專利名稱：關(guān)聯(lián)的多參數(shù)單細(xì)胞測定及殘余生物材料回收的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)將基因組材料進(jìn)行分選、收集而獲得的高通量樣品中的蛋白和核酸 逐個(gè)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)的、關(guān)聯(lián)的定量測定的方法和裝置。相關(guān)申請(qǐng)本國際申請(qǐng)要求2007年8月9日提交的名稱為“關(guān)聯(lián)的多參數(shù)單細(xì)胞測定及殘余 生物材料回收的方法”的臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/954，946的權(quán)利，將所述臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體并 入本文。
背景技術(shù)：
熒光激活細(xì)胞分選(FACS)在研究和臨床應(yīng)用中廣泛使用。所述儀器具有非?？?速地進(jìn)行多參數(shù)分析和分選的能力，但其通常需要大樣品量和進(jìn)行操作和維護(hù)的訓(xùn)練有素 的操作員，且難以消毒。FACS儀器可分析少至10000個(gè)和多達(dá)幾千萬個(gè)細(xì)胞。而在分選應(yīng) 用中，進(jìn)行分選的能力降低，因?yàn)闃悠反笮⌒∮?00，000個(gè)細(xì)胞。在所有情況下，所述細(xì)胞 必須事先標(biāo)記。大多數(shù)情況下，使用綴合了熒光分子(如異硫氰酸熒光素，又名FITC)的抗 體標(biāo)記抗原或相似的膜結(jié)合蛋白，但核染色劑、胞內(nèi)染料或細(xì)胞指導(dǎo)的熒光蛋白(例如，綠 色熒光蛋白，又名GFP)合成也可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。流式細(xì)胞術(shù)也適用于分子檢測。例 如，可將具有多種顏色和/或強(qiáng)度的熒光珠用作固體支持物以用于蛋白或多肽分析物的抗 體捕獲測定。同樣，可將核酸與珠和熒光標(biāo)記雜交，以使用流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行快速讀取。在 這兩種情況下，在使用流式細(xì)胞術(shù)測定前進(jìn)行生物化學(xué)測定，并可將所述儀器作為珠快速 讀取儀使用。在某些情況下，掃描式細(xì)胞術(shù)在讀取中同樣有效。FACS儀器支持至所述儀器 支持的獨(dú)立熒光通道數(shù)的多個(gè)信息，但所述多個(gè)信息為單一類型(例如，僅表型)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(又名qPCR)是用于定量測定從目的細(xì)胞中提取的DNA和RNA 的技術(shù)。使用相當(dāng)于10，000 100，000個(gè)細(xì)胞的合并基因組量來進(jìn)行大多數(shù)qPCR反應(yīng)。 研究人員對(duì)測定個(gè)細(xì)胞的遺傳內(nèi)容越來越感興趣，但此努力被當(dāng)前可用的高成本試劑和勞 動(dòng)密集性操作法所阻礙。因此，大多數(shù)單細(xì)胞PCR研究僅在少于100個(gè)上細(xì)胞進(jìn)行。即使 現(xiàn)有的機(jī)器人技術(shù)和用量為1 10 μ L/的1536微孔板仍比幾百孔的花費(fèi)昂貴。當(dāng)出現(xiàn)目 的細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)量的比例少于的罕見情況時(shí)需要將達(dá)50000個(gè)的細(xì)胞逐一進(jìn)行檢查。 沒有大量時(shí)間和金錢的花費(fèi)，目前的技術(shù)無法達(dá)到這種通量水平。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究和系統(tǒng)生物學(xué)的工作中，通常需要使差異信息相關(guān)聯(lián)。將細(xì)胞 表面受體或報(bào)告子與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈接的數(shù)據(jù)對(duì)這些活動(dòng)越來越有價(jià)值。迄今為止，所述 信息基于大量細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。通常情況下，測定數(shù)千至數(shù)百萬計(jì)的細(xì)胞的表面蛋白或RNA表 達(dá)，并將所述信息在統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)聯(lián)。在測定過程中，樣品的任何異質(zhì)性被平均。siRNA基 因沉默之類的強(qiáng)大技術(shù)本身可將異質(zhì)性導(dǎo)入樣品中，從而受到此信息平均的限制。許多研究者已得到了逐個(gè)細(xì)胞定量關(guān)聯(lián)基因型的蛋白(或其他的表型特征)和核 酸的值。微流術(shù)(microfluidics)已被確定為一項(xiàng)能使儀器進(jìn)行所述測定的技術(shù)，但還未產(chǎn)生作為例子的方法和儀器。微加工式細(xì)胞儀具有分析和分選少達(dá)1000個(gè)細(xì)胞的潛力，而在易于使用的封閉體系中隨之消耗的試劑更少。當(dāng)用復(fù)制酶之類的高成本試劑工作時(shí)前者是重要的。而后者 是重要的，因?yàn)榕c常規(guī)的FACS儀器不同，其不產(chǎn)生氣溶膠，減少污染分選細(xì)胞和與生物有 害材料工作的風(fēng)險(xiǎn)。已描述了幾種微加工細(xì)胞分析儀和分選儀，但大多數(shù)為“概念證明”。通過對(duì)微加工式細(xì)胞儀、單細(xì)胞包裹技術(shù)和適當(dāng)信號(hào)處理的這些元件進(jìn)行結(jié)合， 可生產(chǎn)出具有逐個(gè)細(xì)胞檢測蛋白表達(dá)和基因表達(dá)的相關(guān)性的儀器。

發(fā)明內(nèi)容
如下所述，在微流網(wǎng)絡(luò)中這些元件組合實(shí)現(xiàn)相關(guān)測定。事先標(biāo)記細(xì)胞，以進(jìn)行表型 測定。在一實(shí)施方式中，連續(xù)流動(dòng)的微流網(wǎng)絡(luò)集成了所有功能。在微流網(wǎng)絡(luò)的第一部分中， 測定細(xì)胞的表型標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號(hào)。微流網(wǎng)絡(luò)的第二部分在微反應(yīng)器中將細(xì)胞與適合基 因表達(dá)測定的預(yù)定混合試劑進(jìn)行獨(dú)立包裹。在微流網(wǎng)絡(luò)的下一部分中，用可包含在微反應(yīng) 器內(nèi)容物中或從其中分離的參照信號(hào)來編碼包裹的細(xì)胞流。在微流網(wǎng)絡(luò)的第四部分中，裂 解細(xì)胞，并用適宜技術(shù)(例如，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(又名實(shí)時(shí)PCR)或qPCR)測定基因表達(dá)。 然后在下一階段解碼微反應(yīng)器流，且信號(hào)處理算法關(guān)聯(lián)表型和基因型測定值。作為最后一 個(gè)可選步驟，可分選微反應(yīng)器，以富集特定基因組。在相關(guān)實(shí)施方式中，首先包裹細(xì)胞，從而 表型分型和編碼同時(shí)發(fā)生。隨后裂解細(xì)胞，然后同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)測定和解碼。這減少微 流網(wǎng)絡(luò)上的詢問點(diǎn)數(shù)。在第二實(shí)施方式中，組合微流網(wǎng)絡(luò)與微孔陣列，以分離個(gè)細(xì)胞，并關(guān)聯(lián)用戶預(yù)選的 遺傳信息與表型群。在第一部分中，用微流網(wǎng)絡(luò)測定細(xì)胞的表型標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號(hào)。在 第二部分中，用多路徑切換網(wǎng)絡(luò)將細(xì)胞分選入個(gè)納流(nanofluidic)微孔。所述孔排列成 各細(xì)胞位于唯一確定的坐標(biāo)中，或所述孔可排列成將細(xì)胞分入2個(gè)以上的陣列中。在后一 種情況下，用戶基于獲得的表型信息選擇一個(gè)以上的門來選擇細(xì)胞的所欲目的地。密封所 述孔，以用適合基因表達(dá)測定的預(yù)定混合試劑獨(dú)立包裹所述細(xì)胞。裂解所述細(xì)胞，并用適宜 技術(shù)通過讀取陣列來測定基因表達(dá)?？煞治鑫⒖字械姆磻?yīng)信息，以檢測遺傳信號(hào)的統(tǒng)計(jì)學(xué) 分布，且可將所述信息反過來與選定表型離散性關(guān)聯(lián)。作為最后的可選步驟，可收集個(gè)微孔 內(nèi)容物，用于進(jìn)一步的基因分析。在第三實(shí)施方式中，使用利用納流(nanofluidic)微孔陣列的掃描式細(xì)胞術(shù)分離 個(gè)細(xì)胞，并獲取關(guān)聯(lián)的表型和基因型信息。同樣，事先標(biāo)記細(xì)胞，以進(jìn)行表型測定。將所述 細(xì)胞置于所述微孔中，并密封所述孔，以用適合基因表達(dá)測定的預(yù)定混合試劑獨(dú)立包裹所 述細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞的掃描式細(xì)胞術(shù)分析收集了指向所述孔坐標(biāo)的表型信息，裂解所述細(xì)胞，然 后用適宜技術(shù)通過讀取陣列來測定基因表達(dá)。級(jí)聯(lián)所述信號(hào)至單相關(guān)數(shù)據(jù)集。作為最后的 可選步驟，可收集個(gè)微孔內(nèi)容物，用于進(jìn)一步的基因分析。在所有的實(shí)施方式中，可進(jìn)行一個(gè)以上的表型測定。通常情況下，可同時(shí)檢測到至 4個(gè)或5個(gè)獨(dú)立熒光信號(hào)。各反應(yīng)中基因表達(dá)測定值可為一種基因的測定值或優(yōu)選為兩種 以上基因復(fù)合的測定值，以獲得關(guān)于選定基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化的定量信息。附圖簡述

圖1為示本發(fā)明的如何逐個(gè)獲得和關(guān)聯(lián)分析用表型(例如用熒光偶聯(lián)抗體標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白)信息和基因型(例如單細(xì)胞、多重定量PCR)信息的概念圖。圖2為連續(xù)流形式的本發(fā)明元件的原理框圖。圖3為改良的連續(xù)流形式或掃描式細(xì)胞術(shù)形式的本發(fā)明元件的原理框圖。
