專利名稱：：用于抗體清除的血液凈化吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于抗體清除的血液凈化吸附劑，屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：自身抗體和免疫復(fù)合物已被證實與一系列疾病的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，如免疫反應(yīng)(過敏，移植排斥)、自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕等)，甚至于癌癥。因此，臨床上需要一種能夠從人血液中選擇性地清除自身抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物的吸附劑，以緩解急性癥狀，遏制病情發(fā)展進而對疾病起到治療作用。隨著此類疾病尤其是自身免疫性疾病發(fā)病率的逐年提高，這種需求也越來越大?；谏鲜隹紤]，目前已有多家機構(gòu)開發(fā)出不同性質(zhì)的吸附劑材料，其中一些已經(jīng)應(yīng)用到臨床。應(yīng)用于血液凈化的吸附劑一般由兩部分組成:作為吸附劑基質(zhì)的高分子載體材料和利用化學(xué)交聯(lián)固定在載體表面的配基分子，其中配基分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)決定了吸附劑的作用效果。目前，臨床中主要采用的兩種用于抗體吸附的血液凈化吸附劑分別以蛋白A和疏水氨基酸作為配基分子。蛋白A是某些金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的一種蛋白組分，它對人類和其他哺乳動物的多種免疫球蛋白具有可逆的親和作用，特別是對免疫球蛋白G(IgG)的Fc區(qū)具有較強的結(jié)合能力。同時，Phillips等人也發(fā)現(xiàn)蛋白A對循環(huán)免疫復(fù)合物(Circulatingimmunecomplexes)也具有較強的特異性相互作用(T.M.Phillips,AnalyticalTechniquesinImmunochemistry;NewYork:MarcelDekker，Inc.,1992，p.75)。目前，蛋白A作為一種典型的生物親和配基已被用于臨床中上述疾病患者體內(nèi)自身抗體和免疫復(fù)合物的清除。Prosorba禾卩Immunosorba(Fresenius,Germany)是兩種目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白A吸附劑，分別以硅膠和瓊脂糖作為載體基質(zhì)。國內(nèi)也有同類產(chǎn)品(中國專利99112880.X)。對于這一類采用蛋白A作為配基的吸附劑，其優(yōu)點在于利用生物分子間天然的親和作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)分子的特異性識別，從而達到較高的吸附選擇性。但其缺點在于蛋白A作為具有生物活性的蛋白質(zhì)分子，需要從金黃色葡萄球菌或基因工程菌中獲得，其生產(chǎn)成本很高。目前Prosorba吸附柱的市場價約為1000歐元，而一對可切換使用的Immunosorba吸附柱市場價約為10000歐元。同時，蛋白質(zhì)配基在固定化和保存過程中不穩(wěn)定，易失活；雖然能夠再生，重復(fù)使用，但也存在難以在線清洗滅菌的問題和配基分子脫落的隱患。以上這些缺點限制了蛋白A免疫吸附劑在臨床中的使用。NorikoHirata報道了兩種分別采用苯丙氨酸和色氨酸作為吸附基團，固定在載體基質(zhì)上，用作吸附血液中抗體類組分和免疫復(fù)合物的吸附劑材料(NorikoHirata，ToshijiKuriyama，andNaokuniYamawaki，I腿usorbaTRandPH;TherapeuticApheresisandDialysis,2003，7(1):85-90)。中國專利200410021373.3中也涉及一種利用組氨酸作為吸附基團的吸附劑材料。除此以外，亦有采用聚氨基酸作為吸附基團用在此領(lǐng)域的報道(中國專利03130403.6)。在吸附劑的設(shè)計合成屮采用氨基酸，尤其是疏水性氨基酸作為吸附基團，以此替代蛋白A,是新一代血液凈化吸附劑的特征之-一。采用人工合成的小分子化合物基團的好處在于產(chǎn)品價格低廉，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。