專利名稱：：一種修復(fù)水體石油污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及石油污染生物修復(fù)，特別是一種利用生物表面活性劑-原油降解菌i^修復(fù)水體石油污染的方法，該方法處理7jC體的石油污染效率高，無二次污染。
背景技術(shù)：
：眾多研究表明，在被石油污染的土壤和水體中，微生物的數(shù)量會先減少，隨后再逐漸增加，或在被石油污染的地區(qū)，一些微生物能夠更好的生長，這說明自然界的微生物普遍存在利用石油烴類生長的能力，而有些微生物在石油烴環(huán)境中會更好的生長。在石油環(huán)境的長期選擇下，這些微生物對石油烴類的降解效果會逐漸加強(qiáng)和穩(wěn)定下來，甚至出現(xiàn)能以石油烴為唯一碳源生長的微生物。一般來說，石油烴進(jìn)入微生物細(xì)胞可分為兩個階段，第一階段是烴類從油相轉(zhuǎn)移到微生物細(xì)胞表面，第二階段是烴類通過細(xì)胞壁與膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在第一階段即烴類的轉(zhuǎn)移階段中，由于石油烴幾乎不溶于水，所以微生物降解烴類時有水相、烴相、空氣相和微生物相同時存在，是一個很復(fù)雜的體系。在利用微生物,修復(fù)石油污染時，生物表面活性劑的存在可以降低油-水的界面張力，有利于油在水體中的分散，在水體中形成微小油滴，這樣微生物能更好的與石油物質(zhì)接觸，達(dá)到好的降解效果。尤其對于石油中^),的烴類物質(zhì)，其憎水性是微生物進(jìn)行代謝、降解的主要障礙，因為烴基質(zhì)必須通過外層親水細(xì)胞壁(膜)才會腿入細(xì)胞內(nèi)而被位于細(xì)胞質(zhì)膜中的烴,酶所代謝。而某些細(xì)菌可以通過產(chǎn)生生物表面活性劑促使烴類'乳化，使其被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而被降解。生物表面活性劑是微生物在代謝過程中分泌的具有一定表面和界面活性，同時含有親7jCS和疏水基的兩性化合物。許多微生物，如細(xì)菌、酵母等在各種碳源，特別是在疏水性基質(zhì)如烴類中能產(chǎn)生生物表面活性劑。生物表面活性劑按照結(jié)構(gòu)分為糖脂、月旨肪酸、磷脂和含氨基酸類脂等，大多數(shù)生物表面活性劑為糖脂類物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種處理效率高的利用生物表面活性劑-原油降解菌聯(lián)合修復(fù)水體石油污染的方法。本發(fā)明的上述技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種修復(fù)水體石油污染的方法，包括以下步驟(1)表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及活性劑的提純分析采集含油廢水，稀釋，涂布于原油平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出TO后經(jīng)劃線分離、純化、保種，獲得能產(chǎn)生表面活性劑的菌株；將所篩選的菌株接種在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，獲取含有表面活性物質(zhì)的發(fā)酵液；從發(fā)酵液中提純表面活性物質(zhì)，分析其中的化合物組成；(2)原油降解菌的篩選采集含油廢水，稀釋，涂布于原油平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出菌落后劃線分離、純化、保種，純化后的菌種在原油培養(yǎng)基平板上反復(fù)馴化，獲得原油降解菌種；(3)表面活性劑-原油,菌聯(lián)合處理含油廢水同時接種上述表面活性劑產(chǎn)生菌和原油,菌于含油廢水中，禾擁所產(chǎn)生的表面活性劑乳化原油，使其分散溶解在水中，以便降解菌對其進(jìn)行生物降解及作為碳源利用。上述步驟(1)和步驟(2)中的原油培養(yǎng)基的pH為7.5，包含原油10g、NH4N033g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、微量元素液2mL、和水lOOOmL;步驟(1)中的液體培養(yǎng)基的pH為7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氫鉀lg、微量元素液2mL和水1000mL;微量元素液按質(zhì)量百分比，包含MgS040.4。