專利名稱：光電流發(fā)生器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光化學(xué)電流發(fā)生裝置領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
已有多種金改性的表面被用于產(chǎn)生和分析光電流[7-9]。借助ITO或Au大電極(macroelectrode)，可將多種光子接收基團(tuán)，或基團(tuán)組合應(yīng)用于光電流發(fā)生器，例如富勒烯，[6，8，11-32]卟啉，[5，6，8，9，11，13-16，20，21，23-25，29-31，33-44]二茂鐵，[5，8，13，23，24，29，36，42，45]Ru(bipy)3[29，46-48]和芘[7-9，45]。在某些情況下，光電流的產(chǎn)生通過生物分子間隔基團(tuán)介導(dǎo)[7，49-52]。
發(fā)明概述在可選擇的方面，本發(fā)明提供了包括諸如熒光素的接收光子的電子轉(zhuǎn)移部分的系統(tǒng)，其中該電子轉(zhuǎn)移部分通過諸如核酸的傳導(dǎo)性間隔部分連接到電極(其可以是能進(jìn)行電子轉(zhuǎn)導(dǎo)的任意表面，即電化學(xué)轉(zhuǎn)換器)。向所述電極施加偏置電勢以還原所述接收光子的電子轉(zhuǎn)移部分，從而形成還原的接收光子的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)，例如FI-自由基，其能夠吸收光子形成激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)。所述系統(tǒng)還具有電子接收部分，例如NAD或NADP，其能從所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)接收電子，從而形成還原的電子受體，例如NADH或NADPH。所述電子接收部分可置于含有支持電子轉(zhuǎn)移的電解質(zhì)的溶液中，該溶液可稱為電子轉(zhuǎn)移溶液，例如能向所述還原的電子受體提供質(zhì)子的水溶液?？蓪⑺鲞B接的電子轉(zhuǎn)移部分浸入所述電子轉(zhuǎn)移溶液中，從而供應(yīng)所述溶液中的所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)和連續(xù)的電子接收部分之間的重復(fù)的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)?？蓪υ撓到y(tǒng)所用的電化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行選擇，使得施加于所述電極用來形成所述還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的偏置電勢低于形成所述還原的電子受體所需的電勢，因而使得在所述電極上沒有發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成所述還原的電子受體的傾向?？蓪λ鱿到y(tǒng)的組件進(jìn)行選擇，從而使得所述還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的生成速率高于所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)向所述電子受體供給電子的速率，從而使得當(dāng)向所述電極施加適當(dāng)?shù)钠秒妱輹r，大部分所述電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)處于還原態(tài)，其易于吸收光子形成所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)。
所述還原的電子受體可以用于例如產(chǎn)生氫的反應(yīng)。
在本發(fā)明的一些實施方案中，可以向所述電子轉(zhuǎn)移溶液中加入能利用所述還原的電子受體如NAD(P)H的酶或其他化學(xué)或生物化學(xué)系統(tǒng)，來利用所述還原的電子受體。在這些實施方案中，所述還原的電子受體可以是例如有生物活性的酶輔因子。所述光電化學(xué)產(chǎn)生的輔因子可以進(jìn)行例如酶學(xué)利用來驅(qū)動醛向醇的轉(zhuǎn)化，酮的還原，還原氨基化或有機(jī)酸的還原。因此，本發(fā)明的光化學(xué)再生的輔因子如NAD(P)H可用于驅(qū)動多種次級生物催化轉(zhuǎn)化，例如還原轉(zhuǎn)化或生物催化的酶級聯(lián)反應(yīng)。
附圖的簡要說明
圖1所示為使用微電極產(chǎn)生光電流的實驗裝置的示意圖(如本文所述，替換實施例可使用多種電極構(gòu)造以及表面類型)。
