專利名稱：一株高效降解有機污染物的細菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及一種具有降解土壤持久性有機污 染物苯并芘功能的細菌。
背景技術：
研究表明，工業(yè)生產中燃料的不完全燃燒、石油開釆、污水灌溉、焦炭 生產、金屬冶煉、汽車尾氣等都能產生有機污染物多環(huán)芳烴。多環(huán)芳烴對人體的毒性表現(xiàn)在強致癌、致突變及致畸性。人類及動物癌癥病變有70%~90% 是環(huán)境中化學物質引起的，而多環(huán)芳烴則是環(huán)境致癌物中最大的一類。吸入 大氣中吸附在微粒上的多環(huán)芳烴而導致的肺癌占總肺癌病變的85%以上，長 期暴露在含高濃度多環(huán)芳香烴的煙氣、石油分餾、莉青及煤產品等環(huán)境中， 皮膚癌即肺癌發(fā)病率很高。苯并[a]芘(BaP)是多環(huán)芳烴中最具代表性且具有強致癌性的物質，它 是含5個環(huán)的稠環(huán)芳烴，已經被許多國家和組織的環(huán)保和衛(wèi)生機構確認為應重 點監(jiān)測和關注的致癌危險物。空氣中苯并[a]芘污染的主要來源有下列幾個方面(1)工業(yè)鍋爐和家用 爐灶燃煤研究表明我國主要為燃煤型污染，大同巿作為我國主要的產煤基 地之一，其能源結構以耗煤為主，燃煤占全巿的總耗能的99%以上，據(jù)分析， 全巿苯并[a]芘的日均值達到330ng/i^[馬西林,丁中華，劉瑞蓮等.大同巿空 氣中多環(huán)芳烴與人尿中1-羥基芘的分析.環(huán)境化學,1994,13(6):536 542]。唐書 彥等研究了包頭巿大氣中BaP在9年中的含量，表明巿區(qū)內BaP的含量為 0.90ug/100m3—2.77ug/100m3，且冬春(釆暖期)大氣中苯并[a]芘的含量高于 夏秋(非釆暖期)，工業(yè)區(qū)附近的大氣BaP含量高于非工業(yè)區(qū)[唐書彥，侯莉 英.包頭巿城區(qū)大氣中BaP濃度十年監(jiān)測淺析[J].內蒙古環(huán)境保護，1995, 7 (1): 31~34]。 (2)工業(yè)生產lkg燃料在燃燒過程中產生的苯并[a]芘量為: 煤67mg 136mg;木材40mg ~ 68mg;汽油12mg ~ 50.4mg。某些工廠周圍lkm 內大氣中的苯并[a]芘濃度為焦化廠0.13嗎/100mS 57.8pg/100m3,煉油廠0.03ng/100m3 ~ 5.04ng/100m3，冶煉廠0.87嗎/100m3 ~ 3.06pg/100m3。焦化和石油化工的興起大大增加苯并[a]芘對環(huán)境的污染，焦化廠附近500米處的濃度 比一般工業(yè)城巿高出500- 1000倍。在半敞開的焦爐瀝青加熱附近4m處的苯 并[a]芘濃度高達78ug/m3 [蹇興超.多環(huán)芳烴(PAH)的污染.環(huán)境保護，1995, 10: 31 33]。 (3)交通據(jù)報道汽車每行駛lkm排出的BaP量為8 10mg。隨著機 動車數(shù)量的增加，路面交通堵塞的升高，在一些公路交通路口苯并[a]芘污染 也曰趨嚴重。此外，在公路隧道中，由于空氣污染擴散。致癌性苯并[a]芘濃 度相當高。(4)垃圾焚燒和森林失火；(5)烹調動物蛋白烹炸過程中可以 產生苯并[a]芘，散發(fā)到廚房中，從而進入人體，這可能是導致炊事人員呼吸 道肺癌發(fā)病率增加的主要原因。烤鴨車間空氣樣品中含有苯并[a]芘，某三處 酒家廚房油煙中苯并[a]芘含量為0.373pg/100m3 1.483|ig/100m3 [袁彥華,孫 連軍，郭秀蘭等.多環(huán)芳烴化合物環(huán)境污染研究.環(huán)境與健康雜志，1999, 16(3): 182~185]。 6)煙草煙氣吸煙嚴重的家庭室內空氣中苯并[a]芘濃度比不吸 煙的家庭高10倍以上[朱利中，劉勇建，松下秀鶴等.室內空氣中多環(huán)芳烴的 污染特征、來源及影響因素分析.環(huán)境科學學報,2001, 21(1): 64 68]。 