專(zhuān)利名稱(chēng)：用作分離介質(zhì)的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于毛細(xì)管電泳的分離介質(zhì)。
背景技術(shù)：
在生物學(xué)相關(guān)科學(xué)中，凝膠電泳是一種使用最為廣泛的分離技術(shù)。在外加電場(chǎng)的作用下，通過(guò)使帶電分子類(lèi)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、核酸和寡核苷酸，在緩沖介質(zhì)中發(fā)生遷移將它們分離開(kāi)。通常，將緩沖介質(zhì)與一種低到中等濃度的適合的凝膠劑一起使用，以促進(jìn)分離，并且將被分離物質(zhì)發(fā)生混合的機(jī)率降低到最小。
直到最近，電泳分離才在凝膠板或者開(kāi)放式凝膠床上進(jìn)行，其通常是由瓊脂糖或交聯(lián)的聚丙烯酰胺材料構(gòu)成。近來(lái)，使用聚合物凝膠或溶液作為分離介質(zhì)的毛細(xì)管電泳(CE)已被用于帶電分子如DNA的分離。毛細(xì)管電泳技術(shù)和光度檢測(cè)方法的聯(lián)合使用為帶電分子的自動(dòng)化操作以及快速定量分析提供了可能性。而且，相對(duì)于傳統(tǒng)的平板電泳方法，毛細(xì)管電泳能在使用很少量的樣品、凝膠(或聚合物溶液)和緩沖劑的情況下提供樣品的定量信息。并且，已實(shí)現(xiàn)了對(duì)帶有不同有效電荷的帶電大分子的高分辨率分離。
通常，毛細(xì)管電泳所用的毛細(xì)管柱是由熔融石英管制備得到的，其直徑大約在25μm到200μm之間，長(zhǎng)度為大約30cm到大約200cm。毛細(xì)管柱內(nèi)充滿了凝膠或溶液分離介質(zhì)和緩沖劑。電泳技術(shù)被用于分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)。
在CE中，分離介質(zhì)是最重要的參數(shù)之一，因?yàn)樗鼪Q定帶電分子類(lèi)物質(zhì)(如DNA片段)的遷移特征，包括分辨率。目前，聚合物溶液被廣泛用于這樣的分離介質(zhì)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種合成的親水均聚物，同時(shí)作為DNA分離介質(zhì)已進(jìn)行了驗(yàn)證。這些均聚物包括線性聚丙烯酰胺(LPA)；和烷基取代的衍生物，如聚-N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚-N-丙烯?；被?乙氧基乙醇(PAAEE)、聚丙烯?；被?PAAP)、聚(丙烯?；被已趸?乙基吡喃葡糖苷(PAEG)、聚乙二醇(PEG)、和聚環(huán)氧乙烷(PEO)。
電泳界非常認(rèn)同高度纏結(jié)的LPA溶液通常能提供最佳的測(cè)序(sequencing)分離，能分離長(zhǎng)達(dá)1300個(gè)堿基的片段中只有一個(gè)堿基不同的DNA分子(Zhou et al.，Anal.Chem.721045-52(2000))。認(rèn)為L(zhǎng)PA良好的性能部分是由于它的親水性。
盡管LPA為長(zhǎng)讀測(cè)序(long read sequencing)能提供良好的DNA分離，但是它有要求使用穩(wěn)定毛細(xì)管壁涂層的缺點(diǎn)。該毛細(xì)管壁涂層要求能抑制電滲流(electro-osmotic flow)(EOF)，并防止被分析物的吸收。電滲流的產(chǎn)生是由于分離介質(zhì)不能直接同毛細(xì)管內(nèi)壁連接。在分離過(guò)程中施加電場(chǎng)，這個(gè)問(wèn)題嚴(yán)重的電滲流就會(huì)出現(xiàn)。通過(guò)將可溶緩沖離子吸附到毛細(xì)管壁的帶電表面可形成雙電層。毛細(xì)管壁附近的溶液中，離子局部濃度過(guò)大，這將導(dǎo)致在鄰近毛細(xì)管壁的部位保持電荷中性。最終結(jié)果是在電泳過(guò)程中，在帶電通道壁會(huì)形成液體的整體流動(dòng)。電滲流導(dǎo)致令人極不滿意的分離結(jié)果。
旨在防止EOF產(chǎn)生的傳統(tǒng)方法包括導(dǎo)入化合物，在將分離介質(zhì)注入毛細(xì)管之前，該化合物能結(jié)合到毛細(xì)管壁的內(nèi)表面上。如授予Shieh的美國(guó)專(zhuān)利No.5,447,617描述了將聚丁二烯共價(jià)結(jié)合到毛細(xì)管的內(nèi)表面上，在其中引入丙烯酰胺單體，并將丙烯酰胺和聚丁二烯共聚。這種預(yù)涂層技術(shù)不僅增加成本，還產(chǎn)生如下問(wèn)題如毛細(xì)管積垢、涂層不均一、以及被涂布的毛細(xì)管的有限貯藏期限。
為避免EOF問(wèn)題的發(fā)生，親水性較低的聚合物被作為分離介質(zhì)使用。比如聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)已作為DNA測(cè)序基質(zhì)使用。由于PVP能動(dòng)態(tài)涂布毛細(xì)管壁，避免了對(duì)于預(yù)涂布毛細(xì)管壁的需求。但是，和使用LPA獲得的分離效能相比，PVP的分離效能差的多。使用PVP僅能實(shí)現(xiàn)略大于300個(gè)連續(xù)DNA堿基的分離。PVP的限制性特征在于分離期間所用的篩選基質(zhì)和熒光染料之間的非特異性(疏水性)相互作用過(guò)高。這種相互作用使較大DNA片段的分離不清楚。
高性能分離介質(zhì)(其篩選能力高、粘度低，并具有動(dòng)態(tài)涂布能力)的開(kāi)發(fā)將有助于CE的自動(dòng)化，進(jìn)一步提高其性能。但是，具有這些特性的均聚物迄今為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。因此，不同的均聚物的混合物得以研究。
研究發(fā)現(xiàn)分子量不同的同一聚合物(如PEO，六乙基纖維素(HEC)和LPA)的混合物，以及兩種改性多糖的混合物，如瓊脂糖和HEC，對(duì)于DNA小片段和DNA大片段都具有較高的分辨率。但是，由化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的兩種聚合物混合得到的混合物，從來(lái)沒(méi)有得到成功應(yīng)用。Kim等人(Kim，Y.，Yeung，E.S.，J. Chromatogr.A.，1997，781，315-325)曾嘗試使用PEO和六丙基纖維素(HPC)的混合物來(lái)進(jìn)行DNA測(cè)序，但發(fā)現(xiàn)分離效果非常差。失敗的原因在于兩種聚合物的不相容性。
CE的另外一個(gè)挑戰(zhàn)在于將通常非常粘稠的分離基質(zhì)導(dǎo)入到狹窄的毛細(xì)管中。聚丙烯酰胺在毛細(xì)管中聚合，避免了迫使聚合物溶液進(jìn)入毛細(xì)管或者微通道的問(wèn)題。還希望在每次使用后，將“使用過(guò)的”聚合物基質(zhì)從毛細(xì)管中除去，并重新在毛細(xì)管內(nèi)填充新鮮基質(zhì)。但是，一旦聚丙烯酰胺在毛細(xì)管中聚合，聚合后的凝膠很難從毛細(xì)管中除去。
最近，具有粘度依賴特征的共聚物被應(yīng)用。這種共聚物允許低粘度狀態(tài)下介質(zhì)的加載和去除，以及高粘度狀態(tài)下的電泳分離。如基于具有低摩爾量(N-異丙基丙烯酰胺)的短的接枝物的LPA的親水骨架的基質(zhì)已被描述(Sudor et al.Electrophoresis22720-8(2001))。并且，基于N，N-二甲基丙烯酰胺和N，N-二乙基丙烯酰胺的共聚物(“P(DMA/DEA)”)的基質(zhì)也被檢測(cè)(Buchholzet al.Anal Chem 73157-64.(2001))。但是，共聚物的合成難以控制和重復(fù)，會(huì)產(chǎn)生不可靠的結(jié)果。
成功的電泳用分離介質(zhì)將包括如下特征穩(wěn)定、中性、合適的網(wǎng)孔大小、動(dòng)態(tài)涂布能力(以有效抑制電滲)、低粘度，介質(zhì)材料用量最少、同時(shí)能提供良好的分離結(jié)果和長(zhǎng)的讀長(zhǎng)(read length)。在本發(fā)明之前，能夠提供一些所需特性(如長(zhǎng)的讀長(zhǎng))的介質(zhì)，一般不同時(shí)具備其它的所需特性，如動(dòng)態(tài)涂布能力。

發(fā)明內(nèi)容
在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)(類(lèi)-IPN)，該聚合物鏈包括以主要骨架形式存在的線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈，以及聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈，LPA鏈的重均分子量是大約0.05×106到大約25×106g/mol，旋轉(zhuǎn)半徑大約是10nm到350nm；而聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈?zhǔn)窃谥饕羌躄PA存在時(shí)，通過(guò)聚合PDMA制備得到的。其中，LPA鏈和PDMA鏈彼此纏結(jié)、互穿；并且其中，該類(lèi)-IPN基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了纏結(jié)的聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，該聚合物鏈包括線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈，該P(yáng)DMA鏈纏結(jié)在LPA鏈間，并與LPA鏈互穿，其中LPA和PDMA的重均分子量大約是0.1×106到大約20×106g/mol，而旋轉(zhuǎn)半徑大約是15nm到320nm，其中該類(lèi)-IPN基本沒(méi)有化學(xué)交聯(lián)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了纏結(jié)的聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其由下述方法制備得到。該方法包括提供包括線性聚丙烯酰胺(LPA)和緩沖劑的溶液，其中該LPA重均分子量為0.05×106到25×106g/mol；提供包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和緩沖劑的溶液，其中該P(yáng)DMA的重均分子量為100,000到25×106g/mol；以分步方式將LPA/緩沖劑的溶液與PDMA/緩沖劑的溶液進(jìn)行混合，其中LPA/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到15倍，而LPA/緩沖劑溶液的體積大約是PDMA/緩沖劑溶液體積的1到50倍；其中，制備得到纏結(jié)、互穿的LPA和PDMA聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，類(lèi)-IPN基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)的方法。該方法包括在外加電場(chǎng)的影響下，使帶電分子類(lèi)物質(zhì)在分離介質(zhì)中發(fā)生遷移，其中分離介質(zhì)的改進(jìn)包括LPA聚合物體系和PMDA聚合物體系，其中該聚合體體系形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，該聚合物鏈包括以主要骨架形式存在的丙烯酰胺(AM)/二甲基丙烯酰胺(DMA)無(wú)規(guī)共聚物鏈，其重均分子量是大約0.05×106到大約2×106g/mol，旋轉(zhuǎn)半徑是大約10nm到大約80nm，聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)在該無(wú)規(guī)共聚物主要骨架存在下，聚合PDMA制備得到；其中，所述鏈彼此纏結(jié)、互穿，并且其中，該類(lèi)-IPN基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種由纏結(jié)的聚合物鏈構(gòu)成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其由如下方法制備得到，該方法包括提供一種包括AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和緩沖劑的溶液，其中AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量為0.05×106到2×106g/mol；提供一種包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和緩沖劑的溶液，其中PDMA的重均分子量為0.05×106到25×106g/mol；以分步方式將該共聚物/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液進(jìn)行混合，其中該共聚物/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到50倍，該共聚物/緩沖劑溶液的體積是PDMA/緩沖劑溶液體積的約1到20倍；其中，制備得到纏結(jié)的共聚物和PDMA聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)的方法。該方法包括在外加電場(chǎng)的影響下，使帶電分子類(lèi)物質(zhì)在分離介質(zhì)中發(fā)生遷移，其中該分離介質(zhì)的改進(jìn)包括AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和PMDA聚合物，其中，該聚合物體系形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。


