專利名稱：用于純化含咕啉分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種親和性吸附劑材料(affinity adsorbent materials)，其包含能與含咕啉化合物例如鈷胺素(CbI，或維生素B12)結(jié)合的高度-特異性官能團(tuán)。本發(fā)明還涉及制備這種吸附劑材料的方法，以及在純化含咕啉分子如鈷胺素中的用途。還提供了通過(guò)該方法純化的包含鈷胺素的組合物。
背景技術(shù)：
維生素B12(或鈷胺素，CbI)是哺乳動(dòng)物的兩個(gè)重要過(guò)程中涉及的生物學(xué)輔助因子將高半胱氨酸修復(fù)為蛋氨酸以及將丙酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸鹽(1)。所有的哺乳動(dòng)物均依賴于外源的B12，這是由于其僅僅由微生物進(jìn)行合成(2)。食草動(dòng)物從各種寄居在其腸系統(tǒng)的大量細(xì)菌中獲得CbI。其它動(dòng)物，包括人類，從動(dòng)物源如肉、奶和蛋中獲得維生素(3，4)。缺乏B12將導(dǎo)致嚴(yán)重的病癥，包括神經(jīng)學(xué)上的異常以及貧血(4，5)。CbI是輔助因子中最復(fù)雜的分子(圖1)，并且包括三個(gè)部分1)具有中心鈷原子的類咕啉環(huán)，2)在較低的軸位置([α]-位)通過(guò)其堿基與鈷配位的核苷酸環(huán)，3)在較高的軸位置([β]-位)與鈷配位的[β]基團(tuán)。
產(chǎn)生B12微生物同時(shí)合成鈷胺素及其類似物，該類似物在其結(jié)構(gòu)上與B12不同并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不具有催化功能(2，6)。最典型的類似物是具有錯(cuò)誤核苷酸堿基的類咕啉(例如假B12，A因子)或者缺失了部分分子(例如鈷啉醇酰胺)。鈷胺素合成的各種中間產(chǎn)物屬于后者。所有的鈷胺素和大部分類似物是具有特征吸收光譜的有色物質(zhì)，這簡(jiǎn)化了其濃度的測(cè)定并使不同的咕啉環(huán)(6)彼此區(qū)分。
具有正確骨架的生物活性的CbI可以包含不同的在[β]-位(圖1)上與鈷原子配位的上部軸基團(tuán)。最常見(jiàn)的[β]-基團(tuán)是甲基、脫氧腺苷、氰化物、水以及一些其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物(6)。具有正確骨架的CbI的所有形式(不論其[β]-基團(tuán)的性質(zhì))可以被細(xì)胞中的酶轉(zhuǎn)化為具催化活性的輔助因子甲基-或脫氧腺苷-鈷胺素(CbI-Met，CbI-Ado)(3)。在這一轉(zhuǎn)化中CbI的中間體形式為含水-CbI(aquo-CbI)(CbI-OH2，維生素B12a)。因此，CbI-OH2、CbI-Ado和CbI-Met是來(lái)自任何天然來(lái)源的普遍存在的鈷胺素(3，4，7)。CbI的氰基形式(CbI-CN)是工業(yè)純的典型產(chǎn)品，并也被稱為維生素B12。
CbI的制備是已有良好建立的方法，其包含一系列使得活性物質(zhì)從細(xì)菌混懸液中分離的步驟(8，9)。雖然該精確的細(xì)節(jié)并不為公眾所獲得，但是其主要的步驟可被假定為1)發(fā)酵；2)添加氰化物的細(xì)胞的熱解作用；3)在基質(zhì)如木炭上的小有機(jī)分子(包括CbI)的非特異性吸附；4)在其它樹(shù)脂如疏水性吸附劑XAD上的洗脫和吸附；5)用苯酚從水相中洗脫和萃取CbI；6)用水-丙酮混合物從苯酚中萃取CbI；7)干燥；8)溶解在熱水中并在室溫從丙酮-水溶液中結(jié)晶；9)最后的干燥。純化的產(chǎn)品為CbI-CN(維生素B12)，但是CbI-OH2(維生素B12a)的制備需要其它的化學(xué)處理和再純化。
上述過(guò)程采用了一系列用來(lái)分離的非特異性步驟。相反，也當(dāng)然可以利用CbI的特有特征，即，在[β]-位與某些化合物配位的能力。例如，具有偶合的[β]-特異性基團(tuán)的基質(zhì)可以被用來(lái)從溶液中萃取CbI。這意味著技術(shù)人員可以僅在一個(gè)步驟中從粗萃取物中純化維生素。成功實(shí)施這一方法是值得期待的，這是由于在來(lái)源介質(zhì)中的CbI具有弱結(jié)合的軸上部的配基，該配基可以被與吸附劑結(jié)合的基團(tuán)所代替。
如上所述，生物源可獲得的CbI的主要形式為CbI-Met、CbI-Ado和CbI-OH2。但是，CbI-Met和CbI-Ado的碳-鈷鍵即使在散射光線照明中對(duì)光也是敏感性的(6)。其結(jié)果是，如果沒(méi)有采取特別的預(yù)防處理，這兩種形式在水溶液中均會(huì)發(fā)生向CbI-OH2的自發(fā)性轉(zhuǎn)變。得到的CbI-OH2在其[β]-位具有弱連接的分子(H2O)，該分子可容易地被一系列的化學(xué)劑所置換(6，10)。一些已知化合物可以以不同的親和性與CbI-OH2結(jié)合，這導(dǎo)致了CbI吸收光譜的特征性改變。這簡(jiǎn)化了對(duì)制備的復(fù)合物的解離常數(shù)的測(cè)定(6，10)CN-(Kd＜10-12M)，SO3-2＞(Kd＝10-7M)，半胱氨酸的SH-基(Kd＝10-6M)，NO2-(Kd＝10-5M)，N3-(Kd＝10-5M)，咪唑和組氨酸(Kd＝10-4M)，不同的氨基(Kd＝10-3M)，和醋酸鹽(Kd＝1M)。但是，這些簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)離子在與基質(zhì)偶合后容易失去CbI-結(jié)合的性質(zhì)。另外，它們中的一些(如含SH化學(xué)劑)會(huì)導(dǎo)致CbI的開(kāi)始減少和破壞(6)。
早期已經(jīng)將氨基-瓊脂糖樹(shù)脂用于與有低親和性的CbI-OH2結(jié)合(Nexo1975，Biochim Biophys Acta 379189-192)。但是該結(jié)合僅僅在CbI高濃度時(shí)才發(fā)生并且非常緩慢(16-20小時(shí))。這一方法因而不能被用于從維生素濃度較低的生物源中純化維生素。
