本發(fā)明屬于污水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

石化工業(yè)的含油污水從原油脫水而來，水質(zhì)來自不同地層，生產(chǎn)工藝也有所不同，因此水質(zhì)復(fù)雜、含油量高、可生化性能差、含氨氮高、含有多種酚和硫化物，并且水量變動性較大、容易導(dǎo)致出水不穩(wěn)定。

絮凝是傳統(tǒng)水處理工藝中簡單有效而又普遍使用的一種工藝，它是通過向廢水中投加絮凝劑，通過改變水體中膠體表面電荷、吸附、網(wǎng)掃捕集等從而使水體的膠粒物質(zhì)發(fā)生凝聚和絮凝而分離出來以凈化廢水的方法。常用絮凝劑包括無機鹽類（硫酸鋁、氯化鐵等）和高分子物質(zhì)（聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺等）。

傳統(tǒng)絮凝雖然可以去除其中大部分懸浮物和膠體物質(zhì)，但常用的化學(xué)絮凝劑用量較大，不易被分解且容易造成二次污染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑。

本發(fā)明的目的之二在于提供用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑，所述微生物絮凝劑包括蠟樣芽胞桿菌菌株（Bacillus cereus）和/或所述蠟樣芽胞桿菌菌株（Bacillus cereus）在生長過程中產(chǎn)生的胞外多聚物。該蠟樣芽胞桿菌菌株可以直接投放到石化含油污水中作為絮凝劑，也可以在投放時添加架橋劑。

其中，所述蠟樣芽胞桿菌菌株的Genbank 序列號為CM000723.1，同源性為98％。所述蠟樣芽胞桿菌菌株，由長慶油田處理油井污水的處理池中污泥分離，并通過高嶺土懸液的絮凝實驗篩選得到。

用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑的篩選方法，具體篩選的方法如下：

A.培養(yǎng)基準(zhǔn)備

細(xì)菌固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂2g/L，PH值為7.0-7.5；

細(xì)菌液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，pH值為7.0-7.5；

真菌固體培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂2g/L、1/3000孟加拉紅溶液體積比10％、氯霉素0.1 g/L，PH值為7.0-7.5；

真菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.5g/L、1/3000孟加拉紅溶液體積比10％、氯霉素0.1g/L，pH值為7.0-7.5；

放線固體菌培養(yǎng)基：淀粉15g/L、硝酸鉀1g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、硫酸亞鐵0.01g/L、瓊脂2g/L,PH值為7.0-7.5；

放線液體菌培養(yǎng)基：淀粉15g/L、硝酸鉀1 g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、硫酸亞鐵0.01g/L、pH值為7.0-7.5；

B. 泥樣準(zhǔn)備

活性污泥樣品取自長慶油田含油污水處理的二級沉淀池，污泥樣品采用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋梯度分別為10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8；

C. 菌落培養(yǎng)

將步驟B中10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀釋液分別吸取1mL用滅菌涂布棒涂于細(xì)菌固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀釋液分別吸取1mL用滅菌分別涂布棒涂于真菌和放線菌固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

D.菌落純化

將步驟C中在培養(yǎng)基上得到多種菌株的菌落，挑選各菌落進(jìn)行平板純化培養(yǎng)，重復(fù)3次后，所得菌株即為分離純化后的菌株，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行4℃保存；

E. 絮凝菌株待測液制備

將步驟D中純化的菌株接種至各相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)48h，最后將培養(yǎng)液高速離心，離心后的上清液即為各絮凝菌株待測液；

F.絮凝能力最強菌株篩選

分別吸取步驟E中制得的各菌株待測液用高嶺土懸液的絮凝實驗進(jìn)行篩選，通過高嶺土懸濁液絮凝率來判定各菌株的絮凝性能強弱，挑選出絮凝能力最強菌株；

G.微生物絮凝劑制備

將步驟F中篩選出來的絮凝能力最強菌株進(jìn)行量產(chǎn)擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)基成分為：紅糖15g/L、硝酸鉀1g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉0.5g/L，pH值為7.0-7.5；搖床速度120r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為48h；

將擴大培養(yǎng)后的菌株培養(yǎng)基先高速離心，去除細(xì)胞體，再加入2倍體積的冷凍無水乙醇至上清液，將上清液中的有機絮凝成分溶解至乙醇內(nèi)，放入4℃冰箱中靜置24h；