圖1是樣品LPA在1×TTE緩沖溶液中的齊姆圖。該圖示出了在散射角在15°到139°，溫度為25℃時(shí)，LPA的靜態(tài)光散射測(cè)量。
圖2為樣品類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)在1×TTE緩沖溶液中的齊姆圖。該圖示出了在散射角為15°到139°，溫度為25℃時(shí)，包括LPA和PDMA的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的靜態(tài)光散射測(cè)量。
圖3示出了樣品LPA的表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑分布，其在散射角為30°，溫度為25℃，C＝3.387×10-5g/ml時(shí)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量獲得。
圖4示出了樣品類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑分布，其是在散射角為30°，溫度為25℃，C＝3.201×10-5g/ml時(shí)通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量獲得。
圖5示出了通過(guò)CE分離DNA(pGEM-3Zf(+)從-21M13上游引物)。該分離在IPN/1×TTE+7M尿素緩沖溶液中，C＝2.0％g/ml，60℃條件下進(jìn)行。毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度是34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分離在本實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行。
圖6示出了通過(guò)CE分離DNA(pGEM-3Zf(+)從-21M13上游引物)。該分離在MegaBACE LPA/1×MegaBACE緩沖液中，44℃，150V/cm的條件下進(jìn)行。毛細(xì)管的長(zhǎng)度為34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分離在本實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行。
圖7示出了通過(guò)CE分離DNA(pGEM-3Zf(+)從-21M13上游引物)。該分離在POP6/1×TTE緩沖液中，50℃，200V/cm的條件下進(jìn)行。毛細(xì)管的長(zhǎng)度為34cm，ID/OD＝75/365(μm)。分離在本實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行。
圖8示出了通過(guò)CE電泳分離DNA BigDye Terminator v3.0的末端部分(堿基數(shù)目從600到～1000)。該分離在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)/1×TTE+7M尿素緩沖溶液中，C＝2.0％g/ml，60℃的條件下進(jìn)行。儀器ABI Prism 310四色單毛細(xì)管遺傳分析儀。
圖9示出了通過(guò)CE電泳分離DNA(BigDye Terminator v3.0)的藍(lán)色-G部分。該分離在POP6/1×ABI緩沖溶液中進(jìn)行。儀器ABI Prism 310四色單毛細(xì)管遺傳分析儀，50℃，Module seqPOP6(1ml)E。毛細(xì)管ID/OD＝50/361(μm)。
圖10示出了通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)室自制測(cè)序分析儀，以2.5％類(lèi)-IPN/1×ABI緩沖液作為分離介質(zhì)，在少于～33min內(nèi)測(cè)得的660bp的四色DNA(BigDye Terminator v3.0)序列。(儀器和base calling軟件由Stony Brook大學(xué)Engineering College提供)圖11示出了通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)室自制測(cè)序分析儀，以POP7/1×ABI緩沖液作為分離介質(zhì)，在～63min內(nèi)測(cè)得的600個(gè)堿基的四色DNA序列(BigDye Terminator v3.0)。(儀器和base calling軟件由StonyBrook大學(xué)Engineering College提供)圖12示出了在LPA/PDMA類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)介質(zhì)中DNA(BigDyeTerminator v3.0)的分離，其中LPA(重量平均MW＝7.6×106g/mol)和PDMA(重量平均MW～470Kg/mol)的含量分別為83％和17％。工作電壓195.5V/cm，DNA注入時(shí)間在27V/cm下20s。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度是33cm，ID/OD＝50/361(μm)。儀器ABI Prism 310四色單毛細(xì)管遺傳分析儀。
圖13示出了在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)(20805)介質(zhì)中DNA(BigDyeTerminator v3.0)的分離。類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中PDMA和LPA的含量分別為～11％和～89％。工作電壓195.5V/cm，DNA注入時(shí)間在27V/cm下20s。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度是33cm，ID/OD＝50/361(μm)。儀器ABIPrism 310四色單毛細(xì)管遺傳分析儀。
圖14示出了改變DNA注入電壓(a)25V/cm；(b)75V/cm；(c)100V/cm對(duì)DNA分離的分辨率的影響。該分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行。注入時(shí)間是10秒；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度是35cm；毛細(xì)管ID＝75μm；工作電場(chǎng)＝150V/cm；緩沖溶液是1×TTE/7M尿素；DNApGEM3Zf(+)(C-mix)。
圖15示出了在有效柱長(zhǎng)為(a)35cm和(b)40cm時(shí)DNA分離分辨率的變化。分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行，注入電壓和時(shí)間是75V/cm、10秒。儀器工作條件和DNA樣品同圖14中所述。
圖16示出了工作電場(chǎng)強(qiáng)度為(a)200V/cm和(b)150V/cm時(shí)pGEM3Zf(+)第581個(gè)堿基后面的電泳圖。分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行，注入電壓和時(shí)間是75V/cm、10秒。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度＝40cm。儀器工作條件和DNA樣品同圖14中所述。
圖17示出了通過(guò)使用由LPA和PDMA比率為(a)1∶0(未涂布的毛細(xì)管)；(b)1.62∶1；(c)3.33∶1；(d)6.33∶1(e)10.9∶1的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)的DNA測(cè)序樣品的分離。分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行，注入電壓和時(shí)間是75V/cm、10秒。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度＝40cm。儀器工作條件和DNA樣品同圖14中所述。
圖18示出了不同的LPA分子量(a)Mv＝4.53×106g/mol；(b)Mv＝6.4×106g/mol；(c)Mv＝7.69×106g/mol；(d)Mv＝9.91×106g/mol對(duì)DNA分離的影響。分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行，注入電壓和時(shí)間是75V/cm、10秒。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度＝40cm。儀器工作條件和DNA樣品同圖14中所述。
圖19示出了DNA分離結(jié)果的比較，其中LPA通過(guò)(a)無(wú)乳化劑聚合；(b)反相微乳液聚合制備得到。分離在實(shí)驗(yàn)室自制儀器中進(jìn)行，注入電壓和時(shí)間是75V/cm、10秒。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度＝40cm。儀器工作條件和DNA樣品同圖14中所述。
圖20示出了DNA(BigDye Terminator v3.0)的電泳圖的黃色-T部分。儀器和工作條件同圖8中相同。
圖21示出了DNA(BigDye Terminator v3.0)電泳圖黃色-T部分中的單堿基分辨率，如圖20所示。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用于分離帶電大分子的毛細(xì)管電泳用分離介質(zhì)，以及制備和使用該分離介質(zhì)的方法。
本發(fā)明中的分離介質(zhì)包括一種聚合物或共聚鏈的“類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)”(類(lèi)-IPN)。這些鏈彼此互穿、互相纏結(jié)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，類(lèi)-IPN包括線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈。在另一具體實(shí)施例中，類(lèi)-IPN包括由丙烯酰胺(AM)和二甲基丙烯酰胺(DMA)鏈構(gòu)成的無(wú)規(guī)共聚物，以及聚二甲基丙烯酰胺鏈。
化學(xué)交聯(lián)不要求出現(xiàn)在類(lèi)-IPN中。優(yōu)選地，不出現(xiàn)化學(xué)交聯(lián)。但是，由于實(shí)驗(yàn)條件不同，可能出現(xiàn)少量化學(xué)交聯(lián)?；诒菊f(shuō)明書(shū)的目的，少量化學(xué)交聯(lián)的定義是低于大約5％、2％、1％、0.5％或0.2％的聚合物鏈和另外的聚合物鏈發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。在類(lèi)-IPN的制備中不使用交聯(lián)劑。
一般而言，在本領(lǐng)域中，術(shù)語(yǔ)“互穿網(wǎng)絡(luò)”用于描述一種聚合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含至少兩種獨(dú)立的化學(xué)交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)彼此互穿，但是互不發(fā)生交聯(lián)。因此，現(xiàn)有技術(shù)所熟知的互穿網(wǎng)絡(luò)與本發(fā)明所涉及的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)間存在的差異在于該類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)組成了一種基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)的單一網(wǎng)絡(luò)。
該類(lèi)-IPN中的每種聚合物(或共聚物)提供對(duì)于分離介質(zhì)不同的所需特性。如LPA具有親水性，并且提供良好的分離效能，如分辨率高、讀長(zhǎng)長(zhǎng)，和工作時(shí)間短。但是，由于LPA不能與毛細(xì)管內(nèi)壁直接連接，這導(dǎo)致在電泳過(guò)程中產(chǎn)生不希望的電滲流。
PDMA親水性較差，能動(dòng)態(tài)涂布毛細(xì)管內(nèi)壁，因此可避免電滲流的產(chǎn)生。同時(shí)，PDMA能抑制毛細(xì)管壁對(duì)帶電大分子(如DNA片段)的非特異性吸附。
本發(fā)明通過(guò)將這兩種不同的聚合物，LPA和PDMA在類(lèi)-IPN中結(jié)合起來(lái)，將每種聚合物理想的特性結(jié)合到一種分離介質(zhì)中。
一般而言，在溶劑中，LPA和PDMA鏈的相容性從彼此相互混溶到彼此不相互混溶?；诒菊f(shuō)明書(shū)的目的，若LPA和PDMA鏈能混合在一起、且能長(zhǎng)時(shí)期保持溶解狀態(tài)，則將LPA和PDMA鏈定義成混溶；若即使在獲得LPA和PDMA鏈的高度纏結(jié)的均一溶液時(shí)，LPA和PDMA鏈最終也要發(fā)生相分離，則將LPA和PDMA鏈定義成不混溶。若LPA和PDMA鏈具有介于混溶和不混溶的聚合物鏈之間的一定程度的混溶性，則LPA和PDMA鏈?zhǔn)遣糠植换烊堋?br> LPA和PDMA鏈的混溶性受到幾個(gè)因素的影響，如溶劑中總聚合物濃度、聚合物的分子量、以及每種聚合物的相對(duì)含量。隨著總聚合物濃度的增加，和/或聚合物分子量增加，和/或LPA作為主要組分的溶液中PDMA相對(duì)含量增加，混溶性降低。