/。、CuSO40.1%、MnSO40.1%、FeS04.7H200.1%和CaCl20.1%。上述步驟(1)和步驟(2)中的培養(yǎng)時間為35天。上述步驟(2)中的別l化次數(shù)為34次。上述步驟(1)中得到的產(chǎn)生物表面活性劑菌株為銅綠假單胞菌。上述步驟(2)中的原油降解菌種為節(jié)桿菌屬、鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和黃單胞菌屬。上述節(jié)桿菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是l:h鄰單胞菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.8;假單胞菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.6;芽包桿菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.4;黃單胞菌屬原油,菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.6。本發(fā)明公開的一種修復(fù)水體石油污染的方法，其關(guān)鍵點(diǎn)是步驟(1)中篩選表面活性劑產(chǎn)生菌時，觀察原油平板上是否出現(xiàn)乳化圈或噬油斑的菌落，此類菌落可育樹原油具有較強(qiáng)的乳化能力；步驟(2)中篩選原油降解菌時，在原油培養(yǎng)基中生長旺盛的菌具有更強(qiáng)的原油降解潛力，值得進(jìn)一步分離純化；步驟(3)中的原油降解過程，在于表面活性齊,投加方式，采用同時接種表面活性劑產(chǎn)生菌和原油降解菌，使得處理體系中表面活性劑不斷乳化原油，促進(jìn)生物降解，這種方式處理效果好，操作簡便。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的生物表面活性劑比一般的化學(xué)表面活性劑在性能方面更優(yōu)越。2、本發(fā)明禾擁生物表面活性劑-原油降解菌聯(lián)合處理7jC體的石油污染的處理效率高，且無二次污染。3、本發(fā)明采用生物表面活性劑-原油降解菌i^處理水體的石油污染的方法，其操作簡便，經(jīng)濟(jì)實用，適合大面積的原位修復(fù)。圖1是本發(fā)明表面活性齊IJ臨界質(zhì)量膠束濃度的領(lǐng)賦圖；圖2是本發(fā)明的銅綠假單胞菌所產(chǎn)鼠李糖同系物HPLC-ESI-MS分析總離子流圖；圖3是本發(fā)明生物表面活性齊啲量對體系降解率影響的示意圖。具體實施方式實施例1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及活性劑的提純分析原油培養(yǎng)基的pH為7.5，包含原油10g、NH4NO33g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、微量元素液2mL和水1000mL;微量元素液按質(zhì)量百分比，包含MgS040.4%、CuSO40.1%、MnSO40.1%、FeS04.7H200.10/0和CaCl20.1%。自廣州石化廠采集含油污水，稀釋IO6、107、108倍，涂布于原油培養(yǎng)基平板上。培養(yǎng)35d后，觀察平板上是否出現(xiàn)乳化圈或噬油斑的菌落，將這些菌落在營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上劃線分離、純化、保種，獲得產(chǎn)生物表面活性劑菌株S6，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌(尸sewdbmowosaerwg7'"osa)。以碳源、氮源、磷酸鹽、微量元素液和pH這五個因素對產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基進(jìn)行正交實驗，獲得產(chǎn)表面活性劑的最佳優(yōu)化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的pH為7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氫鉀lg、微量元素液2mL和水lOOOmL。