專利名稱：Zwl73菌株在4-氯硝基苯及硝基苯原位生物修復(fù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌株在環(huán)境有機(jī)污染物治理技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用 惡臭假單胞菌(i^^/owo"wpw^/") ZWL73菌株在4-氯硝基苯和硝基苯污
染土壤中進(jìn)行原位生物修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氯代硝基芳香類化合物(Chloronitrobenzenes)是有毒有害且難降解的污 染物類群之一。氯代硝基芳香類化合物的代表，4-氯硝基苯 (l-chloro-4-nitrobenzene或4-chloronitrobenzene， 4CNB)常用于有機(jī)化合物 合成中間體，染料和農(nóng)藥等，較難溶于水，因而多沉積在土壤中，被土壤 顆粒吸附，造成污染。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)氯代硝基苯類化合物 (Chloronitrobenzenes, CNBs)會引起人體和動物的高鐵血紅蛋白血癥 (Methemoglobinemia),是一種誘變劑和致癌劑，近年來倍受環(huán)境學(xué)家關(guān) 注。4CNB分子中氯離子和硝基的易得電子特性和其立體結(jié)構(gòu)特征，使它 們?nèi)魏我粋€單獨存在都可增加了苯環(huán)裂解的難度，當(dāng)二者共同存在時，苯 環(huán)裂解難度會更大，因而在環(huán)境中更加難以降解。
氯代硝基苯類化合物作為原材料和中間體早已被廣泛用于生產(chǎn)和制造 各種染料、農(nóng)藥、醫(yī)用藥品等，我國自1950年就開始生產(chǎn)氯代硝基苯，目 前生產(chǎn)廠家20余家，幾乎遍布全國各地。氯代硝基苯類化合物已通過多種 途徑進(jìn)入環(huán)境，成為首要有毒有害且難降解的污染物類群之一。
硝基苯是^種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于制造苯胺、炸藥、潤滑 劑、農(nóng)藥、及香料等的工業(yè)生產(chǎn)中。隨著人類工業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，大量 的硝基苯進(jìn)入到自然環(huán)境中。據(jù)估計，每年全世界大概有一萬噸以上的硝 基苯被排入環(huán)境。硝基苯是高毒性物質(zhì)，被人類皮膚吸收或從呼吸道吸入 其蒸汽后，會引起中毒甚至致死，所以它被列入世界《環(huán)境優(yōu)先控制有毒 有機(jī)污染物》的名單。
清除污染環(huán)境中的污染物可以采用物理或化學(xué)的方法進(jìn)行，伹是這些 方法往往操作繁瑣、成本較高，而且容易產(chǎn)生二次污染。
生物修復(fù)技術(shù)主要是利用天然的或接種的生物并通過工程措施為生物生長與繁殖提供必要的條件，從而加速環(huán)境污染物的降解或去除，使其濃 度降至環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的安全濃度之下。
生物修復(fù)技術(shù)根據(jù)所利用的生物類群，可以分為微生物修復(fù)、植物修 復(fù)、動物修復(fù)。由于土壤中微生物種類豐富，而且微生物可以降解代謝多 類污染物，因而微生物修復(fù)在各類生物修復(fù)中研究最多，也應(yīng)用最廣。
從修復(fù)工藝上看，生物修復(fù)技術(shù)分為原位生物修復(fù)(/" Bioremediation)和異位生物修復(fù)CExBioremediation)。原位修復(fù)一般指 在現(xiàn)場處理，不涉及到受污染介質(zhì)的運輸，因而成本較低，但較難嚴(yán)格控 制。異位修復(fù)是將污染物運至專用的處理設(shè)施或反應(yīng)器中，處理效率較高 宜控制，但費用較高。