要獲得用于分離介質(zhì)的適合網(wǎng)孔大小，要求有一定的最小總聚合物濃度。一般而言，為獲得對(duì)于絕大部分測(cè)序分離適合的網(wǎng)孔大小，要求總聚合物濃度大約是1.5wt％的數(shù)量級(jí)或更高。在LPA和PDMA鏈相對(duì)含量相當(dāng)，同時(shí)其分子量高時(shí)，在總聚合物濃度為1.5wt％時(shí)，LPA和PDMA鏈彼此部分不混溶。但是，通過(guò)使部分不混溶的LPA鏈和PDMA鏈形成類(lèi)-IPN，至少一旦在需要進(jìn)行帶電生物分子的分離時(shí)，該LPA鏈和PDMA鏈應(yīng)能彼此纏結(jié)、互穿。
類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中的LPA鏈和PDMA鏈至少在聚合物鏈彼此排斥這點(diǎn)上不相同。因此，該鏈在溶液中變得伸展，超過(guò)其正常構(gòu)象。因此，與不以類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)形式存在的組成型LPA鏈和PDMA鏈的重量/體積比之和相比較，溶液中的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的重量/體積比更小。更充分伸展的構(gòu)象能有效提供一種更好的分離介質(zhì)，同時(shí)將形成理想的網(wǎng)孔大小所需的聚合物材料的數(shù)量減少到最少程度。
LPA和PDMA鏈必須混溶到這樣的程度，即至少一旦在需要進(jìn)行帶電大分子的分離時(shí)，該聚合物鏈應(yīng)能保持彼此纏結(jié)。如此，當(dāng)類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)被置于測(cè)序緩沖介質(zhì)中時(shí)，該類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)以均一的、凝膠狀的溶液形式存在。
LPA鏈、PDMA鏈和類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的某些物理特性能被確定。這些特性包括分子量、多分散指數(shù)、旋轉(zhuǎn)半徑和流體動(dòng)力學(xué)半徑。這些特性能影響由特定的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)提供的分離效能?；陬?lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的具體應(yīng)用，這些特性可以被改變以最優(yōu)化分離結(jié)果。這些特性將在下文中進(jìn)行探討。
單一聚合物鏈的分子量通過(guò)將單體的分子量和聚合物鏈中單體數(shù)量簡(jiǎn)單相乘得到。聚合物溶液中包括多種具有不同分子量的聚合物鏈。溶液中聚合物的分子量即是溶液中聚合物鏈的分子量的平均值。有幾種方式來(lái)描述溶液中聚合物的平均分子量。
一種描述溶液中聚合物分子量的方式是通過(guò)確定溶液中聚合物的“數(shù)均分子量”(Mn)。數(shù)均分子量被定義為溶液中聚合物鏈的總分子量除以溶液中聚合物鏈的總數(shù)量。也就是說(shuō)，Mn＝∑niMi/∑ni，其中ni是溶液中分子量為Mi的聚合物鏈的數(shù)目。
另一種描述聚合物分子量的方式是通過(guò)確定“重均分子量”(Mw)。重均分子量被定義成niMi2的總和除以niMi的總和，其中ni是分子量為Mi的聚合物鏈的數(shù)目。也就是說(shuō)，Mw＝∑niMi2/∑niMi。重均分子量可以通過(guò)靜態(tài)激光散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
比值Mw/Mn被定義成聚合物的多分散指數(shù)。該指數(shù)是聚合物鏈的尺寸分布量度。多分散材料的重均分子量一般比數(shù)均分子量大。若多分散指數(shù)的值接近1，則聚合物鏈尺寸大小更接近。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，多分散指數(shù)能使用數(shù)值計(jì)算法，即CONTIN法(Provencher，Comput.Phys.Commun.27229(1982))并結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定法估算得到。
旋轉(zhuǎn)半徑(Rg)是聚合物鏈的尺寸量度。它是根據(jù)聚合物鏈中分子量為mi的每個(gè)單體距聚合物鏈重心的距離分布來(lái)定義的，即Rg2＝∑miri2。溶液中聚合物的旋轉(zhuǎn)半徑可以通過(guò)靜態(tài)激光散射實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)驗(yàn)確定。旋轉(zhuǎn)半徑在交疊濃度之后測(cè)定。
另外，若已知溶液中特定的聚合物的旋轉(zhuǎn)半徑Rg和相應(yīng)的重均分子量(Mw)兩值，那么在相同溶液中，具有不同已知Mw的聚合物，其旋轉(zhuǎn)半徑能估算得到。這個(gè)估算方法使用下面公式Rg＝KgMwα，其中，Kg是常數(shù)。在一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)的良好的溶劑中，指數(shù)α大約是0.58。
旋轉(zhuǎn)半徑相關(guān)的一個(gè)特性是流體動(dòng)力學(xué)半徑(Rh)。通過(guò)使用動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定聚合物分子的遷移率(根據(jù)稀溶液中的平移擴(kuò)散系數(shù))，可確定溶液中聚合物分子的流體動(dòng)力學(xué)半徑。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的那樣，Rg∶Rh比值取決于聚合物分子的構(gòu)象。
本發(fā)明中的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)不能通過(guò)簡(jiǎn)單地將LPA和PDMA混合制備，而是使用特定的合成方法，以影響這些聚合物鏈的纏結(jié)和互穿。
一種優(yōu)選的用于制備類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的合成方法包括由LPA，或AM/DMA共聚物形成聚合物網(wǎng)絡(luò)，或“主要骨架”。基于本發(fā)明中的目的，主要骨架包括溶劑中的LPA聚合物分子、或AM/DMA共聚物分子，其中，如下文所述，對(duì)于特定的溶劑，溶液的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LPA，或AM/DMA共聚物的交疊濃度(C*)。
溶液中聚合物的交疊濃度是指聚合物分子第一次相互交織、并變得彼此纏結(jié)時(shí)的最低濃度。因此，聚合物溶液的特征在交疊濃度時(shí)通常顯著改變。與更稀濃度時(shí)的單個(gè)聚合物分子相比，交疊濃度時(shí)的單個(gè)聚合物分子，對(duì)毗鄰分子的運(yùn)動(dòng)影響更大。比如，聚合物分子的運(yùn)動(dòng)更受限于毗鄰分子。同樣地，一般而言，溶液粘度急劇增加。
交疊濃度可根據(jù)聚合物溶液的各種可測(cè)定的特性來(lái)決定。比如，一般而言，聚合物溶液的交疊濃度被估算為溶液固有粘度([η])的倒數(shù)。
并且，交疊濃度可根據(jù)溶液中聚合物的分子量M和旋轉(zhuǎn)半徑(Rg)，利用公式C*～M/Rg3估算得到。分子量和旋轉(zhuǎn)半徑能通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的光散射實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。B.Chu，“Laser LightScatteringBasic Principles and Practice，”2ndEdition，Academic Press，Boston(1991)pp.343。
LPA主要骨架通過(guò)使用任何合適的聚合方法聚合丙烯酰胺單體形成。一旦溶液達(dá)到交疊濃度，LPA主要骨架就能形成。聚合方法的實(shí)例包括反相微乳液聚合、無(wú)乳化劑聚合、常規(guī)的和種子乳液聚合(conventional and seeded emulsion polymerization)、以及分散和懸浮聚合。
優(yōu)選產(chǎn)生高分子量的LPA的聚合方法，如，反相微乳液聚合。反相微乳液聚合方法為本領(lǐng)域所熟知。反相微乳液包含被油性分子包裹的納米尺寸級(jí)水滴。在引發(fā)劑，如UV輻射或者熱引發(fā)劑的觸發(fā)下，在水滴內(nèi)發(fā)生聚合。無(wú)乳化劑聚合也可合成高分子量LPA分子。
優(yōu)選的是具有分子量分布范圍相當(dāng)窄，也就是多分散指數(shù)小的LPA。反相微乳液聚合提供了多分散指數(shù)小的LPA。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，有由上限和下限所定義的范圍。每個(gè)下限可以與每個(gè)上限結(jié)合定義一個(gè)范圍。上下限均可作為獨(dú)立要素。
優(yōu)選地，主要骨架LPA的物理性質(zhì)在緩沖溶液中存在LPA時(shí)測(cè)定。恰當(dāng)?shù)木彌_劑的實(shí)例包括Tris-TAPS-EDTA(TTE)，Tris-硼酸(Borate)-EDTA(TBE)和Tris-冰醋酸-EDTA(TAE)。LPA如下的物理性質(zhì)在1×TTE緩沖溶液中測(cè)定。1×TTE緩沖溶液含50mM Tris；50mM TAPS；和2.0mM EDTA。
交疊濃度取決于LPA的分子量和溶劑。1×TTE中LPA的交疊濃度范圍的下限大約是5.0×10-4g/ml。其它下限的實(shí)例包括5.0×10-3g/ml和9.0×10-3g/ml。1×TTE中LPA的交疊濃度范圍的上限大約是4.0×10-2g/ml。其它下限(上限)的實(shí)例包括1.0×10-2g/ml和2.0×10-2g/ml。一個(gè)交疊濃度的具體的實(shí)例大約是1.2×10-3g/ml。
優(yōu)選地，LPA鏈的重均分子量范圍的下限大約是0.05×106g/mol。其它下限的實(shí)例包括大約0.1×106、0.3×106、1×106、4×106、6×106、和7×106g/mol。
優(yōu)選地，LPA鏈的重均分子量范圍的上限大約是25×106g/mol。其它上限的實(shí)例包括大約8×106、10×106和15×106g/mol。LPA重均分子量的一實(shí)例是7.6×106g/mol。
優(yōu)選地，LPA鏈的多分散指數(shù)的范圍是窄的。比如，優(yōu)選地，多分散指數(shù)范圍的下限大約是1.01。其它下限的實(shí)例包括大約1.02、1.05和1.1。
優(yōu)選地，多分散指數(shù)范圍的上限大約是1.8。其它上限的實(shí)例包括約1.3、1.5和1.6。一個(gè)LPA多分散指數(shù)的實(shí)例是1.3。
優(yōu)選地，緩沖溶液中的LPA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限大約是10nm。其它下限的實(shí)例包括大約15nm、28nm、55nm、125nm、150nm、和165nm。
優(yōu)選地，緩沖溶液中LPA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的上限大約是350nm。其它上限的實(shí)例包括大約180nm、210nm和250nm。一個(gè)LPA旋轉(zhuǎn)半徑的實(shí)例是大約180nm。
溶液中LPA的流體動(dòng)力學(xué)半徑的范圍與良好溶劑中LPA的Rg范圍相吻合，這將被本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知。溶液中LPA的流體動(dòng)力學(xué)半徑的實(shí)例是大約81nm。
將二甲基丙烯酰胺單體和LPA主要骨架聚合。通過(guò)采用任何適合的方法聚合二甲基丙烯酰胺單體，如，比如，使用同上文所述的制備LPA的相同的方法。優(yōu)選自由基聚合。
優(yōu)選地，由LPA和PDMA鏈形成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的重均分子量范圍的下限是大約幾十萬(wàn)。其它下限的實(shí)例包括大約0.1×106、0.5×106、2×106、和6×106g/mol。
優(yōu)選地，由LPA和PDMA鏈形成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的重均分子量范圍的上限是大約20×106g/mol。其它上限的實(shí)例包括大約7×106、10×106和16×106g/mol。一個(gè)LPA/PDMA類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的重均分子量的具體實(shí)例是大約6.4×106g/mol。
優(yōu)選地，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)具有組成型聚合物，其中，每種組成型聚合物的多分散指數(shù)范圍的下限是大約1。其它下限的實(shí)例包括大約1.05和1.1。
優(yōu)選地，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)具有組成型聚合物，其中，每種組成型聚合物的多分散指數(shù)范圍的上限是大約1.8。其它上限的實(shí)例包括大約1.3和1.5。