但是，采用什么樣的化合物分子，以及如何提高小分子吸附基團的作用效果，是這一領(lǐng)域所面臨的新問題。上述固定化小分子的吸附材料普遍存在的缺點在于吸附劑在實際病人血漿中對目標(biāo)分子吸附容量不高。這是由所選用吸附基團的性質(zhì)決定的。在NorikoHirata的報道中(NorikoHirata，ToshijiKuriyama，andNaokuniYamawaki,ImmusorbaTRandPH:TherapeuticApheresisandDialysis,2003，7(1):85-90)可以看到，吸附劑基于免疫球蛋白表面廣泛分布的疏水位點和整體的正電性，在不溶性親水載體上固定化有機小分子，利用其表面分布的負(fù)電基團和疏水基團兩部分共同作用吸附抗體類分子和免疫復(fù)合物。這種吸附劑對人血清白蛋白等主要蛋白沒有明顯的吸附作用，但是問題在于帶電基團弱化了疏水作用強度，使吸附劑與目的蛋白之間的作用力減弱，造成吸附容量不高，約7rng工gG/mL吸附劑，從而單次治療效果不明顯。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題(l)蛋白A吸附劑價格昂貴，不易儲存和消毒，適用范圍有限；(2)以疏水氨基酸作為配基的吸附劑具有對致病因子的選擇性差，治療效果不顯著等缺陷。本發(fā)明提供一種用于抗體清除的血液凈化吸附劑，該血液凈化吸附劑應(yīng)對血漿中的致病因子具有較好的選擇性和較高的吸附容量，并具有化學(xué)和物理性質(zhì)穩(wěn)定，成本相對低廉的優(yōu)點。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種用于抗體清除的血液凈化吸附劑，它由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配基兩部分構(gòu)成，配基的分子結(jié)構(gòu)為其中A，B，C中有一個原子為N，其它為C;n為0-2。所述的固相載體材料選自瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖或聚乙烯醇。所述的固相載體材料選用多孔微球的形式，其膠孔透過分子量為150，0005，000，000。所述的配基選自4-巰基乙基吡啶或3-巰基乙基吡啶。吸附劑的多孔載體基質(zhì)可以是任何合適的材料，包括多糖材料，例如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖等；也可以是親水性的合成高分子材料，例如經(jīng)取代或未經(jīng)取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇等。本發(fā)明吸附劑的載體基質(zhì)應(yīng)該具有良好的親水性，基質(zhì)本身不應(yīng)對蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附，同時，應(yīng)具有良好的血液相容性，不會造成凝血機制激活等不良反應(yīng)。吸附劑的多孔載體基質(zhì)是球形顆粒，它們需要有足夠的通透性和相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其膠孔的透過分子量最好在150,000到5，000，000。因為材料要吸附的目的分子中IgG的分子量為150,000，而免疫復(fù)合物，尤其是IgM免疫復(fù)合物分子量則要大得多。配基分子在固相載體基質(zhì)上的固定化是依靠配基上的巰基基團和固相載體上的可反應(yīng)基團通過化學(xué)反應(yīng)共價連接?？梢耘c上述配基上的巰基發(fā)生反應(yīng)的基團包括環(huán)氧基團、鹵素、烯基、甲苯磺酸、三氟乙基磺酸單甲氧基等。上面所提到的固相載體基質(zhì)若不含有可與巰基反應(yīng)的活性基團，則需要通過采用一些活化試劑使其產(chǎn)生巰基反應(yīng)基團。這類活化試劑往往具有雙功能團，例如環(huán)氧氯丙垸、環(huán)氧溴丙烷、二氯(溴)丙醇、二溴丁垸、二縮水甘油醚、二乙烯基砜、溴丙烯等等。通過調(diào)節(jié)活化試劑的用量可以控制載體基質(zhì)的活化程度，進而得到一系列不同配基密度的吸附劑。配基密度影響著吸附劑的吸附效果，配基偶聯(lián)密度提高，單位體積吸附材料的蛋白結(jié)合容量隨之提高，但密度高到一定程度之后，同時也會帶來更多的非特異性吸附。本發(fā)明的有益效果是這種用于抗體清除的血液凈化吸附劑相對于基于蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗抗體等蛋白質(zhì)類抗體親和作用分子的吸附劑，最突出的優(yōu)點在于它具有較好的穩(wěn)定性，不存在被蛋白水解酶降解的隱患。