專利名稱：色譜配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的色譜配體，其用作純化生物分子例如蛋白。舉例來說此配體用作純化抗體，優(yōu)選固定于多孔載體例如顆?；蚰ど?。因此，發(fā)明也包括含新配體的色譜基體、其制備方法和用來純化抗體的試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)是由許多相互依賴的共同使身體免于細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒的感染及防止腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞類型組成。免疫系統(tǒng)的衛(wèi)兵是不斷浸游在宿主血流中的巨噬細(xì)胞。當(dāng)被感染或免疫挑戰(zhàn)時，巨噬細(xì)胞通過吞沒稱作抗原的外來分子標(biāo)記的侵略者來作出反應(yīng)。此事件以輔助細(xì)胞T細(xì)胞為媒介，引發(fā)一系列復(fù)雜的反應(yīng)其導(dǎo)致了B細(xì)胞興奮。這些B細(xì)胞依次產(chǎn)生結(jié)合外來侵略者的稱為抗體的蛋白?？贵w和抗原間的結(jié)合事件標(biāo)志外來侵略者經(jīng)吞噬作用或補體系統(tǒng)的活化作用被破壞。存在許多不同種類的抗體，也稱作免疫球蛋白，如IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。它們的區(qū)別不僅在于它們的生理學(xué)地位還在于它們的結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)的角度看，IgG抗體已被廣泛研究，可能是因為它們在成熟免疫反應(yīng)中扮演的顯著地位。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用適當(dāng)?shù)目乖ㄟ^動物免疫制造多克隆抗體。反應(yīng)中動物產(chǎn)生多克隆抗體。然而，出于許多目的，希望有稱作單克隆抗體的某個抗體的單一克隆。單克隆抗體(MAb)通過雜交種或由僅產(chǎn)單個抗體的正常B細(xì)胞與異常骨髓瘤腫瘤細(xì)胞融合組成的融合細(xì)胞產(chǎn)生。這產(chǎn)生的雜交種稱作雜種細(xì)胞，目前用于生產(chǎn)抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。
現(xiàn)今，免疫球蛋白所擁有的生物活性在人及牲畜的診斷、健康護理和治療部分的一定范圍的不同應(yīng)用被開發(fā)。事實上，過去幾年，單克隆抗體和重組抗體構(gòu)造已成為在臨床試驗和接受FDA批準(zhǔn)上作為治療學(xué)和診斷學(xué)被普遍研究的最大種類的蛋白。表達(dá)系統(tǒng)和生產(chǎn)策略的補充，為了以簡單劃算的方式獲得高度純化的抗體需要有效的純化方法。
分離免疫球蛋白的傳統(tǒng)方法是基于選擇性可逆沉淀含免疫球蛋白的蛋白片段同時舍去溶液中其它組的蛋白。典型的沉淀試劑是乙醇，聚乙二醇，易溶鹽例如硫酸銨和磷酸鉀，和辛酸。這些沉淀方法典型地提供了非常不純的產(chǎn)品與此同時消耗了時間并費力。此外，沉淀試劑加入粗材料中使很難為了其它目的使用上清液并造成了處理問題其在談到免疫球蛋白大規(guī)模純化時特別有關(guān)。
分離免疫球蛋白的一個可選方法是色譜，其包括一類密切相關(guān)的分離方法。區(qū)別色譜和其它大部分分離的物理及化學(xué)方法的特征是兩個互相不混溶的相進(jìn)行接觸其中一個相固定而另一個相流動。引入流動相內(nèi)的樣本混合物在被流動相帶入體系時與固定相和流動相進(jìn)行一系列相互作用。相互作用開發(fā)了樣本組分的物理或化學(xué)性質(zhì)的差異。在流經(jīng)含固定相柱的流動相的影響下這些差異支配個別組分移動的比例。為了提高與固定相的相互作用分離的組分排出。最短滯留的組分最先洗脫，最強保留的材料最后洗脫。當(dāng)樣本組分從柱中洗脫出時一個組分充分滯留以防止與鄰近溶質(zhì)區(qū)域的重疊，這時得到分離。為了每個特殊的分離目的，正不斷努力設(shè)計最佳的固定相。這種固定相一般由附著了含官能團即結(jié)合基團的配體的載體或基礎(chǔ)基體組成。一般參考每種基于所利用的相互作用原理的色譜法，例如親和力色譜法、疏水性相互作用色譜法和離子交換色譜法。
根據(jù)鎖匙識別原理親和力色譜法是基于目標(biāo)生物分子與生物特異配體之間的特有作用。因而，目標(biāo)和配體將組成親和力配對，例如抗原/抗體、酶/受體等。蛋白基的親和力配體是眾所周知的，例如蛋白A親和力色譜法和蛋白G親和力色譜法其均是抗體分離和純化的普遍方法。眾所周知蛋白A色譜法提供顯著的特異性，特別是對單克隆抗體，因此能得到高純度。與離子交換、疏水性相互作用、羥磷灰石層析和/或凝膠過濾步驟聯(lián)合使用的以蛋白A為基礎(chǔ)的方法成為許多生物制藥公司抗體純化方法的選擇，參見WO8400773和US5,151,350。然而，由于蛋白的肽鍵，蛋白A基質(zhì)表現(xiàn)某種程度的堿性敏感度。另外，當(dāng)?shù)鞍譇基質(zhì)用于從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化抗體時，源自細(xì)胞的蛋白酶可能引起蛋白A或其肽片段的損耗。
離子交換色譜法經(jīng)常用于分離免疫球蛋白。在陰離子交換色譜法中，免疫球蛋白的負(fù)電荷氨基酸端鏈將與色譜基體的正電荷配體相互作用。另一方面在陽離子交換色譜法中，免疫球蛋白的正電荷氨基酸端鏈將與色譜基體的負(fù)電荷配體相互作用。
疏水性相互作用色譜法(HIC)是另一種所述方法并用于分離免疫球蛋白。如果目標(biāo)是高度純化的免疫球蛋白產(chǎn)品，一般推薦將HIC與一個或多個進(jìn)一步的步驟結(jié)合。在HIC中，為了使免疫球蛋白有效結(jié)合HIC基體，需要將易溶鹽加入流動相中。通過降低易溶鹽濃度，結(jié)合的免疫球蛋白隨后從基體中釋放出來。因而，此方法的一個缺點是需要將易溶鹽加入粗材料中，因為這可能引發(fā)問題和增加大規(guī)模用戶的成本。例如，對于如乳清、血漿、和雞蛋黃的粗材料，許多實例中易溶鹽加入粗材料中在大規(guī)模應(yīng)用上是抑制的，因為鹽能阻止免疫球蛋白廢棄粗材料任何經(jīng)濟上可行的使用。大規(guī)模應(yīng)用另一個問題是幾千升廢料的處理。