在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中的LPA和PDMA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限大約低于10nm。其它下限的實(shí)例包括大約15nm、40nm、80nm和150nm。
優(yōu)選地，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中的LPA和PDMA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的上限大約是320nm。其它上限的實(shí)例包括大約165nm、210nm和280nm。類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中的旋轉(zhuǎn)半徑的一實(shí)例是大約153nm。
由LPA和PDMA鏈構(gòu)成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)在1×TTE中的交疊濃度大約是5×10-4到3.0×10-2g/ml。一個(gè)交疊濃度的具體的實(shí)例是大約5.5×10-3g/ml。
LPA的重量分子量的范圍在大約6×106到7×106g/mol之間時(shí)，LPA含量和PDMA含量比率的范圍在大約10∶1到15∶1之間。
通過(guò)首先提供LPA主要骨架，允許LPA和PDMA在高的聚合物濃度下混合，由此能夠制備均一的、凝膠狀的溶液，從而形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。即使在較高濃度條件下LPA和PDMA變得不混溶，且在相當(dāng)?shù)臅r(shí)間出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的相分離，這種方法也可得以實(shí)施。
在LPA濃度較高時(shí)，如大于大約4.0×10-2g/ml，PDMA和LPA變得基本上不混溶。但是，在本發(fā)明中的一個(gè)具體實(shí)施例中，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)由AM和DMA的無(wú)規(guī)共聚物，和均聚合物PDMA形成。(AM/DMA的)無(wú)規(guī)共聚物為在高的總聚合物濃度、且沒(méi)有出現(xiàn)相分離的條件下(與PDMA)形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)提供可能。
在所述的具體實(shí)施例中，通過(guò)使用任何適當(dāng)?shù)木酆戏椒?，在緩沖液中將丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺單體聚合。自由基聚合是優(yōu)選的聚合方法。一旦緩沖溶液中達(dá)到交疊濃度，則由AM和DMA無(wú)規(guī)共聚物鏈形成無(wú)規(guī)共聚物的主要骨架。緩沖溶液中無(wú)規(guī)共聚物的交疊濃度大約是3×l0-3到4.0×10-2g/ml。緩沖溶液中所述范圍的另一下限是5.0×l0-3g/ml。緩沖液中所述范圍的另一上限是3.0×l0-2g/ml。緩沖溶液(如1×TTE)中的交疊濃度的一具體實(shí)例是大約1.0×10-2g/ml。
優(yōu)選地，構(gòu)成主要骨架的AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物鏈的重均分子量范圍的下限是大約0.05×106g/mol。其它下限的實(shí)例包括大約0.1×106和0.3×106g/mol。
優(yōu)選地，構(gòu)成主要骨架的AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物鏈的重均分子量范圍的上限是大約2×106g/mol。其它上限的實(shí)例包括0.5×106和1×106g/mol。
優(yōu)選地，在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中AM含量和DMA含量的比率范圍的下限大約是5∶1。其它的下限實(shí)例包括10∶1和20∶1。優(yōu)選地，在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中AM含量和DMA含量的比率范圍的上限大約是50∶1。其它上限的實(shí)例包括30∶1和40∶1。
優(yōu)選地，緩沖溶液中AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物的旋轉(zhuǎn)半徑大約介于10nm到80nm之間。該范圍的下限的實(shí)例是大約10nm、15nm和30nm。該范圍的上限的實(shí)例是大約40nm、55nm和80nm。優(yōu)選地，該無(wú)規(guī)共聚物的多分散指數(shù)介于大約1.1到2之間。
通過(guò)使用任何合適的聚合方法，在無(wú)規(guī)共聚物主要骨架存在時(shí)，通過(guò)聚合DMA可制備得到PDMA鏈。自由基聚合是優(yōu)選的聚合方法。
優(yōu)選地，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的組成型聚合物和共聚物的重均分子量范圍的下限大約是0.1×106g/mol，其中該類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)由AM/DMA共聚物和PDMA聚合物形成。下限的其它實(shí)例包括大約0.5×106g/mol和0.8×106g/mol。
優(yōu)選地，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的組成型聚合物和共聚物的重均分子量范圍的上限大于2×106g/mol，其中該類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)由AM/DMA共聚物和PDMA聚合物構(gòu)成。上限的其它實(shí)例包括大約1×106g/mol到2×106g/mol。
優(yōu)選地，該聚合物和共聚物的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限大約是15nm。下限的其它實(shí)例包括大約40nm和50nm。
優(yōu)選地，該聚合物和共聚物的回轉(zhuǎn)半徑范圍的上限大約是80nm。上限的其它實(shí)例包括大約55nm和65nm。
優(yōu)選地，無(wú)規(guī)共聚物和PDMA聚合物的多分散指數(shù)介于大約1.1到2之間。多分散指數(shù)的一具體實(shí)例是大約1.6。應(yīng)注意到的是存在兩種類(lèi)型的聚合物，其中每種都有自己的多分散指數(shù)，這加寬了類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的多分散指數(shù)，尤其是在兩種聚合物的分子量大大不同時(shí)。
在本發(fā)明中的可選具體實(shí)施例中，制備類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的方法可通過(guò)混合溶液法實(shí)現(xiàn)。在該方法中，形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的聚合物和/或共聚物要求在聚合物的混合物的均一、單相區(qū)域中能彼此相容。
在該方法中，提供了LPA和PDMA的單獨(dú)的溶液。這些溶液中的溶液之一，優(yōu)選PDMA溶液，較LPA溶液更稀。用于這些溶液的溶劑的實(shí)例包括水和緩沖溶液。合適的緩沖溶液的實(shí)例包括Tris-TAPS-EDTA(TTE)、Tris-硼酸-EDTA(TBE)、和Tris-冰醋酸-EDTA(TAE)。將兩種聚合物徹底混合，為聚合物鏈互穿提供可能。將兩種聚合物溶液與兩種遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于交疊濃度的溶液混合沒(méi)有效用。
LPA溶液的濃度大約是PDMA溶液濃度的1到15倍。在LPA和PDMA濃度相同的具體實(shí)施例中，PDMA的體積相應(yīng)地降低。LPA溶液的體積大約是PDMA溶液體積的1到50倍。在LPA和PDMA體積相同的具體實(shí)施例中，PDMA的濃度相應(yīng)地降低。
以分步方式將PDMA溶液加入LPA溶液中。每次加入后，將得到的溶液充分混合?；诒菊f(shuō)明書(shū)中的目的，分步方式意味著PDMA溶液總量的部分被加入到LPA溶液中，并且在每部分加入之后，將得到的溶液充分混合。被加入部分的實(shí)例包括三分之一的PDMA溶液、四分之一的PDMA溶液、五分之一的PDMA溶液、十分之一的PDMA溶液、和二十分之一的PDMA溶液。
在該具體實(shí)施例中，優(yōu)選地，LPA的重均分子量范圍的下限大約是0.05×106g/mol。其它下限的實(shí)例包括大約0.1×106、0.3×106、和1×106g/mol。
優(yōu)選地，LPA的重均分子量范圍的上限大約是25×106g/mol(或盡可能高)。其它上限的實(shí)例包括大約4×106、6×106、7×106、8×106、10×106、15×106和20×106g/mol。LPA重均分子量的一實(shí)例是6.4×106g/mol。
LPA溶解在含水溶液中，如水，或緩沖溶液。合適的緩沖劑的實(shí)例包括TTE、TBE和TAE。優(yōu)選的緩沖溶液的一實(shí)例是1×TTE+7M尿素緩沖液。LPA/緩沖劑溶液，如LPA/TTE溶液，其濃度范圍的下限優(yōu)選是大約1.0％g/ml。下限的其它實(shí)例包括4.0％和6.0％g/ml。LPA/緩沖劑溶液，如LPA/TTE溶液，其濃度范圍的上限優(yōu)選是大約12.0％g/ml。上限的其它實(shí)例包括8.0％和10.0％g/ml。隨著濃度的增加，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)孔大小降低。LPA/TTE溶液濃度的一實(shí)例是大約2.6％g/ml。
優(yōu)選地，PDMA的重均分子量范圍的下限大約是100,000g/mol。其它下限的實(shí)例包括大約300,000和500,000g/mol。優(yōu)選地，PDMA的重均分子量范圍的上限大約是25×106g/mol。其它上限的實(shí)例包括大約1×106、3×106和10×106g/mol。PDMA重均分子量的一個(gè)實(shí)例是470,000g/mol。
PDMA溶于含水溶液中，如水或緩沖溶液。適當(dāng)?shù)木彌_劑的實(shí)例包括TTE、TBE和TAE。優(yōu)選的緩沖溶液的實(shí)例是1×TTE+7M尿素緩沖液。PDMA/緩沖劑溶液，如PDMA/TTE溶液，其濃度范圍優(yōu)選介于大約0.1％g/ml到3.0％g/ml之間。PDMA/TTE溶液的濃度的一個(gè)實(shí)例是大約1.6％g/ml。
在通過(guò)該方法制備得到的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中，LPA大約是PDMA的3.0到15.0倍。比如，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)可以包括大約85wt％LPA和15wt％PDMA。
溶液混合法也可用于制備AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和PDMA的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。制備AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和PDMA的獨(dú)立的緩沖溶液。合適的緩沖溶液的實(shí)例包括TTE、TBE和TAE。，這些溶液中的一種溶液，優(yōu)選PDMA溶液，較無(wú)規(guī)共聚物溶液更稀。該聚合物和共聚鏈充分混合，為該鏈互穿提供可能。
AM/DMA的無(wú)規(guī)共聚物溶液的濃度大約是PDMA溶液濃度的1到50倍。在該共聚物和PDMA濃度相同的具體實(shí)施例中，PDMA的體積相應(yīng)地減少。該無(wú)規(guī)共聚物溶液的體積大約是PDMA溶液體積的1到20倍。在該共聚物和PDMA體積相同的具體實(shí)施例中，PDMA的濃度相應(yīng)地降低。該共聚物/緩沖劑溶液的濃度大約是5.0到20.0％g/ml，優(yōu)選大約7％到12％g/ml。PDMA/緩沖劑溶液的濃度大約是0.1到1.0％g/ml。
如前文關(guān)于LPA和PDMA的描述那樣，以分步方式將PDMA溶液加入到無(wú)規(guī)共聚物溶液中。
在該具體實(shí)施例中，優(yōu)選地，該無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量范圍的下限大約是0.05×106g/mol。其它下限的實(shí)例包括大約0.1×106，和0.3×106g/mol。優(yōu)選地，該無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量范圍的上限大約是2×106g/mol(或盡可能高，但在可接受的粘度范圍內(nèi))。其它上限的實(shí)例包括大約0.5×106、1×106和1.5×106g/mol。
優(yōu)選地，PDMA的重均分子量范圍的下限大約是50,000g/mol。其它下限的實(shí)例包括100,000和200,000g/mol。PDMA的重均分子量范圍的上限大約是25×106g/mol。其它上限的實(shí)例包括500,000、1×106、3×106、5×106和10×106g/mol。