微生物修復(fù)技術(shù)與其他修復(fù)技術(shù)相比有以下優(yōu)點l)不破壞植物生長 所需的土壤環(huán)境；2)不會形成二次污染或?qū)е挛廴疚锏霓D(zhuǎn)移，遺留問題 少；3)可最大限度地降低污染物濃度，并且污染物可在原地被降解清除；4) 費用低，是現(xiàn)有環(huán)境工程技術(shù)，如傳統(tǒng)的化學(xué)，物理修復(fù)經(jīng)費的30% — 50%; 5)操作簡便，操作人員可以避免受污染物直接影響；6)修復(fù)時間相
對較短，對周圍環(huán)境干擾少。
雖然在污染物的處理中，物理、化學(xué)方法做出了一定的貢獻(xiàn)，生物修 復(fù)技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的最根本特點是消除污染物而不是分離轉(zhuǎn)移污染
物，從而在根本上解決環(huán)境問題，被譽(yù)為21世紀(jì)治理環(huán)境污染的優(yōu)選技 術(shù)，具有廣泛的發(fā)展和應(yīng)用前景。我國從20世紀(jì)90年代起開始對生物 修復(fù)技術(shù)進(jìn)行研究。
氯代硝基苯類化合物的毒性及其已經(jīng)引起的環(huán)境問題，已經(jīng)促使人們 嘗試通過生物修復(fù)的方法解決環(huán)境中氯代硝基苯類化合的污染。但目前的 研究還是集中在菌種分離和微生物培養(yǎng)方法方面，分離得到了幾株能夠分 解代謝氯代硝基苯類化合物的微生物菌株。如專利"一種降解對氯代硝基 苯的睪丸酮叢毛單胞菌及其用途"(CN200310114337.7)分離了一株睪丸酮 叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)菌株，專利"惡臭假單胞菌ZWL73及其 制法和應(yīng)用"(CN03128122.2)分離了一株惡臭假單胞菌ZWL73，這些菌 株能以對氯代硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長，同時將對氯代硝基苯 完全降解利用。但是目前尚無利用對氯代硝基苯利用菌株進(jìn)行土壤污染物 的生物修復(fù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種ZWL73菌株在4-氯硝基苯及硝基苯原位生 物修復(fù)中的應(yīng)用，ZWL73降解菌株在4CNB污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用； ZWL73降解菌株在4CNB污染的生物修復(fù)過程中的應(yīng)用。利用具有降解能力
4的細(xì)菌菌株在4-氯硝基苯、硝基苯污染土壤中進(jìn)行原位生物修復(fù)，該菌株為惡臭 假單胞菌(Pwi^owo"w;w"必)ZWL73，能夠徹底分解代謝污染物4-氯硝基苯 和硝基苯。利用本方法進(jìn)行4-氯硝基苯、硝基苯污染的生物修復(fù)，能夠不破壞植 物生長所需的土壤環(huán)境，不會形成二次污染或?qū)е挛廴疚锏霓D(zhuǎn)移，并可最大限度 地降低污染物濃度，可在原地降解清除污染物，而且費用低，并且操作簡便，操 作人員可以避免受污染物直接影響，修復(fù)時間相對較短，對周圍環(huán)境干擾少。
惡臭假單胞菌(/^ewt/omowwpwWa) ZWL73能以對氯代硝基苯或硝基 苯作為唯一碳源、氮源和能源生長，同時能完全分解代謝對氯代硝基苯或 硝基苯，并已經(jīng)獲得專利授權(quán)"惡臭假單胞菌ZWL73及其制法和應(yīng)用" (C葡128122.2)。
本發(fā)明的技術(shù)要點是針對4-氯硝基苯或硝基苯污染的土壤，通過添加降解 菌——惡臭假單胞菌ZWL73菌完成污染物原位生物修復(fù)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案如下
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種在4-氯硝基苯或硝基苯污染土壤 中，通過添加降解菌發(fā)酵液的方法，完成污染物的原位生物修復(fù)。該方法 首先建立一種模擬的土壤環(huán)境，然后加入污染物4-氯硝基苯或硝基苯以及 ZWL73降解菌，在室內(nèi)可控條件下模擬一種有機(jī)物污染環(huán)境。在不同時間 取土壤樣品進(jìn)行檢測(0-25天)，通過鑒定生物修復(fù)過程中4-氯硝基苯或硝 基苯的濃度，證明接種惡臭假單胞菌ZWL73后，土壤中的污染物4-氯硝基 苯或硝基苯明顯消除。同時通過監(jiān)測降解代謝的次產(chǎn)物氯離子和氨離子的 濃度，證明污染物的降解消除是接入土壤環(huán)境中的降解菌的生物修復(fù)作用 完成的。最后通過平板計數(shù)的方法，證明惡臭假單胞菌ZWL73菌能夠穩(wěn)定 存在于土壤環(huán)境中。