因此，存在著對(duì)簡(jiǎn)單并且迅速地從生物和其它來(lái)源中分離CbI和其它含咕啉化合物的方法的需要。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供一種適于純化含咕啉化合物的吸附劑材料，其中所述吸附劑材料·包含四唑作為官能團(tuán)，和/或·由包含下述步驟的方法得到i)提供包含氰化物的活化基質(zhì)，和ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)，和/或·具有[β]-特異性官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)在pH3～7.5、5℃～60℃下與CbI-OH2結(jié)合，其Kd小于100μM，并且其中所述吸附劑材料不引起所述含咕啉化合物的減少和破壞。
首次，將吸附劑材料發(fā)展為能夠以高親和性在[β]-位與含咕啉化合物結(jié)合，而不引起所述含咕啉化合物的減少或破壞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備適于純化含咕啉化合物的吸附劑材料的方法，該方法包含下述步驟i)提供包含氰化物的活化基質(zhì)，以及ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)。
不被一種特定理論所束縛，化學(xué)引發(fā)的方法以及功能基團(tuán)的特征指出四唑殘基為吸附劑材料中的官能團(tuán)，即活性物質(zhì)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于制備吸附劑材料的方法，其包括使四唑基團(tuán)與基質(zhì)相連，或在基質(zhì)上引發(fā)四唑基團(tuán)的形成。
本發(fā)明還提供了一種用于從溶液中純化含咕啉化合物的方法，所述方法包含將所述溶液暴露于本發(fā)明的吸附劑材料。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于從溶液中純化含咕啉化合物的方法，其包含下述步驟i)提供包含含咕啉化合物的溶液，ii)提供本文定義的本發(fā)明的吸附劑材料，iii)將所述溶液暴露于所述吸附劑材料中，iv)從沒(méi)有被吸附到吸附劑材料上的溶液的成分中分離與所述吸附劑材料結(jié)合的含咕啉化合物的復(fù)合物，v)任選地進(jìn)行洗滌，以及vi)從所述吸附劑材料中洗脫所述含咕啉化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法純化的鈷胺素和組合物，如藥物組合物或食品組合物，其包含所述純化的鈷胺素。


圖1.鈷胺素的結(jié)構(gòu)。鈷胺素(CbI，維生素B12)分子包括三個(gè)部分1)具有中心鈷原子的類咕啉環(huán)，其根據(jù)配位的狀態(tài)而在其原子價(jià)方面不同；2)在較低的軸位(α)與堿基配位的核苷酸；3)在上部的軸位(β)與鈷配位的基團(tuán)。不同的基團(tuán)可以以不同的親和性在CbI的β-位結(jié)合。
圖2.四唑的形成以及其性質(zhì)。上圖為CNBr-活化的瓊脂糖和疊氮化合物之間的反應(yīng)。建議的方案包含兩個(gè)步驟，其中在疊氮化合物向氰化物的最初的連接后，隨著四唑的出現(xiàn)進(jìn)行環(huán)的轉(zhuǎn)化。在文獻(xiàn)11中給出了該反應(yīng)。下圖四唑及其基團(tuán)在中性pH中是帶負(fù)電的，并且在pKa4-5和pKb(-3)-(-2)具有連結(jié)兩個(gè)質(zhì)子的能力。
圖3.CbI-OH2和氨基-四唑之間的反應(yīng)。A)在沒(méi)有四唑(實(shí)線)以及有2mM氨基-四唑(點(diǎn)劃線)的存在下，于0.2M磷酸鹽緩沖液、pH7.5、37℃時(shí)50μM CbI-OH2的光譜。B)在如A所述的條件下，在與不同濃度的氨基-四唑(25-250μM)混合后，CbI-OH2的吸光度的變化。推定的曲線顯示出符合雙分子反應(yīng)CbI+ATZCbI-ATZ，其中k+＝306±20M-1s-1以及k_＝(1.2±0.3)·10-3s-1。
圖4.A)隨時(shí)間變化的CbI-OH2在親和吸附劑材料的吸附。將CbI-OH2溶液與不同體積的CbI-特異性吸附劑材料混合。終濃度為50μM CbI、25-250μM的與基質(zhì)偶合的官能團(tuán)。該反應(yīng)在pH7.5，37℃以及對(duì)混合物適度攪拌的條件下進(jìn)行。在某個(gè)間隔，取0.5ml樣品并迅速過(guò)濾。測(cè)量在溶液中CbI-OH2的量。推定的曲線顯示符合雙分子反應(yīng)CbI+吸附劑材料CbI-吸附劑材料，其中k+＝55±6M-1s-1以及k_＝(4.1±0.3)·10-3s-1。B)使20μMCbI-OH2與不同濃度吸附劑材料進(jìn)行結(jié)合的平衡。培育的時(shí)間為5小時(shí)和22小時(shí)(pH6.0，20℃)。曲線的擬合給出了下述的平衡解離常數(shù)Kd＝2.8μM(5小時(shí))，和Kd＝1.1μM(22小時(shí))。
圖5.CbI吸附作用的pH最適條件。將在具體吸附劑材料上CbI-OH2的吸附初速度描繪為pH的函數(shù)(20℃)。終濃度為50μM CbI和400μM結(jié)合基團(tuán)。pH最適條件在pH3-7的區(qū)域。具有pK12.0和pK27.8的兩個(gè)基團(tuán)的質(zhì)子化-去質(zhì)子化將影響結(jié)合。不受具體理論的限制，將相互作用分子所已知的pK值進(jìn)行比較，可以建議如下所述的用于有效結(jié)合的條件1)吸附劑的四唑基團(tuán)需要去質(zhì)子化(pH＞2)，2)CbI需要為含水形式(aquo-form)(CbI-OH2，pH＜7.5)而不是羥基形式(hydroxo-form)(CbI-OH，pH＞7.5).
