專利名稱：降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解苯胺微生物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芳香族有機(jī)化合物對(duì)地表水和地下水的污染已成為人類面臨的最大的環(huán)境問題之一。苯胺是最簡單的一級(jí)芳香胺，也是最典型的芳香族化合物。在橡膠、除草劑、染料， 醫(yī)藥、有機(jī)樹脂、油漆、香水、制革、石油加工、塑料等化工行業(yè)廣泛被采用的原材料，是一種 “三致”物質(zhì)，1989年已被中國列為“環(huán)境優(yōu)先控制污染物”物質(zhì)之一。隨著工業(yè)化程度的加劇，全球?qū)Ρ桨返男枨笠苍诓粩嗌仙?，?jù)資料顯示，2003年全球苯胺的消費(fèi)量約為2900kt， 全世界以各種形式排入環(huán)境中的廢棄苯胺約為30kt。而苯胺廢水的生物方法以其運(yùn)行成本低利于管理而廣泛推行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度苯胺廢水的降解苯胺菌株5_1#的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的降解苯胺菌株5_1#，為腦膜膿毒性伊麗莎白菌 5-1# (Elizabethkingia meningos印tica) CCTCC NO :M2010287，已于 2010 年 11 月 1 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號(hào)CCTCC NO :M2010287o降解苯胺菌株5_1#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為腦膜膿毒性伊麗莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningos印tica)CCTCC NO :M201(^87應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。所述的腦膜膿毒性伊麗莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningos印tica)CCTCC NO :M2010287應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningos 印 tica) 5_1#CCTCC NO :M201(^87 的單菌落接種于 20ml生長培養(yǎng)基中，25 35°C、pH為6. 5 7. 5的條件下?lián)u床振蕩3 4天，待特征菌生長穩(wěn)定后，得到菌濁液；按菌濁液含高濃度苯胺廢水的體積比=1 (80 120)，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中，25 35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6. 5 7. 5，反應(yīng)60-72小時(shí)。固體培養(yǎng)基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、自來水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。生長培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。所述含高濃度苯胺廢水是指含苯胺的濃度為1800_2200mg/L的廢水。本發(fā)明是從城市污水處理系統(tǒng)脫水活性污泥中馴化、分離、篩選得到的一株在高濃度的苯胺廢水中具有一定的生長能力的新菌株。并對(duì)其降解苯胺的能力及影響其活性的因素做了研究，結(jié)果表明，該菌株在高濃度的苯胺廢水中，可利用苯胺作為唯一的碳源、氮源、能源，以1800-2200mg/L的苯胺溶液為例，該菌在7 內(nèi)將其降解85%以上，該菌株可處理含高濃度苯胺廢水。本發(fā)明獲得的新菌株即可在高濃度的含苯胺廢液中生存，也可將苯胺作為唯一的碳氮能源加以降解利用。


圖1是降解苯胺菌株5_1#的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；圖2是降解苯胺菌株5_1#在苯胺初始濃度不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖3是降解苯胺菌株5_1#在培養(yǎng)液PH值不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖4是降解苯胺菌株5_1#在培養(yǎng)溫度不同條件下，對(duì)苯胺的降解效率圖；圖5是降解苯胺菌株5_1#在不同氮源供給條件下，對(duì)苯胺的降解能力特征圖。具體方法如下一、降解苯胺菌株5_1#(苯胺降解特征菌)的篩選方法(1)培養(yǎng)基1)固體培養(yǎng)基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、自來水100mL、 ρΗ7· 0-7. 2。2)普通營養(yǎng)培養(yǎng)基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCllOg、自來水1000mL、 ρΗ7· 0-7. 2。3)馴化培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，苯胺濃度逐漸增加至 2. 5g/L，營養(yǎng)成分逐漸減少，pH值7. 0。4)分離培養(yǎng)基牛肉膏2g/L，蛋白胨4g/L，氯化鈉2g/L，苯胺lg/L，pH值7.0，苯胺 1.5g/L，瓊脂 15 20g/L。5)篩選培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺一定濃度(1800_2200mg/L)。6)生長培養(yǎng)基磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。