接種銅綠假單胞菌于上述優(yōu)化的培養(yǎng)基中(接種量2%)，30°C，165ipm，搖床振蕩培斜8h，4000rpm離心獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液與原油各8mL混合，用力振蕩lmin后，油水形成均勻的乳化液，三角瓶瓶壁不掛油，此時原油的粘度由原來的1123mPa*S斷氐至195mPa*S，降低了82.67%,室溫靜置2d，油水相略有分離，16d后，油水相完全分離，此時，油相體.積降低為6mL，說明部分原油已溶于發(fā)酵液，形成了長時間穩(wěn)定的微乳狀液。粗提將銅綠假單胞菌培養(yǎng)液12500r/min離心30min去除菌體，上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH為2.0，加入等體積乙酸乙酯萃取2次，合并有機(jī)相，用無水Na2SO^P燥，4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到綠色漿狀物，為表面活性劑粗產(chǎn)品。精提將粗品溶于0.05mol/L的NaHCO3溶液，過濾后，用鹽酸調(diào)pH為2.0，4°C放置24h，12500r/min離心15min，去掉上清液，干燥得表面活性劑純品。銅綠假單胞菌產(chǎn)表面活性劑的量為0.283g/L。將提取到的表面活性劑純品分別稀釋至20mg/L、25mg/L、33mg/L、40mg/L、50mg/L、67mg/L、100mg/L、200mg/L后，測不同質(zhì)量濃度的表面活性劑溶液的表面張力，實驗結(jié)果見圖1。隨著表面活性劑質(zhì)量濃度的增大，溶液的表面張力逐漸.降低，至U34mN/m后基本保持不變，說明該生物表面活性劑的CMC值(臨界膠束濃度)為67mg/L，比一般化學(xué)表面活性齊啲CMC值低1~2個數(shù)量級，性能優(yōu)越。采用HPLC-ESI-MS分析銅綠假單胞菌產(chǎn)生的生物表面活性劑組分。在分析之前，將表面活性劑純品溶于乙腈-水(1:1)溶液。分析方法儀器為美國Agilent公司高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀。質(zhì)譜儀為AB公司生產(chǎn)，4000QTARP，酉fi以EclipsePlusC18反相鍵合色譜柱(150mmx2.1mmx5mm)。液相色譜^i牛進(jìn)樣量5^lL,分,樣(1:4);流動相為乙腈-水，采用線性'梯度洗脫，流速250pL/min。梯度洗脫程序如表l:表l梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>質(zhì)譜斜牛:采用負(fù)離子電離，霧化氣和干燥氣都為N2;碰撞電壓-70V;噴霧電壓-4.5kV;溫度400°C;柱后流出物導(dǎo)入離子源速率SpL/min;質(zhì)譜掃描質(zhì)量數(shù)范圍200~1000m/Z。各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定采用面積歸'一化法。圖2是銅綠假單胞菌(i^ew^wowosaen^7'"ara)所產(chǎn)鼠李糖脂的HPLC-ESI-MS分析的總離子流圖。各組分的保留時間、分子離子峰、相對豐度、主要的離子碎片如表2所示。表2銅綠假單胞菌所產(chǎn)鼠李糖脂同系物中各組分的結(jié)構(gòu)及相對豐度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Rha表示一個鼠李糖分子；Q表示一個自長度為n的烷基脂肪酸分子；Cn:i表示一個碳鏈長度為n的含一個不飽和鍵的烷基脂肪酸分子。實施例2原油降解菌株的篩選、分離將含油污水稀釋106、107、108倍涂布于原油培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)35d后，挑取生長較好，離較大的菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上劃線分離、純化、保種，純化后的菌種在原油培養(yǎng)基平板上別l化34次，獲得石油,菌種P1、P2、P3、P4、P5。菌種鑒定結(jié)果為P1—節(jié)桿菌屬"W/zra^ctersp.)，P2-鄰單胞菌屬(尸/es/omo"ossp.)，P3-假單胞菌屬(尸sew(iomo,sp.)，P4—芽孢桿菌屬CSa"7/w;ssp.)，P5—黃單胞菌屬C^"Aowo"ossp.)。在原油培養(yǎng)基中接種石油,菌種，經(jīng)搖床振蕩培養(yǎng)5d后，加入20mL石油醚(30~60°0，轉(zhuǎn)至分液漏斗萃取，振蕩lmin，靜置，待分層后分離，收集上層液，用石油醚洗滌23次，合并上層液用干燥的無水硫酸鈉脫水，66'C蒸干，置干燥器中冷卻恒重，稱重。