圖6.使CbI-OH2+CbI-Ado的混合物與吸附劑結(jié)合。CbI的結(jié)合是在pH7.5，20℃以及不同的光照條件下進(jìn)行，其中所述CbI是天然來(lái)源中的典型。50μM CbI的混合物，其包含20％的CbI-OH2(弱[β]-基)、70％的CbI-Ado(強(qiáng)[β]-基，對(duì)光敏感)以及≈10％的CbI-CN(強(qiáng)[β]-基，對(duì)適度的光照有抗性)。吸附的條件為1)在黑暗中、2)在散射光下、3)在用散射光的初步光照30分鐘后。在t→∞的剩余的吸光度對(duì)應(yīng)于4μM的CbI-CN，其作為污染物而存在于CbI-Ado的制劑中。
圖7.CbI從具體吸附劑材料的解吸作用。CbI從吸附劑(0.1ml)中的洗脫是于20℃、用1ml的下述溶液進(jìn)行1)10mM KCN，pH5.5(空心圓)；2)10mM KCN，pH7.5(三角形)，pH9.5(方形)，pH12(菱形)；3)1M HCl(實(shí)心圓)。
圖8.洗脫的CbI的光譜。在用KCN(產(chǎn)物為CbI-CN(圖8A))或1MHCl(產(chǎn)物為CbI-OH2(圖8B))洗脫CbI之后，測(cè)定得到的制備物的光譜并且與標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)線)進(jìn)行比較。短劃線對(duì)應(yīng)于洗脫后馬上得到的制備物(pH7.5)。短劃點(diǎn)線顯示了CbI最終制備物的光譜(脫鹽的、凍干的和再溶解的)。
圖9.CbI樣品的薄層色譜。A)吸附和洗脫后的樣品1-標(biāo)準(zhǔn)的CbI-CN；2-于37℃用1M HCl水解3h后的CbI-CN；3-從親和性材料中用10mMKCN洗脫的CbI-CN，脫鹽的和凍干的；4-由CbI-OH2制備的CbI-CN，其用HCl進(jìn)行洗脫，脫鹽的和凍干的；5-CbI-CN的羧基類似物。B)CbI的標(biāo)準(zhǔn)純化1-標(biāo)準(zhǔn)的CbI-CN；2-純化的CbI-CN(從血漿中吸附的CbI-OH2，用HCl進(jìn)行洗脫，轉(zhuǎn)化為CbI-CN，脫鹽的和凍干的)；3-CbI-CN的羧基類似物。
圖10.四唑、氨基-四唑的衍生物通過(guò)其胺與下述三種不同材料共軛環(huán)氧瓊脂糖6B、CM瓊脂糖以及羧基-安伯萊特(Amberlite)IRC76。
發(fā)明詳述定義這里使用的術(shù)語(yǔ)“官能團(tuán)”是指按照與被分離的分子(這里為含咕啉分子)相互作用的化學(xué)基團(tuán)，該分離分子的分離方式是在用于分離的條件下使被分離的分子仍附著在吸附劑材料?！肮倌軋F(tuán)”不應(yīng)該被解釋為所述基團(tuán)是附著在基質(zhì)上的唯一化學(xué)基團(tuán)、或被解釋為以某一具體方式附著在基質(zhì)上的。例如，圖2顯示了具有四唑作為官能團(tuán)的吸附劑材料的一個(gè)例子，但是可以采用其它的相似材料，在所述材料中，例如四唑通過(guò)不同于圖2中所顯示的化學(xué)部分而與基質(zhì)連接，參見(jiàn)圖10。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”是指適于連接(共軛)或引發(fā)官能團(tuán)的材料，優(yōu)選聚合性材料。該基質(zhì)可以例如為樹(shù)脂、小丸、固體載體或其它固體表面(solid surface)的形式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中基質(zhì)是瓊脂糖基樹(shù)脂。優(yōu)選的具體基質(zhì)為CNBr-活化的瓊脂糖(TM)、環(huán)氧瓊脂糖6B、CM瓊脂糖以及羥基-安伯萊特IRC76。
本發(fā)明的吸附劑材料和制備方法在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種適于純化含咕啉化合物的吸附劑材料，其中所述吸附劑材料·包含四唑作為官能團(tuán)，和/或·由包含下述步驟的方法得到
i)提供一種包含氰化物的活化基質(zhì)，和ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)，和/或·具有[β]-特異性官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)在pH3～7.5、5℃～60℃下與CbI-OH2結(jié)合，其Kd小于100μM，并且其中所述吸附劑材料不引起所述含咕啉化合物的減少和破壞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述含咕啉化合物是含咕啉化合物的含水形式或者與含水形式的含咕啉化合物平衡的形式。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的含咕啉化合物為鈷胺素或其類似物，優(yōu)選含水-鈷胺素。
吸附劑材料以高親和性與含咕啉化合物結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述吸附劑材料在pH3～7.5、5℃～60℃下與CbI-OH2結(jié)合，其Kd為0.01～100μM，例如Kd為0.1～50μM，例如Kd為0.5～20μM，例如Kd為1～7μM。Kd優(yōu)選按照在實(shí)施例1中所描述的進(jìn)行檢測(cè)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)通過(guò)重力填充到柱中時(shí)，吸附劑材料具有最大的飽和劑量，即在每升的吸附劑材料中有0.1～500mmol、例如0.5～100mmol、例如1～50mmol、例如4～8mmol的含咕啉化合物。
在又一實(shí)施方案中，吸附劑材料不與CbI-CN或CbI-Ado結(jié)合。
可以使用本領(lǐng)域中已知的許多活化基質(zhì)作為活化基質(zhì)。優(yōu)選的活化基質(zhì)是CNBr-活化的瓊脂糖或CNBR-活化的凝膠瓊脂糖。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于制備包含至少一種官能團(tuán)的吸附劑材料的方法，該吸附劑材料適于純化含咕啉化合物，所述方法包含下述步驟i)提供一種包含氰化物的活化基質(zhì)，和ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于制備吸附劑材料的方法，其包含使四唑基團(tuán)與基質(zhì)連接或者在基質(zhì)上引發(fā)四唑基團(tuán)的形成。該四唑基團(tuán)可以與基質(zhì)按照任何合適的方式連接，例如通過(guò)描述于實(shí)施例4和圖10中的在四唑的碳原子上的任何適合的取代基團(tuán)。
純化含咕啉化合物的方法本發(fā)明定義的吸附劑材料可用于從各種來(lái)源包括生物源中純化含咕啉化合物。
因此，在另一個(gè)主要的方面，本發(fā)明涉及用于從溶液中純化含咕啉化合物的方法，其包含下述步驟i)提供包含含咕啉化合物的溶液，ii)提供這里定義的吸附劑材料，iii)將所述溶液暴露于所述吸附劑材料，iv)從沒(méi)有被吸附到吸附劑材料上的溶液的成分中分離與所述吸附劑材料結(jié)合的含咕啉化合物的復(fù)合物，v)任選地進(jìn)行洗滌步驟，以及vi)從所述吸附劑材料中洗脫所述含咕啉化合物。