再將混合樣品高速離心，棄掉上清液，將沉淀用75％乙醇溶解洗滌離心，重復(fù)3-5次，得到絮凝劑粗品；

最后用冷凍干燥機干燥制得所述用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑。

用于處理石化含油污水的微生物絮凝劑的使用，將所述微生物絮凝劑直接投放到石化含油污水中攪拌，投放量按照每100ml污水投放2-6ml的微生物絮凝劑計算。

本發(fā)明中的微生物絮凝劑在其生長代謝過程中，在一定條件下能分泌包圍在微生物壁外的細(xì)胞多聚化合物，這些胞外多聚物成分主要包括脂類、肽類、多糖等各種衍生物等。多聚物能通過絮凝架橋、改變表面電荷以及親疏水性從而使水中懸浮物和膠體類物質(zhì)脫穩(wěn)，從而起到絮凝和沉淀作用。相比于傳統(tǒng)的無機、有機人工合成的化學(xué)絮凝劑，微生物絮凝劑具有無毒害、無二次污染、環(huán)境友好、沉降性能穩(wěn)定、易被生物降解等優(yōu)點。

而且本發(fā)明通過和無機絮凝劑聚合氯化鋁（PAC）、有機絮凝劑陽離子聚丙烯酰胺（PAM）對比，新型微生物絮凝劑絮凝效果更優(yōu)，同時不會造成水體的二次污染。

同時本發(fā)明在水質(zhì)pH變動的情況下（6-9）絮凝效果比較穩(wěn)定，在中性偏酸的環(huán)境下（pH值6-7）絮凝效果最好，絮凝率最高可達(dá)68.9％（pH值為6，滴加量為4mL）。本發(fā)明量產(chǎn)培養(yǎng)過程選擇用紅糖水作為主要培養(yǎng)基質(zhì)量，降低了生產(chǎn)成本，易于進(jìn)行生物工程的大量生產(chǎn)。

附圖說明

圖1本發(fā)明投加量對絮凝率的影響；

圖2污水pH對絮凝率的影響；

圖3本發(fā)明與有機無機絮凝劑投加量對絮凝率的影響；

圖4 本發(fā)明細(xì)菌PCR電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。

活性污泥樣品取自長慶油田含油污水處理的二級沉淀池，含油污水處理設(shè)計量為300m³/天，污泥含水率97.6％，pH值6-8。COD_Cr為1000-150 mg/L，BOD₅為500-700 mg/L，NH₄-N為300-400 mg/L，濁度200-250NTU，pH值6-9。采用絮凝氣浮+A²O+膜處理工藝進(jìn)行處理后達(dá)標(biāo)排放。

污泥樣品采用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋梯度分別為10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8。所用平板分離培養(yǎng)基為：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌培養(yǎng)基），成分為：其中牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂2g/L，pH值為中性（7.0-7.5）；

馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基），成分為：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂2g/L、1/3000孟加拉紅溶液體積比10％、氯霉素0.1g/L，pH值為中性（7.0-7.5）；

高氏一號培養(yǎng)基（放線菌培養(yǎng)基），成分為：淀粉15g/L、硝酸鉀1g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、硫酸亞鐵0.01g/L、瓊脂2 g/L，pH值為中性（7.0-7.5）；

將10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀釋液分別吸取1mL用滅菌涂布棒涂于細(xì)菌培養(yǎng)基上，將10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀釋液分別吸取1mL用滅菌涂布棒涂于真菌和放線菌培養(yǎng)基上，將所有涂菌平板倒置后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，細(xì)菌培養(yǎng)溫度37℃，放線菌和真菌培養(yǎng)溫度為30℃。

培養(yǎng)后在培養(yǎng)基上得到多種菌株的菌落，挑選各菌落進(jìn)行平板純化培養(yǎng)，重復(fù)3次后，所得菌株即為分離純化后的菌株，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行4℃保存。

將純化菌株接種至各相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基和平板分離培養(yǎng)基出不含瓊脂糖外其他成分相同，在各自培養(yǎng)溫度下進(jìn)行搖床培養(yǎng)48h，搖床速度為150r/min。隨后將培養(yǎng)基5000r/min高速離心30min，離心后的上清液即為各菌株的絮凝待測液。

分別吸取各菌株待測液1mL、3mL、5mL滴入高嶺土懸濁液中進(jìn)行絮凝性能試驗，對照組分別吸取等量的培養(yǎng)基進(jìn)行測試，通過高嶺土懸濁液絮凝率來判定各菌株的絮凝性能強弱，以此篩選出絮凝性能強的菌株。絮凝率通過在550nm處的吸光度的差值判斷，公式如下：