US5,945,520(Burton等人)公開了混合式色譜樹脂在結(jié)合pH下顯示疏水性特征和在解吸附pH下顯示疏水性特征和/或靜電特征。樹脂特別設(shè)計成在低離子濃度和高離子濃度下均從水溶液中結(jié)合目標(biāo)化合物。這是通過包括一條間隔臂的經(jīng)過選擇的可離子化配體和至少一種可離子化官能度完成的，其中固體載體基體上可離子化配體的密度大于約150μmol/ml樹脂或1mmol/g樹脂干重中更小者。另外，包括所述可離子化配體的樹脂的疏水性特征是在第一pH時在高離子濃度和低離子濃度下充分結(jié)合水介質(zhì)中至少50％的目標(biāo)化合物?？呻x子化官能度說明性的例子是4-(氨基甲基)吡啶，3-(氨基甲基)吡啶，2-(氨基甲基)吡啶，1-(3-氨基丙基)-咪唑，2-(氨基甲基)-苯并咪唑，4-(3-氨基丙基)嗎啉。
此外，WO01/38228(Belew等人.)涉及陰離子交換吸附方法其中硫醚陰離子交換劑用于從液體中通過結(jié)合除去負(fù)電荷物質(zhì)。每個配體包括一個正電荷氮和一個距所述電荷氮1-7個原子距離的硫醚鍵。所要物質(zhì)如細(xì)胞、細(xì)胞的部分和含肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在0.25M NaCl鹽濃度區(qū)域被吸附。
最后，US6,702,943(Johansson等人)公開了通過吸附在載有多個含陰離子交換基團和疏水性結(jié)構(gòu)的配體的基體上來從液體中除去目標(biāo)物質(zhì)的方法。更特別地，配體含有鄰近正電荷陰離子交換基團的芳香環(huán)。所要物質(zhì)是細(xì)胞、細(xì)胞的部分和含肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。由于能在高鹽濃度如0.25M NaCl下吸附目標(biāo)物質(zhì)，公開的配體表示為“高鹽配體”。
然而，為了優(yōu)選涉及純化特定目標(biāo)分子的方法，需要唯一的操作條件，并且最佳分離基體不同情形下有變化。例如，在生物技術(shù)工業(yè)中，需要設(shè)計特有的方法純化肽和蛋白、核酸、病毒等。此外，抗體純化中，抗體的類型將決定分離基體的選擇。因而，為了許多經(jīng)常發(fā)展的新產(chǎn)品的純化，仍需要在可選擇的分離基質(zhì)的領(lǐng)域提供廣泛選擇。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個方面是提供新配體其用于從液體的其它組分中分離抗體。
發(fā)明一個特別的方面是提供這樣的配體其能吸附雜質(zhì)蛋白而不吸附目標(biāo)抗體。
發(fā)明進(jìn)一步的方面和優(yōu)點將從以下的詳細(xì)描述中體現(xiàn)。
附圖簡述

圖1是根據(jù)發(fā)明說明性的色譜配體，即通過胺結(jié)合在載體上的N-芐基-N-甲基乙醇胺。
圖2顯示在包括固定于SepharoseTM6FF的N-芐基-N-甲基乙醇胺配體的分離基體上單克隆抗體分離的色譜圖；和如下所述，強陰離子交換劑Q SepharoseTMFF作為參考。
圖3a)和b)顯示用mAb1-重組蛋白A的混合物在配體原型上進(jìn)行的色譜的結(jié)果。
圖4a)-c)顯示樣本使用Mab1、1％重組蛋白A及從圖3的色譜試驗中匯集的流經(jīng)級份和洗出液級份的分析尺寸排阻色譜(SEC)結(jié)果。
定義術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本說明書中可交換使用。
術(shù)語“分離基體”此處用于表示由結(jié)合了一種或多種含官能團的配體的載體組成的材料。在這個領(lǐng)域術(shù)語“樹脂”有時用作分離基體。
術(shù)語“多模態(tài)”分離基體指的是能提供至少兩個不同的但聯(lián)合操作的與結(jié)合的化合物相互作用的位置的基體。例如，這些位置中的一個可提供一種有吸引力類型的配體與興趣物質(zhì)間的電荷-電荷相互作用。另一個位置可提供電子受體-供體相互作用和/或疏水性相互作用和/或親水性相互作用。電子供體-受體相互作用包括例如氫結(jié)合、π-π、陽離子-π、電荷轉(zhuǎn)移、偶極-偶極、感應(yīng)偶極子等的相互作用?！岸嗄B(tài)”分離基質(zhì)也稱作“混合模式”分離基質(zhì)。
術(shù)語“表面”此處意指所有的外部表面，并包括多孔載體情況中的外部表面及孔表面。
術(shù)語“洗脫液”在這個領(lǐng)域使用它的常規(guī)含意，也就是從分離基體中釋放一種或多種化合物的合適pH和/或離子濃度的緩沖液。
術(shù)語“捕獲步驟”在液相色譜的范圍內(nèi)指的是分離過程的最初步驟。最普遍地，捕獲步驟包括凈化、濃縮、穩(wěn)定和從可溶雜質(zhì)中有效純化。在捕獲步驟之后，可以接著中間純化其進(jìn)一步減少雜質(zhì)例如宿主細(xì)胞蛋白，DNA，病毒，內(nèi)毒素，營養(yǎng)素，細(xì)胞培養(yǎng)基組分例如消泡劑和抗生素，和產(chǎn)品有關(guān)的雜質(zhì)例如聚集體、錯誤折疊的種類和凝集物的殘留量。術(shù)語“一次性”此處意指在色譜柱和其它分離基質(zhì)的范圍內(nèi)基體被打算單次使用或有限次使用。一次性產(chǎn)品方便使用以除去甚至很小量也有害的雜質(zhì)，這種情形下方便吸附所述雜質(zhì)到基體上并再丟棄基體。另一種想要一次性產(chǎn)品的情形是為了無菌處理，這種情形下基體是消過毒的或至少無菌的。
術(shù)語“磨光步驟”在液相色譜的范圍內(nèi)指的是最后的純化步驟，其中微量雜質(zhì)被除去留下活性安全的產(chǎn)品。在磨光步驟除去的雜質(zhì)通常是目標(biāo)分子或疑似泄漏產(chǎn)品的構(gòu)象構(gòu)體。
術(shù)語“Fc-結(jié)合蛋白”意指能結(jié)合抗體可結(jié)晶部分(Fc)的蛋白并包括如蛋白A和蛋白G、或保留所述結(jié)合性質(zhì)的任意片段或其融合蛋白。
發(fā)明詳述第一個方面，本發(fā)明是包括芳香族乙醇胺的色譜配體。發(fā)明所述的配體特別用于純化抗體，這將在下面更詳細(xì)地討論。
第一個實施方案中，此配體由下列式R1-R2-N(R3)-R4-R5定義其中
R1是取代的或未取代的芳香環(huán)體系，例如苯基基團；R2是包括0至4個碳原子的烴鏈；R3是包括1至3個碳原子的烴鏈；R4是包括1至5個碳原子的烴鏈；且R5是OH或H。
如前所示，基團R1通過可能不含碳原子的碳鏈R2與胺連接，即R1和胺之間構(gòu)成鍵；或通過1至4個碳原子例如2至3個碳原子，其任意被取代。用R5連接胺的碳鏈R4可以包括1至5個碳原子例如2至4個碳原子，其任意被取代。胺的R3可以包括包括1至3個碳原子例如2個碳原子，其任意被取代。