通過(guò)該方法制備得到的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其無(wú)規(guī)共聚物較PDMA大約高達(dá)50倍。
本發(fā)明中所有具體實(shí)施例中制備得到的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)可作為帶電分子類(lèi)物質(zhì)的分離介質(zhì)，如毛細(xì)管電泳或芯片上的DNA/蛋白分析。生物分子的實(shí)例包括核酸分子和蛋白質(zhì)。
在不考慮儀器變量的情況下，就給定的聚合物，用于DNA序列分析的毛細(xì)管電泳的分離條件的最優(yōu)化取決于三個(gè)主要因素聚合物濃度、樣品注入量和電場(chǎng)強(qiáng)度。分離介質(zhì)中聚合物的濃度影響到分辨率、工作時(shí)間和讀長(zhǎng)。濃度越高，分辨率越高，但是濃度越低，粘度越低，分離更快，讀長(zhǎng)更長(zhǎng)。最佳濃度應(yīng)該在盡可能低的濃度條件下，分辨率足夠高。樣品注入量影響到分辨率和信號(hào)噪聲比。為實(shí)現(xiàn)最佳效果，注入量應(yīng)該保持最少，以提供高分辨率和足夠高的信號(hào)噪聲比。電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)該適當(dāng)高，比如大約150V/cm。就較小片段而言，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，分離更快捷，分辨率更高。但是，如果電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高，較大片段的分辨率就會(huì)降低，同時(shí)讀長(zhǎng)縮短。
作為DNA分離介質(zhì)，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)成功地結(jié)合了PDMA的動(dòng)態(tài)涂布能力和LPA的親水性。同時(shí)，由于這兩種聚合物體系的部分不相容性，LPA和PDMA鏈均得到超過(guò)其自然構(gòu)象的伸展。這種伸展提高了類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)的效率，同時(shí)將用于獲得理想網(wǎng)孔大小所使用的聚合物材料量降低到最小。通過(guò)使用裸露毛細(xì)管而不增加另外的聚合物涂布步驟就能獲得高效的分離分辨率。
包括LPA和PDMA的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)，其性能受到幾個(gè)變量的影響。比如，如前文所述，LPA的分子量及其分子量分布，在DNA測(cè)序分析中起著重要的作用。LPA分子量越高，同時(shí)分子量分布范圍越窄，其分辨率越高，同時(shí)分離能力越穩(wěn)定。
另外，相對(duì)于LPA的分子量，LPA與PDMA的比率影響到分離效果。就LPA的每個(gè)重量分子量范圍而言，LPA∶PDMA比率可優(yōu)化分離效果。比如，就重均分子量大約是6×106到7×106的LPA而言，LPA∶PDMA比率的范圍介于大約10∶1到15∶1時(shí)最佳。即使總聚合物濃度相當(dāng)?shù)?，若PDMA含量進(jìn)一步增加，可能導(dǎo)致該聚合物體系的微相分離，不利于分離效果。
如圖20和21所示，在最佳的工作條件下，通過(guò)使用2.0w/v％LPA和PDMA，LPA∶PDMA比為10∶1作為分離介質(zhì)，在60℃，大約35分鐘內(nèi)，對(duì)于858個(gè)堿基的單個(gè)堿基分辨率可達(dá)到0.50以上，對(duì)于1000個(gè)堿基的單堿基分辨率為～0.3以上。值得注意的是LPA和PDMA總分子量越高，性能會(huì)得到進(jìn)一步提高。
由于該聚合物不通過(guò)交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)連接，因此該類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)可以容易地從毛細(xì)管中去除。因此，如果必要，在每次電泳工作后，這些聚合物溶液可以被替換。這樣的特征使本發(fā)明中的分離介質(zhì)非常適用于自動(dòng)毛細(xì)管電泳。
制備類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)在于1)選擇最有效的分離聚合物；2)將該分離聚合物和另外的聚合物混合均勻，該另外的聚合物能動(dòng)態(tài)涂布毛細(xì)管的內(nèi)壁或分離芯片；以及3)每種聚合物均高于自身的交疊濃度。因此，主要骨架聚合物應(yīng)該具有在總聚合物濃度(即由所需網(wǎng)孔大小決定的濃度)中的體系所允許的最高聚合物比率。該涂布聚合物應(yīng)盡量少，但需高于自身的交疊濃度。就用于測(cè)序分析的分離介質(zhì)而言，由于總聚合物濃度相對(duì)較低，很容易滿足該要求。就芯片上進(jìn)行的DNA分析而言，即對(duì)于使用較短的通道長(zhǎng)度(信道長(zhǎng)度)和較小的帶電分子大小進(jìn)行快速分析，網(wǎng)孔大小更小，所需總聚合物濃度變得更高。在這種濃度條件下，即便對(duì)于在低聚合物濃度時(shí)能混溶的LPA和PDMA而言，也會(huì)出現(xiàn)相分離?；诖?，在總聚合物濃度較高時(shí)，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中的聚合物的相容性可通過(guò)利用AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物調(diào)節(jié)，其中，調(diào)節(jié)該共聚物中DMA的含量，使PDMA同AM/DMA的無(wú)規(guī)共聚物在所需濃度范圍內(nèi)變得混溶。類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)分離介質(zhì)應(yīng)該使用本發(fā)明中的方法徹底混合，即通過(guò)一種聚合物在另外的主要骨架聚合物中進(jìn)行原位聚合，或通過(guò)分步法。為獲得可重復(fù)性的結(jié)果，混合溶液在分子水平上應(yīng)該保持均一，但這并不取決于視覺(jué)觀察。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法過(guò)硫酸銨(APS)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、N-三-(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和丙烯酰胺購(gòu)自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。丙烯酰胺由氯仿兩次重結(jié)晶。將磺基丁二酸二(2-乙基己基)酯(AOT，F(xiàn)luka)溶于甲醇中以去除鹽分，然后過(guò)濾。然后將濾液和石油醚一起振蕩，以便抽提有機(jī)雜質(zhì)。隨后除去溶劑，在五氧化二磷的存在下，于50℃真空干燥沉淀物。偶氮二異丁腈(AIBN)由乙醇兩次重結(jié)晶。N，N，N′，N′-四亞甲基二胺(TEMED)購(gòu)自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)。DMA購(gòu)自Polysciences(Warrington，PA，USA)，使用前在80℃/20mmHg下蒸餾。陽(yáng)極和陰極工作緩沖液均是1×TTE(50mMTris/50mM TAPS/2.0mM EDTA)。同分離基質(zhì)一樣，陰極工作緩沖液也包括-7M尿素。所有反應(yīng)和溶液中使用的水均經(jīng)Milli-Q水凈化系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)去離子化至18.2MΩ。
通過(guò)反相微乳液聚合制備LPA表1列出了典型的LPA制備方法。聚合反應(yīng)在氮?dú)庵校?5℃，攪拌速度為350rpm的條件下進(jìn)行。除AIBN溶液外，所有成分均放置在150ml四頸圓底燒瓶中。該圓底燒瓶配備有機(jī)械攪拌器、回流冷凝器、溫度計(jì)、氮?dú)膺M(jìn)氣管，和加料漏斗。在AIBN溶液加入前，反應(yīng)系統(tǒng)用氮?dú)獯祾咭粋€(gè)小時(shí)。聚合結(jié)束后，在過(guò)量丙酮中沉淀，連續(xù)洗滌、過(guò)濾和50℃真空干燥，從而回收聚丙烯酰胺。
表1聚丙烯酰胺聚合a方法

a)聚合時(shí)間2hb)聚合溫度60℃制備類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)將LPA溶解入100ml四頸圓底燒瓶中的水中，該圓底燒瓶配備有機(jī)械攪拌器、回流冷凝器、溫度計(jì)、氮?dú)膺M(jìn)氣管，和加料漏斗。加入DMA后，反應(yīng)系統(tǒng)用氮?dú)獯祾咭粋€(gè)小時(shí)，然后加入APS和TEMED。聚合結(jié)束后，在過(guò)量丙酮中沉淀，隨后連續(xù)洗滌、過(guò)濾和50℃真空干燥，從而回收類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。表2列出了典型的制備基于LPA和PDMA的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的方法。
表2基于丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的制備方法

聚合溫度0℃聚合時(shí)間24h
聚合物的特征利用Ubbelohde粘度計(jì)測(cè)定1M NaNO3水溶液中LPA的固有粘度[η]，通過(guò)外推法計(jì)算30℃、零濃度時(shí)該LPA的固有粘度。使用下面的公式計(jì)算合成的LPA的粘度-平均分子量(Mv)(表1)[η]＝3.73×10-2Mv0.66cm3/g。
通過(guò)AC250-1H-NMR測(cè)定類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的組合物，其以D2O作為溶劑。類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中LPA與PDMA的比率(表2)以位于2.1和2.6ppm的峰的積分峰面積比估算。
測(cè)序化學(xué)使用具有AmpliTaqDNA聚合酶的ABI PRISMTMDye Primer(-21 M13 forward)Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，pGEM3Zf(+)雙鏈模板上的FS(PE Biosystems/Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用FAM標(biāo)記的引物和C端混合物進(jìn)行單染料標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)。DNA測(cè)序利用GeneAmp PCR System2400(PE Biosystems/Perkin-Elmer)進(jìn)行，循環(huán)條件如下95℃10秒、50℃5秒和70℃1分鐘的15個(gè)循環(huán)，隨后95℃10秒和70℃1分鐘的15個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化、隨后用95％和75％v/v乙醇洗滌兩次、20μl去離子甲酰胺中重新懸浮。
激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)氬離子激光器被用于形成λ＝488nm的激發(fā)光束和大約5mW的入射功率。該激光束經(jīng)焦距為25cm的透鏡聚焦、通過(guò)分色鏡(550DRLP；Omega Optical，Brattleboro，VT)反射，然后使用10×物鏡再次聚焦在分離通道內(nèi)的點(diǎn)上。經(jīng)分色鏡的熒光在進(jìn)入光電倍增管(Hamamatsu R928，Hamamatsu Corporation，NJ)前，由帶通濾波器(530DF30，Omega Optical，Brattleboro，VT)進(jìn)行過(guò)濾。為獲得毛細(xì)管圖像，該裝置還連有電荷耦合裝置(CCD)攝像機(jī)(SONY SSC-M350，SONY Corporation，New York，NY)。顯微鏡上的發(fā)光裝置發(fā)出的白色光束照亮毛細(xì)管。然后，它通過(guò)物鏡聚焦、通過(guò)滑入/滑出鏡(slide in-and-out mirror)反射，通過(guò)Zoom 6000系統(tǒng)放大(D.0 Industries，Rochester，NY)，隨后通過(guò)CCD攝像機(jī)檢測(cè)。顯微鏡(KarlZeiss，Melville，NY)和CCD攝像機(jī)提供了獲得優(yōu)良光學(xué)質(zhì)量和快速對(duì)準(zhǔn)的方法。
CE步驟1.針對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的CE儀器使用具有75/365μm的ID/OD的熔融石英毛細(xì)管(PolymicroTechnologies，Phoenix AZ)。通過(guò)用刀片剝開(kāi)聚酰亞胺涂層在距陽(yáng)極端8cm處開(kāi)放檢測(cè)窗。毛細(xì)管用1M HCl簡(jiǎn)單洗滌10min。使用氣密注射器將分離介質(zhì)注入毛細(xì)管。每次電泳工作前，將毛細(xì)管柱在300V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下進(jìn)行調(diào)試，直至電流穩(wěn)定(一般約10min)。以電動(dòng)方式將DNA樣品注入毛細(xì)管。

