從而稱為陰離子交換REED設(shè)置(AX-REED)，或者在陽離子交換REED設(shè)置 (CX-REED)中帶正電的離子(陽離子)與其它陽離子交換。透析液攜帶與料液離子交換的離子。在板框式設(shè)置中，堆疊數(shù)張分別被流間隔物分開的膜以使得便于交替設(shè)置料液和透析液。在本發(fā)明的實施方式中間歇地變化所述至少兩個電極的極性。在分離期間，兩張膜圍繞各進料間隔物室，這使得便于將離子從料液運出或自透析液運入料液。電場/電流方向的各次反轉(zhuǎn)引起受影響離子的經(jīng)膜極化特征的短期重建，而圍繞各進料室的兩張膜相互交換功能。這導致分離過程的短期反轉(zhuǎn)，而之前被除去的離子被推回料液直至重建膜特征。因為各次反轉(zhuǎn)引入短暫的分離暫停并且引入輕度的過程不穩(wěn)定性，所以有利的是在電流反轉(zhuǎn)之間保持污染積累所允許的盡可能長的間隔。在本發(fā)明實施方式中多REED堆并聯(lián)操作。這種設(shè)置使得例如在生物反應(yīng)器中對微生物的影響最小化，原因是與串聯(lián)操作相比在生物反應(yīng)器外的停留時間以及自設(shè)定點的 PH偏離都有所減少。在本發(fā)明的又一實施方式中多REED堆串聯(lián)或級聯(lián)操作。這種設(shè)置使得每次通過可以有更高的離子除去率并且更適合連續(xù)下游操作。REED法可以用于自生物反應(yīng)器/活發(fā)酵過程萃取抑制劑如有機酸離子以改善細胞生長(連續(xù)發(fā)酵)的生產(chǎn)能力和壽命和/或調(diào)節(jié)代謝物產(chǎn)生(例如重組蛋白質(zhì))。REED 法可以例如用于生物學、生物轉(zhuǎn)化或催化系統(tǒng)中的PH控制，其中連續(xù)產(chǎn)生小酸性或堿性組分(例如乳酸鹽，乙酸鹽，氨水，硝酸鹽)。通過將所產(chǎn)生的有機酸離子與自堿性透析液的氫氧根離子交換，然后該堿性透析液中和伴隨的氫離子，總的結(jié)果是恒定的PH和顯著降低的有機酸蓄積水平。對于成堿系統(tǒng)情況相似，其中堿性離子與自酸性透析液的氫離子交換，酸性透析液又中和料液中的氫氧根離子。在所產(chǎn)生的酸或堿充當生長抑制劑的生物學系統(tǒng)中，REED系統(tǒng)的pH控制較直接滴定入生物學系統(tǒng)的標準pH控制更為優(yōu)選，后者僅維持pH 水平但本身無法抑制經(jīng)中和的酸性或堿性代謝物的積累。在本發(fā)明的實施方式中，在多個AX-REED或CX-REED膜堆的情況下，任一 REED堆中的電場相對任意其它REED膜堆不同步地反轉(zhuǎn)。隨各次電流反轉(zhuǎn)之后的上述短期效果通過引入短期負面效果直至膜的離子特征重建來影響REED系統(tǒng)的pH控制。在AX-REED的情況下，通過各進料室中的一張陰離子交換膜萃取酸性離子，而氫氧根離子通過對側(cè)陰離子交換膜進入。當電流方向反轉(zhuǎn)時，在首先提及的膜內(nèi)萃取的酸性離子被推回料液，隨后氫氧根離子開始進入料液。從而，在此短時間間隔內(nèi)直至氫氧根特征經(jīng)之前用來萃取酸性離子的膜重建，未觀察到PH控制。在各次電流反轉(zhuǎn)之后直至PH控制再生的時間相位長度取決于各種過程條件和膜特性；一般地，在過程再次以完全PH控制操作之前需要10-90秒。這記錄為pH的突然變化，然后其必須經(jīng)調(diào)整回到所希望的設(shè)定點。在含多于一個膜堆的系統(tǒng)中，有利的是在各個分離堆上不同步地進行電流反轉(zhuǎn)，以便分散電流反轉(zhuǎn)的不穩(wěn)定性效果并減少其總影響。不同步的電流反轉(zhuǎn)的應(yīng)用更詳細地公開于申請人相同日期的共同未決專利申請中，題為"Method and system for improved processparameter control of a liquid composition in a reverse electro-enhanceddialysis (REED) system"，通過援引將該專利申請并入本文?！惆凑漳の廴痉e累來選擇堆電流反轉(zhuǎn)的間隔長度。一般地，在任一 REED堆中的所述間隔可以是5-6000秒，優(yōu)選8-3000秒，更優(yōu)選10-2000秒和甚至更優(yōu)選100-1500秒。