含咕啉化合物在本領(lǐng)域中是熟知的，其包括例如類咕啉、CbI合成的中間物、鈷啉醇酰胺、假B12、A因子等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述含咕啉化合物是含咕啉化合物的含水形式或者與含水形式的含咕啉化合物平衡的形式。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的含咕啉化合物為鈷胺素或其類似物，優(yōu)選含水-鈷胺素。
在上述純化方法的一些實(shí)施方案中，所述溶液在步驟iii)之前和/或之中被暴露于光下。這可以例如將不與吸收劑材料結(jié)合的CbI形式轉(zhuǎn)化為與所述材料結(jié)合的形式，例如CbI-OH2。
而且，在一些實(shí)施方案中，純化的方法包含在步驟iii)之前的溶液預(yù)處理，以從與其它分子例如蛋白質(zhì)的復(fù)合物中釋放含咕啉化合物。這種預(yù)處理優(yōu)選通過(guò)優(yōu)選在低的pH如pH3加熱所述溶液而進(jìn)行。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化方法的步驟iii)中的暴露是在pH3～7之間進(jìn)行。
純化方法可以由使含咕啉溶液通過(guò)裝載了本發(fā)明吸附劑材料的柱而進(jìn)行。因此，在上述方法的一些實(shí)施方案中，步驟iii)和iv)包含使所述溶液通過(guò)包含所述吸附劑材料的柱。
對(duì)于吸附的含咕啉分子的洗脫可以按照許多方式進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，洗脫步驟vi)包含使用氰化物(CN-)。優(yōu)選在pH7-12進(jìn)行，優(yōu)選在下述步驟之后進(jìn)行，所述步驟通過(guò)例如酸化而將二氰基形式轉(zhuǎn)化為單氰基形式。
在其它的實(shí)施方案中，在步驟vi)的洗脫中包含使用酸例如HCl，優(yōu)選接著中和步驟和另一通過(guò)添加氰化物轉(zhuǎn)化為氰基形式的步驟。
純化方法優(yōu)選包括從含于樣品中的鹽中純化所述含咕啉化合物的另一個(gè)步驟。這可以按照包括透析和/或使用活性炭的吸附的許多方式進(jìn)行。
當(dāng)使用活性炭時(shí)，所述純化優(yōu)選通過(guò)將所述含咕啉化合物吸附在活性炭上后、從不被活性炭吸附的溶液成分中分離與活性炭結(jié)合的含咕啉化合物、以及從活性碳上洗脫吸附的含咕啉化合物。
鈷胺素和本發(fā)明的組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的純化方法得到的鈷胺素。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含由本發(fā)明的純化方法得到的或可得到的鈷胺素。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含由本發(fā)明的純化方法得到的或可得到的鈷胺素和可藥用的稀釋劑、載體或賦形劑。
本發(fā)明的組合物可適用于以任何適合途徑如經(jīng)口(包括口含或舌下)、局部(包含口含、舌下或透皮)或胃腸外(包含皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi))的途徑給藥。這樣的制劑可以按照藥物領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行制備，例如通過(guò)將活性成分與載體或賦形劑進(jìn)行混合。
適用于口服的藥物制劑可以是分散單元的形式，例如膠囊或片劑、粉末或顆粒、在水性或非水性液體中的溶液或混懸液、可食用的泡沫體或咀嚼片(whips)、或者水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。
適用于局部給藥的藥物制劑可以制備為軟膏、霜?jiǎng)?、混懸劑、洗劑、粉末、溶液、膏劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油劑。適用于在口腔內(nèi)局部給藥的藥物制劑包括糖錠(lozenges)、錠劑(pastilles)以及口腔洗劑。
適用于胃腸外給藥的藥物制劑包含水性的或非水性的無(wú)菌注射溶液，其可以包含抗氧劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì)；水性的或非水性的無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以是單元?jiǎng)┝康男问交蚨鄤┝咳萜鞯男问嚼缑芊獾陌碴郴蛐∑?，也可以在凍干的條件下儲(chǔ)存，其只需在使用前添加無(wú)菌液體載體如注射用水即可。臨時(shí)的注射溶液和懸浮液可以由無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。
優(yōu)選的單元?jiǎng)┝恐苿┌钚猿煞值娜談┝炕騺唲┝?、或其合適的部分。
應(yīng)當(dāng)理解的是，除了上面提及的具體成分之外，制劑還可以包含用于所涉及的制劑類型的其它本領(lǐng)域的常規(guī)添加劑，例如適用于口服的可以包含矯味劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了食品補(bǔ)充劑，其包含由本發(fā)明的方法純化的鈷胺素。
實(shí)施例實(shí)施例11.1吸收劑材料的制備將CNBr-活化的瓊脂糖4B(Pharmacia)裝載到柱中，用1mM HCl廣泛地洗滌，之后與0.02M NaN3在0.1M NaH2PO4緩沖液(Pi-緩沖液)在pH7.5、室溫中反應(yīng)。在1小時(shí)之內(nèi)，使兩個(gè)柱床體積的介質(zhì)泵經(jīng)柱。
當(dāng)1體積的用酸洗滌的基質(zhì)與2～3體積的0.02M NaN3在0.2M Pi-緩沖液、pH7.5中的溶液在定期攪拌下培養(yǎng)1小時(shí)，瓊脂糖與疊氮化合物之間的反應(yīng)也可以分批進(jìn)行。在偶合步驟后，吸收劑物質(zhì)用0.1M Pi-緩沖液，pH6.0-7.0洗滌，之后用水洗滌。制備的材料按照懸浮的吸收劑材料∶水(1∶1)的比例在室溫中保存。
1.2反應(yīng)的化學(xué)作用CNBr-活化的瓊脂糖和疊氮化合物之間的確切反應(yīng)機(jī)理是未知的。根據(jù)文獻(xiàn)(11)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，圖2的方案提出了可能的反應(yīng)機(jī)理。該反應(yīng)可能包含兩個(gè)步驟，其中在疊氮化合物第一次附著在瓊脂糖上，接著通過(guò)環(huán)轉(zhuǎn)化為四唑基團(tuán)而進(jìn)行的。為了測(cè)試這一假設(shè)，分析了水溶性氨基-四唑向CbI-OH2(pH7.5，37℃)上的結(jié)合。意在比較氨基-四唑?qū)aN3與對(duì)制備的吸附劑材料上的速率常數(shù)。
正如通過(guò)在與氨基-四唑混合后在CbI-OH2中所檢測(cè)到的光譜的改變所表明的，氨基-四唑能夠配位到CbI的[β]-位(圖3a)。得到的光譜是相當(dāng)?shù)湫偷腃bI-N-R(6)。含四唑化合物與CbI的[β]-位的結(jié)合能力是前所未知的。通過(guò)及時(shí)監(jiān)測(cè)CbI-OH2向CbI-四唑的光譜轉(zhuǎn)變，研究了這一反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。相關(guān)的速率常識(shí)由顯示的曲線計(jì)算得到(圖3b)。本發(fā)明將疊氮化合物、氨基-四唑以及吸附劑材料進(jìn)行比較測(cè)定的結(jié)果示于表1。其支持了向瓊脂糖導(dǎo)入的官能團(tuán)是四唑-基團(tuán)這一理論。