圖4為在圖2的連續(xù)流實(shí)施方式中使用的微流元件的示意圖。圖5為在圖2的連續(xù)流實(shí)施方式中如何通過周期事件或非周期事件的編碼和解碼 來獲得表型和基因型測定關(guān)聯(lián)的例子的示意圖。圖6為用于進(jìn)行表型和基因型關(guān)聯(lián)的、包含獨(dú)立式一次性盒和儀器的集成系統(tǒng)的 實(shí)施方式的原理框圖。圖7示圖6所示與微流網(wǎng)絡(luò)一起使用的樣品裝載盒的實(shí)施方式。圖8示用于逐個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表型和基因型分析和關(guān)聯(lián)的樣品裝載器、微流裝載芯片 和毛細(xì)管的實(shí)施方式。圖9A示與圖8所示的毛細(xì)管一起使用的熱控組件的實(shí)施方式。圖9B示在圖9A所示的熱控組件中的毛細(xì)管夾持器的實(shí)施方式。圖9C示在圖9A所示的熱控組件中的毛細(xì)管夾持器的另一實(shí)施方式。圖10示與圖7所示用于逐個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表型和基因型分析和關(guān)聯(lián)的樣品裝載器一 起使用的微流芯片的實(shí)施方式。圖11示與圖7所示用于逐個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表型和基因型分析和關(guān)聯(lián)的樣品裝載器一 起使用的微流芯片的另一實(shí)施方式。圖12為單細(xì)胞表型和基因型分析和關(guān)聯(lián)的離散關(guān)聯(lián)實(shí)施方式的原理框圖。圖13A為用于進(jìn)行圖12所示的離散關(guān)聯(lián)實(shí)施方式的微流元件和納孔(nanowell) 陣列的示意圖。圖13B為用于分選和索引圖13A所示的實(shí)施方式中的單個(gè)細(xì)胞的步驟的示意圖。圖14A示與多分支微流回路中的納孔離散關(guān)聯(lián)的方法的另一實(shí)施方式。圖14B示使用圖14A所示的實(shí)施方式對(duì)分選成9種表型群的樣品的表型-基因型關(guān)聯(lián)。圖15A為在納孔(nanowell)中用掃描式細(xì)胞術(shù)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行表型和基因型分析 及關(guān)聯(lián)的另一實(shí)施方式的元件的示意圖。圖15B示在圖15A所示的實(shí)施方式中的掃描和索引個(gè)細(xì)胞的步驟。圖16為在單細(xì)胞基因組分析儀和分選儀的連續(xù)流實(shí)施方式中使用的微流元件的 示意圖。圖17為在包含基因型分選的離散實(shí)施方式中使用的微流元件和納孔(nanowell) 陣列的示意圖。圖18A D示顯示流動(dòng)形式的實(shí)際裝置的實(shí)際顯微圖。圖19為跟蹤示波器，其顯示作為細(xì)胞前向散射和液滴前向散射的時(shí)間函數(shù)的振幅。圖20為包含不同長度的編碼滴的六個(gè)平行的毛細(xì)管的顯微圖。圖21為具有不同長度和順序的編碼滴的三個(gè)毛細(xì)管的顯微圖。圖22A和B分別示PCR前和后在微容器中的檢測結(jié)果。圖23A和B示在PCR擴(kuò)增前和后在三相體系中的微容器。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了適于對(duì)例如對(duì)從數(shù)百個(gè)細(xì)胞 數(shù)千個(gè)細(xì)胞到數(shù)萬個(gè)細(xì)胞 數(shù)十萬 個(gè)細(xì)胞數(shù)規(guī)模的樣品逐個(gè)細(xì)胞分析表型(如用綴合了熒光的抗體或組成型表達(dá)的熒光報(bào) 告分子(例如綠色熒光蛋白)標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白或胞內(nèi)蛋白)信息和基因型(如用于檢 測單核苷酸多態(tài)性(3呢)、0嫩拷貝數(shù)或1 織基因表達(dá)的單細(xì)胞、多重定量？0 或肌- 00信 息的方法和裝置。較大的樣品量有利于利用多維散點(diǎn)圖來揭示基因和蛋白之間的生物模式 和關(guān)系。如圖1所示，本發(fā)明的主要目的為通過逐個(gè)詢問單個(gè)細(xì)胞來獲得已選定的表型特 征和已選定的基因表達(dá)，然后逐個(gè)細(xì)胞關(guān)聯(lián)所述信息。用于關(guān)聯(lián)高通量樣品的表型-基因 型信息的方法可在微流網(wǎng)絡(luò)中的連續(xù)流動(dòng)樣品上進(jìn)行，或在預(yù)裝載于納孔(nanowell)陣 列芯片中的靜態(tài)樣 品上進(jìn)行。例如，可使用在連續(xù)流實(shí)施方式中的流式細(xì)胞術(shù)或使用掃描 式細(xì)胞術(shù)來對(duì)預(yù)裝載在納孔(nanowell)芯片中的靜態(tài)樣品進(jìn)行表型測定，以檢測指示所 述樣品中細(xì)胞的物理特性(如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小或熒光標(biāo)記的定位(在細(xì)胞核、細(xì)胞表面 或細(xì)胞質(zhì)))的熒光信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，使用例如兩種、三種或四種顏色的熒光檢測 進(jìn)行多表型測定。其他表型分析方法包括測定光散射，即細(xì)胞的正向和側(cè)向散射。然后編 碼所述細(xì)胞，以創(chuàng)建用于在后的關(guān)聯(lián)的表型測定索引。在納孔(nanowell)芯片中，所述陣 列上細(xì)胞位置提供編碼信號(hào)。在一連續(xù)流實(shí)施方式中，將細(xì)胞包裹在納升微容器中，并可將 染料、編碼珠或任何光學(xué)可檢測的物理參數(shù)與所述微容器偽隨機(jī)結(jié)合以創(chuàng)建索引。然后裂 解所述細(xì)胞，并擴(kuò)增靶DNA序列(如通過等溫?cái)U(kuò)增或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(包括終點(diǎn)PCR、 實(shí)時(shí)PCR (RT-PCR)或定量PCR(qPCR))，或其他任何擴(kuò)增核酸的方法)，以測定細(xì)胞中的基因 表達(dá)、基因型或核酸的其他目的特征。用光學(xué)圖像傳感器檢測和測定各微容器中的擴(kuò)增產(chǎn) 物(即擴(kuò)增的DNA序列)，并將此數(shù)據(jù)發(fā)送到處理器，以與先前測定的各微容器中的表型信 息相關(guān)聯(lián)。使用由參照信號(hào)或納孔(nanowell)陣列位置創(chuàng)建的索引解碼各微容器中的表 型數(shù)據(jù)，并將所述信息與靶DNA或RNA擴(kuò)增獲得的基因型信息(如單核苷酸多態(tài)性(SNP)、 DNA的拷貝數(shù)或RNA基因表達(dá)的檢測)相關(guān)聯(lián)。圖2示在連續(xù)流實(shí)施方式中分析個(gè)細(xì)胞及關(guān)聯(lián)表型和基因型數(shù)據(jù)的步驟。在步驟 100中，分析了含在水溶液中的多個(gè)細(xì)胞的樣品輸入部10的整群的選定的表型特征，如蛋 白表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小或熒光標(biāo)記(在細(xì)胞核中對(duì)在細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)中)位置。首 先，如使用經(jīng)熒光分子(熒光染料)、綠色熒光蛋白或染料標(biāo)記的抗體標(biāo)記所述細(xì)胞。然后 將所述樣品導(dǎo)入到微流流動(dòng)細(xì)胞中，且將所述細(xì)胞匯集為單束細(xì)胞流。通過表型標(biāo)記逐個(gè) 測定了細(xì)胞流產(chǎn)生的熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，使用四種顏色的流式細(xì)胞術(shù)測定多個(gè) 表型特征。下一步，在步驟102中，將細(xì)胞獨(dú)立包裹在含適合擴(kuò)增細(xì)胞中的靶DNA序列的預(yù) 定試劑混合物的納升微容器或滴中。例如，如在下面進(jìn)一步的討論中，可將所述細(xì)胞和PCR 試劑混合物導(dǎo)入到微流網(wǎng)絡(luò)中的流道中，所述微流網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)為分離和包裹油包水滴流中的 個(gè)細(xì)胞。所述滴或微容器優(yōu)選具有大于樣品細(xì)胞且小于流道橫截面直徑的橫截面直徑。例 如，微容器優(yōu)選在30 μ m 500 μ m之間，取決于流道尺寸。多數(shù)微容器基于細(xì)胞濃度和滴 體積依據(jù)泊松分布優(yōu)選含有一個(gè)細(xì)胞或0個(gè)細(xì)胞。此外，可使用包裹的主動(dòng)控制(如以控 制的方式使用壓縮、閥門或閘門來計(jì)量細(xì)胞)裝載非泊松分布的0個(gè)或一個(gè)細(xì)胞。例如，在 一些實(shí)施方式中，至少90%的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞，或至少80%的微容器含有1或0 個(gè)細(xì)胞，或者至少70%的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞，或者至少60%的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞。測定在各微反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果數(shù)據(jù)。例如，在一方法中，照明流道，且 用光學(xué)檢測器檢測信號(hào)(如前向散射)，其指示滴中細(xì)胞的有無。更精密的檢測使用前向 散射陣列的檢測，以提供更好的空間分辨率以計(jì)算和定位滴中的細(xì)胞/粒子。在另一方法 中，可將暗場照明和成像添加到單個(gè)檢測器散射測定。當(dāng)前向散射信號(hào)檢測滴前沿時(shí)，CCD 照相機(jī)可同步拍攝所述滴的暗場圖像。細(xì)胞/粒子會(huì)在圖像中為亮點(diǎn)，其可經(jīng)處理和鑒定 而用于計(jì)數(shù)。在一些實(shí)施方式中，可基于用戶選定的參數(shù)(如測定的表型特征)分選所述細(xì) 胞。例如，可通過熒光、前向散射或任何適宜成像或檢測形式在流體流中檢測具有所欲特 征的靶細(xì)胞的存在。然后可使用雙向電泳、氣動(dòng)開關(guān)或雙向流體或光學(xué)開關(guān)(如序 列號(hào)為 11/781，848，名稱為“細(xì)胞分選系統(tǒng)和方法”的共同在審專利申請(qǐng)中所述，其通過引用整體 并入本文)將靶細(xì)胞引至靶流道，以用于包裹和/或編碼?？蓪⒎前屑?xì)胞引至與廢物槽連 接的廢物流道。在一些實(shí)施方式中，可在表型測定前分選所述細(xì)胞。另外，可基于測定的表 型特征分選所述細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，可使用兩種油形成三相體系，其中一種油充當(dāng)裝 載流體而第二種油充當(dāng)?shù)伍g間隔。這抑制了相鄰水滴的聚結(jié)。圖23A和B示PCR擴(kuò)增前和 后在三相體系中的微容器的例子。在步驟104中，用參照信號(hào)編碼微容器來索引在微容器中的細(xì)胞的表型信息，用 于隨后與微容器中的細(xì)胞的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。參照信號(hào)可包含在微容器中或從微容器中分 離?？墒褂镁哂歇?dú)特標(biāo)記且可光學(xué)測定的任何物理參數(shù)以偽隨機(jī)模式產(chǎn)生參照信號(hào)。然后 記錄和儲(chǔ)存一個(gè)以上編碼的微容器圖像，用于隨后在用包含在微反應(yīng)器中或從微反應(yīng)器中 分離的 進(jìn)行基因型測定后與微容器圖像進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)。例如，在一些實(shí)施方式中，可以 偽隨機(jī)模式將熒光微珠或染料注入微容器，然后其成像。另外，微容器的尺寸、微容器的長 度和/或微容器之間的間隔可以變化，以創(chuàng)建一個(gè)可重建的偽隨機(jī)模式。在編碼模式中的 參照信號(hào)時(shí)間間隔可依據(jù)需要的跟蹤精度而變化。例如，在一些實(shí)施方式中，參照信號(hào)可與 每個(gè)微容器連接，或參照信號(hào)可與每10個(gè)微容器連接，或與每100個(gè)微容器連接，或與每 200個(gè)微容器連接，或與每500個(gè)微容器連接，或與每1000個(gè)微容器連接。在步驟106中，測定了細(xì)胞的基因型。裂解細(xì)胞并經(jīng)受擴(kuò)增(如等溫?cái)U(kuò)增、終點(diǎn) PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR或定量PCR)靶DNA序列所需的熱條件。在經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)施方式中， 使溫度循環(huán)以產(chǎn)生用于PCR所需循環(huán)數(shù)的適合溫度。這可通過使用熱塊或Peltier裝置 的標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀完成，或可通過替代技術(shù)(如烤箱、冷熱空氣、流動(dòng)具有良好熱傳導(dǎo)性的加 熱液體、在不同溫度下的儀器組件之間傳輸裝置或現(xiàn)有技術(shù)已知的其他任何適宜加熱元件 (認(rèn)為所述相同列表可適用于本文所述的其他實(shí)施方式))完成。在一些實(shí)施方式中，微容 器可連續(xù)流經(jīng)重復(fù)通過固定溫度區(qū)的蛇形流道，以完成聚合酶鏈反應(yīng)。另外，可將微容器裝 載進(jìn)流道中并保留或多或少的靜電，同時(shí)流道的溫度通過所需的溫度分布反復(fù)循環(huán)，以完 成聚合酶鏈反應(yīng)。微容器經(jīng)受所需的PCR循環(huán)數(shù)以擴(kuò)增靶DNA，并測定擴(kuò)增產(chǎn)物。在微反應(yīng) 器中包裹細(xì)胞的混合試劑包括非特異性熒光檢測分子(如嵌入染料)，或序列特異性熒光 探針(如分子信標(biāo)，TaqMan 探針)或現(xiàn)有技術(shù)已知的其他任何適宜探針或標(biāo)記，當(dāng)激 發(fā)所述探針或標(biāo)記時(shí)，其發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物量成比例的熒光。所述探針可與以與DNA產(chǎn)物成 比例的量存在的通過DNA擴(kuò)增過程產(chǎn)生的雙鏈DNA產(chǎn)物、單鏈DNA產(chǎn)物或非產(chǎn)物寡核苷酸 結(jié)合。成像系統(tǒng)使用所需波長的光來激發(fā)熒光探針，以直接或間接測定擴(kuò)增的產(chǎn)物。