如果取代基不削弱配體的結(jié)合性質(zhì)至相當(dāng)?shù)幕痉秶枷悱h(huán)體系R1可以包括一種或多種取代的或未取代的苯基基團。因而，R1可以包括一種或多種芳香環(huán)，例如亞苯基、亞聯(lián)苯基或亞萘基結(jié)構(gòu)和其它芳香環(huán)體系。芳香環(huán)可以是雜環(huán)的，即含一個或多個氮、氧或硫原子，例如吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、或吡喃。說明性的R1取代基團選自由羥苯基(2-，3-和4-)、2-苯并咪唑基；甲硫基氧基苯基(2-，3-和4-)、3-吲哚基、2-羥基3-硝基苯基、氨苯基(2-，3-和4-)、4-(2-氨基乙基)苯基、3，4-二羥基苯基、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基、4-咪唑基、4-氨基吡啶、6-氨基嘧啶基、2-噻吩基、2，4，5-三氨基苯基、4-氨基三嗪基和4-砜酰氨基苯基組成的組。
在一個優(yōu)選實施方案中，R1是未取代的苯基。在一個可選實施方案中，R1是由一個或多個OH基團取代的苯基。
此外，R1、R2、R3和R4的一個或多個可以由任何適合的取代基取代，只要配體的結(jié)合性質(zhì)不被削弱至相當(dāng)?shù)幕痉秶＠?，如果一個更多的親水性配體被要，它可以包括一種或多種親水性基團例如OH基團。作為選擇，取代基可以提高配體的疏水性，這種情形下配體可包括一種或多種疏水性基團例如烷基和/或氟。最后，取代基可以被用于引進(jìn)一種或多種附加的官能度例如帶電實體，也提高配體的多模態(tài)特征。此外，碳鏈R2和R3可以是直鏈或支鏈的，只要支鏈不削弱配體的結(jié)合性質(zhì)至相當(dāng)?shù)幕痉秶?br> 在此配體一個特別的實施方案中，R2是-CH2-。在另一個實施方案中，R3是-CH3。在一個進(jìn)一步的實施方案中，R4是-CH2-CH2-CH2-或-CH2-CH2-。在另一個實施方案中，R1是未取代的苯基。
因而，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的配體包括N-芐基-N-甲基乙醇胺(BMEA)。在一個可選的實施方案中，配體是N，N-二甲基芐胺。
本領(lǐng)域技術(shù)人員使用有機化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法易合成本發(fā)明所述的配體。
發(fā)明一個進(jìn)一步的方面是制備分離基體的方法，所述方法包括固定多個前面所述的配體到載體上。為了提供適合在醫(yī)學(xué)或診斷領(lǐng)域特別單獨使用的基體，根據(jù)本發(fā)明制備的分離基體也在隨后的步驟中被滅菌。因而，在一個實施方案中，方法包括制備如前所述的基體、將如此制備的基體裝入柱內(nèi)、和將如此制備的基體滅菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員在適合條件下易進(jìn)行滅菌，例如熱處理、輻射、或任何其它常規(guī)使用的方法。
如前式所示，在不固定的狀態(tài)下，本發(fā)明所述的配體包括一個叔胺其構(gòu)成一個結(jié)合到載體上的適合的柄，因而產(chǎn)生包括季胺和苯基基團的結(jié)合配體。因此，固定時，本發(fā)明所述的配體被認(rèn)為是多模態(tài)陰離子交換配體，因為除正電荷季胺基團外它也包括疏水性的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。將配體固定到多孔或非多孔表面的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，參見親和力配體固定技術(shù)，Hermanson等人，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。在一個實施方案中，載體表面上配體密度是接近常規(guī)離子交換基質(zhì)一般所用的范圍。
在一個優(yōu)選實施方案中，配體結(jié)合到載體是通過引進(jìn)載體和連接基團之間的連接基團。結(jié)合可以根據(jù)任何常規(guī)共價結(jié)合方法例如通過使用表氯醇、表溴醇、烯丙基-縮水甘油醚、雙環(huán)氧化物如丁二醇二環(huán)氧甘油醚、鹵素取代的脂肪族物質(zhì)如二氯丙醇、和二乙烯基砜來進(jìn)行。這些方法都是本領(lǐng)域眾所周知的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員易進(jìn)行。
在一個特別的實施方案中，本發(fā)明所述的配體通過也稱作擴展器的更長的連接基團分子結(jié)合到載體上。擴展器是本領(lǐng)域眾所周知的，一般用于增加配體和載體間的空間距離。擴展器有時表示為觸角或可伸縮臂，對于可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)描述參見US6,428,707，其通過引用在此處被包含。簡單扼要地，擴展器可以是聚合物的形式例如均聚物或共聚物。親水性聚合的擴展器可以是合成起源即用合成的骨架，或生物起源即使用天然存在的骨架的生物聚合物。典型合成的聚合物是聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醚等。典型的生物聚合物是多糖例如淀粉、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖。
載體可以由有機材料或無機材料制成，并可以是多孔的或非多孔的。在一個實施方案中，載體由天然聚合物制備，例如交叉結(jié)合的糖類材料如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、魔芋膠、卡拉膠、結(jié)冷膠、藻朊酸鹽、果膠、淀粉等。天然聚合物載體易制備并任選根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法如逆懸浮膠凝作用(S HjerténBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964))交叉結(jié)合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，載體是一種相對剛性但多孔的瓊脂糖，其通過增強流動性質(zhì)的方法制備，參見US6,602,990(Berg)或SE0402322-2(Berg等人.)。在一個可選的實施方案中，載體由合成的聚合物或共聚物制成，例如交叉結(jié)合的合成聚合物如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。這種合成的聚合物易制備并任選根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法交叉結(jié)合，參見“懸浮聚合擴展的苯乙烯基聚合物載體”(RArshadyChimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。天然的或合成的聚合物載體也可以利用商業(yè)來源例如GEHealthcare，Uppsala，Sweden的，比如多孔顆粒形式。在另一個可選的實施方案中，載體由無機聚合物制成，例如硅石。無機的多孔和非多孔載體是本領(lǐng)域眾所周知的并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法是容易制備的。