表1.檢測(cè)不同化合物得到的配位于CbI-OH2[β]-位的速率常數(shù)

實(shí)施例2.CbI-OH2特定吸附劑的性質(zhì)2.1.用CbI以最大可能程度的間歇式飽和(Batch saturation)疊氮化合物-激活的基質(zhì)測(cè)試了CbI-OH2與制備的吸附劑材料的結(jié)合。當(dāng)將0.05ml懸浮的吸附劑材料∶水(1∶1)與0.5ml的1mM CbI-OH2在pH6的0.1M Pi-緩沖液，進(jìn)行混合并培養(yǎng)5分鐘，觀察到用CbI充分飽和吸附劑材料。將樣品離心(10,000rpm，30s)，用2ml pH6的0.1M Pi-緩沖液、洗去有色的上清液1分鐘。吸附劑材料通過(guò)離心而被沉淀，并按照如2.2節(jié)所描述地從小球中洗脫結(jié)合的CbI。根據(jù)其吸收光譜檢測(cè)洗脫CbI的濃度。在裝載的吸附劑中CbI-結(jié)合基團(tuán)的濃度估計(jì)為4-8mM。在樹(shù)脂中活性基團(tuán)的量取決于原始的瓊脂糖。新鮮的CNBr-活化的瓊脂糖顯示了高水平的由疊氮處理所引發(fā)的基團(tuán)。
2.2.在分析測(cè)定法中從吸附劑材料中洗脫CbI將CbI-飽和的吸附劑材料(0.02-0.1ml)在1ml的2mM KCN于pH7-9和95℃下進(jìn)行培養(yǎng)5分鐘，導(dǎo)致了吸附的CbI以二-氰基形式全部釋放，即在較高和較低軸位置具有與鈷配位的CN-基團(tuán)的CbI(CN-CbI-CN)的全部釋放。洗脫的CbI由其吸光度而定量。比較容易檢測(cè)二-氰基-CbI，這是由于配體的這種形式與所有其它CbI相比較具有最高的吸光系數(shù)(6)。
2.3.吸附劑材料沒(méi)有泄漏的柱飽和當(dāng)具有吸附劑的0.2ml的柱于pH6以100μM CbI-OH2的流量處理，在任何可視的泄漏之前，可以達(dá)到在親和性材料中的2mM的濃度。在大于2mM的飽和水平，從柱中的洗脫液開(kāi)始包含逐漸增多量的CbI-OH2(5-10μM或更高)。另一方面，當(dāng)應(yīng)用的溶液不包含任何游離的CbI-OH2時(shí)，飽和至相同水平的吸附劑材料不存在任何顯著的泄漏。吸附的CbI好像對(duì)外部的CbI-OH2是敏感的，其中后者攻擊吸附劑材料中的配體并在高飽和時(shí)引起輕微的流出。
2.4.吸附劑和CbI-OH2之間相互反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)吸附劑和CbI之間的反應(yīng)被假定為雙分子可逆反應(yīng)A+BAB，其至少在吸附劑材料適度飽和時(shí)被認(rèn)為是正確的。為了檢測(cè)該反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將不同量的吸附劑材料(對(duì)應(yīng)于在最終混懸液中為25-250μM濃度的官能團(tuán))與50μM CbI-OH2混合。該反應(yīng)可以在pH7.5、37℃、20℃或于pH6.0、20℃的條件下進(jìn)行。在具有輕微攪拌的培養(yǎng)后，將0.5ml份的懸浮液通過(guò)裝載在巴斯德吸管中的海綿迅速過(guò)濾。檢測(cè)在過(guò)濾樣品中CbI的濃度，并用于繪制經(jīng)時(shí)的吸收曲線(圖4a)。按照表1所示的速率常數(shù)描繪，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)是令人滿意的。使CbI與材料的結(jié)合可以在5℃或60℃或者在20-37℃進(jìn)行，但是具有吸附過(guò)程的成比例減速/加速(proportional deceleration/acceleration)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分析了結(jié)合的平衡。不同量的吸附劑材料在輕微攪拌中與1ml的20μM CbI-OH2培養(yǎng)5-22小時(shí)。將可溶性CbI-OH2的減少對(duì)混懸液中官能團(tuán)的濃度作圖(圖4b)。之后計(jì)算了平衡解離常數(shù)(表1)。其值比在動(dòng)力學(xué)測(cè)定中由速率常數(shù)計(jì)算得到的Kd略低(圖4a)。比較CbI-OH2吸附動(dòng)力學(xué)清楚地顯示出與具有疊氮化合物的CbI-特異性吸附劑材料相比較，具有氨基-四唑的CbI-特異性吸附劑材料具有更高的相似性。這支持了下述假設(shè)在疊氮化合物-活化的瓊脂糖中的官能團(tuán)為四唑基團(tuán)而不是偶合的疊氮化合物。
上述動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可以預(yù)測(cè)關(guān)于在裝載柱中吸附劑的狀態(tài)。因此，使包含CbI-OH2的介質(zhì)通過(guò)裝載到柱中的吸附劑材料而進(jìn)行過(guò)濾(在吸附劑材料中為4mM的假定四唑基團(tuán))，將導(dǎo)致以流速為每分兩柱床體積時(shí)的吸附為施加的CbI的95％，或者以流速為每分一柱床體積時(shí)的吸附為施加的CbI的99.8％(pH6，室溫)。實(shí)驗(yàn)測(cè)定確認(rèn)了上述計(jì)算，并顯示在流速為2ml/min時(shí)濾經(jīng)1ml柱的2.5μmol CbI有95-96％的吸附(pH6，室溫)。在稀釋的懸浮液中(1體積吸附劑材料與99體積的含CbI溶液混合，假定40μM的四唑基團(tuán)，最終稀釋程度為1μM CbI，pH6.0，20℃)的間歇式吸附(batchadsorption)，在30分鐘培養(yǎng)后顯示出大約CbI-OH2的80％的吸附。
2.5.吸附對(duì)于pH的依賴性考慮到在反應(yīng)分子中存在的許多基團(tuán)具有酸堿性質(zhì)，可以預(yù)料CbI-OH2與四唑基團(tuán)的結(jié)合是pH-敏感的i)四唑上的第二個(gè)質(zhì)子的pK為(-2)-(-1)，ii)四唑上的第一個(gè)質(zhì)子的pK為2-4，iii)CbI的核苷酸堿基因?yàn)橘|(zhì)子化而pK為0，iiii)CbI-OH+H+CbI-OH2的酸堿平衡的pK為7.6。將具有較寬范圍pH0-12的溶液作為用于在吸附劑材料上CbI-OH2吸附的介質(zhì)而進(jìn)行檢測(cè)。在當(dāng)0.2ml吸附劑材料的懸浮液與1ml含60μM CbI的介質(zhì)混合時(shí)以間歇式進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)光學(xué)測(cè)驗(yàn)在1-30分鐘之間跟蹤了從上清液中CbI的除去。將結(jié)合的初速度對(duì)pH作圖(圖5)。該圖顯示最佳的條件在pH3～pH7之間。影響結(jié)合的基團(tuán)的近似pK為pK 2.0和pK 7.8。
正如圖5所示，在pH 0(1M HCl)沒(méi)有檢測(cè)到吸附。在低pH值沒(méi)有結(jié)合這并不是因吸附劑材料的劣化所致，這是由于一旦pH被調(diào)整為4-7、用HCl清洗的吸附劑材料便恢復(fù)了其從溶液中捕獲CbI-OH2的能力。正如對(duì)于四唑基團(tuán)所已知的那樣，這一效果好像是由吸附劑材料在低pH時(shí)的質(zhì)子化而導(dǎo)致的(11)。