在根據(jù)本發(fā)明方法的實施方式中，所述至少一個REED步驟包括陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)步驟而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)步驟。在根據(jù)本發(fā)明方法的又一實施方式中，所述反向電增強透析(REED)膜堆是陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)堆而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括將所述液態(tài)組合物通過陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆。當將AX-REED與CX-REED系統(tǒng)組合用于改善控制pH和靶標離子水平時本發(fā)明提供優(yōu)勢。之前已描述REED法如何能夠用于pH控制和在以低分子帶電抑制劑例如有機酸或堿形式產(chǎn)生靶標離子的生物過程中保持低水平的抑制劑。在某些系統(tǒng)中，與REED系統(tǒng)的pH 控制所實現(xiàn)的效果相比靶標離子水平的改善控制是必需的。為了在產(chǎn)生靶標離子的反應(yīng)器中保持穩(wěn)定的pH，調(diào)整用于pH控制的REED系統(tǒng) (下文稱為"初級REED系統(tǒng)")以中和反應(yīng)器中酸或堿離子的產(chǎn)生量。為了確保上述效果，反應(yīng)器中相應(yīng)量的帶負電或帶正電的離子分別被氫氧根或氫離子替換。經(jīng)該初級REED 系統(tǒng)替換的離子是在有關(guān)反應(yīng)器中存在的帶負電或帶正電的低分子離子(包括靶標離子) 的不同代表。該分布取決于離子遷移數(shù)，其取決于分子電荷、離子淌度和濃度。當REED pH 控制一般地在具有顯著濃度靶標離子的反應(yīng)器上操作時，作為PH控制步驟的一部分而萃取和替換的主體離子一般構(gòu)成靶標離子，從而幫助保持在抑制水平之下的穩(wěn)定靶標離子水平。當REED在具有高含量的類似靶標離子電荷和尺寸的其它離子(例如無機離子，氨基酸)的反應(yīng)器系統(tǒng)中用于pH控制時，更少部分的經(jīng)替換以保持pH控制的離子構(gòu)成靶標離子。這導致經(jīng)中和靶標離子在pH控制反應(yīng)器中的凈蓄積。
從而，在本發(fā)明的實施方式中，引入與初級REED系統(tǒng)相比交換相反電荷離子的" 次級REED系統(tǒng)"以改善靶標離子水平的控制。在酸產(chǎn)生過程中，AX-REED用作pH控制的初級REED系統(tǒng)以中和酸性靶標離子。通過以并聯(lián)或串聯(lián)模式加入CX-REED作為次級REED 系統(tǒng)，自反應(yīng)器的陽離子能夠與氫離子交換，該過程酸化反應(yīng)器而無需加入更多的酸分子。 相應(yīng)于增加的酸化，調(diào)節(jié)pH的AX-REED將增加反應(yīng)器陰離子與氫氧根離子的交換，從而增加酸性靶標離子的萃取并克服其任何蓄積，若非如此則可能發(fā)生蓄積。如此則可能降低靶標離子濃度而不擾亂反應(yīng)器的PH穩(wěn)定性。對于堿產(chǎn)生過程原理是相似的用CX-REED作為pH控制的初級REED系統(tǒng)，而 AX-REED用于控制靶標離子水平的次級REED系統(tǒng)。其它過程效果影響反應(yīng)器的總濃度水平。水也通過滲透和電滲透跨越REED系統(tǒng)中的離子交換膜進行交換。當透析液的離子活性高于反應(yīng)器的離子活性時，正如一般情況， 則滲透將導致水分子自反應(yīng)器擴散至REED中的透析液。當交換與替換它們的氫氧根或氫離子的淌度相比具有較低離子淌度的靶標離子時，一般觀察到水分子自反應(yīng)器進入透析液的電滲流?？偟膩碚f，REED系統(tǒng)一般地自反應(yīng)器萃取水。在本發(fā)明的實施方式中，所述反向電增強透析(REED)膜堆是陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)堆并且所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括用酸滴定所述液體。在本發(fā)明的備擇實施方式中，所述反向電增強透析(REED)膜堆是陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)堆并且所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括用堿滴定所述液體。將非抑制性酸或堿加入反應(yīng)器將導致初級REED系統(tǒng)增加離子交換，這導致抑制性離子濃度降低而非抑制性離子濃度增加。兩類離子間的濃度比會接近平衡值，其取決于抑制性離子加入速率與形成速率的比率。在具體實施方式