本發(fā)明所涉及的細(xì)菌菌株添加方法，包括但不僅限于降解菌發(fā)酵液直接 添加的方法，還可以將降解菌作為主要活性成分制備各種微生物制劑(如 可濕性粉劑、乳劑、水劑，其制備方法為農(nóng)藥的常規(guī)制備方法)，然后添加 到污染的土壤中。還可以將降解菌破碎，提取具有降解能力的活性蛋白， 然后用于生物修復(fù)。
本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)環(huán)境，包括但不僅限于土壤，還可以直接應(yīng)用 于水體、森林、濕地等各種含有4-氯硝基苯或硝基苯污染物的環(huán)境。
本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)方法，包括但不僅限于原位修復(fù)，還可以應(yīng)用 于生物反應(yīng)器等異位生物修復(fù)中。
本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)方法，包括但不僅限于微生物修復(fù)，還可以用 于植物-微生物、動物-微生物聯(lián)合生物修復(fù)中。
本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)的污染物種類，包括但不僅限于4-氯硝基苯 和硝基苯，還可以用于以4-氯硝基苯和硝基苯為代謝中間產(chǎn)物的污染物的生物修復(fù)。
與物理、化學(xué)污染物處理方法相比，應(yīng)用本發(fā)明的微生物生物修復(fù)方法 效果顯著，并具有以下優(yōu)點l)僅僅通過引入降解菌株就能完成全部生物修 復(fù)過程，不需要添加任何輔助的物質(zhì)，不破壞植物生長所需的土壤環(huán)境， 最大限度的降低污染物處理過程對環(huán)境的影響；2)與其他污染物處理方法相 比，不會形成二次污染或?qū)е挛廴疚锏霓D(zhuǎn)移，能夠徹底分解污染物，遺留 問題少；3)可最大限度地降低污染物濃度，并且污染物可在原地被降解清除， 尤其適用于突發(fā)環(huán)境污染事件的處理中。在本發(fā)明的一個實施例中，提供 了一種生物修復(fù)的方法，能夠完全修復(fù)的4-氯硝基苯、硝基苯污染濃度分 別達(dá)到1 mg/g土壤干重、0.4mg/g土壤千重；4)操作簡便，操作人員可以 避免受污染物直接影響；5)修復(fù)時間相對較短，對周圍環(huán)境干擾少，在本發(fā) 明的一個實施例中，提供了一種4-氯硝基苯、硝基苯生物修復(fù)的方法，分 別經(jīng)過6天和8天完成污染物的完全去除，達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。


圖1為4CNB生物修復(fù)過程中4CNB的濃度變化圖
Soil+4CNB:天然土壤添加4CNB處理組；Soil+4CNB+ZWL73:天然 土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組；Sterile soil+4CNB+ZWL73:滅 菌土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組。
橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤中的4CNB的濃度(mg每克干土)。
圖2為4CNB生物修復(fù)過程中NH/的濃度變化圖
Control:天然土壤組；Soil+4CNB:天然土壤添加4CNB處理組； Soil+4CNB+ZWL73:天然土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組； Sterile soil+4CNB+ZWL73:滅菌土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理 組。橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤中的NH4+的濃度(g每克干土)。
圖3為.4CNB生物修復(fù)過程中Cl'濃度的變化圖