中列出了具體注入條件、具體長(zhǎng)度和電泳條件。
2.針對(duì)ABI-310步驟同(1)，但遵循ABI過(guò)程的常規(guī)操作。
實(shí)施例2變量工作條件的影響工作條件，如DNA注入寬度、有效柱長(zhǎng)和工作電場(chǎng)強(qiáng)度，對(duì)類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)在DNA分離中的性能影響非常大。為了比較，根據(jù)下面的公式計(jì)算所選DNA片段的分辨率(R)R＝2(t2-t1)/[1.699(w2+w1)]，其中t和w分別表示遷移時(shí)間和1/2最大高度的全峰寬度。
在CE中，DNA樣品一般是通過(guò)電動(dòng)注射方式注入毛細(xì)管柱。初始DNA帶寬或被注入的DNA的量通過(guò)調(diào)節(jié)注入電壓和注入時(shí)間間隔進(jìn)行調(diào)控。
圖14示出了使用實(shí)施例1中的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)在不同DNA注入電壓下的分辨率的變化。保持注入時(shí)間間隔(10s)不變，利用公式(2)計(jì)算注入電壓為25V/cm、75V/cm、和100V/cm時(shí)堿基片段分離的分辨率，同時(shí)相對(duì)于片段長(zhǎng)度對(duì)分辨率作圖(圖14)，其中被檢測(cè)堿基片段長(zhǎng)度為103/104、158/159、186/187、216/217、280/281、310/311、357/358、411/413、716/720和833/836。(其中411/413堿基對(duì)的分辨率除以2，716/720堿基對(duì)的分辨率除以4，和833/836堿基對(duì)的分辨率除以3)。與注入電壓100V/cm和25V/cm相比，注入電壓為75V/cm時(shí)分辨率最高。更高的注入電壓(高于75V/cm)不僅增加初始DNA帶寬，且導(dǎo)致峰前拖尾。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于DNA片段在樣品緩沖液和分離介質(zhì)交界處過(guò)量堆積。注入電壓過(guò)高，注入時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將導(dǎo)致在施加工作電壓前一些DNA片段被導(dǎo)入分離介質(zhì)。帶寬增加，峰型畸變，會(huì)降低分離效果。注入電壓較低，能縮短初始帶寬，從而提高分辨率。但是，若電壓過(guò)低，信號(hào)噪聲比將會(huì)降低。注入時(shí)間間隔對(duì)DNA分離的影響方式同注入電壓。
在75V/cm下，注入時(shí)間10s，分離效果最好(未給出數(shù)據(jù))。注入電壓和注入時(shí)間間隔與初始DNA帶寬緊密相關(guān)。當(dāng)其它工作條件，如柱長(zhǎng)、溫度、和工作電場(chǎng)強(qiáng)度保持不變時(shí)，存在一個(gè)最佳組合。
另一個(gè)對(duì)DNA分離具有很大影響的參數(shù)是柱長(zhǎng)。圖15示出有效柱長(zhǎng)為40cm和35cm時(shí)分辨率的變化。40cm的柱長(zhǎng)比35cm的柱長(zhǎng)分辨率更高。在用CE進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析中，13cm到60cm的柱長(zhǎng)已與不同分離介質(zhì)一起被使用。一般說(shuō)來(lái)，存在一個(gè)最小柱長(zhǎng)；柱長(zhǎng)比最小柱長(zhǎng)更小，則不能獲得令人滿意的分離；柱長(zhǎng)較長(zhǎng)通常會(huì)導(dǎo)致DNA讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，但是工作時(shí)間短；通過(guò)降低柱長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)快速分離，但同時(shí)降低了DNA的讀長(zhǎng)和分辨率。
工作電場(chǎng)強(qiáng)度影響到DNA測(cè)序的速度、讀長(zhǎng)和分辨率。圖16是在工作電場(chǎng)強(qiáng)度為200V/cm和150V/cm時(shí)，在581個(gè)堿基后pGEM3Zf(+)(C-mix)的電泳圖。和較高的工作電場(chǎng)強(qiáng)度(200V/cm)相比，較低的工作電場(chǎng)強(qiáng)度(150V/cm)使得DNA讀長(zhǎng)更長(zhǎng)、分辨率更高和遷移時(shí)間更長(zhǎng)。
溫度影響DNA分離。一般地，柱溫適當(dāng)增加(低于50℃)，會(huì)提高分離效果和分離速度，這也有助于DNA大片段的分離。當(dāng)使用LPA和PDMA構(gòu)成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為DNA分離介質(zhì)時(shí)，能觀察到非常相近的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。
LPA與PDMA比率的影響圖17示出了DNA測(cè)序樣品的分離，該分離是使用LPA與PDMA比率為1.62∶1，3.33∶1，6.33∶1，和10.9∶1的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)。在無(wú)涂層的毛細(xì)管中，將分子量為6.4×106g/mol的LPA作為DNA分離介質(zhì)，分離效能非常差，如圖17a所示。通過(guò)添加非常少量的PDMA形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)可以顯著提高分離效果，如圖17e所示，其中，LPA與PDMA比率為10.89∶1。但是，PDMA量的進(jìn)一步增加會(huì)削弱分離效果。如圖17b-d所示，當(dāng)LPA與PDMA比率從6.33∶1降到1.62∶1時(shí)，分離分辨率相應(yīng)降低。
在圖17中，LPA的分子量非常高(6.4×106g/mol)。含少量PDMA(LPA∶PDMA為10.9∶1)的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的形成在沒(méi)有相分離的情況下優(yōu)化了該網(wǎng)絡(luò)。另外，PDMA提供了足夠強(qiáng)的動(dòng)態(tài)涂布能力，能抑制電滲流。PDMA含量增加(LPA∶PDMA為6.33∶1)會(huì)導(dǎo)致分離效能更差。并且，PDMA含量進(jìn)一步增加會(huì)引起微相分離，這會(huì)破壞類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的性能，如圖17b和17c所示。
LPA分子量的影響為了開(kāi)發(fā)適用于DNA測(cè)序分析的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，使用分子量盡可能高的LPA來(lái)形成主要骨架，然后將少量PDMA單體聚合，以優(yōu)化類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的形成并提供動(dòng)態(tài)涂布能力。圖18示出了LPA分子量對(duì)DNA分離的影響。當(dāng)保持LPA∶PDMA比率幾乎不變并且較低(小于10∶1以保持LPA和PDMA的相容性)時(shí)，LPA的分子量越高，分辨率越好并且讀長(zhǎng)越長(zhǎng)。由大尺寸的LPA形成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的主要骨架提供了幾乎所有的篩選能力?；ゴ㏄DMA鏈的存在擴(kuò)展了LPA鏈，并且，使得分離介質(zhì)更有效。
LPA分子量分布的影響如圖18所示，類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中更高的LPA分子量會(huì)產(chǎn)生更好的分辨率和更長(zhǎng)的DNA讀長(zhǎng)。為了增加LPA的分子量，可以采用不同的合成方法。在一種方法中，采用無(wú)乳化劑的方案來(lái)聚合LPA(樣品AO，表1)。在另一種方法中，采用反相微乳液聚合的方案來(lái)聚合LPA(樣品A4，表1)。用兩種方法都成功合成了片段大于9×106的高分子量LPA。這樣的LPA用于形成具有類(lèi)似量的PDMA的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其在DNA分離中的性能如圖19所示。用反相微乳液聚合法合成的LPA在同PDMA(圖19b)形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)后，分離能效更佳。所有的其它條件，如LPA分子量、LPA∶PDMA比率和形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的方法，幾乎相同。
優(yōu)化條件下的DNA測(cè)序?yàn)榱颂岣逥NA分離的處理量，讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的快速分離是一個(gè)很實(shí)用的方法。采用下面的工作條件有效柱長(zhǎng)為34m，工作電壓為225V/cm，在75V/cm進(jìn)行DNA注入，時(shí)間是8s，溫度為45℃。類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)具有如下參數(shù)2.5w/v％(LPA的Mv是4.53×106g/mol)，LPA/PDMA比率為10.81∶1。使用Fam標(biāo)記的-21 M13引物在pGEM-3Zf(+)模板上形成C端單染料標(biāo)記的DNA序列測(cè)定片段的電泳譜圖，如圖15所示。在室溫下，能實(shí)現(xiàn)高達(dá)617個(gè)堿基時(shí)，單個(gè)堿基分辨率為0.63，高達(dá)～1000個(gè)堿基時(shí)單堿基分辨率為0.3。值得注意的是，操作溫度越高(＞50℃)，具有相當(dāng)?shù)姆直媛仕璧墓ぷ鲿r(shí)間越短。
實(shí)施例3在LPA中聚合PDMA以生成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)(a)樣品制備采用反相微乳液聚合法將已純化的丙烯酰胺單體聚合成LPA。在LPA主要骨架中將二甲基丙烯酰胺單體進(jìn)行自由基聚合，形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。
(b)激光散射用溶液的制備配制兩種溶于1×TTE緩沖溶液中，濃度分別為7.77×10-2g/ml和1.20×10-2g/ml的LPA和類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的儲(chǔ)備溶液。將該儲(chǔ)備溶液保存在50ml的容量瓶中，在慢速搖動(dòng)混合器上振蕩至少7到10天，以制備均一的溶液。通過(guò)稀釋儲(chǔ)備溶液制備用于光散射檢測(cè)的，指定濃度的六種LPA溶液和五種類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)溶液。將每種稀釋液通過(guò)離心(7700g(-8000rpm)，6h)凈化。上層無(wú)塵溶液用來(lái)檢測(cè)該溶液光散射的特征。
(c)光散射檢測(cè)在散射角為15°到139°、溫度25℃下，使用實(shí)驗(yàn)室自制激光散射分光計(jì)進(jìn)行靜態(tài)和動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)。在532nm波長(zhǎng)處激光輸出功率為～500mW。利用Brookhaven Instruments B19000數(shù)字相關(guān)儀測(cè)定在散射角為30°、35°、40°、50°、60°、70°和90°時(shí)的強(qiáng)度-強(qiáng)度自相關(guān)函數(shù)。
圖1和圖2分別示出了LPA和類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的靜態(tài)光散射結(jié)果。圖3和圖4分別示出了LPA和類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果。圖3出現(xiàn)兩個(gè)峰，其中一個(gè)是在Rh～15nm處的微小峰，而另一個(gè)是在Rh～80nm處的主峰。對(duì)類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)而言，該微小尺寸的成分可在澄清過(guò)程中去除。但是，該微小峰的存在可能是LPA的聚合過(guò)程的指示，其中可能涉及分子鏈增長(zhǎng)的兩個(gè)獨(dú)立步驟。開(kāi)始步驟中形成較小尺寸的分子鏈，后續(xù)步驟中形成較大尺寸的分子鏈。
(d)毛細(xì)管電泳類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)分離介質(zhì)的制備在一個(gè)5ml小瓶中，將干燥的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)溶解在1×TTE+7M尿素緩沖溶液中?？?cè)芤后w積一般少于2ml，并且聚合物濃度約為2-2.5％g/ml。通過(guò)靜置過(guò)夜，使干燥樣品溶脹成凝膠狀溶液后，在旋渦混合器上將該凝膠狀溶液徹底混合20s，每天兩次，直到聚合物全部溶解。至少要花3-4天時(shí)間來(lái)制備其均一溶液。在使用之前，(聚合物溶液)分離介質(zhì)要進(jìn)行離心，以除去氣泡。