圖2所示為(a)在(a)在KOH中，及(b)在KOH和熒光素存在的條件下，在pH12，50mV·s-1時BAS大電極上的暗(Dark)電流CVs。(b)在pH8.6，50mV·s-1時開燈(-)和關(guān)燈(-)條件下微電極的CVs。參比電極為Ag/AgCl。
圖3所示為(a)在不同的電勢施加持續(xù)時間(vs.Ag/AgCI)i)0mV，ii)-750mV，1min，iii)-750mV，2min，iv)-750mV，3min，v)-750mV，6min，vi)-750mV，10min，vii)-750mV，20min的條件下熒光素的UV-可見吸收光譜；(b)在不同的電勢施加持續(xù)時間(vs.Ag/AgCl)i)0mV，ii)-750mV，1min，iii)-750mV，2min，iv)-750mV，3min，v)-750mV，4min的條件下熒光素的發(fā)射光譜。
圖4所示為(a)在-750mV(vs.Ag/AgCl)大量電解1小時之后的1∶2的ERP光譜；以及(b)模擬的1∶2的ERP光譜。
圖5所示為來自通過Au微電極上的1∶2單層產(chǎn)生光電流的實施例的數(shù)據(jù)，其中所示為(a)溶液中有NADP+；(b)溶液中沒有NADP+；以及(c)632nm輻射(功率＝10mW·cm-2)照射下的1∶2單層以及溶液中存在NADP+。
圖6所示為在缺乏NADP+(□)和存在NADP+(○)的情況下，(a)光電流響應(yīng)對所施加的還原電勢的函數(shù)；以及(b)光電流響應(yīng)對光強(qiáng)度的函數(shù)。
圖7顯示了多次激發(fā)響應(yīng)，其表明光電流作為重復(fù)次數(shù)的函數(shù)有小幅降低。
圖8所示為在473nm輻射、4mW·cm-2和0.1mM NADP+溶液的條件下，來自Au網(wǎng)電極(mesh electrode)上的1∶2單層的光譜電化學(xué)數(shù)據(jù)。(a)在0mV(-)和-750mV(--)vs.Ag/AgCl條件下的基線NADP+；(b)為乳酸脫氫酶和丙酮酸加入前(--)和加入后(-)的UV-可見光譜。
圖9所示為光電流產(chǎn)生和NADP+還原的推定機(jī)理的示意圖，其僅出于概念性目的(而不必描述本發(fā)明實施方案運作的實際機(jī)理)。
圖10所示為本發(fā)明的氫發(fā)電機(jī)的示意圖，其中暗反應(yīng)艙含有可利用還原的電子受體“NXH”(例如NADH[我們可以插入可選擇的煙酰胺衍生物的描述，如果你知道它們是什么的話？])的氫化酶或其他催化劑來合成H2，其中所述還原的電子受體NXH由本發(fā)明的光反應(yīng)提供，該光反應(yīng)在與所述暗反應(yīng)艙存在液體連接的光反應(yīng)艙中進(jìn)行，其中連接到電極(電化學(xué)傳導(dǎo)性表面)的光子受體(熒光團(tuán)“F”)介導(dǎo)了所述NXH的合成。
圖11所示為在1∶2改性的金網(wǎng)電極上的光誘導(dǎo)的NADH電化學(xué)合成的UV-可見證據(jù)的示意圖。
圖12所示為在乙醛(acetylaldehyde)存在的條件下，顯示由醇脫氫酶(ADH，Baker’s Yeast，Sigma-Aldrich)引起的NADH酶消耗的UV-可見光譜的示意圖。
圖13所示為金電極上的熒光素標(biāo)記的DNA的自組裝單層上的NADH光生成作用的推定機(jī)理的示意圖，其僅為概念性目的(而不必描述本發(fā)明實施方案運作的實際機(jī)理)。
圖14a-b所示為金電極上的所述自組裝單層在輻射下生成光電流的示意圖。(a)473nm含NAD+；(b)473nm無NAD+；632nm含NAD+。標(biāo)尺(scaler)為Y＝200nA·cm-2，X＝20秒。
圖15a-b所示為(a)有NAD+(○)以及沒有NAD+(□)的條件下，電流密度對所述入射光強(qiáng)度的函數(shù)，以及(b)電流密度對所施加的電勢的函數(shù)。
圖16a-b所示為(a)從NAD+形成NADH光生成作用的分光光度分析。340nm的峰對應(yīng)NADH的形成。每條曲線代表步長為5分鐘的輻射。比色杯的體積為0.12ml。以及(b)通過NADH-依賴的醇脫氫酶(0.5U/ml)的催化，利用NADH驅(qū)動乙醛(10mM)向乙醇的轉(zhuǎn)化。340nm處吸光度的降低對應(yīng)NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化。每條曲線代表了3分鐘步長。在缺乏乙醛或醇脫氫酶的情況下，光譜無變化。