一些國 家和組織對肺癌產生的可能因素進行了調查研究，初步認為吸煙比大氣污染 對肺癌的增長具有更直接的關系。每天吸煙20支的人可吸入0.6pg 0.8^ig苯并 [a]芘，吸煙者比不吸煙者肺癌的危險性高2倍。土壤中苯并[a]芘的主要來源是工業(yè)滲漏，固體廢物和大氣沉降。不同區(qū) 域的土壤中苯并[a]芘的含量不同。自然區(qū)土壤中苯并[a]芘的含量為1.5-28.0 pg/kg，石油污染灌溉10余年的土壤苯并[a]芘含量為50 15(Hig/kg,工業(yè)區(qū)特 別是老工業(yè)區(qū)的土壤的含量一般為350 56(^g/kg，老的煉油廠區(qū)的土壤高達 12000 |ig/kg，飛機場附近的植被和土壤中多環(huán)芳烴含量比其它控制污染區(qū)高 8 ~ 9倍[王連生.多環(huán)芳烴分析技術.南京大學出版社，1988]。我國食品受苯并[a]芘污染的主要途徑有以下幾個方面(1 )煙塵污染 煤炭、石油、木材等的不完全燃燒，產生的苯并[a]芘附著在不完全燃燒的顆 粒上進入空氣，經過沉降作用附著于植物表面或土壤中，被葉和根吸收。據(jù) 調查，工業(yè)區(qū)生產的菜籽，苯并[a]芘的含量為215.5pg/kg，而農業(yè)區(qū)同類作 物僅含有2.69ng/kg。 (2)廢水、廢氣污染生產炭黑、煉油、煉焦、合成橡膠、瀝青等行業(yè)的廢水、廢氣中含有大量苯并[a]芘。廢水排入江河湖海中， 通過食物鏈將苯并[a]芘濃縮于魚、蝦、貝、海菜等水產品中。某地調查鰻魚 中苯并[a]芘含量為lng/kg 2.7pg/kg,遠高于海水中的含量。瀝青中苯并[a] 芘的含量高達2.5%~3.5%，噴燒瀝青時苯并[a]芘散發(fā)在空氣中，對環(huán)境和空 氣造成極大污染。汽車排放的廢氣是環(huán)境和食物中苯并[a]芘增加的一個重要 來源，燃燒lkg汽油可排放12pg 50嗎的苯并[a]芘。(3)食品加工過程中的 污染生魚、生豬肉、生羊肉等一般檢出苯并[a]芘的量極少，但燒烤后含量 明顯增加?？局剖称烦Ｓ玫娜剂嫌忻?、木炭、焦炭、煤氣和電熱等，其食品 與燃燒產物直接接觸，除煙塵中的苯并[a]芘可使食品遭受污染外，烘烤時有 機物受熱分解，亦經環(huán)化，聚合形成苯并[a]芘，從而使食品中的苯并[a]芘含 量增加。苯并[a]芘對人體的致癌劑量為13.3mg。由于苯并[a]芘的五個苯環(huán)的排列 是非對稱的，而使得各結合鍵上的電子密度有明顯的差異。苯并[a]芘的4,5-鍵(菲環(huán)雙鍵)具有高電子密度(被稱之謂"K區(qū)")。易與細胞內的大分子(如DNA, RNA等)發(fā)生共價結合，有可能破壞DNA和RNA的正常功能，主要是使DNA 的遺傳信息發(fā)生改變，引起細胞致突變，從而引發(fā)癌變。大量動物試驗已證 實苯并[a]芘能夠引發(fā)肺癌、皮膚癌、胃癌等癌變[朱雨辰，曹曉煜.淺談苯并 [a]芘[J].江蘇環(huán)境科學，1999， 12(4): 43~44]。其代謝產物的毒性作用通 常是經過氧化代謝過程產生的中間體與大分子反映導致靶細胞結構和功能的 改變，終代謝產物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)不僅能和DNA形成加合物， 而且代謝過程中產生的大量活性氧簇(ROS)也會造成DNA損傷。DNA損傷 后如果得不到及時修復，就會在復制過程中產生突變，最終致癌。微生物降解苯并[a]芘有兩種途徑:一種是作為微生物的唯一碳源和能源,另 一種是共代謝或共氧化作用。雖然多環(huán)芳烴的去除途徑主要靠微生物降解,但 苯并[a]芘因其分子結構內苯環(huán)的高度密集,以及其高的辛醇水分配系數(shù),而具 有很強的難降解性。共代謝是指微生物在有可利用的唯一碳源時，對它原來不 能利用的物質也能分解代謝的現(xiàn)象[程國玲,李培軍,王鳳友等.多環(huán)芳烴污染 土壤的植物與微生物修復研究進展[J].環(huán)境污染治理技術與設備,2003， 4(6): 30-36]。