專利名稱：一株對苯并[a]芘具有降解功能的菌株的制作方法
一株對苯并[a]芘具有降解功能的菌株技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株對苯并[a] 芘具有降解功能的菌株。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的有毒有機污染物，具有強烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用。PAHs能通過生物累積及食物鏈的傳遞作用對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，已引起各國環(huán)境科學家的高度重視。美國環(huán)保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物，我國也把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單中。生物降解是實現(xiàn)恢復PAHs污染環(huán)境的最有效手段之一。
一般來說，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴則難于降解，較長期存在于環(huán)境中。然而由于缺少高效的多環(huán)芳烴降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土壤生物修復技術(shù)的進一步發(fā)展和應用。現(xiàn)有的微生物降解PAHs的研究普遍集中在低分子量PAHs的降解微生物的篩選、分離與純化，而對于高效降解高分子量PAHs的微生物報道較少。分離與純化高分子量PAHs高效降解菌是生物修復PAHs污染環(huán)境的關(guān)鍵。
因此，需要從污染的環(huán)境中馴化篩選出對高分子量的多環(huán)芳烴(如苯并[a]芘) 降解速率較快的微生物菌種，然后再把它們應用于實際PAHs污染環(huán)境的生物治理，這對于治理和修復多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株對苯并[a]芘具有降解功能的菌株。所用菌株經(jīng)鑒定為無色桿菌 Achromobacter sp.，2010年3月23日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，該中心位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC3684。將該菌株制成含菌量為1.25X 108CFU/ml的菌懸液，可用于環(huán)境中苯并[a]芘的降解。
從污染土壤中分離純化所述苯并[a]芘降解菌的步驟如下
(1)選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (2)向體積為IOOOmL的開口玻璃瓶中加入25 30mL濃度為lg/L的苯并[a]芘的丙酮混合溶液，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。
(3)向步驟O)中開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min 的條件下攪拌40 50min后加入步驟(1)中的土壤250g ；然后置于溫度為25 30°C的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為 NH4Cl :1. 5g · ΙΛ KH2PO4 :1. 5g · Λ MgCl2 :0. 25g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. IOg · Γ1。
(4)向體積為100 200mL的錐形瓶中加入IOmL濃度為lg/L的苯并[a]芘的丙酮混合溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。
(5)向步驟中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0. 5mL微量金屬液和0. ImL維生素 c 溶液；其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H20 :35mg · L-1，CuCl2 :0. 20mg · L-1，H3BO3 6. Omg · ΙΛ MnCl2 · 4H20 :25mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 :3. Omg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. Omg · Λ ZnCl2 :2. 5mg · L-1。
(6)向步驟(5)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為 25 30°C轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天，每天打開瓶口一次以恢復錐形瓶內(nèi)的溶解氧；按接種體積比為200 250 1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至( 處理后的錐形瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除苯并[a]芘的好氧降解菌群。
(7)向體積為500mL的錐形瓶內(nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1. OmL微量金屬液、0. ImL 維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。
(8)向體積為150mL的錐形瓶內(nèi)加入50mL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 60g 瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65 70°C時，在超凈工作臺中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺中放置2天。
(9)在超凈工作臺中向步驟⑶中的培養(yǎng)皿中加入0.5mL濃度為lg/L的苯并[a] 芘丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使苯并[a]芘的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺中放置2天。
(10)向體積為25mL的錐形瓶內(nèi)加入IOmL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0. 25g 瓊脂，在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺中冷卻至38 40°C。
(11)在超凈工作臺中向步驟(10)的錐形瓶中加入ImL步驟(6)得到的苯并[a] 芘好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(9)中的培養(yǎng)皿中，來回傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，10 15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。
(12)在超凈工作臺中挑取步驟(11)培養(yǎng)皿中的菌落，進行重復分離，分離純化8 個周期以上即可得到能夠高效降解苯并[a]芘的純菌種。
運用上述方法能夠分離純化到對芘降解性能好的微生物菌種。
具體實施方式
向加入苯并[a]芘和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開口玻璃瓶內(nèi)加入受石油污染的土壤進行苯并[a]芘降解微生物的富集與馴化，30d后向加入苯并[a]芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為IOOr/ min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除苯并[a]芘的降解菌群。在超凈工作臺中制作以苯并[a]芘為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有苯并[a]芘降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 15天。在超凈工作臺中向加入苯并[a] 芘、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25 30°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天。然后進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠降解苯并[a]芘的純菌種。
運用分離純化得到的降解苯并[a]芘的菌種無色桿菌AchromcAacter sp.制成菌懸液，含菌量為1.25X 108CFU/ml，進行降解苯并[a]芘的降解試驗。結(jié)果表明菌株無色桿菌AchromcAactersp.能夠?qū)Ρ讲a]芘進行有效的降解，當苯并[a]芘的初始濃度為 0. Ilmg/L、0. 34mg/L,0. 71mg/L、l. 19mg/L 時，20 天后的降解去除率分別為74. 35 %, 84. 66%,78. 91%,68. 33%。
權(quán)利要求
1. 一株對苯并[a]芘具有降解功能的菌株，其特征在于，所述菌株經(jīng)鑒定為無色桿菌 Achromobacter sp.，菌種保藏號為 CGMCC3684。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一株對苯并[a]芘具有降解功能的菌株。苯并[a]芘降解菌經(jīng)鑒定為無色桿菌Achromobacter sp.，菌種保藏號為CGMCC3684。將該菌株制成含菌量為1.25×108CFU/ml的菌懸液，對初始濃度分別為0.11mg/L、0.34mg/L、0.71mg/L、1.19mg/L的苯并[a]芘在20天后的降解去除率分別為74.35％、84.66％、78.91％、68.33％。
文檔編號B09C1/10GK102533575SQ201010584918
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者丁愛中, 李帥冉, 杜勇超, 程莉蓉, 范福強, 豆俊峰 申請人:北京師范大學