將pH升高到大于7也導(dǎo)致結(jié)合的減速，這可能是由于含水-CbI向其羥基-形式(其中OH-基比水對(duì)CbI的[β]-位具有更高的親和性)的轉(zhuǎn)化所致。但是，正如在表1中的數(shù)據(jù)所示，與pH6相比較，在pH7.5時(shí)結(jié)合并不困難。
2.6.生物學(xué)上相關(guān)的CbI與TZ-瓊脂糖的結(jié)合天然源中可獲得的CbI的主要形式為CbI-Ado、CbI-Met以及CbI-OH2，其中前兩者是光敏感性的。因此，20％CbI-OH2與80％CbI-Ado混合物的吸附特性是在下述條件下檢測(cè)的0.1ml吸附劑材料，0.9ml緩沖液，50μMCbI，pH6，20℃。樣品進(jìn)行不同地照射1)保存在黑暗中、2)結(jié)合過(guò)程中在散射的室照明中培養(yǎng)，3)在結(jié)合前進(jìn)行30分鐘散射光照明。結(jié)果用溶液中保留的光密度與培養(yǎng)時(shí)間描繪(圖6)。正如所預(yù)料的，在所有的樣品中，20％的CbI-OH2被迅速地從介質(zhì)中除去。相反，在研究中，對(duì)三種樣品保留的CbI-Ado結(jié)果不同。因此，當(dāng)將樣品保存在黑暗中時(shí)，快速吸附的第一階段后進(jìn)行的是非常緩慢的CbI-Ado的結(jié)合。對(duì)懸浮液進(jìn)行的適度光照導(dǎo)致了吸附的顯著加速，而對(duì)于溶液進(jìn)行的預(yù)光照使得結(jié)合的速度幾乎不能從純CbI-OH2中區(qū)分出來(lái)。
可以推導(dǎo)出下述結(jié)論，即，由CbI-Ado向CbI-OH2的光化學(xué)轉(zhuǎn)變是十分有效的，并且即使在適度的照射下在1小時(shí)的培養(yǎng)后實(shí)際上整個(gè)池(wholepool)的最初CbI-Ado積累在吸附劑材料中。正如可以從記錄的光譜中所發(fā)現(xiàn)的，上清液中殘留的吸光度既不與CbI-Ado相關(guān)，也不與CbI-OH2相關(guān)，而得自污染的CbI-CN(未顯示)。
2.7.在不同條件下CbI從吸附劑材料中的解吸附作用CbI從親和性吸附劑材料的釋放可以按照工作的目的而以多種方式進(jìn)行。在2-10mM KCN中于pH7.5、95℃下迅速定量洗脫的方法適用于分析的目的并描述于第2.2節(jié)中。下面描述兩種更適用于大批量純化CbI的其它方法。
第一種方法也采用10mM KCN，但是解吸附是在緩和的條件下進(jìn)行。因此，如果培養(yǎng)的時(shí)間足夠長(zhǎng)，可以在室溫和pH7-12的條件下洗脫CbI(圖7)。約10小時(shí)足以從吸附劑材料中除去99％的吸附的CbI。由于這一反應(yīng)是不可逆的，因此實(shí)際上不需要過(guò)量的洗脫劑以從裝載的柱中釋放全部的CbI。得到作為CN-CbI-CN的配體，并且在兩個(gè)配位位置上氰化物的存在加速了從吸附劑材料中的釋放。將介質(zhì)酸化到pH2-3導(dǎo)致了在20分鐘內(nèi)向單-氰基形式(CbI-CN，維生素B12)轉(zhuǎn)變。得到物質(zhì)的吸光度光譜與CbI-CN標(biāo)準(zhǔn)溶液的沒(méi)有不同(圖8)。KCN洗脫的優(yōu)點(diǎn)在于CbI向氰基-形式和二氰基-形式的轉(zhuǎn)化，所述兩種形式對(duì)于不同的化學(xué)試劑而言是十分穩(wěn)定的。但是，該方法的缺點(diǎn)在于使用了危險(xiǎn)化合物KCN。
與CbI結(jié)合的pH依賴性相一致，吸附的CbI的洗脫還可以在1M HCl中進(jìn)行(圖5)。該方法是迅速的，并且在其中吸附劑材料∶酸的比例為1∶10的酸中分批培養(yǎng)(batch incubation)1分鐘后達(dá)到90-95％的洗脫(圖7)。剩余5-10％的CbI的釋放需要新鮮的HCl，即與上述不可逆的KCN-誘導(dǎo)的洗脫相反在酸中的吸附-解吸過(guò)程是可逆的。在柱的解吸附中，泵入兩柱床體積的1M HCl通過(guò)吸附劑材料(每一個(gè)體積5分鐘)以釋放95％的結(jié)合的配體是足夠的。如果必要，吸附劑的完全恢復(fù)可以通過(guò)再用兩體積的酸清洗而實(shí)現(xiàn)。不推薦將CbI長(zhǎng)時(shí)間的保存在1M HCl中，這是由于其將緩慢水解為羧基-類似物。因此，洗脫的樣品用5M NaOH中和，并添加緩沖液以將pH保持在要求的水平(pH5或pH7.5)。光譜測(cè)定顯示出，得到的包含CbI-OH2的樣品以及光譜與標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有不同(圖8)。通過(guò)添加比CbI稍微過(guò)量的KCN，在pH5時(shí)CbI的含水-形式可以容易地轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的氰基-形式。由于氰化物的保護(hù)性質(zhì)，轉(zhuǎn)變?yōu)镃bI-CN可以是優(yōu)選的。
2.8.在不同介質(zhì)中CbI-特異的吸附劑材料的穩(wěn)定性吸附劑材料的穩(wěn)定性對(duì)于材料的長(zhǎng)期應(yīng)用是重要的，并且制備的吸附劑被證明可以抗降解。例如，吸附劑材料可以于室溫在水或1-10mM NaN3(抗菌劑)中保存一年而不發(fā)生任何可見(jiàn)的劣化。不僅僅保存，而且CbI解吸附的條件均可能影響吸附劑材料的性質(zhì)。因此，我們測(cè)定了洗脫介質(zhì)對(duì)于吸附劑材料的影響。
測(cè)定顯示吸附劑可以于室溫在10mM KCN，0.1M Pi，pH7.5保存至少兩周而沒(méi)有CbI-結(jié)合能力的任何損失。最大飽和程度以及吸附速度均與新鮮材料的相同。
另一方面，對(duì)于在1M HCl中培養(yǎng)后的吸附劑材料進(jìn)行測(cè)定也是相當(dāng)必要的，這是由于該溶液的pH已經(jīng)在報(bào)導(dǎo)的瓊脂糖用的穩(wěn)定范圍(pH2-11)之外。該測(cè)定如下進(jìn)行。將在酸中培養(yǎng)了30-50小時(shí)后的吸附劑材料置于CbI-OH2溶液(0.1M Pi，pH6.0，200μM CbI)流中。檢測(cè)洗脫液體的吸光度，并且該實(shí)驗(yàn)一旦在CbI的泄漏達(dá)到20μM即達(dá)到所用介質(zhì)的10％便終止。然后測(cè)定吸附的配體量，數(shù)據(jù)以CbI在吸附劑材料內(nèi)的濃度表示(表2)。
表2.在用1M HCl培養(yǎng)不同時(shí)間后吸附劑材料的CbI-結(jié)合性質(zhì)

在1M HCl中的培養(yǎng)導(dǎo)致了樹(shù)脂的部分劣化，并伴隨CbI的較早泄漏和較低的飽和程度。在快速流動(dòng)吸附(兩柱床體積/分)時(shí)該作用更加明顯，但并不像在減小的流動(dòng)(半柱床體積/分)時(shí)所表示的那樣明顯?？傊?，即使在1M HCl中培養(yǎng)50小時(shí)后，也可以在0.5體積/分的流速下將柱飽和到每升吸附劑材料中2mmol CbI的水平。這結(jié)果顯示CbI-特異性材料可能保存300個(gè)吸附-解吸附的循環(huán)(在每次HCl洗脫中保持10分鐘)而沒(méi)有嚴(yán)重地?fù)p壞。
2.9.在從吸附劑材料中洗脫后CbI-樣品的脫鹽由親和性吸附劑材料制備CbI，由于有高濃度的NaCI(HCl洗脫后進(jìn)行NaOH中和)或存在7-8mM游離KCN(KCN洗脫)而不能在洗脫后馬上使用。下述的兩種方法是最適于從溶液中除去低分子量的物質(zhì)。
