專利名稱：親和性的明膠-氨基硅烷-陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于蛋白分離的親和膜的制備方法，尤其是具有親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法。
技術(shù)背景傳統(tǒng)柱親和分離使用的顆粒狀吸附劑具有"死端"式孔結(jié)構(gòu)，目標(biāo)蛋白與配基的結(jié)合受 到表面液膜擴(kuò)散、孔擴(kuò)散以及吸附動力學(xué)三方面速度的限制，其中主要傳質(zhì)阻力來自孔擴(kuò)散。 親和膜分離與其相比具有"通孔"或"對流孔"，則只受表面液膜擴(kuò)散及吸附動力學(xué)的影響， 消除了孔擴(kuò)散這一速度控制過程，從而可在較低的操作壓力和較高的流速下對目標(biāo)蛋白進(jìn)行 快速分離和純化，縮短操作時間、提高純化效率，減少分離能耗。親和膜分離技術(shù)要求膜基質(zhì)具有親水性，物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械穩(wěn)定性好，孔徑和孔隙率分布均勻，可利用的化學(xué)基團(tuán)(如-OH基、-NH2基、-COOH基等)多，非特異性吸附低等特點[Ge DT, Shi W， Ren L, et al., Journal of Chromatography A, 2006, 1114: 40-44〗。陽極氧化鋁膜具有孔徑均一、排列有序、分布均勻等特點，常作為模板用于"納米復(fù)制"技術(shù)來制備各種功能材料的納米管、納米線、納米結(jié)構(gòu)陣列體系及量子點陣等。陽極氧化鋁膜具有理想的孔徑和孔隙率分布以及較好的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性，具有作為親和膜基質(zhì)膜的潛力，但由于陽極氧化鋁膜上活性基團(tuán)含量少，很難固載大量的配基，必須對其進(jìn)行化學(xué)改性，使其滿足作為親和分離介質(zhì)的要求，然而目前尚未見有關(guān)陽極氧化鋁膜改性的相關(guān)報導(dǎo)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有較多的活性基團(tuán)(-NH2基、-COOH基)，良好的親水性 和生物相容性，可廣泛應(yīng)用于親和分離，以氨基硅烷偶聯(lián)劑為活化劑的親和性的明膠一氨基 硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法。本發(fā)明的具體步驟如下1) 陽極氧化鋁膜的活化以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸置于10% 20 %氮基硅烷溶液中，于20 7(TC下反應(yīng)0.5 2h ，取出膜清洗、干燥，得帶有環(huán)氧基的陽極氧化鋁膜；2) 明膠一環(huán)氧基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸于含有l(wèi)-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)的明膠HC1水溶液中于20 4(TC下 反應(yīng)12 36h ,取出復(fù)合膜清洗、干燥，即得明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜；或?qū)в邪被年枠O氧化鋁膜浸于濃度為0.5% 4.0%的羰基二咪唑的丙酮溶液中于 20 5(TC下反應(yīng)0.5 2h ，然后再將膜置于濃度為2 8mg/ml的明膠水溶液中于20 40 °C 下反應(yīng)2 8h ，取出復(fù)合膜清洗、干燥，即得明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜。陽極氧化鋁膜的孔徑最好為0.1 0.8 pm，厚度最好為30 200 pm，孔隙率最好為40% 85 o/o。環(huán)氧基硅垸溶液的溶劑為無水乙醇和pH5.0乙酸鈉一冰醋酸緩沖液的混合溶液，無水乙 醇與乙酸鈉一冰醋酸緩沖液的體積比為(10 15) : 1。氨基硅烷可為Y-氨丙基三乙氧基硅垸、Y-氨丙基三甲氧基硅垸、，氨丙基甲基二甲氧基硅 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基硅垸。含有EDOHC1的明膠HC1水溶液中EDOHC1的濃度最好為5 20 mg/ml。明膠HC1水溶 液中明膠的濃度最好為2 8 mg/ml。明膠HC1水溶液的pH最好為3.0 5.0。本發(fā)明將明膠通過共價鍵偶聯(lián)在陽極氧化鋁膜上。選用的活化試劑為氨基硅烷偶聯(lián)劑，氨基硅烷作為連接兩種不同性質(zhì)材料的"分子橋"已經(jīng)在復(fù)合材料、涂料、膠粘劑等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。由于其無毒性、無污染、適用廣泛、成本低、優(yōu)異的粘接性能等優(yōu)點，目前逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為一種活化或交聯(lián)試劑修飾藥物載體或生物材料基質(zhì)。另外，所選用的改性材料明膠是一種熱水可溶的多肽化合物，由動物的皮、骨等結(jié)締組織中的膠原蛋白質(zhì)水解而成，由于它具有來源豐富、親水性佳、生物相容性好和具有大量活性官能團(tuán)(-NH2基、-COOH基)等優(yōu)點，使其作為改性材料能夠彌補(bǔ)單一陽極氧化鋁膜材質(zhì)在應(yīng)用于親和膜時的缺陷。所制備的明膠一氨基硅垸-陽極氧化鋁復(fù)合膜具有活性官能團(tuán)多、生物相容性好、孔徑和孔隙率分布均勻以及傳質(zhì)阻抗小等優(yōu)點，可有效提高親和分離的溶質(zhì)回收率和配基利用率，進(jìn)而提高親和分離效能。可廣泛用于親和純化分離。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實施例11. 