發(fā)明的詳細(xì)說明一方面，本發(fā)明提供了從金微電極上的熒光素標(biāo)記DNA的自組裝單層(SAM)產(chǎn)生光電流的系統(tǒng)。在這類實施方案中，熒光素作為光子受體(或熒光團(tuán))，DNA作為將所述光子受體或熒光團(tuán)連接到所述電極表面的間隔基團(tuán)。熒光素具有相對較大的摩爾吸光度，因而更容易吸收光子來進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)[10]。在示例性的實施方案中，使用所述DNA間隔基團(tuán)的部分原因是間隔物長度依賴性的研究證實較短的間隔基團(tuán)其光電流降低，表明通過緊密接近電極表面可以使將激發(fā)狀態(tài)的熒光團(tuán)其失活。在適應(yīng)這些限制的情況下，本發(fā)明也可選用其他的熒光團(tuán)和間隔基團(tuán)?？蛇x擇的間隔基團(tuán)可包括，例如傳導(dǎo)性的聚合物，如多吡咯類，聚噻吩類，聚苯乙炔類，肽類，聚酰胺或肽核酸(PNAs)。可選擇的光子受體包括卟啉類，黃素類，泛醌類，醌類，二茂鐵，Ru(bipy)3，亞甲基蘭，亞甲基綠，MV+，芘和納米顆粒類(例如Au，Ag，CdSe，SdS，ZnSe，ZnS，Pd，Pt)?？蛇x擇的基體可包括，例如，銦錫氧化物(ITO)，Ag，Pt和Si表面，其可形成為具有多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面，從微電極到大的平表面?；就该鞯腎TO電極組(electrode stack)可適用于提供穿過電子受體的電流，從而所述電子受體(例如NAD(P)H)從所述電極組的照射面進(jìn)入，而還原的電子受體(例如NAD(P)H)則從所述電極組的無照射面離開，該過程中所述基本透明的電極組在所述電極組的整個深度范圍內(nèi)都能協(xié)助對所述系統(tǒng)的照射。
如圖10所示，所述還原的電子受體可用于例如產(chǎn)生氫的反應(yīng)中。如圖11和圖12所示，通過本發(fā)明系統(tǒng)生成的NADH可用于酶催化。圖11顯示了1∶2改性的金網(wǎng)電極上的光誘導(dǎo)的NADH電化學(xué)產(chǎn)生。圖12顯示了乙醛存在下，由醇脫氫酶(ADH，面包酵母，Sigma-Aldrich)引起的NADH的酶消耗。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在所述電子轉(zhuǎn)移溶液中加入了利用所述還原的電子受體NADH的酶生物化學(xué)系統(tǒng)，說明了對具有生物學(xué)活性的還原的電子受體的利用。如圖16b所示，可將光電化學(xué)產(chǎn)生的NADH用于驅(qū)動乙醛向乙醇的酶學(xué)轉(zhuǎn)化。在一定的條件下，所述過程對氧氣，有機(jī)溶劑和其他化合物的抑制作用有耐受性。在替換的實施方案中，由本發(fā)明系統(tǒng)產(chǎn)生的諸如NAD(P)H的還原的電子受體可用于多種其他反應(yīng)。
實施例1材料與制備在國家研究委員會(Saskatoon，SK，Canada)采用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方法合成并純化了DNA，并對其純度和特性進(jìn)行驗證。通過將固定在軟質(zhì)玻璃(soft glass)內(nèi)的50μm Au絲熔化，然后用0.05μm氧化鋁漿液拋光，再浸入熱的Piranha浸蝕溶液(H2SO4∶H2O2＝3∶1)中10分鐘來進(jìn)行洗滌(操作Piranha浸蝕溶液應(yīng)極其小心，且不能將其儲存于密閉容器中，其是非常強(qiáng)的氧化劑，能與大多數(shù)有機(jī)材料劇烈反應(yīng))，最后在Millipore H2O中進(jìn)行超聲波處理，制備得到金電極。采用光學(xué)顯微鏡對每個電極進(jìn)行檢查，以確保所述Au電極表面光滑，并且在所述玻璃和所述Au之間形成了有效的密封。然后在0.5M H2SO4溶液中通過從電勢-0.1到+1.25V vs.Ag/AgCl的循環(huán)掃描對所述電極進(jìn)行電化學(xué)處理，直到在1.1V得到穩(wěn)定的金氧化峰。
通過將所述微電極在含0.05mM雙鏈DNA的50mM Tris-ClO4的緩沖溶液(pH8.6)中孵育5天，制備了FI-DNA改性的金電極。然后，如圖1所示，將所述電極用相同的Tris-ClO4緩沖溶液進(jìn)行清洗，并裝備入光-電化學(xué)電池中。為了排除可能影響計時安培分析法的反電極反應(yīng)，優(yōu)選對所述反電極進(jìn)行隔離。