7)無機(jī)鹽溶液磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L，pH值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量。8)苯胺無機(jī)鹽溶液磷酸氫二鉀5. 17g/L，磷酸二氫鉀1. 70g/L,硫酸銨2. 63g/L， pH 值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+ 痕量，苯胺 250_6000mg/L。以上培養(yǎng)基分別于121°C高壓滅菌30min后備用，需添加苯胺的，將高濃度的苯胺母液(約10g/L)用無菌0. 45um濾膜過濾除菌后，按比例與已滅好菌的液體培養(yǎng)基混合。(2)實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備臺(tái)式高速離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠TGL-16G)、紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用T6新世紀(jì))、手提式蒸汽消毒器(上海三申、光照培養(yǎng)箱(重慶華茂儀器有限公司SHH150G)、光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯ΒΧ40型)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司 SW-CJ-10)、菌落計(jì)數(shù)器(上海宏匯電器廠QL-901)、臺(tái)式恒溫?fù)u床(太倉市華美生化儀器廠 TH2-C)、電泳儀及電泳槽等。(3)菌株的分離與篩選1)活化菌種來源于污水處理廠濃縮污泥樣品，取污泥樣品按水泥比100 1分散于水體中，在30°C，150r/min的條件下培養(yǎng)12小時(shí)后備用；2)馴化取活化菌濁液Iml接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中，梯度加入苯胺溶液，每 24小時(shí)取Iml菌液接種于馴化培養(yǎng)基中(苯胺溶液濃度梯度增加至約3g/L，苯胺濃度 1500mg/L后培養(yǎng)時(shí)間增至2天或以上)，備用；馴化培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，苯胺濃度逐漸增加至2. 5g/L，營養(yǎng)成分逐漸減少，pH值7. 0 ；3)篩選取馴化后的菌濁液，無菌梯度稀釋至約2.0X106個(gè)/L涂布于分離培養(yǎng)基上，30°C下恒溫培養(yǎng)至菌落成熟，挑取菌落特征明顯的單菌落劃線與分離培養(yǎng)基上；4)純化待分離培養(yǎng)基上的單菌落成熟后，挑取單菌落至生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天； 取步驟1)中菌液接種于2000mg/L的生長培養(yǎng)基中，兩天后劃線于1000mg/L的分離培養(yǎng)基上，待菌落長出后，挑取單菌落劃線于新的平板上，如此反復(fù)2-3次后，分離得純種菌，即一株降解苯胺菌株5_1#。二、降解苯胺菌株5_1#的鑒定1.對(duì)降解苯胺菌株5_1#的鑒定對(duì)苯胺高效降解菌株5_1#進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平確定菌株的種屬。16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1. 5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8000rpm室溫離心5min，徹底除去上清；2)加STE緩沖液1. 5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0. 567mlTE (lOmmol/ LTris-HCl，lmmol/LEDTA, pH8. 0)溶液，重懸細(xì)菌；3)加 IOwt% SDS30ul 和 20mg/ml 的的蛋白酶 K3ul，于 37°C水浴 Ih ；4)加入 5mol/L 氯化鈉溶液 IOul，CTAB/NaCl 80ul，于 65°C育溫 IOmin ；5)加入等積體酚氯仿/異戊醇(24 1)混勻，4°C、12000g/min離心5min,將上清液轉(zhuǎn)入另一支Eppendorf管中；6)加入等體積的酚氯仿/異戊醇/(25 24 1)混勻，4°C、12000g/min離心 5min，提取上清液置于另一只管中，如此反復(fù)三次，直至看不到蛋白層為止；7)加入0. 6倍體積的異丙醇，輕柔混合，沉淀DNA，4°C、12000g/min離心5min，棄
上清液；8)用70wt%的乙醇洗滌lmin，離心，棄上清，自然涼干，并將DNA溶于100 μ 1 1/10的TE溶液中；9)加入終濃度為 50 μ g/ml 的 RNase，37°C，30min,去除 RNA，_20°C保存?zhèn)溆?。?6SrDNA基因的PCR擴(kuò)增為了進(jìn)一步確定篩選得到的細(xì)菌5_1#的種屬，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，采用的引物序列為Pl正向引物(5 ‘ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ‘)和P2反向引物 (5 ‘ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘ )，PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海某生物技術(shù)有限公司完成，同源性檢索利用NCBI數(shù)據(jù)庫，經(jīng)比對(duì)相似序列，分析該菌與已知菌種同源性的高低，并作菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)照，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，進(jìn)而判斷兩菌種的菌屬。2、16S rDNA 序列測(cè)定
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本發(fā)明采用對(duì)16S rDNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1385bp的擴(kuò)增帶(用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè))，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，
測(cè)定其全序列如下。
gctaccatgcaagccgagcggtagattactttcgggtattggaaaggggcgtaggggggc60
gaaccacgtgggcacccggcctttatcggggggttaccctttcgaagggagaataattac120
ccattattattttattcggcttcgggggattttgaaaactacgggggataaaaaggggcc180
cccccaaaattacttagtgggggaggtaccggccccccagggcaacaatctttagggggc240
ttgaaggggtgttcccccccctgggtccggaaacccgaaccaaatccctacggaaggcac300
catggagaaatatggaacaaggggggaaacccggacccggccttcccgcgggcagaaaaa360
