專利名稱：一種高效氯氰菊酯降解菌及其應(yīng)用的制作方法
一種高效氯氰菊酯降解菌及其應(yīng)用
(-)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種高效氯氰菊酯降解菌一固氮弧菌(AZOarCuSindigenS)HZ5及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在我國已有五十多年施用歷史，隨著國家對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯等 高毒性、難降解農(nóng)藥的禁用，促使擬除蟲菊酯類農(nóng)藥擴(kuò)大生產(chǎn)和使用范圍，現(xiàn)在擬除蟲菊酯 類農(nóng)藥占我國殺蟲劑總施用面積的三分之一以上，主要是施用于棉花、果樹、蔬菜以及對(duì)家 庭害蟲的防治。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有胃毒和觸殺作用，雖然對(duì)作物安全，但是它們對(duì)人、 畜有中等毒性，對(duì)水生生物、蜜蜂、家蠶高毒。1997年，林小濤等人就發(fā)現(xiàn)，甲氰菊酯對(duì)羅氏 沼蝦表現(xiàn)為高毒；1999年，朱魯生等發(fā)現(xiàn)，甲氰菊酯及其混合劑對(duì)雞也表現(xiàn)為高毒；另外， 2002年魯興萌等研究發(fā)現(xiàn)，即使低濃度的擬除蟲菊酯農(nóng)藥也會(huì)對(duì)一些經(jīng)濟(jì)昆蟲造成極大的 危害，如家蠶；2001年桐鄉(xiāng)和海寧發(fā)生的桑園中毒事件就是因擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留問題引 起的，而且菊酯還具有在高等動(dòng)物體內(nèi)富集的能力，潛在危害很突出。而且殘留農(nóng)藥使得我 國蜂產(chǎn)品、茶葉、紡織品、蔬果等遭遇“綠色壁壘”，自從我國加入WTO以來，歐洲不斷降低從 我國進(jìn)口的蔬果、茶葉、肉類等產(chǎn)品的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響了我國的出 口貿(mào)易，阻礙了經(jīng)濟(jì)發(fā)展。高效氯氰菊酯雖然屬于低毒農(nóng)藥，但是它對(duì)魚類及其他水生生物高毒。近年來， 研究發(fā)現(xiàn)高效氯氰菊酯對(duì)哺乳動(dòng)物及人類有潛在的致癌性和生殖、發(fā)育毒性。因此，隨 著高效氯氰菊酯的廣泛應(yīng)用，由其引起的環(huán)境污染問題受到人們的普遍關(guān)注。氯氰菊酯 (cypermethrin, CP，式1，其中*為手性中心)是一種重要的擬除蟲菊酯殺蟲劑，具有較高的 殺蟲活性，可以用于防治多種農(nóng)業(yè)害蟲，應(yīng)用范圍非常廣泛。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)手性碳 原子，因此共有4對(duì)對(duì)映異構(gòu)體。順式、反式氯氰菊酯為各含有兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的混合物。 而高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin，β-CP)則為順式、反式氯氰菊酯的混合物，共含有4 個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，其中順反式的比例為2 3，由于其各個(gè)對(duì)映異構(gòu)體之間的殺蟲活性存在著 明顯差異，且大部分對(duì)映異構(gòu)體是沒有藥效或是低藥效的，如果噴灑在農(nóng)田，不僅不能殺滅 害蟲，還造成資源的大量浪費(fèi)，嚴(yán)重的還會(huì)影響到人體健康和生態(tài)安全，這就使得在對(duì)映體 水平上研究手性農(nóng)藥的降解趨勢(shì)顯得尤為重要。 式 1
對(duì)于環(huán)境中的農(nóng)藥殘留的解決，可以采用禁用、物化方法和生物修復(fù)方法，物化方 法工程大、費(fèi)用高、副作用大、易引起二次污染、而且解決不徹底，生物修復(fù)方法具有高效、 安全、成本低、無二次污染、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，主要有動(dòng)植物修復(fù)、微生物修復(fù)、根際環(huán)境 的生物降解。生物降解技術(shù)因其不易造成二次污染，保護(hù)了生態(tài)系統(tǒng)的完整性，能夠做到污 染前預(yù)防、污染后防治，因此具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。國內(nèi)外研究最多的就是利用微生物降解 修復(fù)環(huán)境中的農(nóng)藥殘留。微生物能以農(nóng)藥作為碳源和能源，對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行代謝或者共代謝，從 而達(dá)到修復(fù)環(huán)境的目的。迄今，已經(jīng)篩選到多株氯氰菊酯降解菌。但是，關(guān)于高效氯氰菊酯 降解菌以及微生物選擇性降解高效氯氰菊酯的報(bào)道則很少見到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是篩選能降解高效氯氰菊酯的菌種，并考察此菌種對(duì)高效氯氰菊酯的降解過程中是否存在對(duì)映體選擇性。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高效氯氰菊酯降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年3月17 日，保藏號(hào)為 CCTCC No =M 2010060。