在步驟108中，解碼基因型測定。光學(xué)檢測器(如光電倍增管、CCD照相機(jī)、光電二極管或光電二極管陣列或其他光學(xué)檢測器)測定在各微容器中的從探針或標(biāo)記發(fā)出的 熒光信號(hào)強(qiáng)度，并在各PCR循環(huán)期間測定擴(kuò)增產(chǎn)物量至少一次。將光學(xué)檢測器的圖像發(fā)送 到計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理和比較，以記錄微容器的編碼模式。在步驟110中，可用現(xiàn)有技術(shù)已 知的圖像處理算法來比較從基因型測定獲得的圖像和索引圖像，然后可逐個(gè)細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因 型測定和表型測定。在一些實(shí)施方式中，在步驟112中，可基于測定的基因表達(dá)來分選微容器，以捕獲 靶核酸用于進(jìn)一步分析?？苫诨蛐蜏y定使用上文所述的光學(xué)開關(guān)指引微容器進(jìn)入靶流 道或廢物流道。在另一實(shí)施方式中，如圖3所示，可同時(shí)進(jìn)行多步驟以使在微流網(wǎng)絡(luò)上的詢問點(diǎn) 數(shù)最少。在這里，將樣品輸入部12中已標(biāo)記的用于表型分析的細(xì)胞導(dǎo)入儀器中，且在步驟 102中，將其獨(dú)立包裹在含適合擴(kuò)增細(xì)胞中的靶DNA的預(yù)定混合試劑的微容器或滴中?？稍?透明的微容器中同時(shí)包裹用于編碼的參照信號(hào)，或另外可控制流動(dòng)條件以偽隨機(jī)的改變微 容器的物理特征，以建立參照信號(hào)。在步驟103中，可在一步驟中測定和記錄表型及參照信 號(hào)，以編碼表型信息，并創(chuàng)建用于與基因型測定關(guān)聯(lián)的索引。接下來在步驟105中，也可在 一步驟中測定基因型和解碼信號(hào)。例如，在上述第一實(shí)施方式中，所述基因型分型光源和檢 測器不同于解碼用光源和檢測器。在這里，可共享所述光源和/或檢測器。裂解個(gè)細(xì)胞，然后使所述微容器經(jīng)受擴(kuò)增(如實(shí)時(shí)PCR或定量PCR)靶DNA序列所 需的熱條件。使所述微容器經(jīng)受所需PCR循環(huán)數(shù)，以擴(kuò)增靶DNA。通過激發(fā)包含在PCR試劑 混合物中的熒光探針，并用光學(xué)檢測器檢測熒光強(qiáng)度來測定PCR循環(huán)中的擴(kuò)增產(chǎn)物。所述 光學(xué)檢測器可為使用連續(xù)流體系的掃描檢測器，或?yàn)楣潭ㄊ綑z測器。將圖形發(fā)送到計(jì)算機(jī)， 以用于圖像的處理和比較，從而記錄微容器的編碼模式。然后可逐個(gè)細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因型測定 值和表型測定值。圖4 5進(jìn)一步詳細(xì)顯示了上述步驟，并使用微流組分進(jìn)行所述步驟。在步驟100 中，通過將細(xì)胞200經(jīng)微流入口 202導(dǎo)入到流道209中來進(jìn)行表型分析。通過兩個(gè)側(cè)面的 鞘緩沖通道203、204建立的鞘緩沖流201夾住所述細(xì)胞200。在鞘流中使用的緩沖液可為 與正在分析的細(xì)胞生物學(xué)相容，且與在熒光檢測(即所述緩沖液在熒光激發(fā)/檢測波長處 具有足夠低的吸光度)和光學(xué)開關(guān)波長中使用的光學(xué)照明相容的任何緩沖液。鞘緩沖液的 優(yōu)選實(shí)施方式使用PBS/BSA，在含有牛血清白蛋白(BSA)級(jí)分5的pH 7. 2的磷酸鹽緩 沖液(PBS)。鞘緩沖液201將細(xì)胞200聚集成細(xì)胞200的單束線，然后在分析區(qū)205對(duì)其進(jìn)行 詢問，以測定一個(gè)以上的所需細(xì)胞表型特征。照明光源(如固定或掃描激光器、UV燈、發(fā)光 二極管或其他平行光源)可導(dǎo)致連接到細(xì)胞200的標(biāo)記(如熒光染料、抗體、GFP或其他熒 光色素)發(fā)熒光，并散射細(xì)胞及容器，以提供各細(xì)胞和容器的物理性質(zhì)的信息(如尺寸、形 態(tài)或緣界)。一個(gè)以上的光學(xué)檢測器(如CCD成像、PMT或光電二極管陣列)測定產(chǎn)生的信 號(hào)。也可在分析區(qū)205進(jìn)行其他類型的光學(xué)測定(如光散射)，以測定細(xì)胞200的表型特 征。在一些實(shí)施方式中，可使用例如四種顏色的流式細(xì)胞術(shù)或通過測定熒光和/或散射來 進(jìn)行多表型測定。例如，可通過多熒光團(tuán)標(biāo)記細(xì)胞，或使用對(duì)不同波長發(fā)出的熒光敏感的其 他熒光探測通道(通常使用單激發(fā)波長(例如但不僅限于488nm))進(jìn)行多表型測定。在這里，各檢測通道合并了 PMT與適宜分色鏡和用于附加附加熒光團(tuán)的熒光發(fā)射波長的發(fā)射濾 光片。以這種方式，由2 4次熒光檢測，即完成通道調(diào)適。在所示實(shí)施方式中，將含有基因表達(dá)測定所需的試劑和熒光DNA檢測分子或探針 的PCR混合物經(jīng)置于鞘流道203、204和包裹流道207a、b之間的側(cè)向試劑流道206a、b注射 進(jìn)流動(dòng)流(flow stream)。在另一實(shí)施方式中，可通過鞘緩沖流道203、204將PCR混合物導(dǎo) 入到細(xì)胞流中。在下一步驟102中，通過將疏水性包裹介質(zhì)經(jīng)側(cè)向包裹流道207a、b導(dǎo)入到流道 209中來進(jìn)行包裹?？墒褂霉栌?、礦物油、氟碳油或其他疏水性液體以促進(jìn)分散水滴的產(chǎn)生。 所述包裹介質(zhì)夾住PCR混合物流和細(xì)胞進(jìn)入個(gè)水基納升微容器或微反應(yīng)器208。 所述納升 微容器208優(yōu)選具有大于細(xì)胞200但不顯著大于微流通道209的直徑。優(yōu)選將包裹流道 207a、b中的流動(dòng)條件選擇為確保優(yōu)選包裹0個(gè)或一個(gè)細(xì)胞/微容器。例如與流式細(xì)胞術(shù) 匹配的微流通道通常具有50 μ m 100 μ mX 150 μ m 300 μ m的橫截面，且可獲得的聚四 氟乙烯毛細(xì)管的直徑可小至400 μ m,因此微容器208的直徑在30 μ m 400 μ m的范圍內(nèi)。在下一步驟104中，編碼和解碼微反應(yīng)器208的序列，以輔助將表型和基因型相關(guān) 聯(lián)。如圖5所示，在表型分析和油滴包裹之間通過將一個(gè)以上的編碼珠220偽隨機(jī)地連接 到細(xì)胞流中一些細(xì)胞200來進(jìn)行編碼。在圖示實(shí)施方式中，所述編碼珠220具有可讀取和 記錄的熒光信號(hào)，以創(chuàng)建在微容器208的流中的個(gè)微容器208的位置的索引。另外，可以偽 隨機(jī)模式將染料的可光學(xué)檢測的脈沖與個(gè)細(xì)胞相連接。一旦編碼珠220連接到細(xì)胞200，所 述細(xì)胞200被包裹到個(gè)微容器208中，然后所述微容器208流經(jīng)可導(dǎo)致編碼珠220發(fā)熒光 的解碼激光器225，且一個(gè)以上的檢測器225測定產(chǎn)生的信號(hào)，以編碼微容器208，及創(chuàng)建微 容器208的索引。記錄的編碼珠(或染料)和細(xì)胞的模式成為可在細(xì)胞裂解后使用的唯一 標(biāo)志，以使從各反應(yīng)器的信號(hào)反過來與測定的細(xì)胞表型相關(guān)聯(lián)。在進(jìn)行擴(kuò)增后，將第二解碼 激光器226置于鄰近所述蛇形流道210處，以使微容器成像。所述第二解碼激光器226使 用光源(如固定或掃描激光器、UV燈或發(fā)光二極管)，以導(dǎo)致編碼珠206發(fā)熒光或散射，且 光學(xué)檢測器(如CCD成像、光電倍增管、光電二極管或光電二極管陣列)測定信號(hào)，以創(chuàng)建 微容器208的圖像，其可與儲(chǔ)存的編碼圖像進(jìn)行比較，以鑒定個(gè)微容器208。通常使用用于 鑒定在磁性數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器中丟失的數(shù)據(jù)位的糾錯(cuò)算法來確定事件的順序。在圖示實(shí)施方式中，通過改變在流道209中的流動(dòng)條件以改變微容器208之間的 間距來提供第二冗余編碼信號(hào)。如圖5所示，這可創(chuàng)建另一可光學(xué)檢測的參照信號(hào)(即液 緣界信號(hào)(droplet boundarysignal))，其可被成像、儲(chǔ)存和重建，以追蹤個(gè)微容器208。在 另一實(shí)施方式中，可獨(dú)立使用用于創(chuàng)建獨(dú)特、可重建模式的參照信號(hào)的任何方法，以編碼微 容器。此外，在兩種實(shí)施方式中，通過提高或降低將編碼信息連接到個(gè)微容器的頻率來制作 的編碼信號(hào)或多或少的強(qiáng)烈依賴于在細(xì)胞追蹤中的可接受誤差水平。例如在一些實(shí)施方式 中，可將編碼珠連接到每個(gè)微容器。另外，可將隨機(jī)模式的編碼珠應(yīng)用于每10個(gè)容器、或每 50個(gè)容器、或每100個(gè)容器、或每500個(gè)容器、或每1，000個(gè)容器的多微容器。類似地，如果 通過改變微容器之間的距離來創(chuàng)建編碼信號(hào)，可將所述距離調(diào)至在10個(gè)容器的塊、或50個(gè) 容器的塊、或100個(gè)容器的塊、或500個(gè)容器的塊或1000個(gè)容器的塊中編碼。接下來在步驟106中，裂解包裹的細(xì)胞200，并用實(shí)時(shí)PCR或定量PCR分析其基因 表達(dá)?？衫矛F(xiàn)有技術(shù)已知的多種方法裂解細(xì)胞，所述方法包括用激光光解、基于超聲波的裂解或化學(xué)裂解。然后所述微容器208流經(jīng)蛇形微流通道210以使微容器208流經(jīng)擴(kuò)增和 實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增的基因產(chǎn)物所需的一個(gè)以上的熱區(qū)。在圖示實(shí)施方式中，蛇形通道210重復(fù) 流經(jīng)三個(gè)溫區(qū)211、212和213。溫區(qū)維持在適宜溫度，以進(jìn)行PCP循環(huán)。例如如本文所示， 第一溫區(qū)211約為60°，第二溫區(qū)212約為72°，第三溫區(qū)213約為96°。溫控系統(tǒng)調(diào)整 流動(dòng)條件，以確保微容器可在各溫區(qū)保留適宜PCR循環(huán)時(shí)間。使微容器208多次流經(jīng)溫區(qū) 211、212、213，且在各次通過后進(jìn)行測定，以測定擴(kuò)增產(chǎn)物量。如以上所討論，PCR混合物包 括發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物量成比例水平的熒光的探針。所述熒光團(tuán)可由光源214(如固定和掃描 激光器、UV燈、發(fā)光二極管)在各PCR循環(huán)期間在特定的時(shí)間或溫度激發(fā)，并通過檢測器 215 (如光電倍增管、CCD照相機(jī)、光電二極管或光電二極管陣列或其他光學(xué)檢測器)檢測。 檢測器215測定熒光強(qiáng)度，以確定在微反應(yīng)器208中的擴(kuò)增產(chǎn)物量。 接下來在步驟108中，解碼先前所記錄的表型測定值。如圖5所示，在個(gè)微容器 208在蛇形通道210中擴(kuò)增時(shí)，第二解碼激光器225讀取來自所述個(gè)微容器208的編碼信 號(hào)。