(e)CE電泳三種用于CE檢測(cè)的不同儀器(i)實(shí)驗(yàn)室自制的具有水冷卻的氬離子激光器的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，λ＝488nm，其用于單染料[FAM]標(biāo)記的引物和C端混合DNA(pGEM-3Zf(+)從-21M13上游引物)的DNA測(cè)序分析。
在圖5中，測(cè)序分析數(shù)據(jù)表明具有單個(gè)堿基分辨率(僅用肉眼)的1000個(gè)堿基的分離可在30min內(nèi)完成。
用于DNA分離的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)與各種聚合物介質(zhì)的商業(yè)產(chǎn)品的比較圖6示出了DNA(pGEM-3Zf(+)從-21M13上游引物)測(cè)序分析數(shù)據(jù)。根據(jù)Amersham Biosciences公司推薦，在44℃和150V/cm下，MegaBACE LPA凝膠/1×MegaBACE緩沖液中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。圖7示出了相同DNA的測(cè)序分析數(shù)據(jù)，但是是在50℃和200V/cm下，在介質(zhì)POP-6(Applied Biosystems)/1×TTE緩沖液中進(jìn)行CE，這是POP6的CE常規(guī)工作條件。
作為對(duì)比，可將800b的DNA樣品的遷移時(shí)間作為分離的速度標(biāo)準(zhǔn)，利用類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)的分離可在26.3min(t800，IPN)內(nèi)完成(圖5)，而利用MegaBACE LPA凝膠作為分離介質(zhì)的分離在89min(t800，LPA)內(nèi)才能完成(圖6)。
在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)介質(zhì)中DNA的分離速度比在MegaBACE LPA凝膠中DNA的分離速度快約3倍。在POP6介質(zhì)中的DNA分離不能達(dá)到800b(圖7)。如果590b的遷移時(shí)間可用作DNA分離的速度標(biāo)準(zhǔn)，那么使用類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)、MegaBACE LPA和POP6作為分離介質(zhì)的遷移時(shí)間分別是t590，IPN＝～22min，t590，LPA＝～70.5min和t590，POP6＝～89min。在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)中590bpDNA的分離所需的時(shí)間僅是在MegaBACE LPA中所需時(shí)間的三分之一，在POP6中所需時(shí)間的四分之一。
ABI3 10遺傳分析儀是一種自動(dòng)化的單毛細(xì)管遺傳分析儀，其被設(shè)計(jì)并被優(yōu)化，以支持寬范圍的測(cè)序和片段分析應(yīng)用。用BigDyeTerminator v3.0標(biāo)準(zhǔn)DNA來(lái)表明測(cè)序分析性能。
圖8示出了BigDye v3.0的電泳分離的末端部分(堿基數(shù)從600到～1000)。在ABI310上，使用經(jīng)表征的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)介質(zhì)，能在36min內(nèi)完成四色BigDye v3.0 DNA的1000個(gè)堿基的分離。
圖9示出了利用POP6介質(zhì)和Module seq POP6(1mL)E對(duì)BigDye v3.0進(jìn)行電泳分離的藍(lán)色-G部分。860b(t860，POP6)的遷移時(shí)間是～61.5min，是利用類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)分離介質(zhì)的860b(t860，IPN)的遷移時(shí)間～32min的1.9倍(圖8)。ABI310不能使用MagBACE LPA凝膠，因?yàn)樵撃z粘滯度高，而ABI310的泵壓不足以進(jìn)行檢測(cè)。
當(dāng)類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)用作分離介質(zhì)時(shí)，肉眼能從電泳分離數(shù)據(jù)中讀取長(zhǎng)的堿基識(shí)別(long base-call)(1007b)(圖8)，而當(dāng)POP6用作分離介質(zhì)時(shí)，肉眼只能讀取860b(圖9)。
實(shí)驗(yàn)室自制的具有硅雪崩光電二極管的激光誘導(dǎo)的熒光(四色)檢測(cè)器(Perkin Elmer Model SPCM-AQR-12-FC)可用以對(duì)BigDye Terminator v3.0進(jìn)行序列分析。該檢測(cè)器由Stony Brook的SUNY工程學(xué)院(Engineering College)制備。作為對(duì)比，CE在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)和Applied Biosystems公司的新產(chǎn)品POP7的不同的介質(zhì)中進(jìn)行。
在圖10中，DNA(BigDye Terminator v3.0)的堿基識(shí)別數(shù)據(jù)表明在60℃和304V/cm下，當(dāng)CE在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)/1×ABI緩沖液中進(jìn)行時(shí)，具有單堿基分辨率的600堿基的分離能在～30.4min(t600，IPN)內(nèi)完成。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度為50cm，毛細(xì)管ID/OD＝50/361(μm)。但是，當(dāng)POP7/1×ABI緩沖液作為分離介質(zhì)時(shí)，在60℃和196V/cm下，對(duì)相同DNA的600個(gè)堿基的分離獲得的最好分離結(jié)果是在～63.3min(t600，POP7)內(nèi)。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度和ID/OD的比率分別是相同的，在50cm和50/361(μm)。圖11是堿基識(shí)別數(shù)據(jù)。在類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)介質(zhì)中，分離具有單堿基分辨率的600b的DNA分離所需的時(shí)間比在POP7中所需時(shí)間少一半。(儀器和堿基識(shí)別軟件由StonyBrook的SUNY工程學(xué)院提供。)實(shí)施例4形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的溶液混合方法分別配制兩種不同聚合物的稀釋溶液。這兩種聚合物溶液逐漸混合到一起，以形成具有指定濃度和聚合物組分的組成的均一溶液混合物。
LPA和PDMA是部分相容的聚合物對(duì)。為制備CE檢測(cè)用分離介質(zhì)，通過(guò)使用溶液混合方法制成均一的LPA和PDMA溶液混合物。分別配制LPA/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液。將LPA(Mw＝7.62×106g/mol)溶解在1×TTE+7M尿素緩沖液中，以配制成2.57％g/ml的溶液。將PDMA(Mw＝470Kg/mol)溶解在1×TTE+7M尿素緩沖液中，以配制成1.61％g/mL的溶液。在每種聚合物在其自身的緩沖劑中完全溶解后，以100μl等分量將300μlPDMA溶液逐步加入0.9ml LPA溶液中。在每次添加PDMA溶液后，將溶液混合物在旋渦混合器上混合20s。溶液混合物中LPA和PDMA的含量分別是83％和17％。值得注意的在PDMA分子量為470K時(shí)，濃度1.61％g/mL已高于其C*值。
圖12示出了利用根據(jù)實(shí)施例3制備的LPA/PDMA類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)的CE結(jié)果。作為對(duì)比，圖13示出了利用根據(jù)實(shí)施例2制備的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)作為分離介質(zhì)的CE結(jié)果。在同樣工作條件下，兩種分離介質(zhì)的DNA分離結(jié)果非常相近。電泳在工作電場(chǎng)為195.5V/cm下進(jìn)行，并且DNA注入時(shí)間為在27V/cm時(shí)20s。
實(shí)施例5一種生成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)的溶液混合方法原材料包括分子量約7M的LPA；和分子量約0.5M的PDMA。采用如下所示的幾種不同方法配制最終總濃度為2～2.5-wt％(0.02～0.025g/mL)的混合溶液。
A)配制LPA/PDMA的濃度比(wt％)為1.6/1的溶液。LPA溶液的濃度為0.0257g/mL，PDMA溶液的濃度為0.016g/mL。采用下述各方式混合最終總濃度為2～2.5wt％的混合溶液。

*假設(shè)體積和體積單位不變。
B)配制LPA/PDMA的濃度比(wt％)為2/1的溶液，其中LPA溶液的濃度為0.028g/ml，PDMA溶液的濃度為0.014g/ml。采用下列各方式混合最終總濃度為2～2.5wt％的混合溶液。

*假設(shè)體積和體積單位不變。
權(quán)利要求
1.一種聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，所述聚合物鏈包括(a)以主要骨架形式存在的線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈，所述聚丙烯酰胺鏈的重均分子量為約0.05×106到約25×106g/mol，旋轉(zhuǎn)半徑為約10nm到350nm；以及(b)聚二甲基丙烯酰胺鏈(PDMA)鏈，所述PDMA鏈?zhǔn)窃贚PA主要骨架存在下，通過(guò)聚合PDMA制備，其中，所述LPA鏈和PDMA鏈彼此纏結(jié)、互穿，并且其中，所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，LPA主要骨架是通過(guò)反相微乳液聚合形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA是在LPA主要骨架中通過(guò)自由基聚合而聚合形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA主要骨架包括緩沖溶液中的LPA，其中，所述LPA具有的交疊濃度為約5×10-4到4.0×10-2g/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA主要骨架在緩沖溶液中的交疊濃度為約1.2×10-3g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的重均分子量的下限為約0.05×106、0.1×106、0.3×106、1×106、4×106、6×106或7×106g/mol。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的重均分子量范圍的上限為約8×106、10×106、15×106或25×106g/mol。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限為約10nm、15nm、28nm、55nm、125nm、150nm或165nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的上限為約180nm、210nm、250nm或3 50nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的多分散指數(shù)為約1.01到1.8。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的多分散指數(shù)范圍的下限為約1.01、1.02、1.05或1.1。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的多分散指數(shù)范圍的上限為約1.3、1.5、1.6或1.8。