從鹽中分離CbI可以利用其質(zhì)量的差異進(jìn)行(CbI為1300，并且鹽為＜100)。這可以通過(guò)用水的透析進(jìn)行，其采用具有孔直徑相當(dāng)于500-1000截止大小的膜。采用相同特征的膜的一些稀釋-濃度循環(huán)也是可能的?；谕肝龅姆椒▽?duì)于CbI-CN是有效的，這是因?yàn)榕c標(biāo)準(zhǔn)品相比較沒(méi)有在UV和可見(jiàn)光譜中引入變化。但是，對(duì)最終CbI-OH2制劑的分析在光譜形狀中顯示了一些變形，這可能是由于[β]-位與雜質(zhì)的反應(yīng)。薄層色譜分析顯示黃色CbI的存在(10-20％)，其比主成分漂移得稍快但是仍然覆蓋了它(圖9A，泳道3)。如果在透析和冷凍干燥之前將CbI-OH2轉(zhuǎn)化為CbI-CN，則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)(圖9A，泳道4)，在制備濃縮的CbI-OH2中存在少量雜質(zhì)建議通過(guò)傳統(tǒng)方法重結(jié)晶樣品。
對(duì)CbI樣品的脫鹽也可以使用活性炭方法。這一步驟不能應(yīng)用于CbI-OH2，這是由于其[β]-位對(duì)活性炭?jī)?nèi)的某些成分是敏感的(CbI的終產(chǎn)物變黃并包含[β]-基團(tuán)而不是水)。另一方面，具有緊密結(jié)合的[β]-基團(tuán)的CbI-CN適用于這種類型的處理。在實(shí)驗(yàn)中，得到了最大飽和程度為每1g活性炭20-25μmol CbI。吸附作用立即發(fā)生，而固體成分可以通過(guò)重力沉降(2-3h)、短暫離心(1分3000g)或過(guò)濾而從溶液中分離。將丸用水清洗，并且將吸附的CbI用96％的乙醇以兩部分(每步培養(yǎng)30分鐘)洗脫。將洗脫的CbI冷凍干燥。
實(shí)施例3.CbI的模型純化3.1.CbI的來(lái)源采用用CbI-OH2飽和的CbI-結(jié)合蛋白內(nèi)因子(IF)(5，12)，并加入到人血漿中而建立模型體系，所述人血漿用0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH3.0稀釋為1∶5。IF-CbI的終濃度為10μM(≈0.01mg/ml的CbI)，其總體積為5ml。污染蛋白的濃度為約15mg/ml。
3.2.CbI的萃取將含CbI的樣品在95℃加熱30分鐘，以從蛋白復(fù)合物中釋放CbI-OH2。在pH3的處理伴隨著約30％配體的降解。作為對(duì)比，在pH7的類似處理導(dǎo)致了CbI-OH2的完全降解，這可能是由于在血漿中存在的含SH化合物的減少。將加熱的樣品冷卻并用NaOH中和至pH5.0并通過(guò)離心除去碎屑。然后用0.1M的檸檬酸緩沖液pH5.0清洗相當(dāng)于總體積1/3的丸，離心并收集了兩種上清液。樣品的終體積為6ml。也可以采用其它萃取方法。
3.3.在TZ-瓊脂糖上的吸附以0.2ml/分(兩柱床體積每分)的流速，將配體吸附在裝載在巴斯德吸管中的CbI-特異性吸附劑材料(0.1ml)上。將結(jié)合有CbI的吸附劑用1ml的1MNaCI，0.1M Tris，pH7.5洗滌，之后用1ml的水洗滌。
3.4.CbI的洗脫吸附的配體用0.3ml 1M HCl從柱中洗脫，其中用5M NaOH中和溶液并且添加檸檬酸鹽緩沖液至0.1M的濃度以將pH保持≈3.0。通過(guò)添加1mMKCN并將樣品在95℃加熱5分鐘，將制備的CbI-OH2轉(zhuǎn)化為CbI-CN。
3.5.脫鹽和冷凍干燥使用具有截止分子量(cut off molecular)為500的膜對(duì)水透析CbI的鹽溶液，之后將樣品凍干。對(duì)溶解的制劑的分析顯示其在UV和可見(jiàn)光部分兩者的吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品的完全一致(圖8)。薄層色譜(圖9B)顯示出了一個(gè)有色成分(泳道2)，其具有相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品(泳道1)的遷移率。純化CbI的量相當(dāng)于添加到模型樣品中的60-65％。25-30％的主要損失發(fā)生在從血漿中萃取CbI-OH2的過(guò)程中。
實(shí)施例4.氨基-四唑與不同基質(zhì)的共軛結(jié)合四唑基團(tuán)的活性性質(zhì)在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中被確認(rèn)。因此，四唑的衍生物氨基四唑通過(guò)其氨基與三種不同材料共軛結(jié)合環(huán)氧瓊脂糖6B、CM瓊脂糖和羧基-安伯萊特IRC76(圖10)。其結(jié)果是，向CbI材料(環(huán)氧-和CM-瓊脂糖)的惰性物(inert)需要2mM和6mM的CbI結(jié)合能力，并且在所有其它方面與早期所述基質(zhì)的行為相一致。CbI向安伯萊特的緩慢而非特異性的結(jié)合是通過(guò)連結(jié)四唑后而加速了10倍(factor 10)。
4.1實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將10ml測(cè)定的基質(zhì)用過(guò)量的水洗滌，并制備反應(yīng)混合物的漿料i)將20ml 0.1M氨基-四唑pH12.3與10mL的環(huán)氧瓊脂糖6B混合；或ii)20mL的0.1M氨基-四唑、0.2M N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺pH5.5與10mL CM瓊脂糖或羧基-安伯萊特IRC76混合。后者混合物的pH在反應(yīng)的第一個(gè)小時(shí)被監(jiān)控并通過(guò)添加5M NaOH維持在pH5.0-5.5。在室溫中繼續(xù)培養(yǎng)并溫和地?cái)嚢鑳商?。之后，活化的基質(zhì)用過(guò)量的水洗滌并檢測(cè)其CbI結(jié)合能力。
實(shí)施例的結(jié)論通過(guò)用疊氮化鈉(NaN3)處理CNBr-活化的瓊脂糖，成功地在不溶性材料上引發(fā)CbI-特異性基團(tuán)。不受特殊理論的限制，動(dòng)力學(xué)分析強(qiáng)有力地指出在得到的吸附劑材料中的活性物質(zhì)是四唑基團(tuán)，而不是疊氮基團(tuán)。在溶液和與載帶材料偶合的四唑基團(tuán)兩者，因與鈷配位而有效地與在其[β]-位的CbI結(jié)合。四唑的性質(zhì)是先前所未知的。得到的材料顯示對(duì)CbI-OH2的高親和性，其在pH6-7.5時(shí)Kd＝1-7μM(表1)，并且最大的飽和程度為每升吸附劑4-8mmol的CbI。在最小泄漏時(shí)可以得到2-3mM的飽和程度。
CbI-OH2對(duì)吸附劑材料的結(jié)合可以在pH3～pH7的較寬范圍內(nèi)觀察到。從溶液中俘獲CbI-OH2在柱過(guò)濾和批量生產(chǎn)的兩過(guò)程中均是有效的。吸附劑材料沒(méi)有通過(guò)緊密結(jié)合的[β]-基與CbI結(jié)合，例如CbI-CN或生物學(xué)形式CbI-Ado。但是，CbI后者形式的散射光照導(dǎo)致轉(zhuǎn)化為伴有有效吸附的CbI-OH2。
進(jìn)行了兩種從CbI-飽和的親和性材料中洗脫的方法。第一種采用10mM KCN以及得到以純CbI-CN的終產(chǎn)物。該方法的優(yōu)點(diǎn)為保護(hù)了CbI的[β]-位以防止其與污染物可能進(jìn)行的反應(yīng)。第二種技術(shù)采用1M HCl作為洗脫劑并使要得到的產(chǎn)物為CbI-OH2，其包含10-20％具有[β]-基的CbI而不是水。這是由于在濃縮CbI樣品過(guò)程中與一些污染物反應(yīng)引起的。