Control:天然土壤組；Soil+4CNB:天然土壤添加4CNB處理組； Soil+4CNB+ZWL73:天然土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組； Sterile soil+4CNB+ZWL73:滅菌土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理 組。橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤中的Cl-的濃度(g每克干土)。
圖4為4CNB生物修復(fù)過程中降解菌ZWL73的數(shù)量變化圖 Soil+4CNB+ZWL73:天然土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組； Sterile soil+4CNB+ZWL73:滅菌土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理 組。橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤樣品中降解菌的數(shù)量的對數(shù)值。
圖5為.硝基苯生物修復(fù)過程中硝基苯的濃度變化圖
天然土壤添加硝基苯處理組(NS+NB);天然土壤添加硝基苯并接種ZWL73細(xì)菌處理組(NS+NB + ZWL73)。橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo) 是土壤中的硝基苯的濃度(mg每S克干土)。
圖6為硝基苯生物修復(fù)過程中NH4+的濃度變化圖
天然土壤組(NS),天然土壤添加硝基苯處理組(NS+NB)，天然土 壤添加硝基苯并接種ZWL73細(xì)菌處理組(NS+NB + ZWL73)。橫坐標(biāo)為 時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤中的NH4+的濃度(g每克千土)。
圖7為硝基苯生物修復(fù)過程中降解菌ZWL73的數(shù)量變化圖
天然土壤添加硝基苯并接種ZWL73細(xì)菌處理組(NS+NB + ZWL73)。 橫坐標(biāo)為時間(天)，縱坐標(biāo)是土壤樣品中降解菌的數(shù)量的對數(shù)值。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實施例 的限制。
所有實施例中的培養(yǎng)基及分子生物學(xué)操作方法為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 悉，可以參考Sambrook等"分子克隆"(實驗室手冊，冷泉港，1989)及 "精編分子生物學(xué)實驗指南"(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學(xué) 出版社，1998)。
實施例1.利用ZWL73降解菌株進(jìn)行4CNB污染土壤的生物修復(fù)(ZWL73 降解菌株在4CNB污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用)
分為四個土壤處理組A.天然土壤組(control), B.天然土壤添加4CNB 處理組(Soil+4CNB) ， C.天然土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理組 (Soil+4CNB+ZWL73) , D.滅菌土壤添加4CNB并接種ZWL73細(xì)菌處理 組(Sterile soil+4CNB+ZWL73) 。 4CNB的添加量為lmg/g土壤干重。其 中，滅菌土的制備方法是稱取300 g 土壤高壓滅菌后，3(TC培養(yǎng)兩天后 再次滅菌，反復(fù)處理三次，得到無菌土壤，并調(diào)節(jié)水含量與天然土壤相 同。
在帶有塑料可旋蓋的250ml玻璃瓶中準(zhǔn)備不同的土壤微環(huán)境，每組3 個重復(fù)。每組取72.6g的天然土壤或滅菌土壤，相當(dāng)于60g的土壤干重， 室溫(20-25°C，以下相同)孵育24h以上。