然后將編碼信號(hào)和基因表達(dá)測定結(jié)果發(fā)送到處理器，以用于編碼信號(hào)的解碼，及將與編 碼信號(hào)連接的細(xì)胞的表型信息與新近測定的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，需要從所測定細(xì)胞的選定部分回收遺傳物質(zhì)，或基于遺傳標(biāo) 志(無需關(guān)聯(lián)表型)分選細(xì)胞。例如如圖12所示，在一些實(shí)施方式中，在基因表達(dá)測定的 最后，可將微容器208分選進(jìn)入兩個(gè)槽，如廢物槽231和靶槽230。使用側(cè)向力開關(guān)225分 選微容器，以基于關(guān)聯(lián)的表型-基因型測定將層流之間的微容器208切換流入到靶流道220 和廢物流道21中。使用光力、雙向電泳、射流脈沖或相似手段控制側(cè)向力開關(guān)。在一些實(shí) 施方式中，不進(jìn)行表型測定，且PCR擴(kuò)增后的分選只基于基因型測定。圖6示在微流網(wǎng)絡(luò)中逐個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表型和基因型關(guān)聯(lián)的集成系統(tǒng)的實(shí)施方式。儀 器300含有可重復(fù)使用的平臺(tái)，其固定了熱組件302，激發(fā)源303、308和所需的檢測器312、 304和306，以詢問和分析含在盒320中的樣品。包含微流網(wǎng)絡(luò)芯片的一次性樣品裝載盒320 與儀器300芯片連接，以進(jìn)行樣品的分析。盒320具有配置為含有編碼、分離和擴(kuò)增樣品 細(xì)胞所需的細(xì)胞樣品和所有試劑、緩沖液、編碼染料或編碼珠和包裹介質(zhì)的多個(gè)槽321 324。在所示的實(shí)施方式中，在槽323中含有細(xì)胞樣品，在槽324中含有油包裹介質(zhì)，在槽 322中含有編碼珠，且在槽321中含有用于產(chǎn)生單細(xì)胞流的鞘緩沖液。在這里，在鞘槽321 中也包括含有擴(kuò)增所需試劑和熒光標(biāo)記的PCR混合物。用UV粘著劑將芯片與盒320的光學(xué)窗口區(qū)連接，且芯片輸入口與其一次性盒320 上相應(yīng)的槽容積(reservoir volumes)連接。將芯片上的樣品流道309中的輸入口與一次 性盒上的細(xì)胞樣品槽323流通連接，以將所述細(xì)胞導(dǎo)入到樣品流道309中。細(xì)胞樣品槽323 的形狀通常為圓錐形，往輸入口的方向漸細(xì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，入口槽含有聚丙烯插入 物，以使細(xì)胞粘附最少，從而使細(xì)胞產(chǎn)量最大。芯片上的微流通道305、307流通連接槽321、 324的出口到樣品流道309。側(cè)向流道305a、b配置為添加PCR混合物到樣品流道309中， 然后側(cè)向流道307引導(dǎo)油進(jìn)入樣品流道309，以在油中包裹樣品細(xì)胞。在儀器300內(nèi)安置盒 320，以在樣品流道309鄰近安置光源(如488nm的激光器303和熒光檢測器312)。盒優(yōu) 選由光學(xué)透明的丙烯酸塑料制成。光學(xué)視窗還使可對(duì)在微流網(wǎng)絡(luò)中的選定位點(diǎn)進(jìn)行可見的 詢問，并使激發(fā)光源和光學(xué)檢測器經(jīng)盒投影到微流芯片。如果適合的話，也可用其他光學(xué)透 明的塑料或適宜材料替代丙烯酸。微流通道通常用光學(xué)透明的物質(zhì)制成，以使細(xì)胞檢測光投影到樣品流道309?；逋ǔ榈幌抻诓ＡА⑹?、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT) 等)及其他可塑的或可行的聚合物(如聚二甲基硅氧烷、PDMS或SU8)。從488nm的激光器303發(fā)出的光經(jīng)盒320投影到在包裹區(qū)上游的樣品流道309， 以詢問細(xì)胞。488nm的激光器303，樣品細(xì)胞的選定表型特征。熒光檢測器312測定熒光， 以測定細(xì)胞的表型信息。然后在適宜條件下將包裹介質(zhì)(如油)導(dǎo)入到樣品流道309，以 將單個(gè)細(xì)胞包裹入個(gè)納升微容器。然后基于一個(gè)以上的測定的包裹的細(xì)胞的表型特征經(jīng)樣 品流道309分選微容器，以用于進(jìn)一步的基因型分型，或進(jìn)入廢物流道330以運(yùn)輸?shù)綇U物槽 334。當(dāng)微容器流經(jīng)樣品流道309時(shí)，索引解碼激光器308以偽隨機(jī)順序激發(fā)先前與細(xì)胞所 連接的索引珠。解碼傳感器306檢測、成像 和儲(chǔ)存連接到細(xì)胞的索引珠的順序，從而它們流 經(jīng)樣品流道309，以創(chuàng)建微容器的索引，以用于與后續(xù)的基因型測定圖像相關(guān)聯(lián)。一旦微容 器已被編碼，將其裝載到用于PCR擴(kuò)增的微流芯片上的蛇形微流通道中。將儀器上的熱組 件302置于鄰近預(yù)裝載微流通道處，使微流芯片中的微容器循環(huán)通過完成PCR擴(kuò)增所需的 溫區(qū)。熱組件302包括熱控元件和使用熱塊或Peltier裝置的標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀，其也可使用 其他技術(shù)來完成，如一個(gè)以上的集成加熱絲、烤箱、冷熱空氣、流動(dòng)具有良好導(dǎo)熱性的加熱 液體、在不同溫度下的儀器組件之間傳輸裝置、或現(xiàn)有技術(shù)已知的其他任何適宜加熱元件。 在一些實(shí)施方式中，可使用多個(gè)加熱元件以建立空間上的熱區(qū)，所述芯片用動(dòng)力元件物理 通過所述熱區(qū)。另外，可使用單個(gè)加熱元件(如冷/熱空氣加熱器)交替加熱和冷卻微流 通道，以使其循環(huán)經(jīng)歷PCR擴(kuò)增用溫度分布。熱控元件控制溫度，并使蛇形通道多次循環(huán)經(jīng) 歷完成所需PCR循環(huán)數(shù)的PCR溫度分布。在各PCR循環(huán)后分析微容器，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物量。如上所述，所述PCR混合物含有 探針，其發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物量成比例水平的熒光。在各PCR循環(huán)期間可通過光源(如固定和 掃描激光器、UV燈、發(fā)光二極管)在特定時(shí)間或特定溫度下激發(fā)探針。通過在微流芯片鄰近 安置的PCR圖像傳感器304(如光電倍增管、CCD照相機(jī)、光電二極管或光電二極管陣列、或 其他光學(xué)檢測器)測定熒光信號(hào)。所述圖像傳感器304測定熒光強(qiáng)度，以測定微反應(yīng)器208 中的擴(kuò)增產(chǎn)物量和各微容器中細(xì)胞的基因型。所述索引解碼激光器308也激發(fā)與各微容器 連接的索引珠，并通過解碼傳感器306使編碼信號(hào)成像。然后將各微容器的編碼信號(hào)和基 因型數(shù)據(jù)發(fā)送到處理器，以索引和關(guān)聯(lián)表型測定與來自個(gè)微容器208的基因型數(shù)據(jù)。在一 些實(shí)施方式中，逐個(gè)循環(huán)對(duì)微容器進(jìn)行成像和跟蹤，例如使用滴尺寸和各圖像中的位置。在 另一實(shí)施方式中，在完成所需PCR循環(huán)數(shù)后對(duì)微容器進(jìn)行成像，并讀取編碼信號(hào)。圖7示與微流毛細(xì)管或微流芯片一起使用的一次性樣品裝載盒的實(shí)施方式，其用 于進(jìn)行單細(xì)胞分析及關(guān)聯(lián)表型信息和基因型信息。盒有6個(gè)內(nèi)置的槽321 326，各具有 單獨(dú)配置為提供與連接芯片上的微流通道接口連接的輸出口。用咬對(duì)蓋340密封槽容積 (reservoirvolumes)321 326，所述咬對(duì)蓋具有鉆進(jìn)去的端口以用于連接氣動(dòng)控制器和 個(gè)槽321 326。所述端口可對(duì)槽應(yīng)用氣壓，其可通過對(duì)槽321 326單獨(dú)施壓來驅(qū)動(dòng)流 體和細(xì)胞經(jīng)過連接的微流芯片的微流網(wǎng)絡(luò)。在另一實(shí)施方式中，可通過注射泵、蠕動(dòng)泵或其 他方式的運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)流體。在所示的實(shí)施方式中，槽323配置為容納約5 50 μ L體積的樣 品；槽324配置為容納約50 1500 μ L體積的包裹介質(zhì)(如油)，且槽321配置為容納PCR 混合物。在一些實(shí)施方式中，槽322可配置為容納編碼介質(zhì)(如熒光珠或染料)。槽321、 322,323和324各包含配置為與連接的芯片的微流網(wǎng)絡(luò)上的入口流通連接的端口，以用于裝載樣品、PCR混合物和可選的編碼介質(zhì)，及將細(xì)胞包裹在包裹介質(zhì)中?？墒褂貌?25和326作為廢物槽形式的實(shí)施方式，其中在包裹前分選所述細(xì)胞。另外，可將一個(gè)以上的槽325和 326與連接的PCR芯片上的多個(gè)通氣道流通連接，以允許芯片上的微流通道內(nèi)的樣品流的 熱膨脹和收縮，同時(shí)可防止外部環(huán)境污染樣品流。蓋340包含硅膠墊片，以輔助其密封盒體 341。它還包括0. Ιμπι的聚丙烯過濾器，以在盒體和外部環(huán)境間創(chuàng)造透氣、液密的接口。在 序列號(hào)為11/781848，名稱為“細(xì)胞分選系統(tǒng)和方法”的共同在審專利申請(qǐng)(其通過引用整 體并入本文)中進(jìn)一步詳述了一次性盒的其他實(shí)施方式。如上所述，進(jìn)行表型-基因型關(guān)聯(lián)的方法和裝置可適于數(shù)百個(gè)細(xì)胞 數(shù)千個(gè)細(xì)胞 至數(shù)萬個(gè) 數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞數(shù)規(guī)模的樣品?？蓪x器平臺(tái)300和一次性樣品裝載盒320可 與配置為處理達(dá)一百個(gè)細(xì)胞的樣品、或達(dá)一千個(gè)細(xì)胞的樣品、或達(dá)一萬個(gè)細(xì)胞的樣品、或達(dá) 十萬個(gè)細(xì)胞的樣品的多種不同的毛細(xì)管或微流網(wǎng)絡(luò)芯片一起使用。圖8示與一次性盒320 —起使用的微流裝載芯片400和毛細(xì)管420的實(shí)施方式。 微流芯片410配置為例如通過UV粘著劑連接將其與盒320的光學(xué)窗口區(qū)連接。當(dāng)芯片連 接到盒320時(shí)，在微流芯片上安置輸入部口 411、412和413，以與PCR混合物槽321、包裹介 質(zhì)槽324和樣品輸入槽323相聯(lián)接。樣品輸入部口 413與樣品流道409流通連接，由此，在 使用中，包含在樣品槽323中的樣品細(xì)胞會(huì)被輸送到樣品流道409中。PCR混合物槽411與 PCR流道405a、b流通連接，其在T形接頭處與樣品流道409相交，以將PCR混合物導(dǎo)入到 流經(jīng)樣品流道409的樣品細(xì)胞流中。在一些實(shí)施方式中，控制PCR混合物的流動(dòng)條件，從而 PCR混合物的導(dǎo)入還將樣品流組織為單束細(xì)胞流。另外，當(dāng)在樣品細(xì)胞輸入部413導(dǎo)入樣品 時(shí)，樣品流道409的直徑可配置為將樣品組織成單束細(xì)胞流。包裹介質(zhì)入口 412與包裹流 道407流通連接，其在PCR混合物交叉點(diǎn)下游的L形接頭處與樣品流道409相交。包裹介質(zhì) (如油)在適宜流動(dòng)條件下在樣品流道409和包裹流道407之間的“L”形接頭處流進(jìn)細(xì)胞 和PCR混合物流，以夾斷細(xì)胞和PCR混合物滴進(jìn)入納升微容器流(優(yōu)選含由油包裹介質(zhì)包 圍的單個(gè)細(xì)胞)?？刂圃诎鞯?07中的流動(dòng)條件，以確保在每微容器中優(yōu)選包裹0或一 個(gè)細(xì)胞。例如，與流式細(xì)胞術(shù)匹配的微流通道的截面通常為50 100 μ mX 150 300 μ m, 且可用的Teflon毛細(xì)管直徑可小至400 μ m,所以納升微容器408將具有30 400 μ m的直 徑。可通過直接驅(qū)動(dòng)泵、氣動(dòng)泵、電動(dòng)力學(xué)、毛細(xì)管作用、重力或其他產(chǎn)生流體流動(dòng)的方法完 成微流通道網(wǎng)絡(luò)中的流動(dòng)條件的設(shè)置和控制。然后將微容器408流裝載進(jìn)微流毛細(xì)管420中，以用于微容器中遺傳物質(zhì)的擴(kuò)增 及基因表達(dá)的測定。如上所述，可進(jìn)一步控制樣品流道409和包裹流道307的流動(dòng)條件，以 改變納升微容器的尺寸和/或如上所述的納升微容器間的間隔，其可提供用于編碼和索引 微容器的相對(duì)位置的微容器的特有順序。在所示的實(shí)施方式中，毛細(xì)管中的微容器間的距 離⑷為約500 1000 μ m,且微流毛細(xì)管420的總長度(L)為500 1000mm，以提供約1000 個(gè)微容器的容量。在另一實(shí)施方式中，可調(diào)整液滴的間距和/或微流毛細(xì)管的總長度，以適 應(yīng)更大或更小的樣品。在使用時(shí)，將毛細(xì)管塑成蛇形布置，其含有由兩端接頭連接的多個(gè)鄰 近平行區(qū)段。例如，在一些實(shí)施方式中，將毛細(xì)管劃分成10 20個(gè)的平行區(qū)段。切斷所述 接頭，留下多個(gè)鄰近的平行區(qū)段，其各長40 50mm。在擴(kuò)增處理前可將毛細(xì)管劃分成多個(gè) 區(qū)段，以使其在毛細(xì)管內(nèi)的微容器位置上、在PCR擴(kuò)增循環(huán)間熱膨脹的連鎖反應(yīng)最小化，從 而提高追蹤個(gè)微容器位置的能力，由此可將擴(kuò)增產(chǎn)物的測定與先前的各個(gè)微容器的表型測定相關(guān)聯(lián)。