13.一種纏結(jié)的聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中所述聚合物鏈包括(a)線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈；和(b)纏結(jié)在所述LPA鏈內(nèi)并互穿在LPA鏈中的聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈，其中，所述LPA和PDMA的重均分子量為約0.1×106g/mol到約20×106g/mol，旋轉(zhuǎn)半徑為約1 5nm到320nm，其中所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述重均分子量范圍的下限為約0.1×106、0.5×106、2×106或6×106g/mol。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述重均分子量范圍的上限為約7×106、10×106、16×106或20×106g/mol。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限為約10nm、15nm、40nm、80nm或150nm。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述旋轉(zhuǎn)半徑范圍的上限為約165nm、210nm、280nm或320nm。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA和PDMA的多分散指數(shù)均為約1.0到1.8。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA和PDMA的多分散指數(shù)均為約1.6。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述網(wǎng)絡(luò)在緩沖溶液中的交疊濃度為約5.0×10-4到3.0×10-2g/ml。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的量與所述PDMA的量的比率范圍為約10∶1到15∶1，其中，所述LPA的重均分子量的范圍為約6×106到7×106g/mol。
22.一種纏結(jié)的聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，由下述方法制備得到，所述方法包括(a)提供一種包括線性聚丙烯酰胺(LPA)和緩沖劑的溶液，其中，所述LPA的重均分子量為0.05×106到25×106g/mol；(b)提供一種包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和緩沖劑的溶液，其中，所述PDMA的重均分子量為100000到25×106g/mol；(c)以分步方式將LPA/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液混合，其中，所述LPA/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到15倍，所述LPA/緩沖劑溶液的體積是PDMA溶液體積的約1到50倍；其中，制備得到由纏結(jié)、互穿的LPA和PDMA聚合物鏈構(gòu)成的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的重均分子量范圍的下限為0.05×106、0.1×106、0.3×106或1×106g/mol。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA的重均分子量范圍的上限為4×106、6×106、7×106、8×106、10×106、15×106或20×106g/mol。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA的重均分子量范圍的下限為100000、300000或500000g/mol。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA的重均分子量范圍的上限為1×106、3×106、10×106、或25×106g/mol。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述LPA/緩沖劑溶液的濃度為約1.0到12.0％g/ml。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA/緩沖劑溶液的濃度為約0.1到3.0％g/ml。
29.一種分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)的方法，所述方法包括在外加電場(chǎng)的作用下，使帶電分子類(lèi)物質(zhì)在分離介質(zhì)中發(fā)生遷移，其中，對(duì)所述分離介質(zhì)的改進(jìn)包括LPA聚合物體系和PMDA聚合物體系，其中所述的聚合物體系形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述互穿網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)合成LPA主要骨架、以及在所述主要骨架內(nèi)聚合PDMA制備得到。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，制備所述互穿網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)(a)提供一種包括LPA和緩沖劑的溶液，其中，所述LPA的重均分子量為0.05×106到25×106g/mol；(b)提供一種包括PDMA和緩沖劑的溶液，其中，所述PDMA的重均分子量為100000到25×106g/mol；以及(c)以分步方式將LPA/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液進(jìn)行混合，其中，所述LPA/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到15倍，所述LPA/緩沖劑溶液的體積是PDMA溶液體積的約1到50倍。
32.一種聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，所述聚合物鏈包括(a)以主要骨架形式存在的丙烯酰胺(AM)/二甲基丙烯酰胺(DMA)無(wú)規(guī)共聚物鏈，其中所述無(wú)規(guī)共聚物鏈的重均分子量為約0.05×106到約2×106g/mol，旋轉(zhuǎn)半徑為約10nm到80nm；以及(b)聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈，其中所述PDMA鏈?zhǔn)窃跓o(wú)規(guī)共聚物主要骨架存在下，通過(guò)聚合PDMA制備得到的；其中，所述AM/DMA鏈和PDMA鏈彼此纏結(jié)，彼此互穿，并且其中所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，無(wú)規(guī)共聚物主要骨架是通過(guò)自由基聚合形成的。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA是在無(wú)規(guī)共聚物主要骨架內(nèi)，通過(guò)自由基聚合而聚合得到。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述無(wú)規(guī)共聚物主要骨架包括緩沖溶液中的共聚物，其中所述無(wú)規(guī)共聚物的交疊濃度為約3×10-3到4.0×10-2g/ml。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物主要骨架在緩沖溶液中的交疊濃度為約1×10-2g/ml。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量范圍的下限為約0.05×106、0.1×106、或0.3×106g/mol。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述的無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量范圍的上限為約0.5×106、1×106、或2×106g/mol。
39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的下限為約10nm、15nm、或30nm。
40.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物的旋轉(zhuǎn)半徑范圍的上限為約40nm、55nm或80nm。
41.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述無(wú)規(guī)共聚物的多分散指數(shù)為約1.1到2.0。
42.根據(jù)權(quán)利要求32所述的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述AM的量與DMA的量的比率范圍為約5∶1到50∶1，其中，所述無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量范圍為約0.05×106到2×106g/mol。
43.一種纏結(jié)的聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)由下述方法制備得到，所述方法包括(a)提供一種包括AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和緩沖劑的溶液，其中，所述AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量為0.05×106到2×106g/mol；(b)提供一種包括聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)和緩沖劑的溶液，其中，所述PDMA的重均分子量為0.05×106到25×106g/mol；(c)以分步方式將共聚物/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液進(jìn)行混合，其中，所述共聚物/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到50倍，所述共聚物/緩沖劑溶液的體積是PDMA/緩沖劑溶液體積的約1到20倍；其中，制備得到纏結(jié)的共聚物鏈和PDMA聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物的重均分子量范圍的下限為0.05×106、0.1×106、或0.3×106g/mol。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物的重均分子量范圍的上限為0.5×106、1×106、1.5×106或2×106g/mol。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA的重均分子量范圍的下限為50,000、100,000、或200,000g/mol。
47.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA的重均分子量范圍的上限為500,000、1×106、3×106、5×106、10×106、或25×106g/mol。
48.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述共聚物/緩沖劑溶液的濃度為約5.0到20.0％g/ml。
49.根據(jù)權(quán)利要求43所述的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述PDMA/緩沖劑溶液的濃度為約0.1到1.0％g/ml。
50.一種分離帶電分子類(lèi)物質(zhì)的方法，所述的方法包括在外加電場(chǎng)的影響下，使帶電分子類(lèi)物質(zhì)在分離介質(zhì)中發(fā)生遷移，其中對(duì)所述分離介質(zhì)的改進(jìn)包括AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和PMDA聚合物，其中，所述聚合物體系形成類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述的互穿網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)合成AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物主要骨架，和在所述主要骨架內(nèi)聚合PDMA制備得到。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，制備所述的互穿網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)(a)提供一種包括AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物和緩沖劑的溶液，其中，AM/DMA無(wú)規(guī)共聚物的重均分子量為0.05×106到2×106g/mol；(b)提供一種包括PDMA和緩沖劑的溶液，其中，PDMA的重均分子量為50,000到25×106g/mol；以及(c)以分步形式將共聚物/緩沖劑溶液和PDMA/緩沖劑溶液進(jìn)行混合，其中所述共聚物/緩沖劑溶液的濃度是PDMA/緩沖劑溶液濃度的1到50倍，所述共聚物/緩沖劑溶液的體積是PDMA溶液體積的約1到20倍；其中，制備得到纏結(jié)的共聚物和PDMA聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，其中，所述類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)基本無(wú)化學(xué)交聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合物鏈的類(lèi)互穿網(wǎng)絡(luò)，該聚合物鏈包括以主要骨架形式存在的線性聚丙烯酰胺(LPA)鏈和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)鏈。該LPA鏈的重均分子量大約是0.05×10
文檔編號(hào)B01DGK1997678SQ200480027066
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2004年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者朱鵬年, 宋立國(guó), 方渡飛, 梁德海, 劉天波, 王延梅, 應(yīng)琦琮 申請(qǐng)人:紐約州州立大學(xué)研究基金會(huì)