生物修復(fù)的方法如下，菌株ZWL73在液體LB培養(yǎng)基中，30'C培養(yǎng) 12h至對數(shù)后期，3,500g離心10 min收集菌體，用0.85%的生理鹽水 (質(zhì)量體積比)清洗兩次后，接種到相應(yīng)的處理組中，接種量約為1.5xl08 cfu(cfu: colony formine unit，菌落形成單位)/g 土壤干重。為保持每個土壤 微環(huán)境組的水分含量和離子含量一致，未接種的處理組加入等體積的
70.85%的生理鹽水，體系最終含水量約為23%(質(zhì)量比)。3(TC培養(yǎng)，定時 取樣進(jìn)行污染物降解和降解菌計數(shù)監(jiān)測，證明通過接種ZWL73降解菌到 4CNB污染土壤中，能夠完成污染物的去除，達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。
實施例2.通過高效液體色譜檢測ZWL73降解菌株對4CNB污染物的生物 修復(fù)過程(ZWL73降解菌株在4CNB污染的生物修復(fù)過程中的應(yīng)用)
通過高效液體色譜法檢測實施例1中的不同生物修復(fù)處理組中的 4CNB污染物的濃度，具體方法為，取0.50g土壤樣品中加入lml的甲醇， 渦旋振蕩lmin后，200 rpm振蕩培養(yǎng)30 min， 12,000g離心10 min后， 移取500 (il的上清液到另一 1.5 ml離心管中，然后12，000g 離心10 min后，再移取200 ^1的上清液到另一 1.5 ml離心管中，取1|^1進(jìn)樣 Gilson 高效液體色譜儀 (High Performance Liquid Chromatography ， HPLC) , C18反相色譜柱(25 cmx4.6 mm, 5 pm孔徑Supelco)。流動相 采用80%的甲醇和20%的水，流速0.8ml/min。釆用119 UV/VIS檢測系統(tǒng) (紫外/可見檢測系統(tǒng)，為HPLC自帶的檢測系統(tǒng))，4CNB監(jiān)測波長為280 nm。 4CNB的保留時間(retention time)是6.6 min。
HPLC檢測結(jié)果如附圖l所示，與污染處理組B (soil+4CNB)相比， 接種ZWL73的土壤處理組C (soil+4CNB+ZWL73)的4CNB降解消除作 用明顯，在6天左右，對4CNB的降解效率己達(dá)98%;同時，滅菌處理 組D (Sterile soil + 4CNB十ZWL73)中的4CNB去除速度明顯快于在處理 組C中的速度，在2天時，土壤處理組D降解效率即達(dá)76%, 4天達(dá)到 95%;說明該降解菌與土壤中的土著菌群存在一定競爭關(guān)系，但是仍然能 夠有效的去除4CNB污染，達(dá)到了原位生物修復(fù)的目的。
實施例3. 4CNB生物修復(fù)過程中NH/的檢測
ZWL73菌株通過還原途徑降解4CNB，因此在代謝過程中4CNB分子 中的NH4會以NH/的形式釋放出來，測定生物修復(fù)過程中NH4+的變化， 能夠證明土壤中4CNB的降解，是源于ZWL73菌株對4CNB的降解作用。
NH4+的檢測方法如下土壤樣品0.50g中加入2.5ml的2mol/l KC1 溶液浸提，200rpm振蕩30min后，立即10,000g 離心5min后取上清， 采用Nessler試劑法進(jìn)行NH4+檢測。
實施例1中的不同生物修復(fù)處理組中的NH4+檢測結(jié)果如附圖2所示， 可以看到?jīng)]有接種ZWL73的天然土壤處理組A (control) , NH4+的濃度在 整個監(jiān)測過程中幾乎沒有變化；僅添加4CNB的土壤(NS + 4CNB)， NH4+ 的濃度在14天后略有升高；在進(jìn)行生物修復(fù)的處理組C (NS + 4CNB +ZWL73)禾n D (Sterile soil + 4CNB + ZWL73)中，在4CNB濃度降低的同 時NH4+的濃度逐漸升高，說明4CNB是在降解菌作用下通過還原途徑降解 的。
實施例4. 4CNB降解過程中Cr檢測
ZWL73菌株通過還原途徑降解4CNB，在代謝過程中4CNB分子中的
ci會以ci—的形式釋放出來，測定生物修復(fù)過程中cr的變化，能夠證明土
壤中4CNB的降解，是源于ZWL73菌株對4CNB的降解作用。
Cl—的檢測方法如下取0.50g土壤樣品，力口 4ml蒸餾水，渦漩振蕩1 min后，8,000g離心5 min,取上清在5 ml的小燒杯中加入80 nl的 ISA溶液，使用Thermo Orion Model 868氯離子檢測儀進(jìn)行檢測。