中，在線測量生物反應(yīng)器中的乳酸濃度，如果乳酸濃度超過給定設(shè)定點則增加用強酸比如磷酸滴定。在本發(fā)明的備擇實施方式中，所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括加水至反應(yīng)器。體積的添加例如添加無菌水或者更稀釋的進料組分會平衡靶標離子的蓄積，但是其受反應(yīng)器尺寸限制或者使得需要除去過量體積。在具體實施方式
中，在線測量生物反應(yīng)器中的電導率，如果電導率超過給定設(shè)定點則增加加水。在本發(fā)明的實施方式中，所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括過濾步驟， 優(yōu)選微量過濾或超濾步驟。因此，使用灌注系統(tǒng)，其中將生物反應(yīng)器的酵素過濾通過壓力驅(qū)動的膜過程并連續(xù)地進料新鮮的底物溶液，使得可以例如通過在線濃度測量或電導率測量精確控制抑制劑水平。在本發(fā)明的實施方式中，對應(yīng)所述液態(tài)組合物的pH、靶標離子濃度或電導率來調(diào)節(jié)所施加電場的強度。通過增加電場強度，REED系統(tǒng)中的離子交換增加，反之亦然。需調(diào)節(jié)的過程參數(shù)的在線、半在線(例如延時)或次級(例如用在線電導率或濁度測量以估計靶標離子濃度)測量值被輸入控制調(diào)節(jié)機構(gòu)例如PID-控制軟件，其又調(diào)節(jié)電源向REED電極的輸出。在本發(fā)明的實施方式中所述液態(tài)組合物是包含固定化或懸浮微生物培養(yǎng)物的發(fā)酵混合物或者是含酶混合物。
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在本發(fā)明的實施方式中所述微生物培養(yǎng)物包含細菌、酵母、真菌或哺乳動物細胞的生長的或靜息的培養(yǎng)物。本發(fā)明的又一實施方式是系統(tǒng)，包含a)至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆，其具有i.至少兩張陰離子交換膜，其間限定用于第一液體的第一室；ii.至少兩個用于第二液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第一室；iii. 一組終端膜；和iv.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；和b)至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆，其具有v.至少兩張陽離子交換膜，其間限定用于第三液體的第三室；vi.至少兩個用于第四液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第三室；vii. 一組終端膜；和viii.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；其中所述至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆和所述至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆為串聯(lián)或并聯(lián)。對于通過受有機酸抑制的細胞株發(fā)酵的生物反應(yīng)器，陰離子交換REED(AX-REED) 用氫氧根離子替換所產(chǎn)生的有機酸，并從而抵消酸形成導致的PH降低。通過調(diào)節(jié)AX-REED， 氫氧根交換能夠保持生物反應(yīng)器PH而無需加入中和劑。將AX-REED與陽離子交換 REED(CX-REED)系統(tǒng)組合(其將生物反應(yīng)器中的陽離子與例如氫離子交換)則可能調(diào)節(jié)有機酸抑制劑的水平以及生物反應(yīng)器PH。組合運用的AX-REED和CX-REED提供增加生物反應(yīng)器控制的可能性并同時減少加入中和劑的需要。結(jié)果是具有高度降低的鹽水平和顯著增加的生產(chǎn)能力的生物反應(yīng)器產(chǎn)品，原因是細胞生長不再受酸抑制所限。