當一級基質存在時,一級基質的代謝能提供足夠的碳源和能源,供微生物生長，并誘導產生相應的降解酶,從而降解二級基質,共代謝被認為是降解難降解有機物的主要方式。苯并[a]芘被細菌降解時，在雙加氧酶的進攻下,一 般先在碳4，5 、 9，10 、 11，12位置上生成順式二氫二醇2苯并[a]芘,然后相應 的二氫二醇2苯并[a]芘之間的化學鍵分別斷裂，生成開環(huán)化合物，該類化合物 進一步被降解[鞏宗強，李培軍,王新等.真菌對土壤中苯并(a)芘的共代謝降解 [J].環(huán)境科學研究，2001, 14 (6): 36 ~ 39]。本發(fā)明是從長期受到有機污染的農田土壤中分離、篩選到一株具有高效 降解苯并[a]芘功能的細菌。該菌株可以用于降解環(huán)境中的有機污染物苯并[a] 芘，在修復菜地和農田有機污染方面具有廣闊的應用前景。 .發(fā)明內容(一) 要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一株高效降解有機污染物的細菌，本發(fā)明的又一目 的是公開該細菌的應用。(二) 技術方案本發(fā)明所述的短波單孢菌CB vww/^o"a5 sp.),該菌株已于2008年11月 17曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱 CGMCC,保藏編號為CGMCCNo. 。該菌經形態(tài)、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鑒定 為變型細菌a亞群柄桿菌科短波單孢菌屬CBwvM"Amw7^sp.)。該菌最適生長 溫度為3(TC，最適生長pH為7 8。該菌形態(tài)特征菌落形態(tài)圓形凸起，表面光滑濕潤，乳白色，邊緣規(guī)則； 菌體形態(tài)菌體細桿狀，G-,長2um，寬0.3um。 生理生化特性 接觸酶反應陽性； 氧化酶反應陽性；生長溫度4"不生長，28"生長，37。C不生長；耐鹽性試驗2。/。NaCl生長，5。/。NaCl生長，7。/。NaCl不生長；苯丙氨酸脫氨酶試驗陽性；利用檸檬酸鹽陰性；水解淀粉陰性； 卵黃卵磷脂酶陰性； 甲基紅試驗陽性； V. P試驗陰性； PH5.7生長陰性；糖醇發(fā)酵產酸葡萄糖陽性，甘露醇陽性，乳糖陰性，蔗糖陰性。 該菌能高效降解苯并[a]芘，可應用于修復菜地和農田有機污染。 (三)有益效果本發(fā)明所述的短波單孢菌(^^w/"&wo"w sp.)在實驗室條件下培養(yǎng)30天 對土壤中的苯并[a]芘降解率達到80%,在修復菜地和農田有機污染方面具有 很好的應用前景。本發(fā)明所述的短波單孢菌(5^vw"^mo"必sp.),該菌株已于2008年11月17 曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC, 保藏編號為CGMCC No.。


圖1是本發(fā)明所述短波單孢菌CS^vww^mo"as sp.)在液體培養(yǎng)條件下的生 長曲線；圖2是本發(fā)明所述短波單孢菌CBwvw"Amw20s sp.)在液體培養(yǎng)條件下對苯 并[a]芘的降解曲線；圖3是本發(fā)明所述短波單孢菌(5^vw"Amo/ms sp.)對土壤中苯并[a]芘的降解曲線。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。 實施例1 本發(fā)明所述短波單孢菌08 ^ ^//附0 05 sp.)的分離稱取10g沉積物樣到90ml無菌水中，加入一定量的玻璃珠，搖床中振蕩 3h。靜置30min后，移取5ml上清液到45ml含有苯并[a]芘終濃度為5mg/1 的無機鹽培養(yǎng)基中，25°C, 150r/min避光培養(yǎng)。以后每隔8d移取適量菌液至 新的無機鹽-苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，連續(xù)富集培養(yǎng)32d后，移取混 合菌液稀釋至l(T6，涂布于2216E培養(yǎng)基平板上分離、純化，記錄單菌落形 態(tài)并斜面保存菌種。