圖9A C示基于上述PCR體系的與毛細(xì)管一起使用的熱控組件。一旦將微容器 裝載入毛細(xì)管420，并將毛細(xì)管劃分成多個(gè)區(qū)段421，將區(qū)段421安裝進(jìn)具有多個(gè)矩形槽423 或毛細(xì)管夾持器的鋁塊422。矩形槽約為Imm深、或2mm深、或3mm深、或4mm深、或5mm深。 在一實(shí)施方式中，如圖9B所示，矩形槽423的寬度比毛細(xì)管的橫切面直徑稍窄，從而在槽的 底部和側(cè)壁與毛細(xì)管之間有熱接觸；而在一些實(shí)施方式中，當(dāng)毛細(xì)管與鋁塊的底部和側(cè)壁 非常接近時(shí)，矩形槽的寬度比毛細(xì)管的直徑稍大。在另一實(shí)施方式中，如圖9C所示，底部毛 細(xì)管夾持器424的形狀相當(dāng)于毛細(xì)管區(qū)段直徑，以便在鋁塊422和毛細(xì)管區(qū)段421之間有 更多的熱接觸。在上述兩個(gè)實(shí)施方式中，矩形槽側(cè)壁的寬度大于等于毛細(xì)管的直徑。在一 些實(shí)施方式中，可在鋁塊的頂部安裝約Imm厚度的玻璃蓋425，以防止向周圍空氣的傳導(dǎo)和 阻礙熱輻射。另外，可在沒有玻璃蓋的情況上使用更深的槽。在另一實(shí)施方式中，可將矩形 槽的側(cè)壁制得比毛細(xì)管的直徑薄，其有利于減少矩形槽之間的間隔，從而提高了加熱塊中 毛細(xì)管的密度。在所述實(shí)施方式中，在高度與毛細(xì)管直徑相等的矩形槽上使用玻璃蓋，以 在較薄的側(cè)壁間保持良好的導(dǎo)熱性；或制作的矩形槽的高度至少為毛細(xì)管直徑的1. 5倍。 例如，在一實(shí)施方式中，如果槽的深度至少為毛細(xì)管直徑的1.5倍，則其側(cè)壁有約0. Imm 0. 2mm的厚度。一旦用多個(gè)毛細(xì)管區(qū)段421裝載鋁塊422，鋁塊的溫度可以1°C /S從60°C 升到95°C，以使毛細(xì)管區(qū)段421循環(huán)經(jīng)過用于PCR擴(kuò)增的溫度分布。可使用任何適合的上 述加熱元件循環(huán)溫度經(jīng)歷所需PCR的循環(huán)數(shù)。圖10示對(duì)更大的樣品進(jìn)行單細(xì)胞表型和基因型分析及關(guān)聯(lián)的微流芯片500的實(shí) 施方式。所示的微流芯片500約為75mmX 75mm，且具有達(dá)10，000個(gè)微容器的容量。微流芯 片優(yōu)選為光透明基板，以使細(xì)胞檢測光能投影到微通道。所述基板通常為但不限于玻璃、 石英、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT)等)及其他可塑的或可行的聚合物(如聚二甲基 硅氧烷、PDMS或SU8)。如上所述，在使用時(shí)，將微流芯片500連接到含有樣品、PCR混合物和包裹介質(zhì)的 一次性樣品裝載盒。當(dāng)在一次性盒的光學(xué)窗口上安置芯片500時(shí)，在一次性盒上所述芯片 500具有配置為連接到細(xì)胞槽、PCR混合物槽和油槽的細(xì)胞入口 513、PCR混合物入口 512和 油入口 511。細(xì)胞輸入部口 515與樣品流道509流通連接，以便在使用時(shí)，將在一次性盒的 樣品槽中含有的細(xì)胞輸送進(jìn)入樣品流道509。PCR混合物入口 411與PCR流道505a、b流 通連接，其與樣品流道409相交，以將PCR混合物導(dǎo)入流經(jīng)樣品流道409的細(xì)胞流。在一些 實(shí)施方式中，控制PCR混合物的流動(dòng)條件，由此PCR混合物的導(dǎo)入將樣品流匯集為單束細(xì)胞 流。另外，當(dāng)在細(xì)胞樣品輸入部513導(dǎo)入樣品時(shí)，可將樣品流動(dòng)細(xì)胞509的直徑配置為將樣 品匯集為單束細(xì)胞流。油入口 512與包裹流道507流通連接，其在PCR混合物交叉點(diǎn)下游 的L形接頭處與樣品流道409相交。在適宜流動(dòng)條件下，在樣品流道409和包裹流道407 之間的“L”形接頭處，將油流注入細(xì)胞和PCR混合物流中，以夾住細(xì)胞和PCR混合物滴進(jìn)入 納升微容器流(優(yōu)選含有由油包裹介質(zhì)包圍的單個(gè)細(xì)胞)。在一些實(shí)施方式中，為了限制包 裹細(xì)胞的數(shù)量至預(yù)選的仍可反過來與表型測定相關(guān)聯(lián)的亞群(subpopultion)，在包裹前提 供分選區(qū)以分選樣品。例如，可進(jìn)行分選，以舍棄紅細(xì)胞而只匯集有核細(xì)胞。納升微容器的 橫截面直徑優(yōu)選比樣品細(xì)胞大，且比流道的橫截面直徑小。例如，微容器的橫截面直徑優(yōu)選 為30 400 μ m,取決于流道尺寸。
如上所述，控制包裹流道507中的流動(dòng)條件，以確保大部分微容器優(yōu)選含有一個(gè) 細(xì)胞或0個(gè)細(xì)胞，例如，在一些實(shí)施方式中，至少90 %的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞，或至少 80%的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞，或至少70%的微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞，或至少60%的 微容器含有1或0個(gè)細(xì)胞。另外，在一些實(shí)施方式中，可進(jìn)一步控制包裹流道507和/或樣 品流道509的流動(dòng)條件，以定期改變微容器尺寸和/或微容器間的間隔，以創(chuàng)建用于索引和 跟蹤個(gè)微容器的編碼信號(hào)?？赏ㄟ^直接驅(qū)動(dòng)泵、氣動(dòng)泵、電動(dòng)力學(xué)、毛細(xì)作用、重力或其他產(chǎn) 生流體流動(dòng)的方法完成微流通道網(wǎng)絡(luò)中的流動(dòng)條件的設(shè)置和控制。然后將微容器流裝載進(jìn)蛇形通道520中，所述蛇形通道520與樣品流道509(用于 擴(kuò)增樣品細(xì)胞中的靶序列)流通連接。通過多個(gè)彎段531a i相連的鄰近區(qū)段521a j 將蛇形分析通道509劃分成多個(gè)平行區(qū)段521a j。優(yōu)選將蛇形通道劃分成50 100個(gè) 的 平行區(qū)段，各50 IOOmm長，取決于樣品尺寸和微容器間的所需間隔。通氣道540a_j與 蛇形通道520的各平行區(qū)段521a j的各末端流通連接。通氣道540a j配置為適應(yīng)在 擴(kuò)增過程中的溫度循環(huán)之間各區(qū)段521a j中的微容器流的熱膨脹和收縮。將蛇形通道 520劃分成多個(gè)與通氣道連接的平行區(qū)段以隔絕由各微小區(qū)段521a j的熱膨脹引起的微 容器的運(yùn)動(dòng)，從而排除了沿整個(gè)蛇形通道520的熱膨脹的連鎖反應(yīng)。因此，可大大減少在溫 度循環(huán)期間蛇形通道520內(nèi)的微容器運(yùn)動(dòng)，并提高了在大體積樣品(例如在蛇形通道520 內(nèi)含有)中追蹤個(gè)微容器的能力。使在溫度循環(huán)期間的微容器運(yùn)動(dòng)最小化也可使在相鄰微 容器占有的空間內(nèi)來回移動(dòng)的微容器的污染風(fēng)險(xiǎn)最小化，并降低了相鄰微容器聚結(jié)的可能 性。在使用時(shí)，在裝載蛇形通道520期間用高壓封件密封通氣道541a j，以維持在 蛇形通道520上的正壓，并確保在蛇形通道中裝載所述微容器。在一些實(shí)施方式中，第一， 高壓封件可包含機(jī)械膜和一個(gè)以上的橡膠墊片，以在樣品裝載期間密封各通氣道540a j。另外，可用在裝載后可被蝕刻的光刻材料或可由熱膨脹壓制動(dòng)(overcome)的疏水閥覆 蓋通氣道。一旦裝載入蛇形通道520，就可放開或移開第一高壓封件。然后使用第二封件隔 絕通氣道540a j與外部環(huán)境，以防止微容器污染。第二封件優(yōu)選機(jī)械順應(yīng)，以適應(yīng)在熱 循環(huán)期間的各區(qū)段521a j中的微容器的熱膨脹和收縮。例如，在一些實(shí)施方式中，所述 第二封件可包括附著到通氣道540a j的薄膜或柔性膜。另外，通氣道540a j可與一 次性盒上的一個(gè)以上的共用通氣槽流通連接，其可用柔性膜或具有過濾器的蓋與外部環(huán)境 隔絕。圖11示用于對(duì)更大規(guī)模的樣品(如含有達(dá)100，000個(gè)微容器的樣品)進(jìn)行單細(xì) 胞表型和基因型分析和關(guān)聯(lián)的微流芯片600的另一實(shí)施方式。芯片600被劃分成4個(gè)獨(dú)立 的裝載和分析區(qū)610a、b、c、d，各有蛇形通道620a d，所述蛇形通道620a 配置為容納 達(dá)25，000個(gè)微容器，且微容器間的間隔為約100 200 μ m?？稍傧氲綄⑿酒罁?jù)所需芯 片容量分成或多或少個(gè)裝載區(qū)。在一次性盒上，各裝載區(qū)610a d配置為具有連接到細(xì)胞 槽、PCR混合物槽和油槽的細(xì)胞入口 613a d、PCR混合物入口 612a d和油入口 611a d。芯片600上的各裝載區(qū)610a d優(yōu)選具有與上述10，000個(gè)PCR容量芯片相同的尺寸， 以便細(xì)胞輸入部、PCR輸入部和油輸入部的相對(duì)位置相近。在使用時(shí)，可將PCR芯片600連 接到動(dòng)力臺(tái)，其暫時(shí)連接各裝載區(qū)610a d到一次性盒，用于以如上所述用于具有一個(gè)裝 載和分析區(qū)的10，000個(gè)PCR微流芯片500時(shí)的相同方式，在芯片600中裝載樣品和PCR混合物，引導(dǎo)油將樣品和PCR混合物包裹在納升微容器中，及將微容器裝載入蛇形分析區(qū)。另 夕卜，可將盒和芯片集成為一個(gè)一體裝置。例如，在一些實(shí)施方式中，一次性盒可具有包裹介質(zhì)和PCR混合物共用的槽，其可 例如使用上述動(dòng)力臺(tái)交替連接到各芯片，或多路傳輸?shù)礁餍酒蜓b載區(qū)。另外，一次性盒具 有多個(gè)獨(dú)立的油槽和PCR混合物槽，其各與一個(gè)裝載區(qū)連接。同樣，在一些實(shí)施方式中，所 述盒可具有一個(gè)樣品槽，其使用一個(gè)以上的閥和流道多路傳輸?shù)礁骷?xì)胞輸入部。另外，在一 些實(shí)施方式中，所述盒具有多個(gè)樣品槽，其各獨(dú)立連接到一個(gè)細(xì)胞輸入部和分析區(qū)。所述盒 還配置為允許光及用于進(jìn)行表型分析的各裝載區(qū)。