此分離基體適合的顆粒大小可以是5-500μm直徑范圍，例如10-100μm，例如20-80μm。在基本上球形顆粒的情形中，平均顆粒大小可以在5-1000μm范圍內(nèi)，例如10-500μm。在一個特別的實施方案中，平均顆粒大小是在10-200μm范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所用方法能容易選擇適合的顆粒大小和孔隙率。例如，對于大規(guī)模處理，出于經(jīng)濟原因，可優(yōu)選更多孔但剛性的載體以允許大體積處理，特別是對于捕獲步驟。在色譜法中，方法參數(shù)如柱的大小和形狀將影響選擇。在膨脹床方法中，基體一般含有高密度填充物，優(yōu)選不銹鋼填充物。對于其它方法，其它標(biāo)準(zhǔn)可影響基體的性質(zhì)。
因而，本發(fā)明的第二個方面是包括結(jié)合在載體上的前述配體的分離基體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，每個載體一般包括多個配體。在一個特別的實施方案中，載體包括結(jié)合了第二種配體的前述配體，其中發(fā)明所述的配體占總配體量的至少約30％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約70％和最優(yōu)選至少約90％。這種結(jié)合的配體分離基體可以為特殊情形而設(shè)計，其中進(jìn)一步相互作用的因素改善了它的分離性質(zhì)。第二種配體可以包括一種或多種帶電基團，例如通過電荷排斥洗脫化合物的陽離子交換劑、疏水性基團、能結(jié)合氫的基團、親和力基團或類似物。
在第一個實施方案中，發(fā)明所述的基體是顆粒的形式，例如基本上球形的、伸長的或不規(guī)則形狀的顆粒。在一個特別的實施方案中，分離基體被干燥，例如干燥的顆粒其使用前浸在液體中以保持原始形狀。在一個說明性的實施方案中，這種干燥的分離基體由干燥的瓊脂糖顆粒組成。然而，發(fā)明所述的基體可任選分離中常規(guī)使用的其它任何形狀，例如單塊、過濾器或膜、毛細(xì)管、薄片、表面等。因此，在第二個實施方案中，基體包括膜狀結(jié)構(gòu)，例如單膜、許多膜或過濾器。
本發(fā)明的第三個方面是前面所述分離基體的使用。在第一個實施方案中，本發(fā)明在蛋白純化中使用如前所述的分離基體。在此使用的優(yōu)選實施方案中，蛋白是抗體、抗體片段、或包括抗體的融合蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明在任何其它化合物的分離中使用如前所述的分離基體，舉例來說選自由多肽，核酸例如DNA、RNA或其寡核苷酸、質(zhì)粒，病毒，朊病毒，細(xì)胞例如原核或真核細(xì)胞，脂類，糖類，有機分子例如小的有機分子，藥靶，診斷標(biāo)記分子組成的組。將在下面更詳細(xì)地討論使用。在另一個實施方案中，本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)中使用如前所述的分離基體作為載體，即固定細(xì)胞在表面生長。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在此應(yīng)用中，術(shù)語分離用作化合物的純化、離析和去除，但它也包括目標(biāo)化合物的識別例如為了診斷目的。
本發(fā)明的第四個方面是分離方法，其中通過將含所述液體樣本的流動相與如前所述的分離基體接觸來從液體樣本的一種或多種其它化合物中分離出所要化合物例如抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明是利用液相色譜的原理進(jìn)行的，即用流動相流經(jīng)含發(fā)明所述分離基體的色譜柱。在另一個可選的實施方案中，本發(fā)明是使用分批式色譜方法進(jìn)行的，其中分離基體加到含液體樣本的管中。在一個特別的實施方案中，加到分批模式中的分離基體包括干燥的顆粒，例如干燥的瓊脂糖顆粒。在另一個實施方案中，方法是利用膨脹床色譜原理進(jìn)行的即將流動相加至膨脹床如液化床上，其中的分離基體是含高密度填充物的基本上球形顆粒形式。
在本方法的第一個實施方案中，不想要的化合物吸附到分離基體上與此同時想要的化合物例如抗體留在流動相中沒有被吸附。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，所吸附的化合物的性質(zhì)和同一性將取決于液體樣本的來源。想要抗體不被吸附的實施方案中所吸附化合物的例子是細(xì)胞和細(xì)胞碎片，蛋白和肽，核酸例如DNA和RNA，內(nèi)毒素，病毒，培養(yǎng)基的殘留物等。在一個特別的實施方案中，此分離基體裝在色譜柱中并且流動相通過重力和/或泵入流經(jīng)所述柱，流經(jīng)柱時抗體被回收。因為，此實施方案的一個優(yōu)點是不需要從柱中洗脫抗體產(chǎn)品。從方法角度看避免特別的洗脫步驟是有吸引力的，因為越少的步驟將導(dǎo)致更快速的純化方法并因此減少方法成本。另外抗體對某些條件是敏感的，例如會削弱它們的折疊型或通過破壞肽鍵降解它們。因而，即使一般而言陰離子交換劑的洗脫條件不包括極端的化學(xué)制品，但鹽和/或pH的變化可能影響敏感的抗體，各種類間影響根據(jù)pI、電荷分布等有變化。因此，此實施方案的另一個優(yōu)點是避免加入洗脫液和將洗脫條件應(yīng)用到所要的化合物上。為了得到化合物吸附最適合的條件，液體樣本與適合的緩沖液或其它液體結(jié)合以提供流動相。本實施方案在陰離子交換色譜的常規(guī)條件下方便試驗，其一般包括在相對低鹽濃度下吸附。因而，在本方法的一個實施方案中，流動相的傳導(dǎo)率在0-25范圍內(nèi)，例如10-15mS/cm。在一個實施方案中，流動相的pH大約是5-6。如果想要釋放吸附的化合物，例如重新使用基體，可在更高鹽濃度下進(jìn)行洗脫例如通過使用漸增的鹽梯度。pH值也可或可選被變換例如漸減的pH梯度以洗脫吸附的化合物。