2216E培養(yǎng)基(1000ml): pH7.6-7.8，蛋白胨5g,酵母浸膏l(xiāng)g,轔酸高 鐵0.01g，陳海水1000ml。無機鹽培養(yǎng)基(NH4)2S04 0.5g/l， NaNO30.5g/l, CaCl2 0.02g/l， KH2P04 1.0g/l， NaH2PO41.0g/l, MgSO40.2g/l， pH7.5。實施例2本發(fā)明所述短波單孢菌(^"^" ^> 0"^5口.)的對苯并[3]芘的降解降解實驗在裝液量為250ml的三角瓶中進行。溶液中苯并[a]芘的濃度為 5mg/l。接入本發(fā)明所述短波單孢菌(^^vw"&mowwsp.)的菌懸液，使培養(yǎng)液中 初始細胞濃度達到2.0x 107個/ml，同時設不接菌對照，各3個重復，在28'C 下振蕩培養(yǎng)l、 2、 4、 6、 8、 10d后，取樣分析培養(yǎng)液中苯并[a]芘的含量及活 菌數(shù)。實驗結果為活菌數(shù)量在第6天的數(shù)量達到了3.5xl()Scfu/m1,隨著時間的延長，活菌體 數(shù)量逐漸減少，10天時活菌數(shù)量為9xl0"cfii/ml，如附圖1所示。無苯并[a]芘的降解率隨著時間的延長而逐漸增加，至第10天增到40%, 如附圖2所示。實施例3 本發(fā)明所述短波單孢菌CB"vM"Awo"os sp.)對土壤中苯并[a]芘的 降解取中國農業(yè)科學院東門外實驗田土壤，將土壤過2mm篩，在三角瓶中加 入30g 土壤，濕熱滅菌30min，向瓶中加入苯并[a]芘-丙酮母液(5mg/ml )300ul， 使苯并[a]芘的終濃度達到50mg/kg。按10%的量向土壤中加入測試菌菌懸液， 同時以無菌水作為對照，隨時補加無菌水，使土壤水分為30%，置25'C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在7d、 14d、 21d、 28d、 42d取樣測苯并[a]芘的殘留量。苯并[a]芘殘留量的測定方法將培養(yǎng)后的土壤風干后取lg，放在50ml 離心管中，加3ml丙酮超聲萃取30min后，11000r/min離心，離心10min, 取上清到新的離心管中，在65"水浴鍋中將丙酮蒸發(fā)至干后加10ml環(huán)己烷， 充分混勻后在分光光度計上于296nm處測其吸光度。實驗結果如附圖3所示，在實驗室條件下培養(yǎng)30天對土壤中的苯并[a] 芘降解率達到80%。
權利要求
1、一株高效降解有機污染物的短波單孢菌(Brevundimonas sp.)CGMCCNo. id="icf0001" file="A2008102261930002C1.tif" wi="22" he="8" top= "35" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 根據(jù)權利要求1所述的菌株，其特征在于所述的有機污染物是苯并[a]芘。
3、 根據(jù)權利要求l所述的菌株在修復菜地和農田有機污染方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株高效降解有機污染物的短波單孢菌(Brevundimonassp.)CGMCC No.2746。該菌在實驗室條件下培養(yǎng)30天對土壤中的苯并[a]芘降解率達到80％，在修復菜地和農田有機污染方面具有很好的應用前景。
文檔編號B09C1/10GK101402931SQ20081022619
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權日2008年11月17日
發(fā)明者任天志, 孫建光, 晶 徐, 徐明崗, 楊肖娥, 胡海燕 申請人:中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所