如上文所述，參考微流芯片500，100，000PCR芯片600中的各裝載和分析區(qū) 610a d含有蛇形通道620a d，將其流通連接到所述蛇形通道620a d與樣品流道 609a d(用于各微容器中的樣品細(xì)胞的靶序列擴(kuò)增)的流通連接。將蛇形分析通道620 劃分成由多個(gè)彎段連接的多個(gè)平行區(qū)段。優(yōu)選將各蛇形通道620a d劃分成50 100個(gè) 的平行區(qū)段，各為約50 IOOmm長，取決于樣品尺寸和所需微容器間的間隔。如上所述，將 通氣道640與蛇形通道620a d的各平行區(qū)段的各末端流通連接，以密封在裝載過程期間 的蛇形通道620a d，并且允許在擴(kuò)增過程中隔絕蛇行通道與外部環(huán)境的同時(shí)允許蛇形通 道熱膨脹和收縮。在另一實(shí)施方式中，可對(duì)預(yù)裝進(jìn)微孔陣列芯片的樣品進(jìn)行表型-基因型分析及關(guān) 聯(lián)。圖12示為源于預(yù)裝進(jìn)微孔陣列的樣品的基因型數(shù)據(jù)分析和關(guān)聯(lián)表型-基因型數(shù)據(jù)的 步驟。在步驟700中，獨(dú)立分析了樣品輸入部70中細(xì)胞的選定表型特征。在一些實(shí)施方式 中，在將細(xì)胞分離進(jìn)納孔前，在微流環(huán)境(例如通過上文所述的流式細(xì)胞術(shù))中進(jìn)行表型分 析。另外，在個(gè)納孔中分離細(xì)胞后，可使用掃描式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型測定。如上所述，在一些 實(shí)施方式中，可使用例如多重?zé)晒鈾z測器或光散射測定儀和熒光的組合進(jìn)行多表型測定。在步驟702中，可基于用戶選定的參數(shù)(如測定的表型特征)分選細(xì)胞。然后可 將所述靶細(xì)胞指引至用于運(yùn)送到納孔陣列的靶流道?？蓪⒎前屑?xì)胞指引到連接廢物槽的廢 物流道。在步驟704中，在一個(gè)以上陣列的納孔中順序放置靶細(xì)胞。優(yōu)選各納孔可含有一 個(gè)細(xì)胞。向納孔中預(yù)裝載基因表達(dá)測定所需試劑及在被激發(fā)時(shí)發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物量成比例水 平的熒光的熒光檢測分子或探針。在一些實(shí)施方式中，可用孔數(shù)優(yōu)選超過所測細(xì)胞數(shù)，以確 保有限稀釋。使用疏水性流體蓋(如油)彼此隔絕個(gè)孔。可基于陣列中各細(xì)胞的精確位置 索引和記錄各納孔中細(xì)胞的表型信息。在步驟706中，測定個(gè)細(xì)胞的基因型?？衫眉訜帷⒓す?、超聲波或化學(xué)裂解或任 何本領(lǐng)域已知的其他適宜技術(shù)裂解細(xì)胞。熱偶聯(lián)陣列到塊加熱器，且使所述納孔通過等溫 擴(kuò)增或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)經(jīng)歷一個(gè)以上的擴(kuò)增基因產(chǎn)物所需的溫度。所述陣列經(jīng) 過所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，并測定擴(kuò)增的基因產(chǎn)物。在步驟708中，解碼基因型的測定。用光源(如固定或掃描激光器、UV燈、發(fā)光二 極管)激發(fā)熒光檢測分子或探針，且用光學(xué)檢測器(如CCD成像、光電倍增管、光電二極管 或光電二極管陣列)采集所述陣列的像，以測定各納孔中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并檢測擴(kuò)增產(chǎn) 物量。在一些實(shí)施方式中，用光學(xué)檢測器(如C⑶照相機(jī))采集整個(gè)陣列的像。另外，通過 掃描激發(fā)光源或掃描檢測器(如連接到光電倍增管的光纖)順序詢問各納孔。將圖像發(fā)送到用于圖像處理的處理器，并與先前記錄的各納孔的表型測定相關(guān)聯(lián)，從而提供了各細(xì)胞的相關(guān)聯(lián)的表型和基因型數(shù)據(jù)74。如圖13A B示，在一些實(shí)施方式中，可在微流環(huán)境中順序進(jìn)行細(xì)胞的表型測定， 然后在微孔陣列中裝載所述細(xì)胞，以進(jìn)行擴(kuò)增和基因型分析。在這里，在步驟700中，通過 將細(xì)胞808導(dǎo)入微流流道709中來進(jìn)行表型分析。如上所述，可講流道配置為例如通過減 小流道709的橫截面直徑來將所述細(xì)胞會(huì)極為單細(xì)胞流，以用于表型分析。在分析區(qū)705 順序詢問細(xì)胞808，以測定細(xì)胞的一個(gè)以上的表型特征。在一些實(shí)施方式中，基于測定的表 型特征或用戶選定的任何其他參數(shù)將細(xì)胞分選成靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞?？赏ㄟ^熒光、前向散 射或任何適宜成像或檢測形式在流體流中檢測具有所需特征的靶細(xì)胞的存在。然后使用通 過引用整體并入本文的、序列號(hào)為11/781848、名稱為“細(xì)胞分選系統(tǒng)和方法”的共同在審專 利申請(qǐng)中描述的雙向電泳、氣動(dòng)開關(guān)或雙向流體或光學(xué)開關(guān)將靶細(xì)胞指引到靶流道711，以 運(yùn)輸?shù)郊{孔陣列芯片800上的個(gè)納孔801a f。將非靶細(xì)胞指引到連接廢物槽的廢物流道 710。在步驟704中，將靶流道711與納孔陣列芯片800上的微流通道803流通連接，以 運(yùn)輸靶細(xì)胞流到個(gè)納孔801a f。將靶細(xì)胞808順序放置在個(gè)納孔801a f中。將所需 的PCR試劑和發(fā)出與擴(kuò)增產(chǎn)物量成比例水平的熒光的熒光檢測物或標(biāo)記預(yù)裝載到各納孔 位置801a f。納孔陣列中各細(xì)胞的位置創(chuàng)建索引，其可基于陣列中的位置隨后用于將各 細(xì)胞的表型測定與基因型測定相關(guān)聯(lián)。各納孔801a f優(yōu)選有幾納升的容積，以容納單個(gè) 細(xì)胞和擴(kuò)增靶DNA序列所需的試劑。例如，在一實(shí)施方式中，孔為100 μ mX 100 μ m的正方 形，及具有70 μ m的深度?？墒褂酶鞣N材料微制造所述納孔801a f，所用材料包括但不限 于玻璃、石英、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT)等)及其他可塑的或可行的聚合物(如 聚二甲基硅氧烷、PDMS或SU8)。微流通道803連接納孔801a f的深度通常在但不僅限 于ΙΟμπι IOOym的范圍。微流通道的寬度通常為但不僅限于深度的1 5倍。一旦細(xì) 胞被裝載到個(gè)納孔801a f中，使油或任何其他適宜包裹介質(zhì)流經(jīng)微流通道803，以分離與 各孔中與PCR試劑在一起的個(gè)細(xì)胞。接下來，在步驟706中，裂解分離的細(xì)胞，并循環(huán)經(jīng)歷完成聚合酶鏈反應(yīng)所需的溫 度分布。例如，如文本所述，所述陣列800循環(huán)經(jīng)歷約96°C的第一溫度、約60°C的第二溫度、 約72°C的第三個(gè)溫度。在一些實(shí)施方式中，通過使用本領(lǐng)域已知的一個(gè)以上的元件(如加 熱塊，集成加熱絲、Peltier加熱器)或通過循環(huán)熱/冷流體或熱/冷空氣來將納孔陣列溫 度調(diào)至產(chǎn)生用于PCR的適合溫度。進(jìn)行所需的PCR循環(huán)數(shù)，并測定擴(kuò)增產(chǎn)物。通過光源(如 固定和掃描激光器、UV燈、發(fā)光二極管)激發(fā)各納孔中的熒光探針或標(biāo)記，并用光學(xué)檢測器 815 (如CCD成像、光電倍增管、光電二極管或光電二極管陣列)采集所述納孔的像，以測定 熒光信號(hào)強(qiáng)度。在另一實(shí)施方式中，可使用UV光測定核酸產(chǎn)物的吸光度。然后依據(jù)在陣列 上的位置索引基因型的測定。因此，可基于在納孔陣列上的位置將各個(gè)細(xì)胞的表型和基因 型相關(guān)聯(lián)。在圖14所示的另一實(shí)施方式中，將流道709中的細(xì)胞流808分選進(jìn)入多個(gè)靶陣列 901a i。在多個(gè)靶陣列的情況下，依據(jù)多測定表型特征使用分選開關(guān)的網(wǎng)絡(luò)來分選細(xì)胞 流多次。例如，如下所示，使用4個(gè)分選開關(guān)725a d，在各分選岔口通過三條線路分選細(xì) 胞。在分選前基于測定的表型，所示分選網(wǎng)絡(luò)能將細(xì)胞分成9個(gè)不同的陣列901a i。如圖14B所示，雖然不將個(gè)細(xì)胞反過來與它們的表型相關(guān)聯(lián)，可確定各陣列的基因表達(dá)的逐 個(gè)細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布，且可將統(tǒng)計(jì)值與用戶選擇的9個(gè)表型聚類相關(guān)聯(lián)。 如圖15A B所示，在一些實(shí)施方式中，在個(gè)納孔801a f中存放和分離細(xì)胞后， 用掃描式細(xì)胞術(shù)測定各細(xì)胞的表型。在這里，標(biāo)記細(xì)胞用于表型分析，例如使用綴合熒光分 子(如異硫氰酸熒光素，又名FITC)的抗體、核染色劑、胞內(nèi)染料或細(xì)胞指導(dǎo)合成的熒光蛋 白(例如，綠色熒光蛋白，又名GFP)。然后將細(xì)胞放置于含擴(kuò)增靶序列所需的PCR試劑和用 于檢測擴(kuò)增的靶序列量的熒光探針或標(biāo)記的納孔801a f中，并將其分離。納孔801a f 可為正方形且平底，或優(yōu)選漸細(xì)至小平底，以便使細(xì)胞自動(dòng)在孔底集中，這減少了測定細(xì)胞 的表型所需的光學(xué)掃描儀數(shù)。在各納孔801a f中放置單個(gè)細(xì)胞。使用光源840 (如固定 和掃描激光器、UV燈、發(fā)光二極管)激發(fā)在納孔陣列800中細(xì)胞上的熒光標(biāo)記，并用熒光檢 測器812順序詢問在陣列800中的各納孔，以測定細(xì)胞的一種以上的表型特征。記錄在陣 列中的各細(xì)胞的位置和表型測定值，以使隨后的單個(gè)細(xì)胞的基因型測定易于與表型測定相 關(guān)聯(lián)。如上所述，裂解分離的細(xì)胞，并經(jīng)PCR溫度分布多次循環(huán)所述細(xì)胞，以擴(kuò)增遺傳物質(zhì)。 使用激光器840激發(fā)在各納孔中的熒光標(biāo)記或探針，并用熒光檢測器812測定熒光信號(hào)強(qiáng) 度，以測定各PCR循環(huán)后的擴(kuò)增遺傳物質(zhì)量。記錄陣列中的各位置的基因型測定結(jié)果，并將 其發(fā)送到處理器，以將其與先前所記錄的各納孔位置的表型測定相關(guān)聯(lián)，從而將各個(gè)細(xì)胞 的表型測定與基因型測定相關(guān)聯(lián)。實(shí)際上，通過給孔陣列加上坐標(biāo)系能進(jìn)行編碼和解碼。在一些實(shí)施方式中，如圖15A和圖18所示，需要基于細(xì)胞的表型和基因型測定，從 在納孔陣列中擴(kuò)增和測定的細(xì)胞的選定部分回收遺傳物質(zhì)。在將細(xì)胞放置在納孔陣列前或 后，可如圖13和圖15所示對(duì)細(xì)胞的一個(gè)以上的表型測定進(jìn)行詢問，或如果僅基于基因型信 息收集細(xì)胞，可直接將其放進(jìn)納孔陣列800中。如上所述，分離、裂解所述細(xì)胞，并經(jīng)一個(gè)以 上的溫度熱循環(huán)陣列800，以擴(kuò)增基因表達(dá)標(biāo)記。用光學(xué)檢測器815測定擴(kuò)增的遺傳物質(zhì)， 并將其與各納孔位置的表型信息相關(guān)聯(lián)。然后使用自動(dòng)微量移液器820基于相關(guān)聯(lián)的表 型-基因型信息從目的納孔中收獲遺傳物質(zhì)，以從個(gè)可尋址的目的孔中提取物質(zhì)。在圖13和圖15所示的納孔的另一使用方法的實(shí)施方式僅用于基因型分析?？煞?離、裂解、熱循環(huán)細(xì)胞，并如先前的圖13和圖15所述測定細(xì)胞的基因型信息，以獲得在數(shù)萬 到數(shù)十萬細(xì)胞上的平行的單細(xì)胞基因型數(shù)據(jù)。因?yàn)樾◇w積(通常為納升——，每細(xì)胞每反 應(yīng)的成本與相同數(shù)量散裝細(xì)胞的每反應(yīng)的成本相當(dāng)。圖18A 18B示以各種流形式進(jìn)行細(xì)胞分離的顯微圖。具體來說，顯微圖18A和 18B示塑料形成的裝置，而顯微圖18C和18D示PDMS形成的裝置。在圖18A中，在岔路口 1000的樣品混合溶液輸入部1002、間隔材料輸入部1004(如含有間隔油(如氟碳油))、溶 液輸入部1006，最終在輸出部1008形成包含在由間隔物質(zhì)分離的溶液內(nèi)的樣品混合物。圖 18B示用400 μ m的標(biāo)尺度量的顯微圖。圖18C示與圖18具有相同常規(guī)元件的相似結(jié)構(gòu)，且 已用一致的方式編號(hào)。圖19示如標(biāo)記所示的示波器跟蹤的細(xì)胞前向散射和液滴前向散射。y軸表示強(qiáng) 度，而X軸表示時(shí)間。從滴的前向散射(FSC)可看出，所述滴具有相當(dāng)規(guī)律的周期性，且指 明了一個(gè)滴和下一個(gè)滴間的緣界。