光電流條件如下，將激光功率為4mW·cm-2，波長為473±5nm且光束直徑小于0.8mm的BM73-4V激光模塊(Intelite Inc.，Genoa，NV，USA)用作激發(fā)源。所述光電流實驗是在采用連接到CV 203BUheadstage的Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)的電位箝條件下進(jìn)行的。將兩電極配置用于電位箝條件，參考電極為1M KCl溶液中的Ag/AgCl絲，工作電極為改性的Au微電極。所述光譜電化學(xué)電池裝入接地的法拉第籠子(Warner Instruments)中，并且放置于活化空氣防振動(Kinetic System)臺上。電流在1kHz通過低通貝塞爾濾波，并在5kHz由DigiData 1322A(Axon Instruments)進(jìn)行數(shù)字化，并通過由PC控制的PClamp 9.0(Axon Instruments)紀(jì)錄。進(jìn)一步濾波是采用20Hz的低通濾波器通過軟件方法實現(xiàn)的。對所有數(shù)據(jù)的分析是使用Origin7.0(OriginLab Corporation)進(jìn)行的。其他的電化學(xué)測量是使用BASCV-50伏特計和為采用標(biāo)準(zhǔn)3電極配置的微電極定制的電化學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行的。所述金微電極(50μm直徑)可作為工作電極。通過將Ag/AgCl絲密封入含有3M KCl并加蓋(capped)有Vycor尖端(tip)的玻璃管中，構(gòu)建了參比電極。通過含有所述電解質(zhì)的魯金毛細(xì)管(Luggin capillary)將所述參比電極從所述電池中隔離。所述反電極是鉑絲。在進(jìn)行測量之前，必須將全部電解質(zhì)溶液在空氣中凈化(purge)至少20分鐘，并且在測量過程中，在所述溶液上保持覆有Ar氣氛。所有實施方案都示例性地在室溫下進(jìn)行。
X-射線光電子能譜法實施如下。將配備有Al-Ká輻射源(1486.6eV)的Leybold MAX200光電管分光計用于收集光電子發(fā)射光譜。在測量過程中，在所述分析艙中的底壓一直保持在至少10-9mbar。所述出射角為60°。常規(guī)的儀器校正標(biāo)準(zhǔn)為Au 4f7/2峰(結(jié)合能84.0eV)。
電子順磁共振(EPR)的實施如下。用配備了高靈敏度圓柱腔(Model4107WZ，Bruker Spectrospin)的Bruker ESP300 X-帶場掃描分光計(共振頻率約9.4GHz)記錄所述EPR光譜。調(diào)制幅度為0.315G，微波功率為20mW，轉(zhuǎn)化時間為41ms，時間常數(shù)為20.5ms，并記錄了32次掃描。使用SimFonia軟件進(jìn)行EPR光譜的模擬。
結(jié)果與討論所述熒光素標(biāo)記的DNA(FI-DNA)的合成是使用標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸酯固體支持物在NRC，薩斯卡通，加拿大完成的。用于所述光電流實驗的序列如表1所示。對所述堿基序列進(jìn)行選擇，以最小化可選的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，并且引入等量的每種堿基。進(jìn)行DNA熔解研究來確認(rèn)所述雙鏈形式的存在/缺乏，并且確保所述熒光素的熒光團(tuán)不會對雙鏈的穩(wěn)定性造成顯著影響。1∶2雙鏈的DNA熔解曲線相比2∶3的雙鏈在Tm值上并無變化(56.8℃vs.56.4℃)，說明所述熒光素部分并沒有顯著干擾雙鏈形成。
表1用于光電流研究的DNA序列 FI＝熒光素
所述1∶2雙鏈與Au微電極在緩沖液中孵育5天，使得形成完整的單層。采用X-射線光電子能譜法(XPS)，橢圓光度法和電化學(xué)法對單層進(jìn)行分析。Au4f7/2峰強(qiáng)度的變化可用來測定所述單層的厚度，并給出了47(5)的值，其說明1∶2并不能形成多層結(jié)構(gòu)。正如對1∶2單層所預(yù)期的那樣，在162eV出現(xiàn)的S2p峰是Au-硫醇鍵的證據(jù)。值得注意的是，預(yù)期1∶2的二硫鍵通過化學(xué)吸附到所述Au表面會發(fā)生斷裂，并且未觀察到二硫鍵的能峰(164.1eV)。此外，在134eV對P2p峰進(jìn)行了測量，其對應(yīng)于DNA的磷酸主鏈。所述XPS結(jié)果提供了清晰的證據(jù)，說明單層通過硫鍵接所述Au表面。橢圓光度法得到Au基體上的1∶2單層的厚度為47(3)。這一數(shù)值與之前的20-mer DNA的測量[53]吻合，并且與自身通過XPS得到的數(shù)值一致，說明所述DNA對所述表面具有相當(dāng)大的傾角。