同時，吸附劑所采用的配基分子都是目前商品化的化合物分子，其生產(chǎn)成本比蛋白質(zhì)要低很多。而且吸附劑能夠耐受強酸、強堿、有機溶劑、加熱等苛刻的處理條件，吸附性能也不會受其影響而發(fā)生改變。相對于其他目前釆用的基于小分子化合物配基的抗體吸附介質(zhì)，吸附劑能表現(xiàn)出更高的抗體吸附選擇性。該血液凈化吸附劑可用作血漿灌流柱的填充材料，用于清除病人血漿中相關(guān)抗體組分，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)的抗核抗體、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的類風(fēng)濕因子、移植排斥反應(yīng)相關(guān)的抗體，或者其他類型的自身抗體和體外循環(huán)免疫復(fù)合物。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1:4-巰基乙基吡啶(4-Mercaptoethylpyridine，4-鹿P)在帶有烯基活性基團的瓊脂糖凝膠(經(jīng)溴丙烯活化)上的偶聯(lián)10gS印haroseCL-6B瓊脂糖凝膠用200mL去離子水分多次洗滌后均勻分散在5mL3MNaOH溶液中，取2mL溴丙烯與凝膠懸液混合，將所得混合物于30'C懸槳攪拌18小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠分別用100mL無水丙酮，100mL去離子水分多次洗滌。得到經(jīng)溴丙烯活化帶有烯基活性基團的瓊脂糖凝膠。稱取1g4-MEP'HC1(鹽酸鹽形式)，溶于1mL去離子水，用10MNaOH調(diào)pH至7，然后加入6mL磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7)和3mL乙腈。將活化后的瓊脂糖凝膠加入混合體系中，于3(TC懸槳攪拌12小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠分別用100mL乙腈，100mL去離子水，100mL0.1M鹽酸分多次洗滌。偶聯(lián)有4-MEP的瓊脂糖凝膠抽干后分散在60mL1M巰基乙醇水溶液中(pHIO)，于3(TC懸槳攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用200mL去離子水分多次洗滌。吸附劑的吸附性能評價實驗采用生理鹽水作為平衡和清洗溶液，5mL新鮮人血清以IOOcm/h流經(jīng)裝填有l(wèi)mL上述吸附劑的玻璃層析柱(直徑為0.66厘米)，經(jīng)生理鹽水沖洗柱床后，用0.2M檸檬酸緩沖液(pH2.3)洗脫吸附蛋白。電泳分析顯示吸附蛋白屮的主要組分是免疫球蛋白，其純度高于85%。差量法分析材料吸附免疫球蛋白的結(jié)合容量，結(jié)果顯示單位體積吸附劑對免疫球蛋白G的吸附量為25.5mg。實施例2:4-MEP在帶有烯基活性基團的瓊脂糖凝膠(經(jīng)二乙烯基砜活化)上的偶聯(lián)取10g伯胺基取代的瓊脂糖凝膠，均勻分散在60mL由0.1M碳酸緩沖液，pH9.5和乙醇(35/65，v/v)組成的混合溶液中，往反應(yīng)體系中加入5mL二乙烯基砜，45'C懸槳攪拌20小時，凝膠懸液經(jīng)乙醇洗滌后分散在30mL由0.05M碳酸緩沖液，pH8.6和乙醇(35/65,v/v)組成的混合溶液中。稱取1g4-MEP'HC1，溶于1mL去離子水，調(diào)pH至8.6后加入反應(yīng)體系中。45'C懸槳攪拌24小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用乙醇充分洗滌，然后分散在60mL1M乙醇胺水溶液(pH10.5)中，于45'C懸槳攪拌2.5小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用200mL去離子水分多次洗滌。吸附劑的評價方式如實施例1。結(jié)果顯示吸附劑對人血清中免疫球蛋白的吸附選擇性與實施例l得到的結(jié)果相當(dāng)，但結(jié)合容量偏低，約為18.5mg/ml。實施例3:3-巰基乙基吡啶(3-Mercaptoethylpyridine,3-MEP)在帶有烯基活性基團的瓊脂糖凝膠(經(jīng)溴丙烯活化)上的偶聯(lián)吸附劑合成方法和評價方式如實施例1，區(qū)別在于反應(yīng)所采用的4-MEP*HC1被替換為3-MEP*HC1。