實施例i中的不同生物修復(fù)處理組中的cr的檢測結(jié)果如附圖3所示， 處理組A和B中，cr濃度在整個監(jiān)測過程中幾乎沒有變化，而在生物修復(fù)
的處理組C和D中，Cr濃度的逐漸升高，也輔助證明了降解菌對4CNB的
消除作用。
實施例5.4CNB生物修復(fù)過程中ZWL73降解菌的平板計數(shù)
由于ZWL73菌具有對卡那霉素、氯霉素的抗性，所以，通過基本培 養(yǎng)基(MM) +Nystatin (制霉菌素，用于抑制樣品中的真菌)十卡那霉素 (Kan)+氯霉素(Cam)+4CNB平板計數(shù)，可以計算出土壤樣品中ZWL73 降解菌的數(shù)量(實施例1中的不同處理組)。具體操作方法如下，加800 ^1 的焦磷酸鈉溶液到0.2 g 土壤樣品中，渦旋振蕩1 min后，200 rpm振 蕩15 min。 靜置10 min后取100 pl上清液加入到裝有卯0 pl的 0.85%生理鹽水的1.5 ml離心管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取相應(yīng)稀釋液 100^1l涂布培養(yǎng)基平板，30'C培養(yǎng)4天后進(jìn)行平板菌落計數(shù)。結(jié)果如附圖4 所示，可以看到，在4CNB的生物修復(fù)過程中，隨著4CNB的降解，兩天 ZWL73降解菌的數(shù)量明顯增加，之后數(shù)量逐漸減少，最終趨于穩(wěn)定。
以上的結(jié)果說明，以1.5xl08 cfu/g干土的接種量，接種ZWL73到 4CNB污染的土壤中，可以保證ZWL73在土壤中存活并且達(dá)到對污染土壤 進(jìn)行原位生物修復(fù)的目的。
實施例6. ZWL73降解菌株在硝基苯污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用
分為3個土壤處理組A.天然土壤組(NS) ， B.天然土壤添加硝基苯 處理組(NS+NB) ， C.天然土壤添加硝基苯并接種ZWL73細(xì)菌處理組(NS +NB + ZWL73)。硝基苯的添加量為0.4mg/g土壤干重。
在帶有塑料可旋蓋的250ml玻璃瓶中準(zhǔn)備不同的土壤微環(huán)境，每組3個重復(fù)。每組取72.6g的天然土壤或滅菌土壤，相當(dāng)于60g的土壤干重， 室溫孵育24h以上。
菌株ZWL73在液體LB培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)12h至對數(shù)后期， 3,500g離心10 min收集菌體，用0.85%的生理鹽水清洗兩次后，接種到 相應(yīng)的處理組中，接種量約為4xl()8cfWg土壤干重。每組3個重復(fù)。體系 最終含水量約為20% (質(zhì)量比)。3(TC培養(yǎng)。定時取樣進(jìn)行硝基苯降解和 降解菌計數(shù)監(jiān)測。同樣，監(jiān)測NH/濃度變化，以佐證ZWL73菌對硝基苯 的降解作用。為保持每個土壤微環(huán)境組的水分含量和離子含量一致，未接 種的處理組加入等體積的0.85%的生理鹽水，體系最終含水量約為23% (質(zhì)量比)。3(TC培養(yǎng)，定時取樣進(jìn)行污染物降解和降解菌計數(shù)監(jiān)測，證 明通過接種ZWL73降解菌到硝基苯污染土壤中，能夠完成污染物的去除， 達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。
實施例7.通過高效液體色譜檢測ZWL73降解菌株對硝基苯污染物的生物 修復(fù)過程-
通過高效液體色譜法檢測實施例6中的不同生物修復(fù)處理組中的硝基苯 污染物的濃度，取0.50g土壤樣品中加入lml的甲醇，渦旋振蕩1 min后， 200 rpm振蕩培養(yǎng)30min， 12，000g離心10min后，移取500 pl的上清液 到另一 1.5ml離心管中，然后12,000g 離心10min后，再移取200 ^1 的上清液到另一 1.5ml離心管中，取1 ^進(jìn)樣Gilson高效液體色譜儀， C18反相色譜柱(25 cmx4.6mm， 5lam孔徑Supelco)。流動相采用80%的 甲醇和20%的水(體積比)，流速0.8ml/min。采用119 UV/VIS檢測系統(tǒng)， 硝基苯監(jiān)測波長為280 nm。硝基苯的保留時間(retention time)是6.0min。
