專利名稱:泛菌屬菌Pantoea sp.M3及其用于降解孔雀石綠的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及泛菌屬的新菌株,還涉及該菌株在降解孔雀石綠中的應用。
背景技術:
孔雀石綠(malachite green,MG)作為殺真菌劑曾廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。MG進入生物體后,轉(zhuǎn)化生成隱孔雀石綠(leucomalachite green,LMG)。MG及LMG在生物體組織中積累起來,不易代謝,具有致癌、致突變作用。加拿大歐盟等國均規(guī)定在食用水產(chǎn)品中禁止檢出MG及其LMG。我國于2002年5月將MG列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》。由于MG的代謝周期緩慢,一般魚塘多年難以根本消除。因此,對漁業(yè)水域中MG的殘留問題也應當加以高度重視。
目前處理水中孔雀石綠的主要方法有物理方法,化學方法和生物方法。物理方法主要是通過吸附,沉降作用去除?;瘜W方法主要有光助Fenton反應,異相光催化,光電催化,電化學方法等。但是這些處理方法投資大、流程復雜,物理吸附并未能將孔雀石綠分解去除,吸附后廢水中仍有孔雀石綠殘留,而且容易造成二次污染。
因此,人們采用微生物的方法降解MG。細菌降解孔雀石綠的報道很少。一項德國發(fā)明專利(Akad.Wiss.Microbial breakdown of xenobiotic dyes oftriphenylmethane series[P].German patentPN290004,PY1991.05.16.)篩選得到分枝桿菌Mycobacterium sp.和棒狀桿菌屬Corynebacterium sp,對于20mg/L孔雀石綠,在24℃可以在2h內(nèi)使脫色率達到47%,在32℃,pH 6.8,22小時內(nèi),完全脫色。Rajesh篩選得到一株庫爾特氏桿菌能夠降解孔雀石綠(Rajesh,1999),該菌可在30min內(nèi)完全使0.365~1.825mg/L的孔雀石綠完全脫色。Sun-YoungAn1等2002年發(fā)現(xiàn)一株檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)可完全脫色3.65mg/L的孔雀石綠。但是現(xiàn)有的微生物處理方法主要集中于MG的脫色研究,檢測方法也多用紫外分光光度法,精確度不高,而且對其主要代謝產(chǎn)物LMG沒有同時檢測。代謝產(chǎn)物隱孔雀石綠同時降解后的檢測的研究未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
1、要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一種降解孔雀石綠高效、快速的細菌及其使用方法,利用該菌能夠有效降解孔雀石綠。
2、技術方案采用的技術方案如下一種泛菌屬菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期2007年3月12日),其具有降解孔雀石綠的能力。
該菌種的主要特征為菌體呈短桿狀,革蘭氏染色陰性,兼性厭氧,過氧化氫酶、V.P.試驗、MR試驗、檸檬酸鹽陽性,氧化酶、吲哚試驗陰性,葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不能水解淀粉。富集培養(yǎng)基上菌落呈白色圓形,邊緣平滑,表面凸起,邊緣整齊。在該培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24h,菌落直徑1mm~3mm.不能以孔雀石綠作為唯一碳源生長。
提取細菌總DNA,以細菌總DNA為模板,PCR擴增16S rDNA,擴增引物為細菌通用引物。正向引物為27f5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’;反向引物為1492r5′-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢驗后委托上海博雅生物技術有限公司進行測序,將所得測序序列結(jié)果提交GeneBank,得到M3的16S rDNA序列的Genebank編號EF192586。
本發(fā)明采用先富集后篩選的方法獲得該菌株。其步驟如下1)從多次噴灑過孔雀石綠的魚塘底泥中,取適量魚塘底泥接種于含0.04mg/L MG的富集培養(yǎng)基中,30℃、150rpm黑暗培養(yǎng)。富集培養(yǎng)基的配方為(mg/L)葡萄糖1000;NaCl 10;MgSO410;NH4NO3100;K2HPO4100;KH2PO4100;酵母膏60;pH 7.0。
2)待培養(yǎng)液混濁且顏色轉(zhuǎn)淺后,將懸濁液轉(zhuǎn)接至下一批次新鮮培養(yǎng)液中(同步驟1中),并逐步加大MG濃度,如此重復,直至MG濃度達5mg/L。