進(jìn)行電化學(xué)試驗來檢測具有1∶2單層的熒光素的氧化還原電勢。然而，由于所述熒光素氧化還原動力學(xué)的自身特性使得循環(huán)伏安法(CV)實驗較復(fù)雜。所述電化學(xué)還原/氧化過于緩慢，而難以進(jìn)行常規(guī)的CV分析。如圖2a所示，盡管在熒光素存在下，CV與缺乏熒光素的情況下并不相同，但是卻沒有可辨別的還原峰。圖2b所示為在黑暗中和受到輻射時熒光素的裸Au CV。當(dāng)所述電極暴露于輻射時，會朝向更高正電流的方向發(fā)生較小的變化。復(fù)雜的情況是所述還原電勢約為-750mV Vs Ag/AgCl，其相對接近所用pH條件下的質(zhì)子還原電勢。因此，由于所述緩慢的氧化還原動力學(xué)，且表觀電位接近產(chǎn)生氫的電勢，因此不可能有清晰的還原峰。其后果是表面覆蓋值不能象對具有良好表現(xiàn)的氧化還原探針一樣通過電化學(xué)定量。所述表面覆蓋的近似值是使用相同的DNA雙鏈得到的，除了用二茂鐵(Fc)替換了熒光素。這種Fc單層的表面覆蓋據(jù)報道為5×10-10mol·cm-2。運用阻抗光譜法(IS)來比較這兩種單層(1∶2對比1-Fc∶2)，從而驗證所述表面覆蓋近似值是否有效。很明顯，所述IS結(jié)果表明在所述相同條件下具有幾乎相同的表現(xiàn)，因而所述表面覆蓋值判定為在20％之內(nèi)。
進(jìn)行熒光素光譜電化學(xué)實驗來提供實際光電流生成實驗中所采用的光物質(zhì)的證據(jù)。當(dāng)施加幅度超過-750mV的電勢時，所述光譜中UV-可見區(qū)域的光吸收顯示出明顯的改變。所述光譜變化如圖3所示。所述熒光素吸收峰(492nm)的降低歸因于所述熒光素(FI)還原成了熒光素陰離子(FI-)。FI-具有獨特的光譜，與FI不同，表現(xiàn)為380-420nm和550-650nm范圍的峰增加[55-57]。
伴隨所述UV-可見光譜變化的是所述熒光素?zé)晒夤庾V的降低。圖3b所示的熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度的降低，說明FI-物質(zhì)具有較低的熒光量子產(chǎn)率。該失活途徑的降低可能是由電子轉(zhuǎn)移(ET)失活途徑的增長引起的。
對所述1∶2雙鏈和熒光素的電化學(xué)EPR研究毫無疑義地證實了在高于-750mV的電勢時，所述還原的FI作為熒光素陰離子自由基(FI-)。所述1∶2和熒光素的EPR光譜及其對應(yīng)的模擬光譜如圖4所示。所使用的模擬光譜數(shù)值見表2，并來自現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻(xiàn)[58-66]。
表2FI和FI-DNA質(zhì)子的偶合常數(shù)和不成對自旋密度 如圖5所示，對1∶2單層的輻射導(dǎo)致在施加-750mV的電勢時，產(chǎn)生了光電流。當(dāng)施加所述負(fù)電勢時，假定存在適合的電子受體，則所述激發(fā)態(tài)的FI-自由基變得能傳遞電子，從而產(chǎn)生電流。在這個實施例中，將NADP+作為受體基團(tuán)加入所述溶液中。重要的是，在產(chǎn)生光電流必需的電勢區(qū)域中，NADP+并沒有被電化學(xué)還原，因此所述電極上的NADP+電子受體也不可能還原。在缺乏NADP+(圖6b)的情況下也觀察到了光電流，但是在存在NADP+(圖6a)的情況下光電流大幅增強(qiáng)。紅色激光(632nm，10mW·cm-2)輻射則不會產(chǎn)生光電流(圖6c)。
對光子合成的暗反應(yīng)而言，NADP+是重要的化學(xué)能量儲備，因此，可開發(fā)作為生物系統(tǒng)中的能量儲備。圖6a所示為由對所述單層的輻射所產(chǎn)生的電流對所施加電勢的函數(shù)。所述電流在約-750mV時達(dá)到最大值，而在較低的外加電勢則急劇下降。在-750mV值最大說明在輻射前所述熒光素被還原成其自由基陰離子，然后進(jìn)行電子傳遞。如圖6b所示，在所述入射激光和輸出光電流之間存在線性關(guān)系。
通過反復(fù)暴露于激光對所述單層經(jīng)受多次激光激發(fā)的可利用性進(jìn)行了評估。如圖7所示，所產(chǎn)生的光電流確實隨著暴露次數(shù)的增加而減弱。然而，光電流降低的幅度卻相對較小。
在含有NADP+的溶液和1∶2單層的條件下，340nm峰的生成證實在本發(fā)明系統(tǒng)中形成了NADPH(圖8a)[68-70]。在電化學(xué)還原條件下通常形成NADP+二聚體，這些二聚體在340nm也有吸收峰[68-71]。
本發(fā)明一個方面的推定的光電流產(chǎn)生過程的示意圖如圖9所示。第一步(圖10a)可能是電子從金表面通過DNA的雙螺旋轉(zhuǎn)移到共價結(jié)合的熒光素，從而將熒光素還原成自由基陰離子。所述熒光素自由基陰離子顯示出具有特別長的壽命(以小時計算)。基于這個原因，F(xiàn)I-能存活足夠長的時間來吸收光子。一旦所述熒光素自由基陰離子吸收了適當(dāng)能量的光子(圖10b)形成了激發(fā)態(tài)的熒光素自由基陰離子(圖10c)，其隨后可以通過向擴(kuò)散的NADP+提供電子而返回基態(tài)。然而，NADP+是二電子受體。因此，相鄰或甚至可能是相同的鏈被再次還原和激發(fā)，為所述NADP提供第二個電子。在該包含在水性介質(zhì)中的系統(tǒng)內(nèi)可促進(jìn)NADP-的質(zhì)子化。