所述固氮弧菌HZ5生物學(xué)特征如下革蘭氏染色反應(yīng)陰性，菌體短桿狀，有鞭毛， 無芽孢，大小約為(0. 5 μ m 1. 0 μ m) X (1. 0 μ m 2. 0 μ m)，菌落平滑，在生理鹽水中不易 分散，接觸酶陽性，氧化酶陰性，能利用環(huán)糊精、淀粉、葡萄糖、吐溫40，不能利用乙酸 鹽、檸檬酸鹽，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性。該菌株16S rDNA的Genbank登陸 號(hào)為 GU592532。本發(fā)明還涉及所述的固氮弧菌HZ5在降解水體中高效氯氰菊酯中的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用為將活化后的固氮弧菌HZ5菌種接種至含20 70mg/L(優(yōu)選 50mg/L)高效氯氰菊酯的LB液體培養(yǎng)基中，30°C、150rpm振蕩養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，菌液離心取 菌體直接或懸浮于緩沖液中制成菌劑投入含高效氯氰菊酯的水體中，對(duì)高效氯氰菊酯進(jìn)行 降解。優(yōu)選的，所述降解在pH7. 0、30°C下進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明的高效氯氰菊酯降解菌可通過直接投加的 方式應(yīng)用于水體中高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水體、土壤等物體上殘 留的高效氯氰菊酯，含有該菌株的菌劑制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，使用方便，具有很好的應(yīng) 用前景。


圖1為本發(fā)明高效氯氰菊酯降解菌的電鏡圖；圖2為標(biāo)準(zhǔn)樣品(50ppm，圖A)、添加樣品(50ppm，圖B)的正相手性高效液相色譜 圖；圖3為本發(fā)明的高效氯氰菊酯降解菌在純培養(yǎng)條件下對(duì)濃度為50ppm的高效氯氰 菊酯的降解曲線圖；圖4為原始添加濃度(圖a)與降解后(圖b)高效氯氰菊酯的正相手性高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合 具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 菌株的篩選與鑒定培養(yǎng)基無機(jī)鹽培養(yǎng)基=NaCllg, K2HPO4 1. 5g，KH2PO4 0. 5g，(MM)2SO4L 5g，MgSO4 0. lg， Iml微量元素溶液(1L微量元素溶液按如下組成配制=MnSO4 · H2O 0. 13g，ZnCl2 0. 23g， CuSO4 · H2O 0. 03g, CoCl2 · 6H20 0. 42g, Na2MoO4 · 2H20 0. 15g, AlCl3 · 6H20 0. 05g，用蒸溜水 補(bǔ)足至1000ml)，蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，混合后攪拌均勻，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121°C， 20min)后制得。富集培養(yǎng)液在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加入高效氯氰菊酯溶液，使得高效氯氰菊酯濃度 為 50mg/LoLB液體培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨5. Og,氯化鈉10. Og,蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，混 合后攪拌均勻，自然PH值，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min)后制得。LB固體培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨5. Og,氯化鈉10. Og,瓊脂15. Og,蒸餾水補(bǔ)足 至1000ml，混合后攪拌均勻，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min)后制得。菌株分離純化污泥樣品采自江蘇永農(nóng)農(nóng)藥廠，取5ml污泥樣品置于250ml錐形瓶中，加入IOOml 富集培養(yǎng)液，黑暗振蕩培養(yǎng)(30°C，150rpm) 1周，取5ml上層濁液于新鮮的富集培養(yǎng)液中，繼 續(xù)黑暗振蕩培養(yǎng)(30°C，150rpm) 1周，重復(fù)上述操作過程3次，每次培養(yǎng)的接種物均取自于 上次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液。取最后一次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液少許進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋后的培養(yǎng)液150μ 1涂 布于含150mg/L高效氯氰菊酯的LB固體平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱(30°C )中培養(yǎng)，待平板上 長出菌落后，挑取各菌落于含150mg/L高效氯氰菊酯的LB固體平板上反復(fù)純化，直至菌落 單一，將純化后的各菌落分別接至LB液體試管中振蕩培養(yǎng)(30°C，150rpm)過夜，將培養(yǎng)好 的菌液離心后接至富集培養(yǎng)液中培養(yǎng)一周，通過高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)各富集培養(yǎng) 液中高效氯氰菊酯殘留量，最后篩選獲得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名為HZ5。