檢測結(jié)果如附圖5所示，與污染處理組B(NS+NB)相比，接種ZWL73 的土壤處理組C (NS+NB+ZWL73)的硝基苯降解消除作用明顯，在8天左 右，對硝基苯的降解效率已達(dá)99%，說明ZWL73能夠有效的去除硝基苯 污染，達(dá)到了原位生物修復(fù)的目的。
實施例8.硝基苯降解過程中NH4+的檢測
ZWL73菌株通過還原途徑降解硝基苯，因此在代謝過程中硝基苯分子
中的>^4會以>^4+的形式釋放出來，測定生物修復(fù)過程中NH4+的變化，
能夠證明土壤中硝基苯的降解，是因為ZWL73菌株對硝基苯的降解作用。 NH4+的檢測方法如下土壤樣品0.50g 中加入2.5ml的2molA KC1
溶液浸提，200rpm振蕩30min后，立即10,000g 離心5min后取上清，
采用Nessler試劑法進(jìn)行NH/檢測。
實施例6中的不同生物修復(fù)處理組中的NH4+的檢測結(jié)果如附圖6所示，NH/濃度在處理A (NS)中隨著時間推移幾乎沒有變化，在處理B (NS + NB)中緩慢升高，而在處理C (NS + NB + ZWL73)中，隨著硝基苯濃度 降低的同時NH/的濃度迅速升高。說明硝基苯是在降解菌作用下通過還原 途徑降解的。
實施例9硝基苯生物修復(fù)過程中ZWL73降解菌的平板計數(shù)
由于ZWL73菌具有對卡那霉素、氯霉素的抗性，所以，通過基本培養(yǎng) 基(MM)十Nystatin (制霉菌素，用于抑制樣品中的真菌)+卡那霉素(Kan) +氯霉素(Cam) +4CNB平板計數(shù)，可以計算出土壤樣品中ZWL73降解菌 的數(shù)量(實施例6中的不同處理組)。具體操作方法如下，加800 ^的焦 磷酸鈉溶液到0.2 g 土壤樣品中，渦旋振蕩1 min后，200 rpm振蕩15 min。 靜置10min后取100^1上清液加入到裝有卯0 pl的0.85%生理 鹽水的1.5 ml離心管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋至10—3、 l(T4、 l(T5、 10-6, 然后每個濃度各取IOO ^涂布培養(yǎng)基平板，3(TC培養(yǎng)4天后進(jìn)行平板菌落 計數(shù)。結(jié)果如附圖7所示，在硝基苯污染的生物修復(fù)過程中，隨著硝基苯 的降解，ZWL73的數(shù)量一直保持比較穩(wěn)定。
以上的結(jié)果說明，以4xl08 cfu/g干土的接種量，接種ZWL73到硝基苯 污染的土壤中，可以保證ZWL73在土壤中存活并且達(dá)到對污染土壤進(jìn)行原 位生物修復(fù)的目的。
1權(quán)利要求
1、一種ZWL73降解菌株在4CNB污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
2、 一種ZWL73降解菌株在4CNB污染的生物修復(fù)過程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ZWL73菌株在4-氯硝基苯及硝基苯原位生物修復(fù)中的應(yīng)用。利用具有降解能力的細(xì)菌菌株在4-氯硝基苯、硝基苯污染土壤中進(jìn)行原位生物修復(fù)，該菌株為惡臭假單胞菌ZWL73，能夠徹底分解代謝污染物4-氯硝基苯和硝基苯。利用本方法進(jìn)行4-氯硝基苯、硝基苯污染的生物修復(fù)，能夠不破壞植物生長所需的土壤環(huán)境，不會形成二次污染或?qū)е挛廴疚锏霓D(zhuǎn)移，并可最大限度地降低污染物濃度，可在原地降解清除污染物，而且費用低，并且操作簡便，操作人員可以避免受污染物直接影響，修復(fù)時間相對較短，對周圍環(huán)境干擾少。分別經(jīng)過6天和8天完成污染物的完全去除，達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。
文檔編號B09C1/10GK101422783SQ20081023672
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者虹 劉, 周寧一, 張俊杰, 牛桂蘭, 王淑君, 碩 趙 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所