相反，在細(xì)胞前向散射(FSC)中的峰的數(shù)量指明了在各 滴中的細(xì)胞數(shù)。圖20示在圖片中從上至下依次標(biāo)記為1011至1016的6種毛細(xì)管的顯微圖。通過滴長度變化影響材料的編碼。例如，將毛細(xì)管1013中的滴長度與鄰近毛細(xì)管1012中的 長度比較，顯示滴長度的顯著變化。圖21為又一通過改變滴長度影響編碼模式的顯微圖。顯微圖中從上至下編碼毛 細(xì)管1021、1022和1023。長度和位置都可形成變化的順序，其以“摩斯密碼”的模式表示。圖22A和22B示基因表達(dá)的實(shí)際檢測結(jié)果。圖22A示平行的20個(gè)毛細(xì)管，其各用 多個(gè)個(gè)反應(yīng)體積充滿。圖22A示表型CD34的結(jié)果。圖22B示qPCR后的結(jié)果。亮反應(yīng)滴代 表陽性基因的表達(dá)。用加到顯微圖上的箭頭標(biāo)記某些滴。通常，每滴中有一個(gè)或兩個(gè)細(xì) 胞。 約5%的細(xì)胞為CD34陽性的KG1A，約95%的細(xì)胞為CD34陰性的Jurkat細(xì)胞。標(biāo)記qPCR 強(qiáng)度的圖片示定量PCR強(qiáng)度作為循環(huán)數(shù)的函數(shù)。在χ軸的左邊為0個(gè)循環(huán)而在右邊以約46 個(gè)循環(huán)結(jié)束。CT直方圖反映了逐個(gè)細(xì)胞的⑶34表達(dá)量。雖然上述發(fā)明描述了將核酸擴(kuò)增與流式細(xì)胞術(shù)的表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的方法和裝置， 仍可容易設(shè)想在微容器中進(jìn)行其他分子檢測(如DNA甲基化、蛋白質(zhì)豐度、細(xì)胞因子檢測、 或其他酶或蛋白的檢測)，以將其與各細(xì)胞的表型測定相關(guān)聯(lián)。此外，雖然本發(fā)明的重點(diǎn)為 在微容器內(nèi)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的測定和關(guān)聯(lián)，但應(yīng)了解可使用上述裝置和方法將在多個(gè)細(xì)胞上 測定的表型_基因型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。雖然已通過有明確目標(biāo)的圖示和例子詳述了上述發(fā)明，但顯然其對(duì)所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說容易理解。依據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，也可在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn) 行一定的改變和改進(jìn)。
權(quán)利要求
用于微流單細(xì)胞分析和關(guān)聯(lián)的集成結(jié)構(gòu)，其包括●盒，所述盒包括■光學(xué)窗口，■多個(gè)槽，其至少包括◆樣品槽、◆流體槽、和◆試劑槽，及●芯片，所述芯片至少包括■細(xì)胞輸入通道，所述細(xì)胞輸入通道與所述樣品槽流通連接，■第一流體輸入通道，其與所述流體槽和所述細(xì)胞輸入通道流通連接，■第二流體輸入通道，其與所示試劑槽和所述細(xì)胞輸入通道流通連接，■蛇形通道，其包括第一末端和多個(gè)平行分區(qū)，所述第一末端與第一和第二流體輸入通道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接，所述多個(gè)平行分區(qū)具有第一和第二末端，且彼此流通連接，■多個(gè)通氣道，其位于所述多個(gè)分區(qū)的第一末端和第二末端，所述芯片被置于鄰近光學(xué)窗口處。
2.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其還包括蓋，所述蓋至少包括 氣壓通道，所述通道具有入口，且與樣品槽和流體槽中的至少一個(gè)連接，和 過濾器，其被置于氣壓通道入口與樣品槽和流體槽中的至少一個(gè)之間。
3.權(quán)利要求2的集成結(jié)構(gòu)，其還包括 多支管，其無需中介管地將來自源的氣壓連接到所述氣壓通道。
4.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述盒還包括第二流體槽，而所述芯片還包括編碼區(qū)， 其中所述第二流體槽與第一流體輸入通道和第二流體輸入通道下游的細(xì)胞輸入通道流通 連接。
5.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述盒還包括廢物槽，而所述芯片還包括分選區(qū)，其中 所述細(xì)胞輸入通道與廢物槽流通連接。
6.權(quán)利要求3的集成結(jié)構(gòu)，其中所述分選區(qū)包括側(cè)向力開關(guān)。
7.權(quán)利要求6的集成結(jié)構(gòu)，其中所述側(cè)向力開關(guān)使用光學(xué)力、雙向電泳或射流脈沖產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述蛇形通道為2.5 5m長。
9.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述蛇形通道包括50 100個(gè)平行分區(qū)。
10.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述多個(gè)通氣道具有第一封件和第二封件，所述第一 封件配置為在裝載期間密封所述蛇形通道，所述第二封件配置為隔絕通氣道與外部環(huán)境。
11.權(quán)利要求10的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第二封件機(jī)械順應(yīng)熱膨脹和熱收縮。
12.權(quán)利要求10的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第一封件各包括機(jī)械機(jī)制。
13.權(quán)利要求10的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第一封件各包括光敏材料。
14.權(quán)利要求10的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第一封件各包括疏水性材料。
15.權(quán)利要求10的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第二封件各包括配置為隔絕蛇形通道與外部環(huán) 境的薄膜。
16.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中盒還包括具有過濾器的通氣槽，且多個(gè)通氣道與通氣 槽流通連接。
17.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其還包括與蛇形通道操控性連接的熱組件，以調(diào)控蛇形通 道中流體的溫度。
18.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其中所述熱組件包括加熱元件和熱控元件，以重復(fù)循環(huán)蛇 形通道中的流體溫度。
19.權(quán)利要求18的集成結(jié)構(gòu)，其中所述加熱元件包括加熱塊。
20.權(quán)利要求19的集成結(jié)構(gòu)，其中所述加熱元件包括熱空氣。
21.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其還包括多個(gè)芯片，其中所述盒配置為連接多個(gè)槽和多個(gè)芯片。
22.權(quán)利要求21的集成結(jié)構(gòu)，其中所述盒還包括一個(gè)以上的閥，以將多個(gè)槽與多個(gè)芯 片流通連接。
23.權(quán)利要求1的集成結(jié)構(gòu)，其還包括多個(gè)芯片，其中所述盒還包括多個(gè)各配置為與多 個(gè)芯片之一上的細(xì)胞輸入部流通連接的樣品槽。
24.權(quán)利要求23的集成結(jié)構(gòu)，其中所述盒還包括多個(gè)流體槽和多個(gè)試劑槽，所述多個(gè) 流體槽各配置為與多個(gè)芯片之一上的第一流體輸入通道流通連接，所述多個(gè)試劑槽各配置 為與多個(gè)芯片之一上的第二流體輸入通道流通連接。
25.用于微流單細(xì)胞分析和關(guān)聯(lián)的集成結(jié)構(gòu)，其包括 盒，所述盒包括■光學(xué)窗口， ■多個(gè)槽，其至少包括 樣品槽、 流體槽、和 試劑槽，■蓋，所述蓋至少包括 至少一個(gè)氣壓通道，所述通道具有入口，且與樣品槽和流體槽中的至少一個(gè)連接，和 過濾器，其被置于氣壓通道入口與樣品槽和流體槽中的至少一個(gè)之間，和 多支管，其無需中介管地將來自源的氣壓連接到所述氣壓通道， 芯片，所述芯片至少包括■細(xì)胞輸入通道，其適于接收流體培養(yǎng)基中的一種以上的細(xì)胞，且所述細(xì)胞輸入通道 與所述樣品槽流通連接，■第一流體輸入通道，其與所述流體槽和所述細(xì)胞輸入通道流通連接， ■第二流體輸入通道，其與所述試劑槽和所述細(xì)胞輸入通道流通連接， ■輸出通道，其與第一流體輸入通道和第二流體輸入通道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接，所述芯片至少部分被置于鄰近光學(xué)窗口處；和 毛細(xì)管，其與所述輸出通道流通連接。
26.權(quán)利要求25的集成結(jié)構(gòu)，其中所述毛細(xì)管為500 IOOOmm長。
27.權(quán)利要求25的集成結(jié)構(gòu)，其中所述第一流體輸入通道與第二流體輸入通道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接。
28.權(quán)利要求25的集成結(jié)構(gòu)，其中所述盒還包括廢物槽，而所述芯片還包括分選區(qū)，其 中所述細(xì)胞輸入通道與廢物槽流通連接。
29.單細(xì)胞分析和關(guān)聯(lián)用微流芯片，其包括 裝載區(qū)，其包括■細(xì)胞輸入通道，所述細(xì)胞輸入通道配置為與樣品源流通連接， ■第一流體輸入通道，其具有第一和第二末端，所述第一末端配置為與試劑源流通連 接，所述第二末端配置為與細(xì)胞輸入通道流通連接，和■第二流體輸入通道，其具有第一和第二末端，所述第一末端配置為與流體源流通連 接，所述第二末端與第一流體輸入通道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接； 分析區(qū)，其包括■蛇形通道，其包括第一末端和多個(gè)平行分區(qū)，所述第一末端與第一和第二流體輸入 通道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接，所述多個(gè)平行分區(qū)具有第一和第二末端，且彼此流通 連接?！龆鄠€(gè)通氣道，其位于所述多個(gè)分區(qū)的第一和第二末端。
30.權(quán)利要求29的微流芯片，其中所述多個(gè)通氣道還包括第一封件和第二封件，所述 第一封件配置為密封蛇形通道，所述第二封件配置為隔絕通氣道與外部環(huán)境。
31.權(quán)利要求30的微流芯片，其中所述第一封件各包括機(jī)械機(jī)制。
32.權(quán)利要求30的微流芯片，其中所述第一封件各包括光敏材料。
33.權(quán)利要求30的微流芯片，其中所述第一封件各包括疏水性材料。
34.權(quán)利要求30的微流芯片，其中所述第二封件各包括配置為隔絕蛇形通道與外部環(huán) 境的薄膜。
35.權(quán)利要求29的微流芯片，其中所述蛇形通道為2.5 5m長。
36.權(quán)利要求29的微流芯片，其中所述蛇形通道包括50 100個(gè)平行分區(qū)。
37.權(quán)利要求29的微流芯片，其還包括多個(gè)區(qū)，所述區(qū)各包括裝載區(qū)和分析區(qū)。
38.權(quán)利要求37的微流芯片，其還包括4個(gè)區(qū)，其中在各分析區(qū)中的蛇形通道為2.5 5m長，且被劃分成50 100個(gè)平行區(qū)段。