絮凝率（％）=（A₁-A₂）/A₁×100％，其中A₁為對照組吸光度值，A₁為待測液的吸光度值。

高嶺土懸濁液是在100ml燒杯中加入0.5g高嶺土和5ml 1％（wt％）的CaCl₂溶液。實驗中加入待測液后先快速攪拌1min，在慢攪3min，隨后靜置15min，用分光光度計測定550nm出的吸光度，由此計算出各菌株的絮凝率。

經(jīng)過絮凝率測定，篩選出絮凝率最高的菌株，當(dāng)加入3mL待測液時，該菌株絮凝能力最強，達(dá)到92.12％。

該菌株在平板培養(yǎng)基上菌落呈淺黃色、表面光滑，無氣絲，革蘭氏染色呈紫色，提取菌種DNA并用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴增后再進(jìn)行純化擴增，PCR電泳純化擴增見圖4，隨后將PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行切膠測序，測序結(jié)果顯示鑒定菌株為蠟樣芽胞桿菌菌株（Bacillus cereus），Genbank序列號為CM000723.1，同源性為98％。

將該菌株進(jìn)行量產(chǎn)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)罐中培養(yǎng)基成分為紅糖15g/L、硝酸鉀1 g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.5 g/L，pH值為中性（7.0-7.5）；搖床速度120r/min，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為48h。

將培養(yǎng)后的菌株培養(yǎng)基以5000r/min高速離心30min，去除細(xì)胞體，加入2倍體積的冷凍無水乙醇至上清液，將上清液中的有機絮凝成分溶解至乙醇內(nèi)，放入4℃冰箱中靜置24h。之后再將混合樣品以5000r/min高速離心30min，棄掉上清液，將沉淀用75％乙醇溶解洗滌離心，重復(fù)3-5次，得到絮凝劑粗品，并通過冷凍干燥機干燥。稱重后，1L發(fā)酵罐可以生產(chǎn)約2.13g微生物絮凝制劑。

上述實施例，只是本發(fā)明的較佳實施例，并非用來限制本發(fā)明實施范圍，故凡以本發(fā)明權(quán)利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

本發(fā)明微生物絮凝劑對含油污水絮凝效果試驗：

1.新型微生物絮凝劑對pH適應(yīng)性和投加量試驗：

取100mL長慶油田油井污水放入250mL錐形瓶中，測得此時水中pH值為6.8。分別吸取量產(chǎn)發(fā)酵罐中絮凝劑樣品2mL、4 mL、6 mL、8 mL、10mL、12 mL加入污水樣品中，對照組分別采用等量未培養(yǎng)菌種的液體培養(yǎng)基作為待測樣品。加入待測液將錐形瓶放在磁力攪拌器上，快攪1min，慢攪3min，之后靜置5min。通過測定污水550nm處的吸光度來計算絮凝率，計算公式之前已經(jīng)給出。

從圖1絮凝效果看出，在pH接近中性條件下，投加量4mL時絮凝率達(dá)到66.5％，繼續(xù)增加絮凝劑用量，絮凝效果沒有明顯提升。

對污水的pH調(diào)節(jié)用HCl和NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，吸取4mL絮凝劑樣品加入污水樣品，并測定各pH下絮凝劑絮凝效果。從圖2可以看出，新型絮凝劑對pH值適應(yīng)較為廣泛，在中性偏酸條件下（pH為4-7），絮凝效果較好，堿性環(huán)境中，可能由于氫氧根負(fù)電荷改變了絮凝劑的表面負(fù)荷，從而影響對懸浮物和油的聚積效果，降低了絮凝率。

2.新型和傳統(tǒng)絮凝劑對含油污水處理效果對比

采用傳統(tǒng)的無機絮凝劑（氯化鋁）和有機絮凝劑（陽離子型聚丙烯酰胺PAM）進(jìn)行絮凝實驗，在污水樣品中分別加入2mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL的傳統(tǒng)絮凝劑樣品（1％，w/v），在同樣攪拌條件下測定吸光度進(jìn)行絮凝效果對比分析。從圖3可以看出，針對該種含油污水的絮凝效果，有機絮凝劑（PAM）要優(yōu)于無機絮凝劑（PAC），兩種絮凝劑最佳投加量均在10mL左右，用量較新型微生物絮凝劑較大，而且對于污水處理而言，有機絮凝劑也屬于難降解物，無機絮凝劑中金屬離子同樣存在二次污染風(fēng)險。新型微生物絮凝劑絮凝效果較傳統(tǒng)絮凝劑有優(yōu)勢，絮凝效率最高為66.5％，并且微生物絮凝劑本身作為自身物質(zhì)可被微生物降解和吸收，不會對環(huán)境造成二次污染。