通過以并聯(lián)模式操作初級和次級REED系統(tǒng)，酵素在生物反應(yīng)器以外所消耗的時間可以被降到最少。由于最佳生長條件存在于生物反應(yīng)器內(nèi)，優(yōu)選酵素流經(jīng)外部REED系統(tǒng)的時間段盡可能短。對于最佳反應(yīng)器控制，有必要控制透析液濃度和流速以及溫度和操作模式。REED 中的離子交換速率取決于電流和被動擴散的共同作用。擴散速率取決于待自透析液轉(zhuǎn)移入反應(yīng)器中的離子的濃度。如果透析液具有高濃度的PH調(diào)節(jié)離子，例如當AX-REED是初級系統(tǒng)時是氫氧根，無論電流如何都會存在氫氧根進入反應(yīng)器回路的實質(zhì)擴散。因此，關(guān)鍵是能夠控制透析液濃度，使得擴散速率絕不超過反應(yīng)器中的產(chǎn)生速率。這通過將透析液的濃度和/或流速與向REED堆的電流輸出關(guān)聯(lián)使得電流增加將導致透析液濃度增加來實現(xiàn)。能夠例如通過在透析液流進入REED系統(tǒng)之前調(diào)節(jié)水和濃縮透析液的加入進行透析液濃度的控制。能夠例如通過調(diào)節(jié)透析液流動泵或用流量調(diào)節(jié)閥進行透析液流量的控制。在串聯(lián)模式中，可能避免酵素變得過于酸性或過于堿性，如果某些組分展示pH不穩(wěn)定性則需要應(yīng)對該問題。取決于REED系統(tǒng)的類型，離開REED系統(tǒng)的酵素被酸化或變得更具堿性，然后當再混入生物反應(yīng)器返回正常PH。在串聯(lián)設(shè)置中，在pH不穩(wěn)定性帶來問題的情況下，可能選擇通過增加或降低酵素的PH來開始將適當?shù)腞EED系統(tǒng)置于在生物反應(yīng)器外循環(huán)回路中的第一步驟。
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取決于生物反應(yīng)器中的產(chǎn)生速率，可能以單通過模式、以批處理模式或其組合來操作透析液流。如果需要低容量，例如在發(fā)酵過程開始時細胞密度低，則將透析液在罐中循環(huán)是有利的。隨著生物反應(yīng)器的生產(chǎn)能力增加，則離開REED堆的透析液的棄去百分比增加。當過程滿負荷運行時，在單次通過堆之后棄去全部透析液并將新鮮透析液泵入堆中。如果使用多個堆，則可能并聯(lián)或串聯(lián)地設(shè)置透析液流，堆間設(shè)或不設(shè)增壓泵。下述非限制性具體實施例中進一步詳細說明本發(fā)明。
實施例實施例1為了表達某些活性藥物成分(API)，在100L生物反應(yīng)器中用富營養(yǎng)素培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)乳酸菌株乳乳球菌(Lactococcus lactis)，其中AX-REED和CX-REED如示于圖1的設(shè)置進行連接。從生物反應(yīng)器(1)將肉湯泵過轉(zhuǎn)接管(2)直至AX-REED和CX-REED的酵素室 (7)隨后返回生物反應(yīng)器。在AX-REED透析液室(6)中泵送NaOH溶液而在CX-REED的透析液室(8)泵送HNO3溶液。通過在電極室(5)中泵送0. 5M NaOH溶液沖洗電極。AX-REED 包含2個具有50個池對的膜堆，其總活性膜面積為5. 6m2。連接至回路的單個CX-REED堆配有20個池對，其具有總膜面積為1. lm2。安裝的膜是ASM陰離子交換膜(10)和CMXsb陽離子交換膜(9)，都來自ASTOM日本。通過接口(11)將高度濃縮的底物溶液連續(xù)加入發(fā)酵器以保持特定的葡萄糖水平并供給必需的生長組分。測量生物量濕重，并這樣進行調(diào)節(jié)將無菌水(1 加入發(fā)酵器并通過靠近發(fā)酵器頂部設(shè)置的管(1 來收獲含API的過量體積。最佳在相對低的乳酸濃度產(chǎn)生生物量，但是API的表達在約250mM乳酸濃度是最優(yōu)的。因而，關(guān)鍵是能夠在整個發(fā)酵過程中保持乳酸水平的控制。在以大約90mM的乳酸濃度接種發(fā)酵器之后8小時開始AX-和CX-REED，參見圖2?？刂苾蓚€AX-REED堆上的電流以保持PH設(shè)定點為6。因為用來控制過程的pH探針在回路中置于REED中試裝置上而不是發(fā)酵器中，所以能夠觀察到自設(shè)定點的輕度偏離。