方程1涉及作為光電化學(xué)過程的特征的量子效率的測量。量子效率(φ)可定義為參與所述光電化學(xué)反應(yīng)的電子數(shù)(dNe-/dt，電子/秒)與每單位時間光活性分子吸收的光子數(shù)(dNhv/dt，光子/秒)的比率[7，8，12-14，16，21，24，30，32，33，36，37，40，72-76]。
在采用功率為4mW/cm2，λ＝473(5)nm的激光進(jìn)行激發(fā)時，在-750mV(vs.Ag/AgCl)的外加電勢下，F(xiàn)I-DNA標(biāo)記的微電極可得到450nA.cm-2的光電流密度。假設(shè)FI-DNA在電極表面的摩爾吸光系數(shù)和在溶液中時相同(ε473，43 000 M-1 cm-1)；則所述量子效率的計算值為0.25(5)。該數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于那些對卟啉SAM(0.1％)[35]，金表面上的含多層芘的系統(tǒng)(1％)[7]報導(dǎo)的數(shù)值，并且可與C60SAM系統(tǒng)中的數(shù)值[8，18，21-25]相比。
盡管在此公開了本發(fā)明的多種實施方案，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員仍可根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)在本發(fā)明的范圍之內(nèi)進(jìn)行諸多變換和修改。這些修改包括以基本相同的方法達(dá)到相同目的的，以公知的等價物對本發(fā)明任意方面進(jìn)行的替換。數(shù)值范圍包括用于限定該范圍的數(shù)值。本文中所用的術(shù)語“包含(comprising)”是開放性的術(shù)語，基本上相當(dāng)于術(shù)語“包括(including)，但不限于”，且術(shù)語“含有(comprises)”也具有相應(yīng)的含義。除非特別說明，本文所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”也包括了復(fù)數(shù)的情況。因此，例如，“物件(a thing)”可以包括超過一個這種物件。本文對參考文獻(xiàn)的引用并未承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本說明書中引用的優(yōu)先權(quán)文件和所有公開出版物，包括但不限于專利和專利申請，在此全文引入作為參考，其效力相當(dāng)于對每一出版物單獨且明確地說明將其引入作為參考，并且就像在本文中公開其全部內(nèi)容一樣。本發(fā)明還包括基本如前所述及參照所述實施例和附圖的全部實施方案及變化。
實施例2材料和制備電極如前所述制備了金微電極(50μm直徑)并對其進(jìn)行表征[104]。金網(wǎng)購自Alfa Aesar(99.9％純度，由0.1mm直徑的細(xì)絲織成的52網(wǎng))，點焊成0.1mm直徑的Au(ibid)導(dǎo)線。通過將其浸入沸騰的Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶3)中10分鐘來對Au網(wǎng)組件進(jìn)行洗滌(操作Piranha腐蝕溶液應(yīng)極其小心，且不能將其儲存于密閉容器中，其是非常強(qiáng)的氧化劑，能與大多數(shù)有機(jī)材料劇烈反應(yīng))。
熒光素-DNA構(gòu)建體在國家研究委員會(Saskatoon，SK，Canada)采用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方法合成并純化DNA。用于所述光電流實驗的序列如表4所示。對所述堿基序列進(jìn)行選擇，以最小化可選的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)，并且引入等量的每種堿基。
表4用于光電流研究的DNA序列。FI＝熒光素
FI-DNA改性的金電極的制備如前所述，將所述微電極和網(wǎng)電極在含0.05mM熒光素標(biāo)記的雙鏈DNA的50mM Tris-ClO4緩沖溶液(pH8.6)中孵育5天[104]。
光電流條件如圖1所示，然后將所述電極用所述Tris-ClO4緩沖溶液進(jìn)行清洗，并裝備入光-電化學(xué)電池中。如果可行將NAD(P)+加至終濃度為2mM。為了排除可能影響計時安培分析法的反電極反應(yīng)，必須對所述反電極進(jìn)行隔離。將激光功率為4mW cm-2，波長為473±5nm且光束直徑小于0.8mm的BM73-4V激光模塊(Intelite Inc.，Genoa，NV，USA)用作激發(fā)源。光電流實驗是在采用連接到CV 203BUheadstage的Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)的電位箝條件下進(jìn)行的。將兩電極配置用于電位箝條件，參考電極為1M KCl溶液中的Ag/AgCl絲，工作電極為改性的Au微電極。所述光譜電化學(xué)電池裝入接地的法拉第籠子(Warner Instruments)中，并且放置于活化空氣防振動(Kinetic System)臺上。