CggCCCtttggttggaaaccggtttttatcggggaataaccctccttccttgtaattact420
taagggtcccgaaaaaatagcccccggttaattcctggccgccgcccccggaattccgaa480
gggggcagcctttatccgaattattgggtttaaaggggcccgagggcgaattgatagtcc540
aggggtgaattccaccgcttaactggtcaacttgcaattgttcttgtaatcctgaagaag600
ggtgaaggggccggaaataggagtggtgggggtaaattgcttaaatttaatttaaacccc660
aatttgcgaaggcgggcaattaagtctaaatgacgctgaggaccaaagcgggggaagcaa720
acaggataggatccccggtagtcccgccgtaaacgatgattactcgtttttggtttaatg780
atcaaagactagccaaagtgataagtaatccacctgggggagtacgttccgcaggatgaa840
actcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgat900
acgcgaggaaccttgccaagacttaaatgggaattgacagacgcagaaatgtgtttttct960
tcggacaattttcaaggtgctgcatggttgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttaggtt1020
aagtcctgcaacgagcgcaacccctgtcactagttgctaacattaagttgaggactctag1080
tgagactgcctacgcaagtagagaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcacggccctt1140
acgtcttgggccacacacgtgctacaatggccggtacagagggcagctacctagtgatag1200
gatgcaaatctcgaaagccggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactctatgaa1260
gctggaatcgctagtaatcgcgcatcagccatggcgcggtgaatacgttcCCgggCCttg1320
tacacaccgcccgtcaagccatggaagctgggggtacctgaagtcggtgaccgtaaaagg1380
agctg1385三、降解苯胺菌株5-1#的菌落形態(tài)、生理和生化特征見下表1所示。
表1，降解苯胺菌株5-1#的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征
權(quán)利要求
1.降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為腦膜膿毒性伊麗莎白菌 5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO :M201(^87應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于所述的腦膜膿毒性伊麗莎白菌 5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO :M201(^87 應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica) 5_1#CCTCC NO :M2010287 的單菌落接種于 20ml 生長培養(yǎng)基中，25 !35°C、 pH為6. 5 7. 5的條件下?lián)u床振蕩3 4天，待特征菌生長穩(wěn)定后，得到菌濁液；按菌濁液含高濃度苯胺廢水的體積比=1 (80 120)，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中， 25 35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6. 5 7. 5，反應(yīng)60-72小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于固體培養(yǎng)基牛肉膏0. 3g、蛋白胨1. 0g、氯化鈉0. 5g、瓊脂2g、自來水100mL、pH7. 0-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于生長培養(yǎng)基磷酸氫二鉀 5. 17g/L，磷酸二氫鉀 1. 70g/L，硫酸銨 2. 63g/L，pH 值 7. 0 7. 2，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、 Ca2+ 痕量，苯胺 2000mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于所述含高濃度苯胺廢水是指含苯胺的濃度為1800-2200mg/L的廢水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解苯胺微生物的應(yīng)用。降解苯胺菌株5-1#的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為腦膜膿毒性伊麗莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NOM2010287應(yīng)用于含高濃度苯胺廢水的處理中。該處理方法為挑取固體培養(yǎng)基上腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1# CCTCC NOM2010287的單菌落接種于20ml生長培養(yǎng)基中，25～35℃、pH為6.5～7.5的條件下?lián)u床振蕩3～4天，待特征菌生長穩(wěn)定后，得到菌濁液；按菌濁液∶含高濃度苯胺廢水的體積比＝1∶(80～120)，取菌濁液接種于含高濃度苯胺廢水中，25～35℃恒溫培養(yǎng)，pH值為6.5～7.5，反應(yīng)60-72小時(shí)。該菌在72h內(nèi)將其降解85％以上，該菌株可處理含高濃度苯胺廢水。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102168037SQ201010570849
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者孫紅麗, 廉晶晶, 梁杏, 羅澤嬌, 靳孟貴 申請(qǐng)人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)