以同步不加菌液搖床振蕩的原油水樣為對照。觀幌Pl、P2、P3、P4、P5對原油的降解率分別為69.30/0、74.0%、83.1%、75.7%和72.9%。降解率的計算降解率=(m廣附2)/Wlxl00Q/()^——對照組的殘油質(zhì)量(g);m2——樣品的殘油質(zhì)量(g)實施例3表面活性劑產(chǎn)生菌一原油降解菌聯(lián)合處理含油廢水將2mLPl、P2、P3、P4、P5菌液分別與2mL銅綠假單胞菌菌液混合投加到初始pH分別為5、6、7、8、9、10的水樣(原油質(zhì)量濃度為lg/L)中培養(yǎng)，同時設(shè)空白對照(只加P1、P2、P3、P4、P5菌液，pH=7.5)，5d后測降解率。結(jié)果表明，在不同pH^#下原油,菌與表面活性劑產(chǎn)生菌^投加時的降解率均高于^^蟲投加原油降解菌，最高,率分別為70.2%、76.9%、84.8%、77.9%和74.5%(空白對照依次為62.5%、70.2%、66.7%、73.9%和55.2%),證明生物表面活性劑可在一定程度上加快石油的降解速率。將2mLPl、P2、P3、P4、P5菌液分別與銅綠假單胞菌菌液0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL混合投加到水樣(原油質(zhì)量濃度為lg/L)中培養(yǎng)，5d后測,率，結(jié)果如圖3，^投加的,效果均好于^^蟲投加石油降解菌，隨著生物表面活性劑產(chǎn)生菌接種量的增加，,率有一個上升的趨勢，隨后,率保持穩(wěn)定，由此可知生物表面活性齊!j與石油,菌存在一個最佳的匹配量。各雜原油,菌及混合菌群與銅綠假單胞菌菌液的最佳匹配依次為1:1、1:0.8、1:0.6、1:0.4、1:0.6。實施例4產(chǎn)表面活性劑菌株與原油降解菌的菌種鑒定1、實施例1篩選的產(chǎn)表面活性劑菌株與實施例2篩選的原油降解菌株的形態(tài)觀察結(jié)果，如表3所示表3菌株(菌落)的形態(tài)觀察結(jié)果菌株名菌形態(tài)菌苔顏色菌形狀Pl邊緣假根狀，根狀擴(kuò)散，表面干燥白色，不透明桿狀，無鞭毛P2邊緣整齊，表面濕潤突起白色，不透明短桿狀，有鞭毛邊緣整齊，表面濕潤，突起，P3菌落圓形紅棕色，半透明桿狀，有鞭毛邊緣不規(guī)則，表面濕潤，P4皮革狀有鵬白色，不透明長桿狀，有鞭毛P5邊緣整齊，表面濕潤，表面光滑黃色，不透明短桿狀，有鞭毛.邊緣整齊，表面濕潤，S6菌落光滑呈圓形綠色，透明短桿狀，有鞭毛2、實施例1篩選的產(chǎn)表面活性劑菌株與實施例2篩選的原油降解菌株的生理生化特征鑒定結(jié)果，如表4所示。表4菌株的生理生化特征鑒定結(jié)果^^^^^PIP2P3P4P5S6革蘭氏染色+————_產(chǎn)芽孢實驗一_—+——氧化酶一一+++過氧化氫酶++++++運(yùn)動性-+++++氧化氧化葡萄糖利用產(chǎn)酸產(chǎn)酸氧化產(chǎn)酸氧化氧化產(chǎn)酸產(chǎn)酸氧化產(chǎn)酸m.h++++++v.p———_——檸檬酸鹽利用+————_硝酸鹽還原++++++3、實施例1篩選的產(chǎn)表面活性劑菌株與實施例2篩選的原油降解菌株的菌株鑒定結(jié)果根據(jù)表3和表4的實驗結(jié)果及16SrDNA測序結(jié)果，參照《一般細(xì)菌常用鑒定手冊》鑒定，可以確定實施例1篩選的產(chǎn)表面活性劑菌株S6為銅綠假單胞菌(尸Midbwowosaerwgz'wora);實施例2篩選的五株原油降解菌株中Pl為節(jié)桿菌屬"W/zra^ctersp.),P2為令P單胞菌屬(尸fes/omo"ossp.)，P3為假單胞菌(^Psodbmo"ossp.)，P4為芽孢桿菌CS"a7/w^sp.)，P5為黃單胞菌O^w^owowmsp.)。權(quán)利要求1、一種修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于包括以下步驟(1)表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及活性劑的提純分析采集含油廢水，稀釋，涂布于原油平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出菌落后經(jīng)劃線分離、純化、保種，獲得能產(chǎn)生表面活性劑的菌株；將所篩選的菌株接種在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，獲取含有表面活性物質(zhì)的發(fā)酵液；從發(fā)酵液中提純表面活性物質(zhì)，