親和性吸附材料是耐用的并對(duì)所有應(yīng)用的試劑具有極好的耐性。進(jìn)行的分析顯示了該材料具有經(jīng)歷300個(gè)吸附后用1M HCl洗脫的循環(huán)的潛在能力。
進(jìn)行了典型純化。使用CbI-OH2結(jié)合到與血漿蛋白混合的特異性蛋白內(nèi)因子。主要的純化階段為1)在pH3和95℃萃取，2)吸附在親和性材料上，3)用1M HCl洗脫、中和并將CbI-OH2轉(zhuǎn)化為CbI-CN，4)將溶液脫鹽并凍干。根據(jù)吸收光譜和在薄層色譜上的遷移率，得到的產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有不同。
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權(quán)利要求
1.用于純化含咕啉化合物的吸附劑材料，其中所述吸附劑材料·包含四唑作為官能團(tuán)，和/或·由包含下述步驟的方法得到i)提供包含氰化物的活化基質(zhì)，和ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)，和/或·具有[β]-特異性官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)在pH 3～7.5、5℃～60℃與CbI-OH2結(jié)合，其Kd小于100μM，并且其中所述吸附劑材料不引起所述含咕啉化合物的減少或破壞。
2.權(quán)利要求1的吸附劑材料，其中所述含咕啉化合物是鈷胺素或其類似物。
3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的吸附劑材料，其中所述含咕啉分子是含咕啉化合物的含水形式優(yōu)選含水-鈷胺素，或者與含咕啉化合物的含水-形式相平衡的含咕啉化合物的形式。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的吸附劑材料，其中所述吸附劑材料在pH 3～7.5、5℃～60℃與CbI-OH2結(jié)合，其Kd為0.01～100μM，例如Kd為0.1～50μM，如Kd為0.5～20μM，如Kd為1～7μM。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的吸附劑材料，其中當(dāng)通過(guò)重力裝載在柱中時(shí)，所述吸附劑材料具有最大的飽和劑量，即在每升的吸附劑材料中有0.1～500mmol、例如0.5～100mmol、例如1～50mmol、例如4～8mmol的含咕啉化合物。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的吸附劑材料，其中所述活化基質(zhì)為CNBr-活化的瓊脂糖。
7.用于制備在上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中定義的吸附劑材料的方法，其包括使四唑基團(tuán)與基質(zhì)相連，或在基質(zhì)上引發(fā)四唑基團(tuán)的形成。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述基質(zhì)為環(huán)氧瓊脂糖6B、CM瓊脂糖或羧基-安伯萊特(Amberlite)IRC76。
9.用于制備在上述權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)定義的吸附劑材料的方法，其包括下述步驟i)提供包含氰化物的活化基質(zhì)，和ii)用包含疊氮化合物的溶液處理所述基質(zhì)。
10.用于從溶液中純化含咕啉化合物的方法，其包括下述步驟i)提供包含含咕啉化合物的溶液，ii)提供權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)定義的吸附劑材料，iii)將所述溶液暴露于所述吸附劑材料中，iv)從沒(méi)有被吸附到吸附劑材料上的溶液的成分中分離與所述吸附劑材料結(jié)合的含咕啉化合物的復(fù)合物，v)任選地進(jìn)行洗滌，以及vi)從所述吸附劑材料中洗脫所述含咕啉化合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述含咕啉化合物是鈷胺素或其類似物。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述含咕啉分子是含咕啉化合物的含水形式優(yōu)選含水-鈷胺素，或者與含咕啉化合物的含水-形式相平衡的含咕啉化合物的形式。
13.權(quán)利要求10～12中任一項(xiàng)的方法，其包括在步驟iii)之前和/或之中將所述溶液暴露在光中。
14.權(quán)利要求10～13中任一項(xiàng)的方法，其包括在步驟iii)之前對(duì)所述溶液進(jìn)行預(yù)處理以將含咕啉化合物從與其它分子如蛋白質(zhì)的復(fù)合物中釋放出來(lái)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述預(yù)處理通過(guò)加熱所述溶液進(jìn)行。
16.權(quán)利要求10～15中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟iii)中的暴露是在pH 3～7之間進(jìn)行。
17.權(quán)利要求10～16中任一項(xiàng)的方法，其中步驟iii)和iv)包含使所述溶液通過(guò)包含所述吸附劑材料的柱。
18.權(quán)利要求10～17中任一項(xiàng)的方法，其中步驟vi)包含使用氰化物(CN-)溶液。
19.權(quán)利要求18的方法，其中步驟vi)在pH 7-12中進(jìn)行。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中轉(zhuǎn)化為單氰基形式的步驟是在步驟vi)之后例如通過(guò)酸化進(jìn)行。
21.權(quán)利要求10～17中任一項(xiàng)的方法，其中步驟vi)包含使用酸例如HCl。
22.權(quán)利要求21的方法，其中中和步驟在步驟vi)之后進(jìn)行。
23.權(quán)利要求21或22，其中轉(zhuǎn)化為氰基形式的另一個(gè)步驟是通過(guò)添加氰化物進(jìn)行。
24.權(quán)利要求10～23中任一項(xiàng)的方法，其包括從包含在樣品中的鹽中純化所述含咕啉化合物的另一個(gè)步驟。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述純化通過(guò)透析完成。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述純化是通過(guò)將所述含咕啉化合物吸附在活性炭上后、從不被活性炭吸附的溶液成分中分離與活性炭結(jié)合的含咕啉化合物、以及從活性碳中洗脫吸附的含咕啉化合物而完成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種親和吸附劑材料，其包含能夠與含咕啉化合物例如鈷胺素(CbI，或維生素B
文檔編號(hào)B01J20/32GK101065185SQ200580037244
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者瑟吉·N·費(fèi)多索夫, 托本·E·彼得森, 埃巴·奈克索, 拉斯·E·伯格倫德 申請(qǐng)人:科本托公司