菌株鑒定將上述獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，該菌株的電鏡照片如圖1所 示。該菌株的主要生物學(xué)特征為革蘭氏染色反應(yīng)陰性，菌體短桿狀，有鞭毛，無芽孢，大小 約為(0. 5 μ m 1. 0 μ m) X (1. 0 μ m 2. 0 μ m)，菌落平滑，在生理鹽水中不易分散，接觸 酶陽性，氧化酶陰性，能利用β -環(huán)糊精、淀粉、葡萄糖、吐溫40，不能利用乙酸鹽、檸檬酸 鹽，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性。該菌株最適宜的生長條件為PH值7. 0，溫度 30°C。該菌株經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為固氮弧菌屬的Azoarcus indigens種。實(shí)施例2:菌劑制備1、將保藏于液體試管中的菌種接種于40ml的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中活化培養(yǎng)4d ；2、將活化好的菌種接種于IOOml含50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，30°C、150rpm振蕩養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；
3、將上述處于對(duì)數(shù)生長期的菌液進(jìn)行離心(6000rpm) 3min,棄上清，菌體用適量的 PH值為7. O的磷酸緩沖液懸浮，此即為菌劑。pH為7. O的0. 2mol/L的磷酸緩沖液的配方為取0. 2mol/L的磷酸二氫鈉39ml和 0. 2mol/L的磷酸氫二鈉61ml，用超純水定容至1000ml，高壓蒸汽滅菌(12rC、20min)后即得。實(shí)施例3 高效氯氰菊酯降解實(shí)驗(yàn)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中高效氯氰菊酯含量的檢測(cè)采用整瓶萃取法萃取高效氯氰菊酯，在含40ml富集液的錐形瓶中加入等體積的 二氯甲烷，充分振蕩后靜置3h，取下層有機(jī)相5ml于干凈試管中，加入無水硫酸鈉脫水，過 0. 45 μ m的濾膜后，吸取Iml液體于進(jìn)樣瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹干，用色譜級(jí)的正己烷定容 至1ml，保存于4°C冰箱中，供高效液相色譜分析。高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin，β-CP)具有兩個(gè)手性中心，含4個(gè)對(duì)映異構(gòu) 體，在手性高效液相色譜圖譜上會(huì)出現(xiàn)四個(gè)峰，可以通過考察降解前后ER(對(duì)映體比率)值 的變化來判斷該菌是否具有對(duì)映體選擇性降解功能。手性高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件流動(dòng)相為正己烷異丙醇=97 3 (體積 比)，手性分析色譜柱為chiralcel OD-H柱，流速為0. 5ml/min,進(jìn)樣量為20 μ 1，柱溫為 25 °C。高效氯氰菊酯殘留量計(jì)算公式如下X = ^xCs
A其中X為待測(cè)樣品中高效氯氰菊酯的殘留濃度(mg/L) ；Ax為樣品中高效氯氰菊 酯的峰面積；Atl為高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；Cs為高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度(mg/ L)。高效氯氰菊酯降解率計(jì)算公式
(χ\尸(％)=1——χ 100%
V C0 J其中Ρ為待測(cè)樣品中高效氯氰菊酯的降解率(％ ) ；X為待測(cè)樣品中高效氯氰菊 酯的殘留濃度(mg/L) ；Ctl為待測(cè)樣品中高效氯氰菊酯的初始濃度(mg/L)。高效氯氰菊酯回收率實(shí)驗(yàn)在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入高效氯氰菊酯，使其終濃度均為50mg/L，然后根據(jù)上 述方法回收無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的高效氯氰菊酯，利用高效液相色譜法檢測(cè)高效氯氰菊酯的含 量，每個(gè)濃度重復(fù)三次。高效氯氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)樣品、添加樣品的色譜圖如圖2所示，測(cè)得各無機(jī)鹽培養(yǎng)基 中高效氯氰菊酯的添加回收率為105.4%，變異系數(shù)分別為2. 1%。由以上數(shù)據(jù)可知，高效氯氰菊酯在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的平均回收率達(dá)90%以上，變 異系數(shù)在1.2% 5%之間，這些數(shù)據(jù)表明用上述方法來檢測(cè)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中高效氯氰菊 酯含量是符合農(nóng)藥殘留分析的要求的。高效氯氰菊酯降解實(shí)驗(yàn)