示于圖2的pH是發(fā)酵器pH?？刂艭X-REED 堆上的電流以保持給定的電導率，其與乳酸濃度相關(guān)。在M小時之后，生物量濃度達到所希望的水平，API表達系統(tǒng)的誘導漸漸開始。通過關(guān)閉CX-REED并以此讓乳酸濃度增加至 250mM來實現(xiàn)上述過程，然后在30小時之后再次開始CX-REED。在52小時之后終止發(fā)酵， 收集大約200L肉湯(包括除去體積)用于進一步純化。與標準批量發(fā)酵相比，以預(yù)先確定的乳酸水平進行發(fā)酵的可能性以10倍因子推高API濃度。實施例2使用與實施例1相似的設(shè)置，但將水加入發(fā)酵器。經(jīng)觀察向發(fā)酵器加水降低CX REED堆上所需的電流。通過適當控制加水，可以省去CXREED。實施例3該實施例展示用于控制一個過程參數(shù)的REED堆如何能夠在模擬的批量進料發(fā)酵過程中與加水相組合以同時控制次級過程參數(shù)。在示于圖1的設(shè)置中，將具10對各915cm2的池的AX-REED與具2對各915cm2的池的CX-REED的并聯(lián)組合連接至20升發(fā)酵器。AX-REED和CX-REED配有Neos印ta AMS陰離子交換膜(10)和Nafi0nmi7陽離子交換膜(9)。將膜裝入JS-9堆(Jurag Separation,丹麥)。準備生物反應(yīng)器/發(fā)酵器(1)以模擬批量進料發(fā)酵，其使用由PH6. 5的磷酸緩沖劑 (60mM)和乳酸鈉(85mM)組成的20L模型溶液。為了模擬以恒定速率產(chǎn)生靶標離子的微生物存在，將90% (w/w)乳酸以75ml/h的速率加入(11)導致恒定酸化。為了模擬加入營養(yǎng)成分和競爭性離子的存在，將5M氯化鈉溶液以75ml/h的速率連續(xù)加入(11)導致鹽度和發(fā)酵器電導率的恒定積累。將發(fā)酵器溫度保持于25°C。將發(fā)酵器中的模型溶液循環(huán)(2)通過并聯(lián)的AX-REED和CX-REED并返回發(fā)酵器。 在AX-REED單元中，將IOL的0. 2M氫氧化鈉的透析液(3)與0. 5M氫氧化鈉的電極沖洗溶液(5) —起循環(huán)。在該實施例中并未激活CX-REED，并且僅將去離子水用于該單元中的透析液。圖3顯示該實施例的結(jié)果。將AX-REED這樣用于調(diào)節(jié)發(fā)酵器中的pH至pH設(shè)定點6. 5 通過可編程邏輯控制器 (PLC)參照發(fā)酵器中的pH傳感器進行控制，調(diào)節(jié)電場并將新鮮氫氧化鈉加入AX-透析液。 經(jīng)觀察AX-REED消除源自乳酸加入的酸化，但是靶標離子(乳酸根)的電導率和濃度仍在發(fā)酵器中增加。在一定時間(0.5小時)，以48ml/h速率將用于稀釋的去離子水(12)加至發(fā)酵器。 稀釋操作將發(fā)酵器電導率控制為常數(shù)值并且降低靶標離子(乳酸根)在發(fā)酵器中的蓄積， 而AX-REED仍然控制發(fā)酵器pH。在加1升水至發(fā)酵器之后，停止加水，并且觀察到電導率和靶標離子的增加。正如所期望的，發(fā)酵器體積自20L增加至21L。實施例4該實施例展示用于控制一個過程參數(shù)的REED堆如何能夠在模擬批量進料發(fā)酵過程中與相反電荷選擇性的REED堆相組合用于同時控制次級過程參數(shù)。使用與示于圖1和實施例3中描述的組合AX-REED和CX-REED所完全相同的設(shè)置。使用如實施例3中所述相同的過程參數(shù)和溶液。顯著差異僅為在該試驗部分中激活 CX-REED。如同實施例3，用20升60mM磷酸緩沖劑溶液和85mM乳酸鈉并加入90% (w/w)乳酸(75ml/h)和5M氯化鈉(75ml/h)開始運行發(fā)酵器。將溶液循環(huán)通過并聯(lián)的AX-REED和 CX-REED單元。圖4顯示該試驗的結(jié)果。按實施例3所述通過AX-REED控制發(fā)酵器中的pH，而電導率和靶標離子(乳酸根) 濃度增加。在試驗中的一定時間(2. 1小時)，將由5升0. 05M硝酸組成的透析液循環(huán)通過 CX-REED (4)。通過調(diào)節(jié)CX-REED中的電場并將新鮮0. 05M硝酸加入CX-透析液，其由可編程邏輯控制器(PLC)控制，CX-REED將發(fā)酵器電導率控制為固定的設(shè)定點而AX-REED仍控制PH參數(shù)。通過在過程中的一定時間O. 7小時)降低電導率設(shè)定點的值，CX-REED也可以根據(jù)新的較低電導率設(shè)定點來降低發(fā)酵器電導率，同時保持PH。在2. 9小時過程時間之后，進一步增加CX-REED電場，經(jīng)觀察這可能減少蓄積并保持靶標離子水平(乳酸根)，而AX-REED仍調(diào)節(jié)穩(wěn)定的發(fā)酵器pH。實施例5該實施例展示用于控制一個過程參數(shù)的REED堆如何能夠在模擬批量進料發(fā)酵過程中與加酸相組合以同時控制次級過程參數(shù)。使用示于圖1和實施例3中描述的組合AX-REED和CX-REED所完全相同的設(shè)置。使用如實施例3所描述的相同過程參數(shù)和溶液。