在本方法第二個并可選的實施方案中，想要的化合物如在常規(guī)液相色譜中一樣吸附到基體上。然后基體可在產(chǎn)品選擇性洗脫之后被重新使用。通過將適當(dāng)緩沖液流經(jīng)柱易進(jìn)行洗脫。如果需要，可在任何這種流經(jīng)前或之間應(yīng)用一種或多種洗滌步驟。在一個實施方案中，此實施方案的操作條件與常規(guī)離子交換中一樣，即如前所述使用低傳導(dǎo)率的流動相吸附并使用高傳導(dǎo)率的緩沖液洗脫。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易通過試驗不同的條件來調(diào)整條件和分析吸附的化合物及流經(jīng)。在一個特別的實施方案中，想要的化合物是抗體。
在前面的第一個和第二個實施方案間選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過控制pH和/或傳導(dǎo)率能容易改變條件以吸附特定的化合物。例如，在抗體的分離中，不同種類的抗體具有不同的電荷和電荷分布圖，其以分離為目的共同決定更優(yōu)選吸附抗體還是讓它們不被吸附流過柱。
根據(jù)本發(fā)明一個實施方案分離的抗體可來自任何眾所周知的來源，例如表面培養(yǎng)的或來自發(fā)酵罐或管中分批或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞。因而，在一個實施方案中，液體是從細(xì)胞發(fā)酵中獲得的上清液。抗體需要從中被分離出的化合物的例子蛋白，DNA，病毒，內(nèi)毒素，營養(yǎng)素，細(xì)胞培養(yǎng)基的組分例如消泡劑和抗生素，和產(chǎn)品有關(guān)的雜質(zhì)例如錯誤折疊的種類和聚集體。流動相和此分離基體間接觸的步驟，即吸附步驟，可在機械過濾、離心和/或色譜步驟之后。例如，如果液體樣本是發(fā)酵肉湯，則方便在使用此基體的步驟前機械除去細(xì)胞碎片、完整的細(xì)胞和其它相對大的組分。
在一個實施方案中，本方法設(shè)立純化的捕獲步驟。在一個特別的實施方案中，液體樣本是粗飼料其在與發(fā)明所述色譜基體接觸前被過濾。因此，此實施方案還設(shè)立捕獲步驟，即使液體樣本已通過機械手段被預(yù)純化。眾所周知，產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞也包括許多一般稱作宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的其它蛋白。這種HCP包括酶如蛋白酶和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的其它蛋白。因而，在一個實施方案中，液體樣本的所有宿主細(xì)胞蛋白通過本方法被充分除去，例如通過吸附到分離基體上。
在一個可選的實施方案中，本方法在洗滌方法中被用作第二個、第三個或甚至第四個色譜步驟，例如中間純化或磨光步驟。因而，在一個實施方案中，應(yīng)用于此分離基體的流動相包括來自分離基體的含抗體的洗出液。在一個實施方案中，液體樣本是來自前面親和力色譜基體的洗出液。在一個優(yōu)選的實施方案中，獲得洗出液的分離基體包括一種或多種Fc-結(jié)合蛋白配體，例如蛋白A配體。術(shù)語蛋白A配體在此上下文中包括天然的及重組的蛋白A，或其功能片段。在此上下文中，術(shù)語“功能”片段意指保留蛋白原始結(jié)合性質(zhì)的片段。這種親和力基質(zhì)是商用的，例如來自GE Healthcare的MabSelectTM。因此，在此實施方案中，除去的優(yōu)選吸附的化合物可以是選自由釋放蛋白A，蛋白A和抗體形成的復(fù)合體例如每個蛋白A分子可包括許多抗體的蛋白A-MAb復(fù)合體、例如與一個蛋白A分子復(fù)合的2-4個抗體，和釋放蛋白A或抗體的聚集體組成的組中的一種或多種。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，根據(jù)前面步驟所用的特定條件例如親和力色譜，洗出液可通過適合的添加或調(diào)整來調(diào)節(jié)。因而，洗出液與適合的緩沖液或液體結(jié)合以提供流動相。
本方法用于分離任何單克隆或多克隆抗體，例如來自哺乳動物宿主如鼠、嚙齒動物、靈長類動物和人的抗體或來自雜交瘤的抗體。在一個實施方案中，分離的抗體是人的或人源化的抗體。抗體可以是任何種類，即選自由IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM組成的組。在一個實施方案中，抗體是能結(jié)合蛋白A、或含F(xiàn)c的抗體片段或融合蛋白的抗體。在一個特別的實施方案中，抗體是免疫球蛋白G(IgG)，例如IgG1。在一個實施方案中，本方法用于純化pI在6-9范圍內(nèi)的抗體，例如7-8范圍內(nèi)。在一個特別的實施方案中，純化抗體pI約為9。在此上下文中，術(shù)語“抗體”理解為也包括抗體片段和任何包括抗體或抗體片段的融合蛋白。因而，本發(fā)明也包括前述抗體和含這種抗體的融合蛋白中任一種的片段的分離。在一個實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一個特別的實施方案中，抗體是人源化的抗體。
如前面所示，在本方法中，回收未吸附抗體充分純的級份。在此上下文中，術(shù)語“充分純”理解為意指所有非抗體化合物已充分除去。最有利地，在此分離基體上除去雜質(zhì)總量的至少約80％，例如至少約95％即95-100％間，例如至少約98％即98-100％間和優(yōu)選至少約99％即99-100％間。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所致，獲得的純度將取決于應(yīng)用于分離基體上液體樣本中抗體的濃度及其它所用條件。因而，在一個實施方案中，根據(jù)本方法分離的抗體是治療級抗體。因而，根據(jù)發(fā)明純化的抗體用于研究和抗體藥品的制備例如MAb藥品。純化抗體的一個可選用途是用于診斷。此外，純化抗體也用于食品產(chǎn)品例如用于人的食品添加劑。例如，根據(jù)本發(fā)明純化的牛抗體用于食品產(chǎn)品。
在本方法的一個特別實施方案中，此分離基體作為一次性色譜柱或一次性過濾器被提供。在治療化合物如抗體的純化方法中使用一次性產(chǎn)品的優(yōu)點是能避免兩個不同步驟間的交叉污染。因而，在一個實施方案中，此分離基體作為無菌的色譜柱或過濾器被提供。在一個實施方案中，本方法是分批式進(jìn)行的，其中一次性分離基體加到裝有含被回收抗體的液體的管中。于是所用基體可以不是否所吸附化合物，其從安全角度看又是有利的因為化合物例如內(nèi)毒素和/或某些宿主細(xì)胞蛋白不需要進(jìn)一步處理。在一個可選的實施方案中，此基體作為一次性產(chǎn)品裝在色譜柱內(nèi)其用于吸附抗體的模式。在一個優(yōu)選的實施方案中，柱和基體已被滅菌以允許使用者在無菌或甚至消過毒的條件下純化抗體產(chǎn)品。