陽極氧化鋁膜的活化將8ml，氨丙基三乙氧基硅垸、30ml無水乙醇和3ml乙酸鈉 -冰醋酸緩沖液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.15 ^m、厚度為200 pm、孔隙率為85 %的陽 極氧化鋁膜置于上述混合溶液中在7(TC反應(yīng)0.5h 。膜取出用乙醇清洗后，150。C加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將160mg明膠溶于20mlpH3.0鹽酸溶 液中，加入400 mg EDOHCl，獲得含有EDOHC1的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1制備的帶 氨基的陽極氧化鋁膜置于上述溶液中在2(TC下振蕩反應(yīng)36h ，反應(yīng)結(jié)束后用大量蒸餾水振蕩清洗膜24h ，于40'C烘箱中干燥lh ，即得明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜。 3.明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠量的確定(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取400mg茚三酮、50mgSnCl2溶于10ml二甲亞砜中，加入2ml 2 mol/L的乙酸鈉溶液，配制成茚三酮顯色液。取100 mg明膠溶于5 ml pH3.0檸檬酸水溶液 中，在9CTC水浴條件下水解24h ，冷卻至室溫加入5 ml pHll.O NaOH溶液使體系呈中性。 依次用移液管準(zhǔn)確量取Oml， 0.2ml， 0.4ml， 0.6 ml， 0.8 ml ， 1.0 ml的該溶液置于比色管中， 分別加入1 ml茚三酮顯色液，用蒸餾水補(bǔ)加至10ml，充分搖勻，在9(TC水浴加熱15min后， 冷卻至室溫，于570nm下比色。所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) 樣品含量的測定取制備所得的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜，用分析天平 精密稱重后剪碎置于含2mlpH3.0檸檬酸水溶液的比色管中，在9(TC水浴條件下水解24h ， 冷卻至室溫加入2mlpH11.0NaOH溶液使體系呈中性。放置5-10min后，加入1 ml茚三酮顯 色液，在9(TC水浴加熱15min后，冷卻至室溫，于570 nm下比色。測得所制備的明膠一氨 基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠的量為70±4 (mg明膠)/(g膜)。實施例21. 陽極氧化鋁膜的活化將3.5mlr氨丙基三甲氧基硅烷、30ml無水乙醇和2ml乙酸 鈉-冰醋酸緩沖液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.7nm、厚度為80pm、孔隙率為55 %的陽 極氧化鋁膜置于上述混合溶液中，在6(TC反應(yīng)lh 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠—氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將40 mg明膠溶于20 ml pH5.0鹽酸溶 液中，加入100 mg EDOHC1,獲得含有EDOHC1的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1制備的帶 氨基的陽極氧化鋁膜置于上述溶液中在35'C下振蕩反應(yīng)30h ，反應(yīng)結(jié)束后用大量蒸餾水振蕩 清洗膜24h ，于40。C烘箱中真空千燥lh ,即得明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜。3. 明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯(lián)明膠的量為53±6(mg明膠)/(g膜)。實施例31. 陽極氧化鋁膜的活化將5ml，氨丙基甲基二甲氧基硅垸、28ml無水乙醇和2ml乙 酸鈉-冰醋酸緩沖液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.4pm、厚度為30)tmi、孔隙率為65 %的 陽極氧化鋁膜置于上述混合溶液中在20。C反應(yīng)2h 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠—氨基硅烷一 陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將200 mg明膠溶于20 ml pH 4.0鹽酸溶液中，JnA0.25gEDOHCl，獲得含有EDOHCl的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1制備的帶氨 基的陽極氧化鋁膜置于上述溶液中在2(TC下振蕩反應(yīng)24h ，反應(yīng)結(jié)束后用大量蒸餾水振蕩清 洗膜24h ，于4(TC烘箱中干燥lh ，即得明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜。3.明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯(lián)明膠的量為65±8 (mg明膠)/(g膜)。實施例41. 陽極氧化鋁膜的活化將5.5ml 氨丙基甲基二乙氧基硅垸、30ml無水乙醇和2ml 乙酸鈉-冰醋酸緩沖液(pH5.0)混合，取一片孔徑為O.l pm、厚度為120 pm、孔隙率為40 % 的陽極氧化鋁膜置于上述混合溶液中在40。C反應(yīng)1.2 h 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加熱 lh ，即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基硅烷—陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將130 mg明膠溶于20 ml pH 3.5鹽酸溶 液中，加入0.35gEDOHCl，獲得含有EDOHCl的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1制備的帶氨 基的陽極氧化鋁膜置于上述溶液中在4(TC下振蕩反應(yīng)12h ，反應(yīng)結(jié)束后用大量蒸餾水振蕩清 洗膜24h ，于40'C烘箱中干燥lh ，即得明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜。3. 明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯(lián)明膠的量為67±5 (mg明膠)/(g膜)。實施例51. 陽極氧化鋁膜的活化取一片孔徑為0.4 pm、厚度為30^m、孔隙率為80 %的陽極 氧化鋁膜按照實施例1步驟1的方法進(jìn)行活化，即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將步驟1制備的帶有氨基的陽極氧化鋁 膜浸于1.5%的羰基二咪唑的丙酮溶液中，于20 。C下，振蕩反應(yīng)lh ，用丙酮清洗3次，并 置于4(TC烘箱中真空干燥30min。將羰基二咪唑活化后的膜置于2 mg/ml的明膠水溶液中。 于室溫下，振蕩反應(yīng)5h 。取出該膜置于40'C烘箱中真空干燥2h ，即得明膠一氨基硅烷一 陽極氧化鋁復(fù)合膜。3. 明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜上偶聯(lián)明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯(lián)明膠的量為65±8 (mg明膠)/(g膜)。
權(quán)利要求
1.親和性的明膠-氨基硅烷-陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特征在于其具體步驟如下1)陽極氧化鋁膜的活化以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸置于10％～20％氨基硅烷溶液中，于20～70℃下反應(yīng)0.5～2h，取出膜清洗、干燥，得帶有環(huán)氧基的陽極氧化鋁膜；2)明膠-環(huán)氧基硅烷-陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的明膠HCl水溶液中于20～40℃下反應(yīng)12～36h，取出復(fù)合膜清洗、干燥，即得明膠-氨基硅烷-陽極氧化鋁復(fù)合膜；或?qū)в邪被年枠O氧化鋁膜浸于濃度為0.5％～4.0％的羰基二咪唑的丙酮溶液中于20～50℃下反應(yīng)0.5～2h，然后再將膜置于濃度為2～8mg/ml的明膠水溶液中于20～40℃下反應(yīng)2～8h，取出復(fù)合膜清洗、干燥，即得明膠-氨基硅烷-陽極氧化鋁復(fù)合膜。
2. 如權(quán)利要求l所述的親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于陽極氧化鋁膜的孔徑為0.1 0.8 pm。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法， 其特征在于陽極氧化鋁膜的厚度為30 200 )Lim。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的親和性的明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法， 其特征在于陽極氧化鋁膜的孔隙率為40% 85 %。
5. 如權(quán)利要求l所述的親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于環(huán)氧基硅烷溶液的溶劑為無水乙醇和pH5.0乙酸鈉一冰醋酸緩沖液的混合溶液，無水 乙醇與乙酸鈉一冰醋酸緩沖液的體積比為10 15 : 1。
6. 如權(quán)利要求l所述的親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于氨基硅烷為Y-氨丙基三乙氧基硅烷、Y-氨丙基三甲氧基硅烷、Y-氨丙基甲基二甲氧基硅 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基硅垸。
7. 如權(quán)利要求1所述的親和性的明膠一氨基硅烷一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于含有EDC'HC1的明膠HC1水溶液中EDOHC1的濃度為5 20 mg/ml。
8. 如權(quán)利要求l所述的親和性的明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于明膠HC1水溶液中明膠的濃度為2 8mg/ml。
9. 如權(quán)利要求1所述的親和性的明膠一氨基硅垸一陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，其特 征在于明膠HC1水溶液的pH為3.0 5.0。
全文摘要
親和性的明膠—氨基硅烷—陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法，涉及一種用于蛋白分離的親和膜的制備方法。提供具有較多活性基團(tuán)(-NH₂基、-COOH基)，良好親水性和生物相容性，可應(yīng)用于親和分離，以氨基硅烷偶聯(lián)劑為活化劑的親和性的明膠—氨基硅烷—陽極氧化鋁復(fù)合膜的制備方法。以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸于氨基硅烷溶液中反應(yīng)，取出膜清洗干燥得帶有環(huán)氧基的陽極氧化鋁膜，再浸于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的明膠HCl水溶液中反應(yīng)，取出復(fù)合膜清洗干燥即得；或?qū)в邪被年枠O氧化鋁膜浸于羰基二咪唑的丙酮溶液中反應(yīng)，將膜置于明膠水溶液中反應(yīng)，取出復(fù)合膜清洗干燥即得。
文檔編號B01D69/00GK101254416SQ20071000996
公開日2008年9月3日 申請日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者張其清, 沈雨青, 巍 石, 葛東濤 申請人:廈門大學(xué)