評價結(jié)果顯示此吸附劑從人血清中吸附免疫球蛋白的結(jié)合容量為23.2mg/ml，洗脫液中免疫球蛋白純度大于85%。實施例4:3-巰基甲基吡啶(3-Mercaptomethylpyridine，MMP)在帶有烯基活性基團的瓊脂糖凝膠上的偶聯(lián)吸附劑合成方法和評價方式如實施例1，區(qū)別在于反應(yīng)所采用的4-MEP*HC1被替換為MMP*HC1。評價結(jié)果顯示此吸附劑從人血清中吸附免疫球蛋白的結(jié)合容量為15.2mg/ml，洗脫液中免疫球蛋白純度大于80%。實施例5:2-巰基吡啶(2-Mercaptopyridine,MP)在帶有烯基活性基因的瓊脂糖凝膠上的偶聯(lián)吸附劑合成方法和評價方式如實施例2，區(qū)別在于反應(yīng)所采用的MEP'HC1被替換為MP。評價結(jié)果顯示此吸附劑從人血清中吸附免疫球蛋白的結(jié)合容量為10.6mg/ral，洗脫液中免疫球蛋白純度大于80%。實施例6:4-MEP在環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠上的偶聯(lián)取10g經(jīng)環(huán)氧活化的S印haroseCL-6B瓊脂糖凝膠(環(huán)氧基團密度大于80iiM/mL濕膠)均勻分散于50mL由0.05M碳酸緩沖液，pH8.6和乙醇(35/65，v/v)組成的混合溶液中。稱取1g4-MEP'HC1，溶于1mL去離子水，調(diào)pH至8.6后加入反應(yīng)體系中。45"C懸槳攪拌16小時。反應(yīng)結(jié)束后用乙醇充分洗滌，然后分散在50mL1M乙醇胺水溶液中(pH10.5)，于45。C懸槳攪拌2.5小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用200mL去離子水分多次洗滌。抽干后將凝膠加入到50mL溶有2mL乙酸酐的2M乙酸鈉溶液中繼續(xù)反應(yīng)1小時，然后用200mL去離子水分多次洗滌。吸附劑的評價方式如實施例1。結(jié)果顯示經(jīng)環(huán)氧基團偶聯(lián)4-MEP得到的吸附劑對免疫球蛋白的吸附容量要低于烯基加成法所得到的吸附劑，單位體積吸附量為14mg。但吸附選擇性與實施例1相當(dāng)。實施例7:4-MEP在溴化瓊脂糖凝膠上的偶聯(lián)稱取1g4-MEP*HC1,溶于1mL去離子水，用10MNaOH調(diào)pH至8，然后加入6mL磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8)和3mL丙酮。取10g溴化的S印haroseCL-6B瓊脂糖凝膠(烷基溴基團密度大于80"M/mL濕膠)分散其中。于3(TC懸槳攪拌12小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠分別用100mL丙酮，100mL去離子水，100mL0.1M鹽酸分多次洗潦。偶聯(lián)有4-MEP的瓊脂糖凝膠抽干后分散在60mL1M巰基乙醇水溶液中(pH10)，于3CTC懸槳攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠分別用200mL去離子水分多次洗滌。吸附劑的評價方式如實施例1。結(jié)果顯示通過溴代垸取代反應(yīng)偶聯(lián)上4-MEP基團的吸附劑對血清屮免疫球蛋白的吸附容量為31mg/mL濕膠；純度大于80%。實施例8:4-MEP在溴化纖維素微球上的偶聯(lián)操作過程如實施例7所不，區(qū)別在于用纖維素微球替代瓊脂糖凝膠用作吸附劑的固相載體基質(zhì)。評價結(jié)果表明纖維素基質(zhì)的吸附劑對人血清中免疫球蛋白的吸附容量為26.6mg/mL濕膠；純度大于80%。實施例9:4-MEP在烯基活化的殼聚糖微球上的偶聯(lián)操作過程如實施例1所示，區(qū)別在于用殼聚糖微球替代瓊脂糖凝膠作為吸附劑的固相載體基質(zhì)。評價結(jié)果顯示此吸附劑對人血清中免疫球蛋白的吸附容量為21.6mg/mL濕膠；純度大于80%。實施例10:腿P在環(huán)氧活化的聚乙烯醇微球上的偶聯(lián)取10g經(jīng)環(huán)氧活化的聚乙烯醇微球(環(huán)氧基團密度大于80uM/mL濕膠)均勻分散于50mL由0.05M碳酸緩沖液，pH8.6和乙醇(35/65，v/v)組成的混合溶液中。稱取lg畫P'HCl，溶于lmL去離子水，調(diào)pH至8.6后加入反應(yīng)體系中。45X:懸槳攪拌16小時。反應(yīng)結(jié)束后用乙醇充分洗滌，然后分散在50mL1M乙醇胺水溶液中(pH10.5)，于45。