第二個方面，本發(fā)明涉及用于從液體的一種或多種其它組分中純化抗體的試劑盒，其試劑盒包括在分隔格內(nèi)的裝有如前所述分離基體的色譜柱、一種或多種緩沖液、和所寫的說明書。分離基體可以是如前所述。所述說明書詳細(xì)描述了上文定義的方法。
附圖詳述圖1顯示了原型配體N-芐基-N-甲基乙醇胺通過氮原子固定到珠子形式的載體上的。結(jié)合的配體在左邊顯示用示意圖所畫的連接基團，而在右邊用說明性的親水性連接基團。在實驗部分，原型配體結(jié)合6％瓊脂糖基體SepharoseTM6FF(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。
圖2顯示含50mg Mab1的樣本在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)、pH6.5中應(yīng)用于含固定于SepharoseTM6FF(901035A)的N-芐基-N-甲基乙醇胺配體、固定于Sepharose6FF的N，N-二甲基芐胺和Q SepharoseTMFF的分離基質(zhì)的色譜圖。用25mM Bis-Tris、0.5mM NaCl、pH6.5進(jìn)行洗脫。
圖3a)和b)顯示用mAb1-重組蛋白A在原型上進(jìn)行的色譜的結(jié)果。緩沖液A是25mM Bis-Tris、50mM NaCl、pH6.0。傳導(dǎo)率約7mS/cm。緩沖液B，0.5M醋酸鈉、pH4.0，用于洗脫。流速是0.5mL/min(150cm/h)。樣本是10mg Mab1，0.10mg重組蛋白A，濃度為4mg/mlMab1和1％重組蛋白A(W/W)。3a)參考Q SepharoseTMFF；b)N-芐基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)。
圖4a)-c)顯示樣本使用Mab1、1％重組蛋白A及從圖3的色譜試驗中匯集的流經(jīng)級份和洗出液級份的分析尺寸排阻色譜(SEC)結(jié)果。藍(lán)色曲線是流經(jīng)(FT)級份，紅色是洗出液。更明確的，圖4a)顯示含4mg/mL Mab1、0.04mg/mL即1％(W/W)重組蛋白A的樣本；4b)顯示圖3a)Q SepharoseTMFF中的FT和洗出液；4c)顯示圖3b)N-芐基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)中的FT和洗出液。
實驗部分本實施例僅為說明性目的而提供，不應(yīng)以任何方式解釋為限制如提交的權(quán)利要求書所定義的發(fā)明范圍。
實施例1發(fā)明所述分離基體的制備BMEA Sepharose Fast Flow的制備發(fā)明所述分離基體的制備方法的一個實施方案如下所示，從交聯(lián)的瓊脂糖凝膠(SepharoseTM6 Fast Flow，GE Healthcare，Uppsala，Sweden)開始。
A.基體上烯丙基基團的引入用烯丙基縮水甘油醚活化Sepharose 6 Fast Flow如下100mlSepharose 6 Fast Flow被吸干，與0.3g NaBH4、12g Na2SO4及35ml 50％NaOH水溶液混合?；旌衔镌?0℃下攪拌1小時。加入100ml烯丙基縮水甘油醚后，懸浮液在50℃下再有力攪拌16小時。混合物過濾后，相繼用500ml蒸餾水、500ml乙醇、200ml蒸餾水、200ml 0.2M醋酸和500ml蒸餾水洗滌凝膠。
滴定至0.22mmol烯丙基/ml凝膠的取代度。
B.通過溴化作用活化烯丙基Sepharose 6 Fast Flow溴加入50ml烯丙基活化的Sepharose 6 Fast Flow(0.22mmol烯丙基基團/ml瀝干的凝膠)、1g醋酸鈉和15ml蒸餾水的攪拌過的懸浮液中，直至獲得持久的黃色。再加入甲酸鈉直至懸浮液完全脫色。反應(yīng)混合物被過濾并且用500ml蒸餾水洗滌凝膠。活化的凝膠再直接轉(zhuǎn)移到一個反應(yīng)管中進(jìn)一步與N-芐基-N-甲基乙醇胺反應(yīng)。
C.活化基體上BMEA(N-芐基-N-甲基乙醇胺)基團的引入胺基團直接通過胺基團的氮原子引入到基體上。在一個典型的過程中，與基體的結(jié)合通過烯炳基基團的溴和親核取代在基本條件下實現(xiàn)。25ml溴活化的凝膠(0.22mmol烯丙基基團/ml瀝干的凝膠)轉(zhuǎn)移至含N-芐基-N-甲基乙醇胺溶液(16.0ml)的反應(yīng)瓶中。加入5ml水并用氫氧化鈉溶液將反應(yīng)溶液pH調(diào)整至12.0。在50℃攪拌下反應(yīng)16小時。凝膠反應(yīng)混合物過濾后，相繼用3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5HCl水溶液和最后3×10ml蒸餾水洗滌。BMEA Sepharose Fast Flow凝膠得到0.15mmol胺/ml凝膠的取代程度。
實施例2流經(jīng)中抗體的純化實施例2A)配置在非結(jié)合條件下，含約50mg mAb1的樣本以約5mS/cm和12mS/cm裝到原型901035A(N-芐基-N-甲基乙醇胺)上。在5，10和15柱體積(CV)時收集流經(jīng)級份(FT)。匯集洗脫峰級份。FT級份分析HCP和蛋白A含量。
為了確認(rèn)色譜實行不是唯一針對某一特殊的mAb，用含mAb2的樣本在pH6.0和約12mS/cm下重復(fù)試驗色譜。原型的實行首先用分析的SEC評價。選出的級份分析HCP和蛋白A含量。用SEC篩級份后，選出的級份送至HCP和蛋白A含量分析。
為了檢驗原型的重組蛋白A清除率，用1％(w/w)重組蛋白A(rPrA)強化MAb1。用對應(yīng)10mg MAb1、pH6.0的1％重組蛋白A和傳導(dǎo)率約7mS/cm的一個樣本量注入原型。流經(jīng)級份和洗出液級份分別匯集并用SEC分析。
材料/研究單位柱和凝膠從GE Healthcare，Uppsala，Sweden獲得HiPrepTM26/10脫鹽目錄號17-5087-01CV＝53.09mlTricornTM5/50目錄號18-1163-09CV＝1mlHR5/5TM目錄號18-0338-01CV＝1mlSuperdexTM200 10/300 GL，目錄號17-5175-01CV＝23.56ml儀器色譜體系KTAExplorerTM10分光光度計Spectra MAX plus化學(xué)制品所有化學(xué)制品均是分析級。水是MilliQ過濾的。
色譜介質(zhì)Q SepharoseTMFast Flow(FF)(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。分離基質(zhì)的配體是如下面表1所述的原型。
表1配體