電流在1kHz通過低通貝塞爾濾波，并在5kHz由DigiData1322A(Axon Instruments)進(jìn)行數(shù)字化，并通過由PC控制的PClamp9.0(Axon Instruments)紀(jì)錄。需要進(jìn)一步濾波，并采用20Hz的低通濾波器通過軟件方法實現(xiàn)。對所有數(shù)據(jù)的分析是使用Origin7.0(OriginLab Corporation)進(jìn)行的。其他的電化學(xué)測量是使用為采用標(biāo)準(zhǔn)3電極配置的微電極定制的恒電位儀進(jìn)行的。所述金微電極(50μm直徑)可作為工作電極。通過將Ag/AgCl絲密封入含有3M KCl并加蓋有Vycor尖端的玻璃管中，構(gòu)建了參比電極。通過含有所述電解質(zhì)的魯金毛細(xì)管將所述參比電極從所述電池中隔離。所述反電極是鉑絲。在進(jìn)行測量之前，必須將全部電解質(zhì)溶液在Ar中凈化(purge)至少20分鐘，并且在測量過程中，在所述溶液上保持覆有Ar氣氛。所有實驗都在室溫下進(jìn)行。
結(jié)果與討論通過電子轉(zhuǎn)移，推斷形成了穩(wěn)定的發(fā)色團(tuán)的自由基陰離子。然后可以通過輻射(473nm)激發(fā)所述發(fā)色團(tuán)。通過這種方式，可以抑制反向電子傳遞。例如，可將熒光素(FI)選作所述發(fā)色團(tuán)，并在適當(dāng)?shù)臈l件下使用，從而使其在適當(dāng)?shù)倪€原電勢條件(-750mV vs Ag/AgCl)下形成具有較大吸光系數(shù)(ε473＝43 000 M-1 cm-1)的穩(wěn)定的自由基陰離子。如圖13所示，在該實施例中，所述發(fā)色團(tuán)通過20堿基對的雙鏈DNA借助硫醇鍵連接到所述金電極。所述DNA間隔基團(tuán)可以幫助防止激發(fā)態(tài)的FI由于過于靠近所述電極表面而猝滅，同時所述DNA的半導(dǎo)體特性也可以協(xié)助電子從所述電極轉(zhuǎn)移到所述發(fā)色團(tuán)。如EPR光譜法所示(圖4)，在外加電勢為-750mV(vs.Ag/AgCl)的情況下，F(xiàn)I能形成所述陰離子自由基FI·-?？蛇x擇適合的電子受體來促進(jìn)連續(xù)的電流流動。在示例性實施方案中，選擇NAD(P)+(即NAD+或NADP+)作為電子受體，其還原電勢高于所述發(fā)色團(tuán)熒光素的還原電勢。
如圖14a所示，在473nm以4mW·cm-2的激光對所述微電極進(jìn)行輻射產(chǎn)生了持續(xù)的電流，多次輻射時幅度僅有微小的降低。在缺乏NAD(P)+的情況下，如圖14b所示，所述電流下降了至少50％。如圖14c所示，使用熒光素不能吸收的波長的紅色激光(632nm，10mW/cm2)，并未觀察到電流。使用沒有標(biāo)記的熒光素DNA的單層不能產(chǎn)生光電流。NAD+和NADP+產(chǎn)生了相等的光電流量子產(chǎn)率。如圖15a所示，在存在或缺乏NAD(P)+的情況下，在所述光子流的強(qiáng)度和電流輸出之間存在線性關(guān)系。如圖15b所示，所述電流在還原電勢為-750mV時達(dá)到穩(wěn)定水平，證明FI在輻射之前先被還原成其自由基陰離子，然后進(jìn)行電子傳遞。
在FI激發(fā)的條件下，在外加電勢為-750mV(vs.Ag/AgCl)的情況下，F(xiàn)I-DNA標(biāo)記的微電極得到了450nA·cm-2的光電流密度。假設(shè)FI-DNA在電極表面的摩爾吸光系數(shù)和在溶液中時相同；則所述效率的計算值為4(1)光子·電子-1(相當(dāng)于約25％的量子產(chǎn)率)。為了說明NAD(P)H的產(chǎn)生，用金網(wǎng)電極實施了大規(guī)模的實施方案，采用分光光度法對所述溶液進(jìn)行監(jiān)測。如圖16a所示，存在340nm的UV-vis峰，其是NADH在受到輻射時顯示的特征(ε340＝6220 M-1 cm-1)。已經(jīng)證明，煙酰胺輔酶能夠由單電子還原產(chǎn)生的自由基形成無生物活性的二聚體。為了證明NADH具有生物學(xué)活性并且不是二聚體，向所述溶液中加入醇脫氫酶和乙醛。如圖16b所示，340nm的峰消失，證明光電化學(xué)生成的NADH能夠進(jìn)行酶學(xué)應(yīng)用驅(qū)動乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)化。根據(jù)估計，所生成的同樣具有340nm峰的無生物學(xué)活性的NAD+還原產(chǎn)物應(yīng)該小于1％。