C懸槳攪拌2.5小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用200mL去離子水分多次洗滌。抽干后將凝膠加入到50mL溶有2mL乙酸酐的2M乙酸鈉溶液中繼續(xù)反應(yīng)1小時后用200mL去離子水分多次洗滌。吸附評價方式如實施例1所示。結(jié)果表明此吸附劑對免疫球蛋白的吸附容量為25.5mg/mL濕膠；純度大于75%。實施例ll:MMP在環(huán)氧活化的葡聚糖微球上的偶聯(lián)10g葡聚糖基質(zhì)均勻分散于30mL去離子水中，依次向反應(yīng)體系中加入5mL二縮水甘油醚，10mL1MNaOH溶液，0.lg硼氫化鈉。于30。C懸槳攪拌16小時。反應(yīng)結(jié)束后，凝膠用200mL去離子水分多次洗滌。此環(huán)氧活化的葡聚糖凝膠與MMP的偶聯(lián)反應(yīng)和評價方法如實施例5所示。評價結(jié)果顯示，此吸附劑對免疫球蛋白的吸附容量為17.2mg/mL濕膠；純度大于80%。實施例12:吸附劑對人血清中類風(fēng)濕因于的吸附評價取按照實施例7方法合成的吸附劑用生理鹽水沖洗3遍，稱取O.1g吸附劑加入到盛有0.25mL血清(材料與血清體積比例為l:2)的樣品瓶中，37°C溫育2小時。檢測吸附前后血清樣品中RF濃度。具體結(jié)果如表l所示。評價結(jié)果表明本發(fā)明吸附劑對人血清樣品中不同初始濃度的RF均有顯著的祛除效果。表l血液凈化吸附劑對類風(fēng)濕因子的去除效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>"一"表示檢測結(jié)果為陰性實施例13:吸附劑對人血清中抗核抗體(ANA)的吸附評價評價方法如實施例11所示，區(qū)別在于所釆用的病人血清樣品中含有高濃度的ANA，評價結(jié)果展示在表2中。結(jié)果表明本發(fā)明吸附劑對初始ANA滴度分別為1:3200和1:1000的血清樣品均表現(xiàn)出明顯的ANA祛除效果，對人部分樣品都具有高于60%的祛除率。表2血液凈化吸附劑對抗核抗體的去除效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>一"表示檢測結(jié)果為陰性權(quán)利要求1.一種用于抗體清除的血液凈化吸附劑，其特征在于它由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配基兩部分構(gòu)成，配基的分子結(jié)構(gòu)為id="icf0001"file="S2008100115300C00011.gif"wi="54"he="22"top="45"left="60"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中A，B，C中有一個原子為N，其它為C；n為0-2。2.據(jù)權(quán)利要求l所述的用于抗體清除的血液凈化吸附劑，其特征在于所述的固相載體材料選自瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖或聚乙烯醇。3.據(jù)權(quán)利要求l所述的用于抗體清除的血液凈化吸附劑，其特征在于所述的固相載體材料選用多孔微球的形式，其膠孔透過分子量為150，0005，000，000。4.據(jù)權(quán)利要求l所述的用于抗體清除的血液凈化吸附劑，其特征在于所述的配基選自4-巰基乙基吡啶或3-巰基乙基吡啶。全文摘要一種用于抗體清除的血液凈化吸附劑，屬于生物醫(yī)學(xué)
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。它由固相載體材料和通過化學(xué)偶聯(lián)固定在載體上的配基兩部分構(gòu)成，配基的分子結(jié)構(gòu)如上，其中A，B，C中有一個原子為N，其它為C；n為0-2。該血液凈化吸附劑能夠高載量地吸附血漿中的抗體組分以及類風(fēng)濕因子、抗核抗體等自身抗體，對血清白蛋白等其它血漿組分非特異性吸附有限，而且制備成本低、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。此材料可作為血液凈化裝置的吸附填料用于血漿中自身抗體和免疫復(fù)合物的清除。文檔編號B01J20/22GK101279242SQ200810011530公開日2008年10月8日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者軍任,張丹妮,雪林,健謝,賈凌云,邳志前申請人:大連理工大學(xué)