樣本使用兩種不同的人源化IgG抗體，亞綱1，表示為MAb1和Mab2，消光系數(shù)分別為1.46和1.50。兩種抗體均在CHO培養(yǎng)物中表達(dá)并隨后在本實驗之前用常規(guī)蛋白A親和力色譜純化。
緩沖液交換在HiPrepTM脫鹽柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上被制得，用感興趣的緩沖液平衡，通過用SuperloopTM(GEHealthcare，Uppsala，Sweden)注入大約體積(5-15mL)。流速為5mL/min并收集5mL級份。為了根據(jù)方程式1計算濃度，匯集含洗脫峰的級份并重復(fù)測定280nm下的吸光度A280＝ε·C·l (Eqn 1)其中 A280是280nm下的吸光度。
ε(mL*mg-1*cm-1)是特別蛋白的消光系數(shù)。
C(mg/mL)是蛋白濃度。
l是路徑長度。
在SuperdexTM200 10/300柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上以0.5mL/min流速進(jìn)行尺寸排阻色譜(SEC)。緩沖液是PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)，從片劑(Sigma，P-4417)制備的，10mM磷酸鹽、0.137M NaCl、2.7m MKCl、pH7.4。
方法平衡2/0.1CV2CV 第一次使用0.1CV試驗間樣本注射50μl等度洗脫1.5CV使用mAB的原型的色譜緩沖液A是25mM Bis-Tris，pH6.0或6.5。為了想要的傳導(dǎo)率約5mS/cm或12mS/cm，包括35mM或100mM NaCl。洗脫緩沖液(緩沖液B)是25mM Bis-Tris、0.5M NaCl、pH6.5。流速是0.5mL/min(150cm/h)。
方法 平衡5CV 緩沖液A樣本注射5-25mL樣本含20mg或50mg mAB洗滌5CV 緩沖液A梯度洗脫10CV 0-100％緩沖液B洗脫10CV 100％緩沖液B回收5CV 緩沖液A使用MAb-重組蛋白A的原型的色譜緩沖液A是25mM Bis-Tris，pH6.0。通過添加50mM NaCl，傳導(dǎo)率約為7mS/cm。緩沖液B是0.5M醋酸鈉，pH4.0。流速是0.5mL/min(150cm/h)。樣本濃度是4mg/mL MAb1-0.04mg/mL即1％(W/W)rPrA。
方法 平衡5CV 緩沖液A樣本注射2.5mL10mg MAb，1％ rPrA洗滌5CV 緩沖液A梯度洗脫10CV 0-100％緩沖液B洗脫10CV 100％緩沖液B回收5CV 緩沖液ACIP(適當(dāng)清除)在每次色譜試驗后，原型和參考基體Q SepharoseTMFF進(jìn)行以下CIP步驟；30％異丙醇5CV(柱體積)H2O 5CV1.0M NaOH 4CV(包括15分鐘暫停)H2O 5CV緩沖液A 5CVH2O 5CV20％EtOH 5CV蛋白A分析選出的級份與比例為800μlSPA樣本稀釋液+200μl樣本的SPA樣本稀釋液混合?；旌虾螅壏菰诩訜釁^(qū)段99℃下加熱10分鐘，然后再次混合。然后樣本被分析重組蛋白A。
宿主細(xì)胞蛋白(HCP)分析樣本(最少600μl)被分析HCP含量。更低的檢測界限是10ng/mL。
實施例2B)在原型配體N-芐基-N-甲基乙醇胺(901035A)上純化含MAb1的樣本含50mg_MAb1的樣本在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)、pH6.5中應(yīng)用于固定在如前面實施例1所述制備的SepharoseTM6FF(901035A)和參考基體Q SepharoseTMFF上的N-芐基-N-甲基乙醇胺。用25mM Bis-Tris、0.5M NaCl、pH6.5進(jìn)行洗脫。
實施例2的色譜圖如圖2所示，其顯示原型N-芐基-N-甲基乙醇胺SepharoseTM6FF(901035A)相比于Q SepharoseTMFF。選來分析的流經(jīng)(FT)級份用箭頭指示。下面表2和表3所示的HCP和蛋白A清除的結(jié)果顯示原型在那方面優(yōu)于Q SepharoseTMFF。
表2HCP分析結(jié)果

表3PrA分析結(jié)果

實施例3流經(jīng)時在原型配體N-芐基-N-甲基乙醇胺上從含MAb1和重組蛋白A(rPrA)的樣本中純化MAb1在此實施例中，用含mAb1-重組蛋白A的樣本進(jìn)行原型色譜。緩沖液A是25mM Bis-Tris、50mM NaCl、pH6.0。傳導(dǎo)率約7mS/cm。緩沖液B是0.5M醋酸鈉、pH4.0。流速是0.5mL/min(150cm/h)。樣本是10mgMab1，0.10mg重組蛋白A，濃度為4mg/ml mAb1和1％重組蛋白A(W/W)。結(jié)果如圖3所示。
最后，用mAb1、1％rPrA和匯集的來自圖4中色譜試驗的流經(jīng)級份和洗出液級份在樣本上進(jìn)行分析的SEC。結(jié)果如圖4所示。圖4a中，陰影峰是MAb1-蛋白A的復(fù)合體。藍(lán)色曲線是流經(jīng)(FT)級份而紅色是洗出液。
實施例4吸附模式4A)配置為了檢驗BMEA Sepharose Fast Flow(BMEA；N-芐基-N-甲基乙醇胺)在吸附模式中的選擇性，人IgG和8種不同的蛋白的保持時間被檢驗。結(jié)果與商用陰離子交換劑Q Sepharose Fast Flow對比。檢驗方法的原理是將蛋白注入用緩沖液A(含哌嗪作為緩沖組分)平衡的HR5/5柱(含固定在SepharoseTMFast Flow上的BMEA配體)中。鹽梯度用來洗脫蛋白(參見下面的方法)。
材料/研究單位柱和Q Sepharose Fast Flow從GE Healthcare，Uppsala，Sweden獲得。
HR5/5TM目錄號18-0338-01柱體積(CV＝1mL)儀器色譜體系KTAExplorerTM10化學(xué)制品和樣本蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、α-乳清蛋白、肌紅蛋白、乳鐵蛋白、核糖核酸酶A和細(xì)胞色素C購自Sigma而人IgG(Gammanorm)購自O(shè)ctapharma。蛋白以1-10mg/ml的濃度溶解于緩沖液A中。Q Sepharose Fast Flow從GE Healthcare，Uppsala，Sweden獲得。所有所用化學(xué)制品是分析級并且所用水是MilliQ過濾的。
色譜在應(yīng)用100μl樣本溶液前柱用緩沖液以0.6ml/min的流速平衡。一次僅分析一個蛋白。蛋白通過從緩沖液A到緩沖液B的線性梯度用21個柱體積的梯度體積洗脫(參見下面的方法)。緩沖液A是25mM哌嗪、pH10.0而緩沖液B是25mM哌嗪、1.0M NaCl、pH10.0。所有試驗中檢測280nm下吸光度。