3)馴化后得到的混合培養(yǎng)物經(jīng)富集培養(yǎng)基平板涂布分離和純化,最終篩選得到MG高效降解菌株。
4)經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定,確定上述菌株是泛菌屬(Pantoeasp.)M3.保存在富集培養(yǎng)基的斜面,使用前外加以外加孔雀石綠(0.5mg/L)的上述培養(yǎng)基進行馴化。
該菌種培養(yǎng)方法為富集培養(yǎng)液滅菌(同上),30℃接種菌株M3,150rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)期。
用于降解孔雀石綠的方法取對數(shù)期該菌株,按2%~4%的重量百分比濃度添加到濃度為0.5mg/L~5mg/L的滅菌孔雀石綠降解培養(yǎng)液中,降解培養(yǎng)液組成按g/L計為葡萄糖0.5~1;NaCl 0.01~0.1;MgSO40.01~0.1;NH4NO30.02~0.1;K2HPO40.01~0.1;KH2PO40.01~0.1;酵母膏0.06~0.3;pH值6.0~8.0。20~30℃降解5~10天,降解效果較好。
3、有益效果本發(fā)明提供了一種用于高效降解孔雀石綠的細菌泛菌屬菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022),本發(fā)明可有效去除漁業(yè)水體中殘留的孔雀石綠及其主要代謝產(chǎn)物隱孔雀石綠。本發(fā)明對低濃度孔雀石綠漁業(yè)水體具有很好的處理效果,對溫度適應范圍比較廣。該菌株對20~30℃的0.5~2mg/L的孔雀石綠降解率在90%以上。使用方法方便,降解性能穩(wěn)定,可同時降解孔雀石綠主要代謝產(chǎn)物隱孔雀石綠。
本發(fā)明所涉及細菌已提交保藏保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏日期2007年3月12日,保藏編號CCTCC No.M 207022。
圖1為葡萄糖濃度對泛菌屬菌Pantoea sp.M3生長的影響;圖2為葡萄糖濃度對泛菌屬菌Pantoea sp.M3降解孔雀石綠的影響;圖3為NH4NO3濃度對泛菌屬菌Pantoea sp.M3生長的影響;圖4為NH4NO3濃度對泛菌屬菌Pantoea sp.M3降解孔雀石綠的影響;圖5為不同磷濃度條件下對泛菌屬菌Pantoea sp.M3生長的影響;圖6為不同磷濃度條件下對泛菌屬菌Pantoea sp.M3降解孔雀石綠的影響;圖7為溫度對對泛菌屬菌Pantoea sp.M3生長的影響;圖8為溫度對泛菌屬菌Pantoea sp.M3降解孔雀石綠的影響。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明實施例1取適量魚塘底泥接種于含0.04mg/L MG的富集培養(yǎng)基中,30℃、150rpm黑暗培養(yǎng)。待培養(yǎng)液混濁且顏色轉(zhuǎn)淺后,將懸濁液轉(zhuǎn)接至下一批次新鮮培養(yǎng)液中,并逐步加大MG濃度,如此重復,直至MG濃度達5mg/L。馴化后得到的混合培養(yǎng)物經(jīng)富集培養(yǎng)基平板涂布分離和純化,最終篩選得到MG高效降解菌株M3。
實施例2將菌株接種于5mg/L的孔雀石綠富集培養(yǎng)基中,活化至對數(shù)期,培養(yǎng)基成分按mg/L計為葡萄糖1000;NaCl 10;MgSO410;NH4NO3100;K2HPO4100;KH2PO4100;酵母膏60;pH 7.0。將所得菌液按2%~4%的重量百分比濃度接入含孔雀石綠0.5~5mg/L孔雀石綠培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5天后測定降解率,可分別達到97.54%,97.1%,100%和77.8%,可見該菌對孔雀石綠特別是較低濃度的孔雀石綠降解效果更好。
實施例3在降解體系中設置不同葡萄糖濃度來比較MG降解效果(圖1和圖2)。由圖1和圖2可見,在葡萄糖濃度為0mg/L時,M3生長緩慢,培養(yǎng)10d后MG濃度降低仍不明顯,說明M3不能以MG作為唯一碳源進行生長和代謝,其緩慢的生長和降解可能是由于初始接入的菌懸液影響而發(fā)生。較高葡萄糖濃度500mg/L和1000mg/L時,MG的降解速率和菌株生長情況基本一致,1d內(nèi)菌株即可到達生長穩(wěn)定期,在2d內(nèi)均可將MG幾乎完全降解。因此,葡萄糖作為菌株生長基質(zhì)的碳源,其濃度對微生物的生長有一定影響,濃度越高,菌體增殖越快,對MG降解越強。從經(jīng)濟性角度考慮,不超過500mg/L葡萄糖就完全有利于M3對MG的降解。