39.逐個(gè)細(xì)胞關(guān)聯(lián)表型和基因型信息的方法，包括 提供第一溶液和第二溶液，所述第一溶液含有多個(gè)細(xì)胞和至少一種用于擴(kuò)增靶DNA 序列的試劑，所述第二溶液不能與第一溶液混合； 逐個(gè)分析第一溶液中各細(xì)胞的表型；眷合并第一溶液和第二溶液，由此形成含多個(gè)納升微容器的流，其中大部分納升微容 器包裹單個(gè)細(xì)胞或不含細(xì)胞； 用參照信號(hào)編碼納升微容器流； 使納升微容器經(jīng)受適合擴(kuò)增靶DNA的熱條件； 測定各微反應(yīng)器中的基因表達(dá)；及 解碼參照信號(hào)，以將各微反應(yīng)器中的基因表達(dá)值與微反應(yīng)器中細(xì)胞的表型相關(guān)聯(lián)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中擴(kuò)增靶DNA包括進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述熱條件包括重復(fù)的熱循環(huán)。
42.權(quán)利要求41的方法，其中擴(kuò)增靶DNA包括進(jìn)行qPCR、實(shí)時(shí)PCR或終點(diǎn)PCR。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述參照信號(hào)含于微反應(yīng)器中。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述參照信號(hào)通過生成納升微容器流中含有的微珠或染 料的偽隨機(jī)模式來創(chuàng)建。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述參照信號(hào)通過生成納升微容器間的偽隨機(jī)間隔模式 來創(chuàng)建。
46.權(quán)利要求39的方法，其中所述參照信號(hào)通過偽隨機(jī)地改變納升微容器的尺寸來創(chuàng)建。
47.權(quán)利要求39的方法，還包括在用參照信號(hào)編碼納升微容器流后使所述納升微容器 流成像，以創(chuàng)建索引。
48.權(quán)利要求39的方法，其中分析表型包括測定熒光信號(hào)。
49.權(quán)利要求39的方法，其中分析表型包括進(jìn)行多個(gè)表型測定。
50.權(quán)利要求39的方法，還包括基于表型測定將細(xì)胞分選為靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞，其中 所述非靶細(xì)胞被分流到廢物槽。
51.權(quán)利要求39的方法，還包括裂解納升微容器中的細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述細(xì)胞裂解通過滲透沖擊、加熱、激光裂解或超聲波進(jìn)行。
53.權(quán)利要求39的方法，其中所述基因表達(dá)通過實(shí)時(shí)PCR或定量PCR測定。
54.權(quán)利要求39的方法，其中測定基因表達(dá)包括測定遺傳物質(zhì)的吸收。
55.權(quán)利要求39的方法，其中測定基因表達(dá)包括測定結(jié)合到DNA產(chǎn)物或DNA擴(kuò)增副產(chǎn) 物的探針或染料的吸收。
56.權(quán)利要求39的方法，還包括基于基因表達(dá)的測定分選納升微容器流。
57.權(quán)利要求39的方法，還包括將所述第一溶液和第二溶液導(dǎo)入微流網(wǎng)絡(luò)。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述微流網(wǎng)絡(luò)包括 裝載區(qū)，其至少包括用于合并所述第一和第二溶液的第一和第二流道，由此形成含 多個(gè)納升微容器的流； 編碼區(qū)；和 分析區(qū)，其包括■蛇形流道，其具有多個(gè)平行分區(qū)，所述多個(gè)平行分區(qū)具有第一和第二末端，且彼此流 通連接，和■多個(gè)通氣道，其位于所述多個(gè)分區(qū)的第一和第二末端；及 解碼區(qū)。
59.權(quán)利要求39的方法，其中將納升微容器流分選到納流微孔的陣列中，由此各孔含 單個(gè)微反應(yīng)器，且其中使納升微容器經(jīng)受重復(fù)溫度循環(huán)的步驟使微孔陣列經(jīng)受重復(fù)溫度循 環(huán)。
60.權(quán)利要求39的方法，其中所述多個(gè)納升微容器包含至少1，000個(gè)納升微容器。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述多個(gè)納升微容器包含至少10，000個(gè)納升微容器。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述多個(gè)納升微容器包含至少100，000個(gè)納升微容器。
63.用于提供對(duì)微流網(wǎng)絡(luò)中個(gè)細(xì)胞的關(guān)聯(lián)表型和基因型分析的集成系統(tǒng)，其包括 樣品源，其包括含有多個(gè)細(xì)胞的水溶液； 包裹源，其包括疏水性流體； 微流網(wǎng)絡(luò)，其包括 ■裝載區(qū)，其包括 樣品流道，其與樣品源流通連接， 側(cè)向流道，其與流體槽和樣品流道流通連接，和 控制器，其配置為引導(dǎo)側(cè)向流道中的流動(dòng)條件，由此，樣品源被劃分入多個(gè)納升微容 器中，和■分析區(qū)，其包括 蛇形通道，其包括第一末端和多個(gè)平行分區(qū)，所述第一末端與試劑輸入通道和側(cè)向 流道下游的細(xì)胞輸入通道流通連接，所述多個(gè)平行分區(qū)具有第一和第二末端，且彼此流通 連接， 多個(gè)通氣道，其位于所述多個(gè)分區(qū)的第一和第二末端； 第一光學(xué)檢測器，其與樣品流道操控性連接，所述檢測器配置為測定來自樣品流道 中納升微容器的信號(hào)； 熱組件，其包括與分析區(qū)操控性連接的加熱元件和熱控元件； 激發(fā)光源，其配置為以特定波長照射蛇形通道； 第二光學(xué)檢測器，其配置為檢測和測定來自蛇形通道中的納升微容器的擴(kuò)增產(chǎn)物；和。 處理器，其連接到所述光學(xué)檢測器，用于記錄和關(guān)聯(lián)由第一和第二光學(xué)檢測器檢測 到的信號(hào)。
64.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其中所述微流網(wǎng)絡(luò)還包括編碼區(qū)，所述編碼區(qū)配置為將 參照信號(hào)應(yīng)用到多個(gè)納升微容器。
65.權(quán)利要求64的集成系統(tǒng)，其還包括解碼傳感器，所述解碼傳感器配置為解碼在納 升微容器上編碼的參照信號(hào)。
66.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其中所述熱控組件配置為以適宜完成PCR的溫度重復(fù)循 環(huán)分析區(qū)的溫度。
67.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其中所述裝載區(qū)還包括分選區(qū)，所述分選區(qū)配置為測定 樣品源中多個(gè)細(xì)胞的物理特征，并基于所述物理特征分選樣品源。
68.權(quán)利要求67的集成系統(tǒng)，其中所述分選區(qū)包括開關(guān)。
69.權(quán)利要求67的集成系統(tǒng)，其中所述分選區(qū)與廢物槽流通連接。
70.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其還包括含有擴(kuò)增靶DNA序列所需的一種以上的試劑的 溶液的試劑源，且其中所述裝載區(qū)還包括與試劑源和樣品流道流通連接的試劑流道，其用 于將試劑源導(dǎo)入到樣品流道。
71.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其中所述分析區(qū)還包括分選開關(guān)，所述分選開關(guān)配置為 基于微反應(yīng)器中擴(kuò)增產(chǎn)物的測定分選納升微容器。
72.權(quán)利要求63的集成系統(tǒng)，其中所述處理器包括糾錯(cuò)算法。
73.逐個(gè)細(xì)胞關(guān)聯(lián)微流環(huán)境中表型和基因型信息的方法，包括 提供樣品溶液和包裹溶液，所述樣品溶液含水環(huán)境中的多個(gè)細(xì)胞，所述包裹溶液不能與所述樣品溶液混合； 將所述樣品溶液和所述包裹溶液導(dǎo)入到微流網(wǎng)絡(luò)中； 逐個(gè)測定所述樣品溶液中各細(xì)胞的表型； 合并所述微流網(wǎng)絡(luò)中的所述樣品溶液和所述包裹溶液，由此將樣品源劃分入多個(gè)納 升微容器中； 用參照信號(hào)編碼納升微容器流； 裝載蛇形通道中的多個(gè)納升微容器，所述蛇形通道含多個(gè)平行分區(qū)和多個(gè)通氣道， 所述多個(gè)平行分區(qū)具有第一和第二末端，且彼此流通連接，所述多個(gè)通氣道位于所述多個(gè) 分區(qū)的第一和第二末端； 使所述蛇形通道經(jīng)受重復(fù)溫度循環(huán)，以在所述多個(gè)納升微容器中擴(kuò)增靶DNA序列； 測定所述多個(gè)納升微容器中的擴(kuò)增產(chǎn)物；及 解碼所述參照信號(hào)，以將來自各微反應(yīng)器的擴(kuò)增產(chǎn)物的測定值與各微反應(yīng)器中細(xì)胞 的表型測定值相關(guān)聯(lián)。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述合并步驟包括 將所述樣品溶液導(dǎo)入到樣品流道中； 將所述包裹溶液導(dǎo)入與所述樣品流道流通連接的側(cè)向流道中，及 弓I導(dǎo)側(cè)向流道中的流動(dòng)條件，由此在所述側(cè)向流道下游的所述樣品流道中的所述樣 品溶液被劃分入多個(gè)納升微容器中。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述微流網(wǎng)絡(luò)還包括廢物槽，所述方法還包括下列步驟 基于表型測定將樣品溶液中的細(xì)胞分選成靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞，及 將所述非靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移到廢物槽。
76.權(quán)利要求73的方法，其中所述溫度循環(huán)包括使蛇形通道經(jīng)受熱氣。
77.權(quán)利要求73的方法，其中所述多個(gè)通氣道包含機(jī)械封件，所述機(jī)械封件配置為在 裝載期間密封所述蛇形通道。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述多個(gè)通氣道配置為當(dāng)使蛇形通道經(jīng)受重復(fù)溫度循 環(huán)時(shí)，將沿蛇形通道中納升微容器流的熱膨脹最小化。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述多個(gè)通氣道包括封件，所述封件配置為在溫度循環(huán) 期間隔絕蛇形通道與外部環(huán)境。
80.權(quán)利要求79的方法，其中擴(kuò)增靶DNA序列包括進(jìn)行定量PCR。
81.權(quán)利要求80的方法，其中擴(kuò)增靶DNA序列包括進(jìn)行多個(gè)定量PCR循環(huán)。
82.權(quán)利要求73的方法，其中超過90%的多個(gè)納升微容器含1或0個(gè)細(xì)胞。
83.權(quán)利要求73的方法，其中超過80%的多個(gè)納升微容器含1或0個(gè)細(xì)胞。
84.權(quán)利要求73的方法，其中超過70%的多個(gè)納升微容器含1或0個(gè)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了對(duì)高通量樣本逐個(gè)細(xì)胞分析和關(guān)聯(lián)表型和基因型信息的方法和裝置。分離細(xì)胞，并逐個(gè)分析了其表型信息和基因型信息，然后將所述表型信息和基因型信息相關(guān)聯(lián)。在微流通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)在連續(xù)流動(dòng)樣品上或在預(yù)裝進(jìn)納孔陣列芯片的樣品上使用對(duì)樣品群的表型-基因型信息進(jìn)行相關(guān)性分析的方法。進(jìn)行表型-基因型分析及其相關(guān)性分析的方法可規(guī)?；挠糜趶臄?shù)百個(gè)細(xì)胞到數(shù)千個(gè)細(xì)胞到數(shù)萬個(gè)和數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞的樣品量。
文檔編號(hào)B01L3/00GK101842159SQ200880107316
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者A·S·卡茲, H·張, K·安, Y·張 申請(qǐng)人:賽路拉公司