方法平衡 5CV緩沖液A樣本注射 100μl(約0.2mg蛋白)梯度 21CV100％緩沖液B梯度后等度5CV緩沖液A結(jié)果為了證明BMEA配體是否選擇性與免疫球蛋白相互作用，人IgG應(yīng)用于裝有新介質(zhì)的1ml柱(HR5/5)。另外，也應(yīng)用蛋白卵清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、α-乳清蛋白、肌紅蛋白、乳鐵蛋白、核糖核酸酶A和細(xì)胞色素C。結(jié)果與從Q Sepharose Fast Flow觀察到的蛋白保持時間對比。Q Sepharose Fast Flow是強陰離子交換劑并用作參考的陰離子交換劑，因為它具有相同的載體基體(載體材料，珠子大小，孔大小，孔體積，組裝過程等)和基本具有相同的取代程度(測得的離子交換容量)。如表1所示，BMEA Sepharose Fast Flow與Q Sepharose Fast Flow相比更強烈阻滯所有研究的蛋白。此外，IgG是用BMEA Sepharose Fast Flow保持時間最長的蛋白(表1)。這反映了與BMEA介質(zhì)結(jié)合比與Q Sepharose Fast Flow結(jié)合要強得多。與Q Sepharose Fast Flow相比，使用BMEA Sepharose Fast Flow時IgG的保持時間增加了27.3分鐘(表1)。這些結(jié)果清楚顯示了BMEASepharose Fast Flow能以選擇的方式用于捕獲及洗脫IgG。
表1不同蛋白在Q Sepharose Fast Flow和BMEA Sepharose FastFlow上的保持時間(tr)

na＝未分析X觀測到兩個峰
權(quán)利要求
1.一種由下列式R1-R2-N(R3)-R4-R5定義的色譜配體其中R1是取代的或未取代的苯基基團；R2是包括0至4個碳原子的烴鏈；R3是包括1至3個碳原子的烴鏈；R4是包括1至5個碳原子的烴鏈；且R5是OH或H。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配體，其中R1、R2、R3和R4中的一個或多個是被OH取代的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的配體，其中R1是未取代的苯基基團。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的配體，其中R2是-CH2-。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的配體，其中R3是-CH3。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的配體，其中R4是-CH2-CH2-CH2-或-CH2-CH2-。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的配體，其包括N-芐基-N-甲基乙醇胺。
8.一種制備分離基體的方法，所述方法包括將多個權(quán)利要求1-7任一項所述的配體固定到載體上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中配體通過胺基團被固定。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中載體是多孔的。
11.一種分離基體，所述基體包括偶聯(lián)于載體上的權(quán)利要求1-7任一項所述的配體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基體，其中載體包括顆粒，例如基本上球形的顆粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離基體，其中載體包括膜結(jié)構(gòu)。
14.一種制備色譜柱的方法，所述方法包括制備如權(quán)利要求11或12所述的基體；將如此制備的基體裝入柱內(nèi)；和將含基體的柱滅菌。
15.一種制備分離膜的方法，所述方法包括制備如權(quán)利要求13所述的膜；和將膜滅菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一項所述的分離基體在蛋白純化中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中蛋白是抗體、抗體片段、或含抗體的融合蛋白。
18.一種在液體樣本中將一種或多種抗體與一種或多種其它化合物分離開的方法，其中將包含所述抗體和化合物的流動相與權(quán)利要求11-15任一項所述的分離基體接觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中分離基體裝在色譜柱內(nèi)，移動相通過重力和/或泵作用通過所述柱，和抗體在柱的流經(jīng)中被回收。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中液體樣本包括從細(xì)胞發(fā)酵中獲得的上清液。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項所述的方法，其中機械過濾和/或色譜的步驟在與分離基體的接觸之前。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21任一項所述的方法，其中液體樣本包括天然飼料。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-22任一項所述的方法，其中吸附的化合物是宿主細(xì)胞蛋白并且基本上所有所述蛋白吸附于分離基體上。
24.一種用來在液體中從一種或多種其它組分純化抗體的試劑盒，所述試劑盒包括在分隔格內(nèi)的裝有權(quán)利要求11-15任一項所述分離基體的色譜柱、一種或多種緩沖液和所寫的說明書。
25.一種用來純化抗體的一次性色譜柱，所述色譜柱包括權(quán)利要求11-15任一項所述的分離基體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的色譜柱，其中所述色譜柱已被滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由下列式(I)R
文檔編號B01D15/32GK101060931SQ200580036147
公開日2007年10月24日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者C·恩格斯特蘭德, A·福爾斯, G·格拉德, B·-L·約翰森, H·J·約翰森, J·-L·馬洛伊塞爾 申請人:通用電氣健康護理生物科學(xué)股份公司