正如實施例3，用20升60mM磷酸緩沖劑溶液和85mM乳酸鈉并加入90% (w/w)乳酸(75ml/h)和5M氯化鈉(75ml/h)開始運行發(fā)酵器。將溶液循環(huán)通過并聯(lián)的AX-REED和 CX-REED單元。圖5顯示該試驗的結(jié)果。在該實施例中并未激活CX-REED，僅將去離子水用于該單元中的透析液(4)。通過 AX-REED如實施例3所述控制發(fā)酵器中的pH，同時電導率和靶標離子(乳酸根)濃度增加。在5小時過程時間之后，開始以速率120ml/h加入7. 5M磷酸(12)。為了 AX-REED 連續(xù)控制受乳酸加入和磷酸加入組合影響的發(fā)酵器pH，AX-REED自動通過增加氫氧根與來自發(fā)酵器的乳酸根和其它陰離子交換進行應(yīng)對。從而，經(jīng)觀察靶標離子的蓄積減少。在5. 2 小時過程時間，加酸速率增加至300ml/h，這引起靶標離子(乳酸根)濃度顯著降低，而盡管 AX-REED發(fā)揮中和兩種酸化效果的作用其仍然控制發(fā)酵器pH。實施例6將150L批量進料發(fā)酵罐通過管和泵連接至裝配均并聯(lián)設(shè)置的5個AX-REED堆和 1個CX-REED堆的裝置。各REED堆是JS-9堆(JuragS印aration，丹麥)。5個AX-REED堆各自包括M個池對而CX-REED堆包括20個池對；各個池對具有915cm2的活性膜面積。圖6顯示REED-控制式發(fā)酵的結(jié)果。將150L發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至發(fā)酵器并通過產(chǎn)乳酸細胞株接種。在標準堿性滴定用于在發(fā)酵器中的PH控制的3小時過程時間之后，乳酸濃度達到預(yù)先確定的水平。然后，酵素開始在發(fā)酵器與REED堆之間循環(huán)。pH控制轉(zhuǎn)為由AX-REED堆進行，而CX-REED用于控制靶標離子(乳酸根)調(diào)節(jié)。在4. 5小時過程時間之后，pH設(shè)定點降低至5. 6。在9. 5小時過程時間之后，CX-REED控制效果降低，由此引起發(fā)酵剩余部分的乳酸根蓄積增加。在發(fā)酵器中通過探針在線測量pH和OD (光學密度)，而每兩分鐘采樣乳酸濃度。圖6顯示5個AX-REED堆如何保持發(fā)酵器pH，而以接近最大產(chǎn)能操作的CX-REED 保持乳酸根蓄積最小化。圖6的OD(光學密度)曲線顯示微生物如何在過程期間保持生長。
1權(quán)利要求
1.控制液態(tài)組合物的PH和靶標離子水平的方法，包括任意順序的下述步驟a)將所述液體通過至少一個反向電增強透析(REED)膜堆的至少一個步驟，所述膜堆具有i)至少兩張離子交換膜，其間限定用于第一液體的第一室； )至少兩個用于第二液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第一室；iii)一組終端膜；和iv)通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；以及b)在所述液體組合物中控制靶標離子水平的至少一個步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少兩個電極的極性間歇式變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項的方法，其中并聯(lián)操作多REED膜堆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項的方法，其中串聯(lián)操作多REED膜堆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述反向電增強透析(REED)膜堆是陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