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權(quán)利要求
1.光電流發(fā)生系統(tǒng)，包括(a)提供電子轉(zhuǎn)移部分，其通過傳導(dǎo)性間隔部分連接到電極；(b)向所述電極施加偏置電壓，以還原所述電子轉(zhuǎn)移部分形成還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)，其能夠吸收光子形成激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)；(c)提供電子接收部分，其能從所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)接收電子，形成還原的電子受體。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述電子接收部分位于電子轉(zhuǎn)移溶液中。
3.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中所述電子轉(zhuǎn)移溶液為水溶液，其能向所述還原的電子受體提供質(zhì)子。
4.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中將所述連接的電子轉(zhuǎn)移部分浸入所述電子轉(zhuǎn)移溶液中，用于供應(yīng)所述溶液中在所述激活的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)和連續(xù)的電子接收部分之間的重復(fù)的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中施加于所述電極用以形成所述還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的所述偏置電壓低于形成所述還原的電子受體所需的電壓。
6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的生成速率大于所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)向所述電子受體提供電子的速率。
7.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述電子轉(zhuǎn)移部分是熒光素。
8.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述電極為金電極。
9.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述傳導(dǎo)性間隔部分是核酸。
10.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述電子接收部分是NAD+或NADP+。
11.如權(quán)利要求10所述的系統(tǒng)，其中所述電子轉(zhuǎn)移溶液中還包括酶，且所述酶利用NADH或NADPH作為輔因子。
12.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中所述酶是脫氫酶。
13.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中所述酶是醇脫氫酶。
14.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中所述酶是還原酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有電子轉(zhuǎn)移部分的系統(tǒng)，該電子轉(zhuǎn)移部分通過傳導(dǎo)性間隔部分連接到電極。向所述電極施加偏置電勢，以還原所述電子轉(zhuǎn)移部分形成還原的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)，其能夠吸收光子形成激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)。電子接收部分從所述激發(fā)的電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)接收電子，形成還原的電子受體。所述還原的電子受體可用于例如產(chǎn)生氫的反應(yīng)。
文檔編號B01J19/00GK1849166SQ200480025978
公開日2006年10月18日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者龍億濤, 托德·C·薩瑟蘭, 海因茲-伯恩哈德·克拉茨, 杰雷米·S·李 申請人:埃德南文斯科技公司