實施例4氮源是促進細菌生長的重要營養(yǎng)元素之一。在降解體系中設置不同氮源(NH4NO3)濃度,比較MG降解效果。由圖3可知氮濃度對M3的生長具有一定影響,氮濃度增大,可以促進菌體的生長。這和MG降解情況相似。從圖4可見,2d內(nèi)高氮濃度200mg/L時,MG降解率就可達到92.8%,而低氮濃度20mg/L時,MG降解率僅為65.6%。但是,若增加培養(yǎng)時間(6d),不同氮源濃度MG降解率均可達到95.9%以上。由此可見,提高氮濃度能提高M3對MG的起始降解速率,但即使在低氮濃度條件下通過延長培養(yǎng)時間(6d)也能使MG幾乎完全降解。因此,從經(jīng)濟角度考慮,氮源濃度選擇不超過20mg/L就能有利于MG降解,并可通過適當增加培養(yǎng)時間以達到有效降解MG的目的。
實施例5磷源也是微生物生長的重要元素之一。在培養(yǎng)體系中設置不同的磷濃度,比較MG降解效果。由圖5可知,同20mg/L相比,100mg/L磷濃度時M3生長更好,因此,提高磷濃度有利于M3的生長。這與MG的降解情況有所不同。從圖6中可知,50mg/L和100mg/L磷濃度下M3對MG的降解情況相似,100mg/L條件下降解速率略快。磷濃度為20mg/L時,2d內(nèi)MG幾乎不被降解,4d后降解率也僅達到40%,而在高磷濃度條件下(50mg/L和100mg/L)MG降解率可分別達到82.05%和97.95%。隨著培養(yǎng)時間的不斷延長(6d),不同磷濃度條件下M3對MG的降解率均可達到96.4%以上。由此可見,提高磷濃度能提高M3對MG的起始降解速率,但即使在低磷濃度條件下通過延長培養(yǎng)時間(6d)也能使MG幾乎完全降解。因此,從經(jīng)濟角度考慮,不超過20mg/L磷濃度就能有利于MG的降解,并可以通過適當增加處理時間就能達到有效降解MG的目的。
實施例6在體系中設置不同溫度,比較MG降解效果。由圖7可見,溫度對菌株M3的生長影響不大,但是,溫度對菌株降解MG速率的影響很大(圖8)。隨著溫度升高,菌株對MG的起始降解速率不斷增加,在25℃時降解速率最大。10d后,低溫度15℃時,M3對MG的降解率僅達到了46.76%,而20℃和25℃時,M3對MG的降解率分別達到91.6%和94.55%。Akad的德國專利中(PN290004,PY1991.05.16).所篩選的菌株Corynebacterium sp.和Mycobacterium sp.可在24℃降解脫色MG至53%,在32℃時可完全降解脫色MG。因此,本發(fā)明篩選出的菌株M3在實際污染處理中能適應更廣泛的環(huán)境條件,優(yōu)于已報道的其他菌株。
實施例7將菌株接種于0.5mg/L的孔雀石綠富集培養(yǎng)基中,活化至對數(shù)期,培養(yǎng)基成分按mg/L計為葡萄糖800;NaCl 8;MgSO450;NH4NO380;K2HPO480;KH2PO480;酵母膏300;pH 8.0。將所得菌液按3%的重量百分比濃度接入含孔雀石綠0.5mg/L孔雀石綠培養(yǎng)集中,培養(yǎng)5天后測定降解率,可達到90%以上。
實施例8將菌株接種于0.5mg/L的孔雀石綠富集培養(yǎng)基中,活化至對數(shù)期,培養(yǎng)基成分按mg/L計為葡萄糖500;NaCl 100;MgSO4100;NH4NO320;K2HPO410;KH2PO410;酵母膏100;pH 6.0。將所得菌液按4%的重量百分比濃度接入含孔雀石綠0.5mg/L孔雀石綠培養(yǎng)集中,培養(yǎng)5天后測定降解率,可達到90%以上。
權利要求
1.一種泛菌屬菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022),其具有降解孔雀石綠的能力。
2.權利要求1所述的泛菌屬菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022)用于降解孔雀石綠的方法,其特征在于取對數(shù)期該菌株,按2%~4%的重量百分比濃度添加到濃度為0.5mg/L~5mg/L的滅菌孔雀石綠降解培養(yǎng)液中,降解培養(yǎng)液組成按g/L計為葡萄糖0.5~1;NaCl 0.01~0.1;MgSO40.01~0.1;NH4NO30.02~0.1;K2HPO40.01~0.1;KH2PO40.01~0.1;酵母膏0.06~0.3;pH值6.0~8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種泛菌屬菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022)。這種細菌具有降解孔雀石綠的能力。取對數(shù)期該菌株,按2%~4%的重量百分比濃度添加到濃度為0.5mg/L~5mg/L的滅菌孔雀石綠降解培養(yǎng)液中,降解培養(yǎng)液組成按g/L計為葡萄糖0.5~1;NaCl 0.01~0.1;MgSO
文檔編號C02F3/34GK101050436SQ20071002104
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月23日 優(yōu)先權日2007年3月23日
發(fā)明者楊柳燕, 任倩, 張彤晴, 潘建林, 蔣麗娟, 吳光紅, 宋煒, 肖 琳, 林海, 周剛 申請人:南京大學