)堆而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括將所述液態(tài)組合物通過陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述反向電增強透析(REED)膜堆是陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)堆而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括將所述液態(tài)組合物通過陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述反向電增強透析(REED)膜堆是陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)堆而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括用酸滴定所述液態(tài)組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述反向電增強透析(REED)膜堆是陽離子交換反向電增強透析(AX-REED)堆而所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括用堿滴定所述液態(tài)組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括加水至所述液態(tài)組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述控制靶標離子水平的至少一個步驟包括過濾步驟，優(yōu)選微量過濾或超濾步驟。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中對應(yīng)于所述液態(tài)組合物的pH、靶標離子濃度或電導率來調(diào)節(jié)所施加電場的強度。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述液態(tài)組合物是包含固定化或懸浮的微生物培養(yǎng)物的發(fā)酵混合物或者是含酶混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物包含細菌、酵母、真菌或哺乳動物細胞的生長的或靜息的培養(yǎng)物。
14.系統(tǒng)，包含a)至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆，其具有i.至少兩張陰離子交換膜，其間限定用于第一液體的第一室； .至少兩個用于第二液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第一室；iii.一組終端膜；和iv.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；和b)至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆，其具有v.至少兩張陽離子交換膜，其間限定用于第三液體的第三室；vi.至少兩個用于第四液體的其它室，各其它室相鄰于至少一個第三室；vii.一組終端膜；和viii.通過至少兩個電極在膜上施加電場的裝置；其中所述至少一個陰離子交換反向電增強透析(AX-REED)膜堆和所述至少一個陽離子交換反向電增強透析(CX-REED)膜堆為串聯(lián)或并聯(lián)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的系統(tǒng)用于控制液態(tài)組合物的PH和靶標離子水平的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制液態(tài)組合物的pH和靶標離子水平的方法，更特別地涉及反向電增強透析(REED)用于萃取反應(yīng)器中產(chǎn)生的低分子帶電物質(zhì)的用途。還更特別地，本發(fā)明涉及用于生物反應(yīng)器中pH控制和抑制劑控制的方法。
文檔編號B01D61/58GK102159304SQ200980134819
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者A·加德, J-U·瑞普 申請人:尤萊格分離有限公司