分析其中的化合物組成；(2)原油降解菌的篩選采集含油廢水，稀釋，涂布于原油平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出菌落后劃線分離、純化、保種，純化后的菌種在原油培養(yǎng)基平板上反復(fù)馴化，獲得原油降解菌種；(3)表面活性劑-原油降解菌聯(lián)合處理含油廢水同時接種上述表面活性劑產(chǎn)生菌和原油降解菌于含油廢水中，利用所產(chǎn)生的表面活性劑乳化原油，使其分散溶解在水中，以便降解菌對其進(jìn)行生物降解及作為碳源利用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于步驟(1)所述產(chǎn)生物表面活性劑菌株為銅綠假單胞菌；步驟(2)所述原油降解菌種為節(jié)桿菌屬、鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和黃單胞菌屬。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的修復(fù)7jC體石油污染的方法，其特征在于，節(jié)桿菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是l:h鄰單胞菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.8;假單胞菌屬原油,菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.6;芽孢桿菌屬原油降解菌與銅綠假單胞菌的配比是1:0.4;黃單胞菌屬原油降解菌與銅綠假單胞.菌的配比是1:0.6。'4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于步驟(1)和步驟(2)中所述原油培養(yǎng)基的pH為7.5，包含原油10g、NH4NO33g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、微量元素液2mL和水1000mL。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于步驟(1)中所述液體培養(yǎng)基的pH為7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氫鉀lg、微量元素液2mL和水1000mL。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的修復(fù)7jC體石油污染的方法，其特征在于所述微量元素液，按質(zhì)量百分比，@*MgSO40.4%、CuSO40.1%、MnSO40.1°/。、FeSO4'7H2O0.10/o和CaCl20,10/()。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于步驟(1)和步驟(2)中所述培養(yǎng)時間為35天。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)水體石油污染的方法，其特征在于步驟(2)中所述馴化次數(shù)為34次。全文摘要本發(fā)明公開了一種修復(fù)水體石油污染的方法，包括以下步驟(1)表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及活性劑的提純分析采集含油廢水，稀釋，涂布于原油平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)出菌落后經(jīng)劃線分離、純化、保種，獲得可能產(chǎn)生表面活性劑的菌株；將所篩選的菌株接種在合適的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，獲取含有表面活性物質(zhì)的發(fā)酵液；從發(fā)酵液中提純表面活性物質(zhì)；(2)原油降解菌的篩選；(3)表面活性劑-原油降解菌聯(lián)合處理含油廢水。本發(fā)明的生物表面活性劑比一般的化學(xué)表面活性劑在性能方面更優(yōu)越，而且利用生物表面活性劑-原油降解菌聯(lián)合處理水體的石油污染，處理效率高，無二次污染。文檔編號C02F3/34GK101234823SQ200810026548公開日2008年8月6日申請日期2008年3月3日優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日發(fā)明者何寶燕,葉錦韶,華尹,娜張,輝彭,秦華明申請人:暨南大學(xué)