取100ml錐形瓶若干，均加入40ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌(12rC，20min) 后加入高效氯氰菊酯溶液，使其濃度均為50mg/L，取適量的高效氯氰菊酯降解菌菌種接種 于此無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，相應(yīng)的配置不含該菌種的作為空白對(duì)照，然后一同置于搖床(30°C， 150rpm)中黑暗振蕩培養(yǎng)。試驗(yàn)組與對(duì)照組均為15個(gè)重復(fù)，在培養(yǎng)時(shí)間為0、l、3、5、7d時(shí)定 時(shí)取樣，隨機(jī)抽取三瓶，根據(jù)上述方法檢測(cè)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中高效氯氰菊酯的殘留量。本發(fā)明菌株在純培養(yǎng)條件下對(duì)不同濃度的高效氯氰菊酯的降解曲線如圖3所示。 觀察圖3，可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)7d后，本發(fā)明高效氯氰菊酯降解菌對(duì)50mg/L的高效氯氰菊酯的降 解率為65. 2%，所有未加菌的空白對(duì)照7d后的水解率均小于5%。高效氯氰菊酯異構(gòu)體絕對(duì)構(gòu)型歸屬Liu等利用高效液相色譜法成功拆分了氯氰菊酯的8個(gè)對(duì)映體(LiuWP and Gan JJ. JAgric Food Chem，2004(52) :755_761)，并且確認(rèn)了各個(gè)異構(gòu)體的絕對(duì)構(gòu)型，發(fā)明人 在相同色譜條件下將OD柱拆分β -氯氰菊酯得到的4個(gè)異構(gòu)體分別再次進(jìn)樣，確定了四個(gè) 色譜峰的絕對(duì)構(gòu)型按出峰時(shí)間先后順序依次為lR-cis-α S、lR-trans-a S、lS-cis-a R 和lS-trans-aR。由圖4通過計(jì)算ER值可以發(fā)現(xiàn)，此降解菌在7d時(shí)間內(nèi)對(duì)高效氯氰菊酯 的降解不存在對(duì)映體選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌種對(duì)高濃度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，因此，該菌 對(duì)環(huán)境中高效氯氰菊酯的降解尤其是對(duì)高效氯氰菊酯的集中修復(fù)具有一定的積極意義。
權(quán)利要求
一種高效氯氰菊酯降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年3月17日，保藏號(hào)為CCTCC NoM 2010060。
2.如權(quán)利要求1所述的固氮弧菌HZ5，其特征在于所述固氮弧菌HZ5生物學(xué) 特征如下革蘭氏染色反應(yīng)陰性，菌體短桿狀，有鞭毛，無芽孢，大小為(0.5μπι 1. 0 μ m) X (1. 0 μ m 2. 0 μ m)，菌落平滑，在生理鹽水中不易分散，接觸酶陽性，氧化酶陰 性，能利用β-環(huán)糊精、淀粉、葡萄糖、吐溫40，不能利用乙酸鹽、檸檬酸鹽，乙酰甲基甲醇試 驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性。
3.如權(quán)利要求1所述的固氮弧菌ΗΖ5在降解水體中高效氯氰菊酯中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將活化后的固氮弧菌ΗΖ5菌種 接種至含20 70mg/L高效氯氰菊酯的LB液體培養(yǎng)基中，30°C、150rpm振蕩養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長 期，菌液離心取菌體直接或制成菌劑投入含高效氯氰菊酯的水體中，對(duì)高效氯氰菊酯進(jìn)行 降解。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在pH7.0、30°C下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效氯氰菊酯的降解菌——固氮弧菌(Azoarcus indigens)HZ5，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，430072，保藏日期2010年3月17日，保藏號(hào)為CCTCC NoM 2010060。本發(fā)明菌種對(duì)高濃度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，在純培養(yǎng)條件下對(duì)50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率達(dá)65.2％，且降解過程中不存在對(duì)映體選擇性。該降解菌可通過直接投加的方式應(yīng)用于水體中高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解水體、土壤等物體上殘留的高效氯氰菊酯，含有該菌株的菌劑制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，使用方便，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C02F101/38GK101880641SQ201010168990
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者劉維屏, 商弘穎, 江吉紅, 袁泉東, 邱吉國, 馬云 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)